Questo protocollo descrive un metodo robusto e riproducibile per la fabbricazione di fantasmi anisotropi di alcol polivinilico (PVA)—strumenti essenziali per convalidare tecniche di elassografia a ultrasuoni che mirano meccanicamente tessuti molli anisotropi (ad esempio, muscoli scheletrici).
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Articolo metodologico
Fabbricazione fantasma di alcol polivinilico anisotropo per l'elastografia a ultrasuoni: procedure e controlli di qualità
In questo articolo
Sommario
Abstract
I fantasmi dell'alcol polivinilico (PVA) sono tipicamente isotropi e ampiamente utilizzati per convalidare le tecniche di elassografia a ultrasuoni destinate alla valutazione dei tessuti molli. Tuttavia, alcuni tessuti molli biologici (ad esempio, muscoli scheletrici) presentano un'anisotropia meccanica distinta, che rende necessaria l'uso di fantasmi PVA anisotropi per i rigorosi test di metodi elastografici che mirino a questi tessuti. Sebbene studi precedenti abbiano rilevato che i fantasmi PVA anisotropi interni possono essere fabbricati tramite cicli di congelamento/scongelamento integrati a stretch (FTC), dettagli tecnici critici (ad esempio, processo di fabbricazione, controllo qualità) rimangono insufficientemente documentati. Questo lavoro presenta un protocollo visivamente dettagliato e riproducibile per la fabbricazione di fantasmi PVA anisotropi, concentrandosi su materiali chiave, processi a passo a passo e controlli di qualità per indurre un'anisotropia stabile e uniforme. I materiali chiave includono il PVA come matrice fantasma, il sorbato di potassio come conservante, le particelle di grafite come diffusori acustici e l'acqua pura (o acqua deionizzata) come solvente. Il processo di fabbricazione comprende tre fasi principali: 1) Preparazione di una soluzione omogenea a base di PVA attraverso condizioni termiche controllate per garantire la completa dissoluzione del PVA; 2) Solidificazione tramite FTC: la soluzione raffreddata viene versata in stampi stampati in 3D, seguita da FTC senza stretching per formare una struttura preliminare; 3) Induzione dell'anisotropia tramite FTC allungate: ulteriori FTC vengono eseguite sotto allungamento controllato per indurre anisotropia direzionale. Le misure di controllo qualità (ad esempio, evitare bolle d'aria durante la dissoluzione del PVA) sono descritte in dettaglio. Dopo la fabbricazione, vengono impiegate le immagini ultrasoniche a onda di taglio (SWI) e test uniassiali a trazione per confermare l'anisotropia meccanica del fantasma. Questo articolo offre un approccio standardizzato per la fabbricazione di fantasmi anisotropi che imitano tessuti al fine di validare le tecniche di elassografia a ultrasuoni con maggiore accuratezza e coerenza.
Introduzione
Alcuni tessuti molli biologici (ad esempio, muscoli scheletrici) presentano anisotropia meccanica macroscopica, che ha origine dalla loro architettura microstrutturaleallineata 1. In particolare, i tessuti connettivi organizzano le fibre muscolari in una struttura gerarchica: l'endomisio circonda le singole fibre, il perimisio raggruppa le fibre in fascicoli e l'epimisio racchiude l'intero muscolo, supportando la trasmissione di forza e l'apporto dinutrienti 2. Le tecniche di elassografia basate su ultrasuoni, come l'imaging a onda di taglio (SWI), sono ampiamente utilizzate per la valutazionemuscolare 3,4. Tuttavia, le proprietà meccaniche anisotrope del muscolo teoricamente portano a una propagazione dell'onda di taglio dipendente dalladirezione 5, il che complica la quantificazione della rigiditàmuscolare 6. I fantasmi meccanicamente anisotropi che imitano i tessuti sono essenziali per far avanzare l'elastografia a ultrasuoni nella valutazione muscolare.
L'alcol polivinilico (PVA) è un materiale ideale per tali fantasmi, poiché mantenere l'allungamento meccanico durante i cicli di congelamento/scongelamento (FTC) allinea le catene molecolari PVA, inducendo così un'anisotropia meccanica 7,8. Gli approcci convenzionali che utilizzano semplici cuboidi PVA soggetti a stiramento spesso portano a una deformazione non omogenea dovuta allo slittamento superficiale, compromettendo così la riproducibilità. Questa limitazione può essere affrontata utilizzando una geometria fantasma ottimizzata con anelli di fissione estremi, che garantisce allungamento affidabile e una distribuzione uniforme delladeformazione 9—migliorando notevolmente la qualità dei fantasmi PVA anisotropi. In questo studio, forniamo una dimostrazione visiva dettagliata della fabbricazione di tali fantasmi PVA anisotropi e ne convalidiamo l'anisotropia meccanica tramite test SWI e uniassiali di trazione.
