Screening e validazione assistiti da computer dei farmaci per il dong per febbre e tosse

Sommario

Qui abbiamo costruito una rete multidimensionale di "patologia componente-bersaglio-via-via", integrando screening farmacologico di rete, docking molecolare e convalidazione del modello murino indotto da LPS. Stabilendo parametri chiave chiari, consente l'identificazione efficiente dei componenti attivi della medicina etnica Tong, Lengyuxiao Tang, e la verifica di un processo ripetibile.

Abstract

Per controllare e verificare sistematicamente i componenti attivi nella medicina etnica Dong, Lengyuxiao Tang (LYXT; Sperm Pharbitidis, Verbena officinalis L. e Zingiber officinale Roscoe) per il trattamento di febbre e tosse, questo schema ha istituito un processo metodologico che integra la previsione della farmacologia di rete e la verifica sperimentale. Innanzitutto, utilizzando il database e la piattaforma di analisi farmacologica dei sistemi di medicina tradizionale cinese (TCMSP), con una biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e una somiglianza farmacologica (DL) ≥ 0,18 come criteri, sono stati selezionati i principali componenti attivi di LYXT e sono stati raccolti i bersagli correlati per febbre e tosse da molteplici database di malattie. Successivamente è stata costruita la rete di interazione "componente-bersaglio-malattia" e, attraverso analisi topologiche e l'arricchimento delle vie della Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) tramite l'ontologia genica (GO) e, grazie all'analisi delle vie principali (CYP3A4, POR) e le vie chiave di segnalazione (via MAPK). La tecnologia di aggancio molecolare è stata utilizzata per verificare la capacità di legare componenti chiave ai bersagli centrali. Infine, è stato stabilito un modello murino per bronchite cronica tramite instillazione intranasale di lipopolisaccaridi (LPS), e l'efficacia antinfiammatoria in vivo dei principali componenti attivi previsti è stata verificata. I risultati hanno mostrato che componenti come β-carotene e saparenolo, selezionati dalla farmacologia di rete, hanno mostrato diversi gradi di effetti antinfiammatori negli esperimenti sugli animali, e i loro meccanismi possono comportare l'inibizione della via di segnalazione MAPK/p38. Questo schema fornisce un esempio ripetibile per lo screening e la ricerca sui meccanismi dei componenti attivi nelle medicine etniche tradizionali.

Introduzione

La medicina Dong è un sistema etnomedico all'interno della Medicina Tradizionale Cinese (MTC), praticato dal gruppo etnico Dong in Guizhou, Hunan e Guangxi. Rappresenta la loro conoscenza empirica cumulativa, sviluppata nel corso delle generazioni. Questo sistema integra erboristica, agopuntura, fissazione ossea, massaggi, terapia dietetica e pratiche spirituali. Le sue caratteristiche distintive derivano dall'isolamento geografico storico del gruppo e dalla tradizione orale, che favorirono una farmacopea unica, basata sulla pratica, adattata all'ambiente locale e alle credenze culturali.

La febbre persistente, una condizione che si sviluppa quando il corpo non riesce a controllare la temperatura, è un segno che il corpo è disfunzionale e una funzione vitale di autoprotezione nelle cellule^umane. Esistono molti metodi diversi per il trattamento dei medicinali riscaldanti della nazionalità Dong. Tra queste, la febbre è classificata in febbre interna e febbre esterna. La febbre interna si riferisce al calore causato da malattie interne, mentre la febbre esterna si riferisce al calore generato dal freddo o dal trauma². La febbre esogena di solito influisce sulla funzione^{gastrointestinale 3}. I medici nazionali di Dong usano la terapia antipiretica per il raffreddore per trattare la febbre. Tra le varie prescrizioni di medicinali Dong, Lengyuxiao Tang (LYXT) è una decoction standard usata per febbre e dolore, composta da Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. e Zingiber officinale Roscoe, che vengono costantemente martellate e mescolate con^{acqua 4}. Viene utilizzato principalmente per febbre e mal di testa causati da un raffreddore.

