Sviluppo di un modello di fusione intersopiare caudale tra ratti: uno studio pilota di fattibilità

Sommario

Questo studio ha dimostrato la fattibilità tecnica di un modello pilota di fusione intersodiare caudale con ratto utilizzando la fissazione posteriore di gabbia e placche. L'analisi istomorfometrica a 12 settimane ha confermato un ponte osseo continuo e distinti modelli di maturazione ossea intra-gabbia. Questo modello tecnico funge da base preliminare per futuri studi su larga scala.

Abstract

Le vertebre caudali dei ratti sono ampiamente utilizzate nella rigenerazione ossea e nella ricerca sulla fusione spinale come siti comodi per testare materiali e impianti di innesti ossei. I precedenti modelli di fusione della coda di ratto hanno ottenuto la fusione intervertebrale tramite rimozione di dischi e innesto osseo, oppure con dispositivi di fissazione esterni. Tuttavia, non è stato sviluppato alcun modello per animali di piccolo dimensione che utilizzi una gabbia di fusione intersomica analoga a quella clinica. Si ipotizzò che un ambiente di fusione ossea evaluable potesse essere stabilito senza complicazioni neurologiche eseguendo un inserimento posteriore della gabbia che imita procedure cliniche, integrato con fissazione delle piastre, nelle vertebre caudali del ratto. Questo studio pilota preliminare (n = 1) è stato progettato per valutare la fattibilità tecnica. Fu sviluppato un approccio chirurgico in cui una gabbia in titanio miniaturizzata veniva inserita con precisione nello spazio del disco resezionato tra le vertebre caudali adiacenti, rispecchiando da vicino la procedura chirurgica umana. Il titanio è stato scelto per la gabbia grazie al suo ampio uso clinico e alla sua biocompatibilità. I risultati iniziali hanno dimostrato la fattibilità tecnica di questo approccio. La gabbia impiantata manteneva l'altezza del disco e l'allineamento della colonna vertebrale. È stata osservata una crescita ossea progressiva attraverso la gabbia, culminata in un collegamento osseo continuo confermato attraverso lo spazio intervertebrale entro 12 settimane dall'intervento. La presenza di una struttura trabecolare continua e l'assenza di tessuto fibroso intermedio sono state confermate radiologicamente e istologicamente. Nel complesso, questo modello di fusione della coda di ratto basato su gabbia offre una piattaforma promettente per valutare nuovi biomateriali e indagare i meccanismi della fusione ossea intervertebrali. Tuttavia, la mancanza di un gruppo di controllo e di un'analisi statistica, dovuta al disegno a soggetto singolo, limita la generalizzazione di questi risultati e richiede ulteriori validazioni.

Introduzione

La fusione intercorporale è un trattamento chirurgico consolidato per vari disturbi spinali, tra cui instabilità, spondilolistesi e malattie degenerative; In particolare, si è evoluto in circa 70 anni come procedura^{standard 1,2}. La procedura prevede la rimozione del disco intervertebrale e l'inserimento di una gabbia o di un innesto osseo per favorire la fusione solida tra vertebre^{adiacenti 3,4}. Inoltre, l'aggiunta di strumentazione posteriore con gabbie riduce i tassi di pseudartrosi e ne amplia le indicazioni^{cliniche 5}. Tuttavia, complicanze come la pseudoartrosi e la subsidenza della gabbia restano sfide cliniche significative, che richiedono lo sviluppo affidabile di modelli preclinici per valutare nuovi materiali e fattori promotori^{della fusione 6,7}.

I ratti sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sulla fusione spinale grazie alla loro fattibilità economica, rapida riproduzione, rapida guarigione e facilità di^{maneggiazione 8,9}. Tuttavia, i modelli esistenti di fusione intersopista con ratti presentano limitazioni significative. In particolare, l'approccio della fusione intersompare lombare anteriore (ALIF) nei ratti richiede una manipolazione importante dei vasi e degli organi addominali, con conseguente elevata invasività chirurgica e rischi sostanziali di^{complicazioni 10,11}. L'approccio della fusione intersomiare lombare posteriore (PLIF) comporta un rischio inevitabile di lesioni neurologiche a causa dei canali spinali e degli elementi neurali estremamente piccoli, rendendo la retrazione neurale quasi^{impossibile 12}. Di conseguenza, la maggior parte degli studi sui ratti si è limitata alla fusione posterolaterale (PLF), che strutturalmente non indaga i meccanismi della fusione ossea all'interno della gabbia, un aspetto critico nei contesti^{clinici 13}. Inoltre, sebbene esistano modelli caudali, mancano di un sistema di valutazione che integri una gabbia intersomiare simile a quella clinica con la fissazione della placca posteriore.