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Protocollo
NOTA: I seguenti passaggi sono illustrati nella Figura 1.
1. 3D stampa di uno stampo fantasma
- Utilizzando software di modellazione 3D, progetta la geometria fantasma per incorporare due anelli di contenimento (uno a ciascuna estremità) per mantenere l'elasticità, con una regione centrale efficace di 35 mm × 60 mm × 5 mm (lunghezza × larghezza × altezza) per garantire un'induzione uniforme dell'anisotropia.
- Stampare lo stampo usando una stampante 3D.
NOTA: Gli anelli di mantenimento impediscono lo scivolamento durante lo stretching, garantendo una distribuzione costante della deformazione. Tutti i file di stampa 3D (.stl) sono forniti nel File Supplementare 1.
2. Preparazione della soluzione PVA
- Pesa polvere PVA (10 wt%), sorbato di potassio (1 wt%) e particelle di grafite (1 wt%, ~6,5 μm di diametro) e misura il volume corrispondente di acqua pura (si raccomanda acqua deionizzata) per preparare un volume batch di ~200 mL.
- Combina polvere di PVA e acqua pura in un becher, posiziona il becher su un mescolatore magnetico dotato di una barra di mescolatore, copri il becher con carta stagnola di alluminio e mescola a ~600 giri/min a temperatura ambiente per 10 minuti finché il PVA non si disperde completamente.
- Trasferire il becher in un vaschio d'acqua a 80 °C e continuare a riscaldare finché il PVA non è completamente dissolto (come dimostra una soluzione trasparente e priva di particelle).
NOTA: Indossare guanti resistenti al calore e dispositivi di protezione oculare durante il riscaldamento per prevenire ustioni termiche. Assicurati che non rimangano particelle PVA non disciolte, poiché comprometterebbero l'omogeneità fantasma.
3. Aggiunta di additivi e colata
- Raffredda la soluzione a ~40 °C continuando a mescolare a ~600 giri/min sullo agitatore magnetico.
- Rimuovere la carta stagnola, aggiungere sorbato di potassio e particelle di grafite, ricoprire con la carta e mescolare a ~600 giri/min finché gli additivi non sono distribuiti uniformemente (confermare visivamente la distribuzione omogenea).
- (Opzionale) Degassa la soluzione PVA per rimuovere le bolle d'aria residue. Posizionare il becher contenente la soluzione mista in una camera a vuoto e applicare un vuoto per circa 30 minuti per rimuovere le bolle d'aria dalla soluzione PVA.
- Fondi la soluzione nello stampo stampato in 3D e assembla lo stampo usando viti.
NOTA: Evita di introdurre bolle d'aria durante il lancio. Tocca delicatamente lo stampo se necessario per eliminare le bolle d'aria intrappolate all'interno della soluzione.
4. FTC iniziale per la solidificazione del PVA
- Metti la muffa in un congelatore a −20 °C per 12 ore.
- Rimuovi la muffa dal congelatore e scongela a temperatura ambiente (20 °C) per 12 ore.
- Demolare con cura il fantasma per evitare danni.
NOTA: Questo passaggio forma un fantasma di base isotropo, fornendo una base stabile per la successiva induzione dell'anisotropia.
5. Indurre l'anisotropia tramite FTC allungate
- Posiziona il phantom sul dispositivo di stretching su misura, allungalo gradualmente fino al 180% della sua lunghezza effettiva (80% di sforzo di trazione), misura manualmente la distanza di stretching e blocca il dispositivo per evitare la retrazione.
- Trasferire l'intero dispositivo di stretching (con il phantom fissato) in un congelatore a −20 °C per 12 ore, seguito dallo scongelamento a temperatura ambiente (20 °C) per 12 ore.
- Ripeti ancora una volta questo ciclo FTC sotto stretching prolungato.
NOTA: Il dispositivo di stretching su misura è costituito da uno stadio lineare bidirezionale a filettatura opposta disponibile commercialmente, assemblato con due supporti di mantenimento fantasma stampati in 3D, per i quali i file STL sono forniti nel File Supplementare 1. Indossa guanti isolanti protettivi contro il freddo per evitare congelamenti quando rimuovi il dispositivo di stretching dal congelatore a −20 °C. Lo stiramento sostenuto durante le FTC allinea le catene molecolari PVA in modo unidirezionale. Totale delle FTC impiegate in questo studio: un ciclo senza allungamento + due cicli allungati (80% di deformazione a trazione).