Tuttavia, i componenti attivi di LYXT e i loro meccanismi molecolari sottostanti restano poco compresi. Per colmare questa lacuna, il presente studio ha utilizzato un approccio di farmacologia di rete per prevedere i potenziali ingredienti attivi e bersagli. Per convalidare queste previsioni, è stato selezionato un modello murino ben consolidato indotto da lipopolisaccaridi (LPS) di infiammazione polmonare, poiché imita le principali risposte infiammatorie associate a febbre e tosse, inclusa l'infiltrazione leucocitaria e la produzione di citochine pro-infiammatorie.

Nel processo di scoperta dei farmaci, vari studi hanno rivelato che i composti possono interagire con più bersagli proteici. Pertanto, il paradigma "un farmaco, un bersaglio biologico" si sta spostando verso un paradigma della farmacologia dei sistemi. Un composto che interagisce con diverse proteine biologiche bersaglio di virus o batteri può fornire effetti farmacologici^{utili 5}. L'analisi farmacologica di rete è un modo praticabile e potente per mitigare il costoso e lungo processo di scoperta dei farmaci. Può aiutarci a comprendere meglio le interazioni tra farmaci, prevedere i meccanismi che causano la malattia, suggerire farmaci alternativi per gli effetti farmacologici desiderati senza effetti collaterali e prevedere le bioattività della medicina tradizionale. Approcci chemoinformatici, docking molecolare e modellizzazione derivata dai dati sono stati applicati con successo per prevedere le bioattività e analizzare i meccanismi. Questi metodi facilitano la rapida scoperta di composti antivirali e antibatterici con potenziale clinico, e questi approcci vengono utilizzati anche per spiegare l'efficacia e gli effetti avversi dei^{farmaci 6}. Ad esempio, il mesilato di imatinib, una piccola molecola, è un inibitore dell'agente causale nella leucemia mieloide cronica, la proteina di fusione Bcr-Abl, ma blocca anche l'attività di diverse tirosina chinasi come Abl, Kit e PDGFR⁷. Pertanto, la ricerca sull'identificazione dei farmaci e dei loro bersagli è ancora cruciale per il potenziale trattamento delle malattie, il che ci aiuta a comprendere i meccanismi con cui i composti farmaceutici agiscono per trattare le malattie a livello molecolare. Gli approcci di modellazione computazionale e analisi di reti possono selezionare con precisione potenziali farmaci e bersagli, mentre l'analisi moltiplicativa delle interazioni può fornire una base teorica e una guida pratica per la verifica sperimentale. In questo articolo, utilizzando uno strumento di ricerca per il ripreso dei geni/proteine interagenti (STRING), il database per annotazione, visualizzazione e scoperta integrata (DAVID) e altri database, combinati con l'analisi dinamica dell'ontologia genica (GO) e l'analisi delle vie di percorso, sono stati raccolti i dati riguardanti gli ingredienti attivi e le proteine d'azione correlate del medicinale Dong LYXT per febbre e tosse, ed è stato esplorato il meccanismo del trattamento combinato degli ingredienti attivi, che può fornire un riferimento teorico specifico per ulteriori ricerche sul medicinale Dong LYXT, fornisce una strategia riproducibile per esplorare i meccanismi farmacologici delle formule etnomedicinali e offre spunti sullo sviluppo di nuovi agenti antinfiammatori.

Protocollo

Il programma di sperimentazione animale è stato esaminato dal Comitato Etico Sperimentale sugli Animali dell'Università di Lanzhou (D2024-292). Essa rispetta i principi di protezione animale, benessere animale ed etica, nonché le disposizioni rilevanti dell'etica nazionale sperimentale del benessere animale.