La colonna caudale dei ratti offre vantaggi unici nella ricerca sulla fusione intersociale. I dischi caudali mostrano forti somiglianze geometriche, composizionali e meccaniche con i dischi lombari umani, rendendoli sempre più popolari nella ricerca sui^{dischi 14,15}. Inoltre, la chirurgia della colonna caudale offre un facile accesso chirurgico, costo-efficacia e rapido recupero post-operatorio rispetto agli approcci^{lombari 16}. Tuttavia, finora nessuno studio ha riportato un inserimento riuscito nella gabbia posteriore della colonna caudale del ratto con una valutazione istologica dettagliata della formazione ossea all'interno e intorno alla gabbia.

La valutazione istologica, in particolare dell'istomorfometria ossea non calcificata, rimane lo standard d'oro per la valutazione dell'osseointegrazione e della fusione^{ossea 17,18}. In particolare, consente un'analisi quantitativa di parametri critici della formazione ossea, tra cui volume/volume tissutale (BV/TV), numero trabecolare e spessore trabecolare, consentendo al contempo una valutazione qualitativa della maturità ossea distinguendo l'osso tessuto dall'osso^{lamellare 19,20}. Una valutazione istomorfometrica così dettagliata può rivelare i modelli di osteoconduzione spaziale e temporale all'interno della gabbia e alle interfacce gabbia-vertebra^21,22. Tuttavia, manca una valutazione istomorfometrica completa dell'osteoconduzione in gabbia nei modelli di ratto.

Questo studio mirava a sviluppare un modello pilota di fusione intersodiare caudale con ratti utilizzando l'inserimento posteriore della gabbia e la fissazione supplementare delle placche per dimostrarne la fattibilità tecnica. Questo studio presenta una tecnica chirurgica dettagliata e una valutazione istologica completa della formazione ossea all'interno della gabbia e alle interfacce delle placche terminali vertebrali. Si ipotizzò che un ambiente di fusione ossea evaluable potesse essere stabilito senza complicazioni neurologiche eseguendo un inserimento posteriore della gabbia che imita procedure cliniche, integrato con fissazione delle piastre, nelle vertebre caudali del ratto. Questo modello fornisce una piattaforma efficiente per valutare i materiali di fusione intercorporale e, nella letteratura esistente, rappresenta un'esplorazione tecnica iniziale del posizionamento riuscito della gabbia posteriore utilizzando la valutazione osteoconduttrice istomorfometrica in un modello di ratto.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Jikei (numero di approvazione 2023–034C1). Questo studio è stato progettato come uno studio pilota di fattibilità. Per valutare la fattibilità tecnica di questa inserzione posteriore altamente delicata e innovativa nella gabbia posteriore nella colonna caudale del ratto prima della validazione su larga scala, è stato utilizzato un singolo animale (n = 1), secondo le linee guida etiche, per minimizzare l'uso durante la valutazione tecnica iniziale. I maschi di ratti Sprague-Dawley (SD) sono stati selezionati come ceppo standard per la ricerca sulla fusione spinale. I criteri di inclusione riguardavano maschi sani di età compresa tra 8 e 10 settimane, con un peso compreso tra 200 e 250 g, per garantire che l'altezza del disco intervertebrale (1,8–2,2 mm) fosse compatibile con la gabbia da 2 mm. Gli animali che mostravano > perdita di peso del 10% durante il periodo di acclimatazione, una diminuzione dell'attività o deformità vissibili della coda sono stati esclusi. Per questo studio, un maschio di ratto Sprague–Dawley (8 settimane, peso 221,8 g; Japan SLC, Shizuoka, Giappone) è stata utilizzata. L'animale è stato alloggiato in un ambiente controllato a 25°C e con un'umidità relativa del 50% (intervallo consentito 30–70%) con un ciclo di luce e buio di 12 ore, e gli è stato fornito accesso ad libitum all'acqua e a una dieta standard per roditori. I ratti venivano ospitati in gabbie a fondo solido dotate di materiali per nidificare e bastoncini da masticare per l'arricchimento ambientale. È stato implementato un periodo di acclimatazione di 3 giorni prima dell'intervento chirurgico. Per evitare che i compagni di gabbia rodicchiassero gli impianti della coda, il ratto è stato mantenuto in condizioni di singola alloggio per tutto lo studio, un fattore critico in questo disegno sperimentale.