6. Rilascio finale e conservazione
- Dopo l'ultimo passaggio di scongelamento FTC, rilascia delicatamente il dispositivo di stretching per evitare danni causati dal rinculo.
- Rimuovi il fantasma dal dispositivo di stretching. Il fantasma anisotropico PVA è ora completo.
- Conserva il fantasma immerso nell'acqua all'interno di un contenitore di plastica sigillato a 4 °C.
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Risultati
La Figura 2A presenta uno schema dell'intero processo di fabbricazione, inclusa la preparazione della soluzione PVA, lo stampaggio, la FTC iniziale senza allungamento, la destampatura e le successive FTC allungate. Utilizzando il protocollo proposto, abbiamo fabbricato due fantasmi anisotropi in PVA per test SWI e uniassiali di trazione, rispettivamente. La SWI è stata eseguita utilizzando un sistema a ultrasuoni di ricerca dotato di una sonda L7-4 (frequenz...
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Discussione
Il successo di questo protocollo dipende dal raggiungimento di una dissoluzione completa e uniforme del PVA e dal mantenimento di uno stiramento sostenuto durante le FTC—due passaggi critici per indurre un'anisotropia meccanica stabile e omogenea. La ricetta utilizzata qui (cioè concentrazione di PVA, numero FTC e sforzo di trazione applicata) è stata selezionata per fabbricare fantasmi PVA anisotropi con rigidità all'interno dell'intervallo fisiologico del tessuto muscolare. In particol...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione per le Scienze Naturali di Pechino (n. 1254038). Gli autori desiderano ringraziare la Prof.ssa Wei-Ning Lee dell'Università di Hong Kong per il suo aiuto con il test di imaging a onda di taglio a ultrasuoni.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bilanciamento analitico | OHAUS | AX224 | Bilancia analitica con calibrazione interna, capacità 220 g, leggibilità 0,1 mg |
| Stadio lineare bidirezionale, a filo opposto | Taobao | N/A | Escursione di 250 mm per filettatura, utilizzata per costruire il dispositivo di stretching su misura |
| Stampante 3D FDM | Bambu Lab | X1 Carbon | Utilizzato per stampare lo stampo fantasma, così come i supporti di mantenimento del fantasma per il dispositivo di stretching su misura |
| FreeCAD | Comunità Open-Source di FreeCAD | N/A | Versione 0.22.0, utilizzata per progettare lo stampo fantasma e i supporti di mantenimento fantasma del dispositivo di stretching su misura |
| Particelle di grafite | MREDA | M151649 | Particelle di grafite, purezza 99,95%, mesh 2000 (~6,5 um), usate come scatterer acustici, 1% in peso |
| Barra di agitazione magnetica | Corning | 401435 | Barra magnetica di mescolare rivestita in PTFE, 1 x 3/8 di pollice, per mescolare la soluzione PVA |
| Agitatore magnetico | IKA | 25005927 | Agitatore magnetico di controllo di sicurezza di base RCT con funzione di riscaldamento |
| Polivinil alcolico | MACKLIN | P81584 | Polivinilica, Mw 89000-98000, idrolizzato al 95%, usato come matrice fantasma, 10% in peso |
| Sorbato di potassio | Sigma-Aldrich | 85520 | Sorbato di potassio, ≥ 99,0% di purezza, usato come conservante, 1% in peso |
| Fase di rotazione | Newport | URS50BPP | Utilizzato per ruotare la sonda a ultrasuoni nel test di imaging a onda di taglio per angoli multipe (0° :2° :90°) |
| Macchina universale di prova a colonna singola | Instron | Modello 5944 | Utilizzato per test di trazione uniassiale, sensore di forza da 50 N |
| Sistema di Ecografia di Ricerca | Verasonics | Vantage 256 | Utilizzata per la sperimentazione di imaging a onda di taglio, sonda L7-4 (frequenza centrale: 5,2 MHz) |
| Bagno d'acqua | LICHEN | HH-2 | Display digitale a bagno d'acqua a temperatura costante, 2 fori a singola fila, per riscaldare e sciogliere la soluzione PVA |
Riferimenti
- Fung, Y. C. . Biomechanics: mechanical properties of living tissues. , (2013).
- Sherwood, L. . Fundamentals of human physiology. , (2011).
- Stiver, M. L., Mirjalili, S. A., Agur, A. M. Measuring shear wave velocity in adult skeletal muscle with ultrasound 2-D shear wave elastography: a scoping review. Ultrasound Med Biol. 49 (6), 1353-1362 (2023).
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Ristampe e permessi