1. Preparazione del database e del software

1. Screening degli ingredienti attivi e raccolta dei geni bersaglio
   1. Accedi al database e alla piattaforma di analisi farmacologica del sistema TCM (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) ed effettua ricerche separate utilizzando i nomi latini di ogni erba nella formulazione LYXT, ovvero Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. e Zingiber officinale Roscoe, come parole chiave per recuperare tutti i composti chimici associati a ciascuna erba.
   2. Applicare i criteri di screening per filtrare i composti recuperati per ogni erba come segue: per Verbena officinalis L., impostare la biodisponibilità orale (OB) ≥ 30,1% e la somiglianza farmacologica (DL) ≥ 0,12; per Zingiber officinale Roscoe, fissare OB ≥ 60% e DL ≥ 0,13; per Sperm Pharbitidis, fissare OB ≥ 16,93% e DL ≥ 0,50. Successivamente, unisci le liste di composti filtrate di tutte e tre le erbe e rimuovi le voci duplicate basate su identificatori TCMSP unici per generare la lista finale dei composti attivi in LYXT.
   3. Esporta tutte le proteine target associate a questi composti attivi dal database TCMSP come una tabella contenente identificatori di composti e nomi delle proteine target, poi importa questa lista di proteine target nel database UniProt (https://www.uniprot.org/).
   4. Utilizzare lo strumento di mappatura UniProtKB ID per convertire tutti i nomi delle proteine target in simboli genici umani ufficiali con il set di direzione di mappatura dal nome della proteina al nome del gene, e rimuovere eventuali voci prive di un simbolo genetico valido per generare la lista finale dei geni target associati ai componenti attivi di LYXT.
2. Raccolta dei geni target per malattie e analisi di sovrapposizione
   1. Scarica geni correlati a febbre e tosse dal database GeneCards (www.genecards.org) cercando separatamente con le parole chiave "febbre" e "tosse", conserva geni con punteggio di rilevanza ≥ 5 e unisci i risultati di entrambe le ricerche all'interno del database.
   2. Scarica i geni correlati a febbre e tosse dal database terapeutico target (TTD) (db.idrblab.net/ttd) cercando separatamente con le parole chiave "febbre" e "tosse", scarica tutti i geni target associati e unisci i risultati di entrambe le ricerche all'interno del database.
   3. Scarica geni correlati a febbre e tosse dal database PharmGkb (www.pharmgkb.org) cercando separatamente con le parole chiave "febbre" e "tosse", scarica tutti i geni associati e unisci i risultati di entrambe le ricerche all'interno del database.
   4. Scarica geni correlati a febbre e tosse dal database Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (www.omim.org) cercando separatamente con le parole chiave "febbre" e "tosse", scarica tutti i geni associati e unisci i risultati di entrambe le ricerche all'interno del database.
   5. Scarica geni correlati a febbre e tosse dal database DrugBank (go.drugbank.com)⁸ cercando separatamente con le parole chiave "febbre" e "tosse", scarica tutti i geni associati e unisci i risultati di entrambe le ricerche all'interno del database.
   6. Unire le liste geniche ottenute da tutti e cinque i database in un unico elenco completo e rimuovere simboli genici duplicati per generare l'elenco finale dei geni target di malattie correlate a febbre e tosse.
   7. Confronta la lista dei target della malattia dello step 1.2.6 con la lista dei geni target della componente attiva LYXT dello step 1.1.4 per selezionare i geni sovrapposti comuni a entrambe le liste, ed esportare questa lista genica sovrapposta come file CSV.
3. Conversione ID e analisi della sezione trasversale
   1. Carica la lista dei geni sovrapposti dello step 1.2.7 nell'ambiente R e accedi al sito web di DAVID (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp).
   2. Carica la lista genica sovrapposta su DAVID con la specie impostata su Homo sapiens e il tipo di lista impostata su simbolo genico, poi esegui lo strumento di annotazione funzionale per eseguire l'analisi della sezione drettivale.
   3. Converti gli ID dei simboli delle proteine intersecanti in ID di ensemble utilizzando la funzione di conversione dell'ID genico all'interno di DAVID, con la direzione di conversione impostata dal simbolo del gene all'ID dell'ensemble.
   4. Esporta la lista degli ID dell'ensemble convertita insieme ai simboli genici originali come file CSV per l'analisi di arricchimento a valle.

2. Screening degli ingredienti attivi vitali e delle proteine target

1. Costruzione di reti compound-target
   1. Carica la lista dei geni intersecanti dal passo 1.2.7 e la lista dei geni target dei componenti attivi LYXT dal passo 1.1.4 nell'ambiente R, poi esegui un'analisi di confronto per identificare i composti associati sia ai geni target che a quelli intersecanti.
   2. Importare i dati della relazione composto-bersaglio in Cytoscape versione 3.8.1 e generare il diagramma della rete "LYXT-Fever and cough-target" per visualizzare le interazioni tra i principi attivi e i loro target associati.
2. Acquisizione dati di interazione proteina-proteina
   1. Importare il file gene ID per l'intersezione tra i bersagli di principio attivo LYXT e i bersagli per febbre e tosse ottenuti nel passo 2.1.1 nel database STRING a https://stringdb.org/, selezionare Homo sapiens come specie e più proteine come metodo di elaborazione dati.
   2. Filtrare le interazioni proteina-proteina impostando la soglia di confidenza a ≥ 0,90 e isolare proteine con correlazione molto bassa, quindi generare un file TSV contenente i dati di interazione filtrati per l'analisi a valle.
3. Conferma dell'analisi dell'intersezione
   1. Utilizzare il linguaggio R per analizzare l'intersezione tra le proteine target dei principi attivi e le proteine target di febbre e tosse, confermando il set genetico sovrapposto identificato nel passo 1.2.7.
   2. Preparare questo set genico sovrapposto confermato per la successiva analisi della rete di interazione proteina-proteina (PPI).