Preparazione di viti e piastre

I materiali di fissazione interna venivano preparati prima dell'intervento chirurgico. Le viti in acciaio inox disponibili in commercio (diametro originale: 1,2 mm, lunghezza: 14 mm) venivano tagliate a una lunghezza precisa di 6 mm utilizzando un tronceafilo (Figura 1A). Queste viti venivano sterilizzate tramite autoclaving standard a vapore a 121 °C per 20 minuti. In una piastra di fissaggio interna in poliossimetilene (POM) (lunghezza 18 mm, larghezza 3 mm, spessore 1 mm), fori per vite con un diametro di 1,2 mm venivano praticati a intervalli di 12 mm utilizzando un trapano manuale (Figura 1B–D). Successivamente, gli angoli delle piastre POM sono stati arrotondati con un tronchino per minimizzare l'irritazione dei tessuti molli circostanti (Figura 1E). Le piastre venivano sterilizzate utilizzando plasma gasoso di ossido di etilene (EtO) o perossido di idrogeno, data la sensibilità termica del polimero. La gabbia in titanio presenta una struttura a reticolo interconnessa con canali longitudinali di diametro 300–500 μm. La sua superficie è stata preparata utilizzando la tecnologia Lamellar 3D Titanium per ottenere una rugosità microsuperficiale di 3–5 μm, facilitando così la crescita ossea diretta.

Anestesia e intervento chirurgico

Non è stato effettuato digiuno preoperatorio per evitare uno stress metabolico inutile. L'anestesia è stata indotta tramite una miscela tripla di anestesia composta da medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (2 mg/kg) e butorfanolo (2,5 mg/kg), somministrata tramite iniezione sottocutanea nel dorso con un ago²³ calibro 25. Il piano chirurgico di anestesia adeguato è stato valutato ogni 15 minuti confermando la perdita del riflesso di ritiro del pedale (pizzicamento del dito del piede), mantenendo le mucose rosa e monitorando la frequenza respiratoria (70–110 respirazioni/minuto). Successivamente fu eseguita la procedura chirurgica per la fusione intersociale delle vertebre caudali. L'animale è stato posizionato in posizione prona (Figura 2A) e l'intera coda è stata disinfettata seguendo un protocollo di pulizia alternata a tre round (70% etanolo, povidone-iodio e 70% etanolo) per garantire un campo sterile. Per identificare le vertebre bersaglio, è stata eseguita una palpazione manuale partendo dal sacro distalmente. La prima giunzione mobile fu identificata come la giunzione sacro-Co1, e il segmento immediatamente distale fu designato come Co2, definendo il sito bersaglio Co2–Co3. È stata effettuata un'incisione longitudinale di circa 2 cm sulla parte dorsale, che si estende dalla seconda alla terza vertebra caudale (Co2–Co3) (Figura 2B), per esporre la superficie posteriore di ciascuna vertebra. Durante l'esposizione, si è prestata attenzione per identificare ed evitare danni alla vena caudale dorsale; La dissezione contundente e l'elettrocauterizzazione bipolare venivano utilizzate per gestire le emorragie lievi. Per preparare il sito di fusione, l'anello fibroso tra le vertebre di CO2 e Co3 è stato inciso con un bisturi (Figura 2C). L'annulo fibroso e il nucleo polpato sono stati poi rimossi meticolosamente tramite curettage usando una curetta e piccole pinze (Figura 2D). Questo passaggio è stato eseguito con ingrandimento chirurgico ad alta potenza (≥3,5x). La completezza della rimozione è stata definita oggettivamente dalla conferma visiva del sanguinamento puntettato (il segno della "placca terminale sanguinante") e dalla totale assenza di tessuto molle residuo. Il danno inaccettabile alla placca terminale è stato definito come erosioni profonde che coinvolgevano > il 25% dell'area totale o penetrazione nell'osso cancelloso > 0,5 mm. Una gabbia in titanio (sezione trasversale di 2 × 2 mm, altezza 2 mm) (Figura 2E) fu successivamente inserita in profondità nello spazio intervertebrale fino a raggiungere un fermo fisico e confermare visivamente il contatto intero con entrambe le placche terminali, creando un fermo attacco di interferenza (Figura 2F, 2G).