3. Screening delle proteine target chiave

1. Visualizzazione della rete PPI
   1. Importa i dati di interazione filtrati dal passo 2.2.2 in Cytoscape versione 3.8.1 e usa lo strumento di visualizzazione della rete per disegnare il diagramma di rete PPI.
   2. Installa e apri il plugin CytoNCA all'interno di Cytoscape, poi usa questo plugin per eseguire un'analisi topologica calcolando i seguenti parametri per ciascun nodo della rete: centralità di grado (DC), centralità di intermedietà (BC), centralità di vicinanza (CC), centralità degli autovettori (EC), centralità di rete (NC) e connettività media locale (LAC).
2. Identificazione delle proteine target chiave tramite screening basato su mediana
   1. Esporta la tabella dei parametri topologici calcolati da CytoNCA come file CSV contenente tutti gli identificatori dei nodi e i relativi valori DC, BC, CC, EC, NC e LAC.
   2. Calcola il valore mediano della centralità dei gradi (DC) su tutti i nodi della rete e identifica tutti i nodi con DC superiore al doppio del valore mediano.
   3. Calcola i valori mediani per la centralità di vicinanza (CC) e la centralità tra le vicinate (BC) su tutti i nodi della rete, poi, dai nodi identificati nel passo 3.2.2, conserva solo quei nodi che soddisfano simultaneamente CC superiore al valore mediano e BC superiore al valore mediano, seguendo l'approccio di screening descritto da Kibble et ^al.9.
3. Compilazione finale dei target chiave
   1. Compila gli identificatori dei nodi ritenuti dal passaggio 3.2.3 in un elenco delle proteine target chiave ed esporta questo elenco come file CSV.
   2. Applicare questa regola di screening basata sulla mediana (DC superiore al doppio della mediana, CC maggiore della mediana e BC maggiore della mediana) come unico criterio per l'identificazione dei bersagli chiave in tutto il manoscritto, garantendo la coerenza con l'approccio di screening unificato stabilito nel protocollo.

4. Analisi dell'arricchimento GO e analisi delle vie KEGG

1. Analisi dell'arricchimento funzionale utilizzando il database DAVID
   1. Seguendo il metodo descritto da Tanabe et ^al.10, carichi la lista genica intersecante dal passaggio 1.3.4 in formato di simbolo genico nel database DAVID a https://david.ncifcrf.gov/, imposta la specie su Homo sapiens e il tipo di lista su simbolo genico.
   2. Eseguire analisi di arricchimento GO selezionando GOTERM_BP_DIRECT per il processo biologico, GOTERM_CC_DIRECT per la componente cellulare e GOTERM_MF_DIRECT per la funzione molecolare, e eseguire l'analisi di arricchimento delle vie KEGG selezionando KEGG_PATHWAY.
   3. Imposta la soglia di significatività a p < 0,05 e applica la correzione del tasso di false discovery (FDR) di Benjamini-Hochberg per test multipli, poi scarica i risultati dell'arricchimento come file CSV contenenti nomi di termini, conteggio genico, valori p, valori p adeguati FDR e geni associati.
2. Generazione di grafici a bolla utilizzando la piattaforma cloud OmicShare
   1. Importare i risultati dell'arricchimento GO dal passaggio 4.1.3 nella piattaforma cloud OmicShare al https://www.omicshare.com/tools e selezionare lo strumento GO enrichment bubble chart.
   2. Carica il file dei risultati contenente nomi di termini, conteggio genico e valori p, poi configura lo strumento per mostrare i primi 20 termini con i valori p più bassi.
   3. Imposta l'asse x per rappresentare il rapporto di arricchimento, l'asse y per elencare i termini GO, la dimensione della bolla per rappresentare il numero di geni e il colore della bolla per rappresentare il valore p.
   4. Genera il grafico delle bolle e scaricalo come file immagine ad alta risoluzione.
3. Visualizzazione dei percorsi KEGG usando KEGG mapper
   1. Ordinare i risultati dell'arricchimento dei percorsi KEGG per valore p in ordine crescente e selezionare i primi 20 percorsi con i valori p più piccoli.
   2. Per ogni percorso selezionato, accedi al database KEGG a https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html per ottenere il diagramma del percorso.
   3. Identificare le proteine target dalla lista genica intersecante presenti in ciascuna via incrociando i parametri con i set geni delle vie a partire dai risultati dell'arricchimento.
   4. Accedi allo strumento KEGG mapper a https://www.kegg.jp/kegg/mapper/, seleziona la funzione Color Pathway , inserisci la lista dei simboli genici che si intersecano e l'identificatore del percorso KEGG, e genera un diagramma dei percorsi codificati a colori con le proteine target identificate evidenziate in rosso.
   5. Compilare tutti gli output dell'analisi di arricchimento, inclusi i file CSV di arricchimento GO per tre categorie, il file CSV di arricchimento dei percorsi KEGG, l'immagine del diagramma a bolle e i diagrammi dei percorsi codificati a colori per i primi 20 percorsi, poi esportare questi file per l'analisi a valle.