Fissazione e chiusura della ferita

Per facilitare la fissazione delle piastre, la superficie ossea attorno ai punti di foratura designati nelle vertebre di CO2 e CO3 fu appiattita utilizzando un router elettrico portatile che operava a 7.800 RPM, dotato di una bava sferica di tipo lima da 2,0 mm (Figura 2H). I fori osseari venivano forati singolarmente a intervalli corrispondenti ai fori delle viti della piastra di fissaggio interna in plastica utilizzando un trapano a mano dotato di una punta di 1,2 mm di diametro (Figura 2I). Due viti in acciaio inox da 6 mm venivano quindi pre-caricate nei fori. della piastra di plastica (Figura 2J). Le viti venivano inserite con un angolo di 90° a una profondità standardizzata di 5 mm con una distanza centro-centro di 12 mm (Figura 2K). Infine, l'incisione cutanea è stata chiusa con suture in nylon 4-0 e la coda è stata nuovamente disinfettata con etanolo al 70% per completare la procedura.

Gestione postoperatoria ed eutanasia

Durante la fase di recupero immediato (Giorno 0), l'animale veniva monitorato ogni 15 minuti e la temperatura rettale veniva mantenuta fino a raggiungere la piena reclinazione sternale e la camminata mirata. Per la valutazione a lungo termine (settimane 1–12), è stato implementato un sistema giornaliero di punteggio basato sul Body Condition Score (BCS), sullo stato di adescamento e sull'attività generale, insieme al monitoraggio giornaliero del sito chirurgico per infezioni o deiscenza. Cibo umido è stato fornito sul pavimento della gabbia durante le prime 48 ore. Il peso corporeo veniva misurato settimanalmente. Gli endpoint umani per l'eutanasia precoce erano definiti severamente come: perdita di peso ≥20%, BCS ≤2,0, persistente incapacità di raggiungere cibo/acqua > 12 ore, segni di dolore intenso/dispnea o gravi complicazioni del sito chirurgico (ad esempio, necrosi). Gli animali che soddisfacevano questi criteri venivano soppressi in modo umano entro 24 ore. Le cure postoperatorie includevano la somministrazione di cefalexina (15 mg/kg) via via endomuscolare subito dopo l'intervento e a 24 ore postoperatorie per prevenire infezioni. Per l'analgesia, il carprofene (2 mg/kg) è stato somministrato sottocutaneamente immediatamente dopo l'intervento e a 12, 24 e 48 ore postoperatorie, per un totale di quattro dosi. A 12 settimane dall'impianto, il ratto è stato soppresso tramite un'overdose di isoflurano. Il segmento dalla seconda alla terza vertebra caudale veniva poi prelevato in blocco e fissato al 70% di etanolo.

Raccomandazioni per la formazione, risoluzione dei problemi e dimensione del campione. Per facilitare l'adozione con successo di questo protocollo impegnativo, i nuovi operatori devono eseguire 3–5 procedure di pratica su cadaveri di ratti, raggiungendo la competenza quando tre posizionamenti consecutivi non mostrano malposizionamento radiografico. La risoluzione comune dei problemi include la pre-misurazione dell'altezza del disco tramite radiografia per ottimizzare la selezione della dimensione della gabbia e la riverifica della piattezza dorsale dell'osso per prevenire la migrazione della gabbia. Se l'acquisto della vite è insufficiente, si consiglia di utilizzare velocità di trapano più basse. Per studi di validazione futuri, si raccomanda una dimensione minima del campione di n = 6-10 per gruppo (con un ulteriore 10–20% per l'attrito) per ottenere una potenza statistica sufficiente. Inoltre, studi futuri devono incorporare gruppi di controllo (ad esempio, gabbia vuota o autoinnesti) per validare le prestazioni del biomateriale.

Analisi radiografica e istologica

La tomografia microcomputerizzata (TC) e la radiografia digitale venivano eseguite utilizzando un sistema di micro-CT con una tensione a tubo di 80 kV e una corrente di 0,1 mA. Durante l'acquisizione è stato utilizzato un filtro in alluminio spesso 1,0 mm per minimizzare gli artefatti di indurimento causati dall'impianto di titanio. Per la valutazione longitudinale, sono state effettuate immagini in vivo a 1 e 4 settimane postoperatorie con una dimensione voxel di 120 μm. L'imaging ex vivo è stato condotto a 12 settimane postoperatorie utilizzando un portacampioni da 24 mm con una dimensione voxel di 24 μm. I dati CT e le immagini radiografiche venivano ricostruiti utilizzando un algoritmo standard di retroproiezione filtrato e analizzati con un visore DICOM. Sono stati definiti criteri quantitativi per valutare l'unione ossea. Radiologicamente, la fusione riuscita è stata confermata quando una struttura trabecolare continua che collega le placche terminali cranica e caudale è stata osservata su almeno tre tagli consecutivi durante la micro-TAC. Durante la segmentazione delle immagini è stata applicata una soglia globale di 700 Unità di Hounsfield (HU). Istamorfometricamente, un rapporto BV/TV pari o superiore al 70% all'interno della gabbia è stato considerato la soglia per il completamento fisico dello spazio e la fusione. Istologicamente, l'unione ossea è stata definita da un ponte osseo completo dal lato cranico a quello caudale senza l'interposizione di tessuto fibroso. Per l'analisi istologica, è stata eseguita una marcatura sequenziale con fluorocromo tramite iniezione sottocutanea di calcina (8 mg/kg) 2 giorni prima dell'eutanasia per identificare la distribuzione spaziale della mineralizzazione attiva al punto terminale di 12 settimane. Le vertebre caudali espulse sono state fissate al 70% di etanolo per 7 giorni e colorate in blocco con una tinta ossea di Villanueva. I campioni sono stati disidratati tramite gradi crescenti di etanolo, incorporati nella resina di metilmetacrilato e sezionati a metà sagittale al centro geometrico preciso della gabbia, come determinato tramite la guida Micro-CT pre-sezionata, utilizzando un microtomo a diamante. Campioni di terra non calcificati (spessore 5 μm) sono stati preparati presso l'Istituto di Istomorfometria Ossea di Ito (Niigata, Giappone). Le immagini venivano acquisite utilizzando un microscopio a campo chiaro e un microscopio laser confocale per la fusione della fluorescenza. Ulteriori esami sono stati eseguiti al microscopio a luce polarizzata e l'analisi istomorfometrica è stata effettuata utilizzando un analizzatore di immagini computerizzato. La Regione di Interesse (ROI) era definita come il volume interno totale della gabbia, escludendo i montanti metallici, ed era suddivisa in ROI intragabbia cranica e caudale. Il tessuto osseo è stato identificato dal colore viola/magenta sotto la colorazione di Villanueva. L'osso lamellare (Lm.V) era definito dalla sua struttura altamente organizzata e parallela a lamelle sotto luce polarizzata, mentre l'osso tessuto (Wo.V) mostrava motivi disorganizzati delle fibre.

Risultati

Peso corporeo (Tabella 1)

Il peso corporeo è stato misurato fino a 12 settimane dopo l'intervento, mostrando un aumento costante (da 221,8 g a 346,8 g), indicando omeostasi fisiologica e supportando indirettamente l'assenza di grave disagio cronico. Ciò è stato confermato da valutazioni multimodali giornaliere che hanno confermato un'attività normale e una guarigione semplice delle ferite.

Ferita (Figura 3

Discussione

Qui è stato stabilito un nuovo modello di fusione intersomiare della spina caudale del ratto. Questo modello prevede l'inserimento di una gabbia in titanio tramite un approccio posteriore arricchito da fissazione a piastra e vite. Successivamente, la formazione ossea intragabbia è stata valutata utilizzando un'analisi istomorfometrica dettagliata. Le caratteristiche distintive di questo modello sono tre: 1) imita da vicino le procedure cliniche di fusione intersomiare lombare posteriore ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4-0 nylon sutures	Natsume	ER-25-30N2
Bright-field microscope	Keyence. (Osaka, Japan)	BZ-X800
Butorphanol	FUJIFILM	021-19001
Calcein	FUJIFILM	76082
Carprofen	FUJIFILM	037-19761
Cefalexin	FUJIFILM	036-11051
Computerized image analyzer	System Supply Co. (Nagano, Japan)	Histometry RT CSS-840
Confocal laser-scanning microscope for fluorescence merging	Carl Zeiss. (Jena, Germany)	LSM 980
Curette	Natsume	E-8-00
Diamond saw microtome	Leica. (Wetzlar, Germany)	SP1600
Electric drill	TAMIYA	N/A	https://www.amazon.co.jp /%E3%82%BF%E3%83% 9F%E3%83%A4-%E3% 82%AF%E3%83%A1% E3%83%8F%E3%83% 88%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%A9%E3% %82%BA-%E5%8B%95%E3% 83%8F%E3%83%B3%E3% %83%87%E3%82%A3% %E3%83%A5%E3%83% %8B%E3%83%89%E3% %83%AB%E7%94%A8%E5% %B7%A5%E5%85%B7/dp/B 01LZ05WWY/ref=sr_1_2?ad grpid=54785347873&dib=eyJ 2IjoiMSJ9.f61YHQv80N0nxws VOdlrIFtTsQoJICvSb4t4rVt97 FEBWkOo4ilX5O2lZH-5vADU HT9CRXO308QpVFqdBNli0C osd4iBSfSzEcKxP9HMX4DhiI S-Qko5ix33W7FjPQqpgTWbj3 CV_vBytnvfqvSyoGN9IB8445o 5Kc0pjeKPG-SRR3Ixpqr2-FT_ ZgUyWstoyQVFTcv_Rq_K4-E OWnuT41BBYtBh757EOAoBe z2lkCd6Psz99wZxfUuvzRUAH Ecq9QV6EmiT9LAY8dYYq08k aLt7Klqx2k-MdV8XbWRxgKk. 7TWzXBGA1PeNmB4me_Cz4 mMFAKBAv5H3YXAw_HPuLd E&dib_tag=se&hvadid=651687 588880&hvdev=c&hvexpln=0& hvlocphy=1009309&hvnetw=g& hvocijid=5538300633798619650 --&hvqmt=e&hvrand=55383006 33798619650&hvtargid=kwd-33 4267191534&hydadcr=4289_13 319726&jp-ad-ap=0&keywords= %E3%82%BF%E3%83%9F%E3% %83%A4+%E9%9B%BB%E5% 8B%95%E3%83%8F%E3%83% B3%E3%83%87%E3%82%A3% %E3%83%89%E3%83%AD%E3% %83%AB&mcid=6b8ff8c984ba3d45 be477b407ef2d1ba&qid=1767395 580&sr=8-2
hand drill	VEAGIA	N/A	https://www.amazon.co.jp/dp/B0D2 9B4W18/ref=sspa_dk_detail_5?pd _rd_i=B0D29B4W18&pd_rd_w=xe kNz&content-id=amzn1.sym.f293b e60-50b7-49bc-95e8-931faf86ed1e &pf_rd_p=f293be60-50b7-49bc-95e8 -931faf86ed1e&pf_rd_r=HPW6B367R QC0VPB7WTTS&pd_rd_wg=E8mAS &pd_rd_r=dbeb0aa7-1bea-4f40-99dd -38bcb05c8234&sp_csd=d2lkZ2V0T mFtZT1zcF9kZXRhaWw&th=1
Medetomidine	FUJIFILM	135-17473
Midazolam	FUJIFILM	135-13791
Pin vise	ANEX	N/A	https://www.amazon.co.jp/%E3%82% A2%E3%83%8D%E3%83%83%E3% 82%AF%E3%82%B9-ANEX-%E3% 83%A9%E3%83%90%E3%83%8B% %E3%83%A5%E3%83%8D%E3% %83%90%E3%82%A4%E3% %82%A4%E3%82%B9%E5%8F% 8E%E7%B4%8D%E5%BC%8F -No-98-R/dp/B000T4D0XQ/ ref=pd_