5. Verifica dell'aggancio molecolare

1. Scarica le strutture 3D delle proteine vitali (come CYP3A4 e POR identificate come target chiave nell'analisi della rete) dal database RCSB PDB a https://www.rcsb.org/, selezionando strutture con risoluzione ≤ 2,5 Å da Homo sapiens che contengono un ligando co-cristallizzato per definire il sito attivo, e scarica i file di dati strutturali dei composti attivi (incluso il beta-carotene, spathulenolo e beta-sitosterolo) dal database PubChem in formato SDF.
2. Preparare le strutture proteiche usando AutoDockTools rimuovendo molecole d'acqua e il ligando co-cristallizzato, aggiungendo idrogeni polari e assegnando cariche di Gasteiger, quindi salvare le proteine preparate in formato PDBQT, convertire i file SDF del composto in formato PDB usando Open Babel, rilevare i legami rotabili per ogni ligando in AutoDockTools e salvare i liganti in formato PDBQT.
3. Definire la scatola della griglia di attracco con dimensioni di 60 × 60 × 60 Å centrate sulle coordinate del sito di legame del ligando co-cristallizzato, poi eseguire l'aggancio molecolare usando AutoDock Vina con esaustività impostata a 8 e num_modes impostata a 10 per generare 10 pose di legame per ogni coppia ligando-proteina.
4. Importare i file di docking risultanti e i relativi file target in PyMOL, identificare e salvare il modello di docking con l'energia di legame più bassa (valore più negativo) come posa rappresentativa.
5. Successivamente, invia questo modello al database PLIP a https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ per analizzare le interazioni tra le piccole molecole e le proteine, inclusi legami idrofobi, interazioni idrofobe, π-stacking e ponti salini.
6. Calcola e compila le energie di legame di tutti i componenti attivi in LYXT contro le proteine target associate a febbre e tosse, quindi genera una tabella riassuntiva contenente i nomi dei composti, le proteine bersaglio, le energie di legame (kcal/mol) e i principali tipi di interazione da presentare nella sezione risultati.
   NOTA: Lo script R utilizzato per l'analisi della farmacologia di rete è disponibile nel File Supplementare 1.

6. Esperimento animale

1. Linea temporale sperimentale
   1. Acclimatare gli animali per 1 settimana, poi eseguire la somministrazione di LPS o soluzione salina al giorno 0, somministrare trattamenti farmacologici giornalieri dal giorno 7 al giorno 20 per 2 settimane ed eseguire l'eutanasia con raccolta del campione al giorno 21.
2. Acquisizione e raggruppamento degli animali
   1. Acquista 60 maschi adulti C57BL/6 topi del peso di 25 ±± 4 g, dai da mangiare ai topi per 1 settimana, poi dividili casualmente in un gruppo fisiologico normale (6 topi) e un gruppo lesionato LPS (54 topi).
   2. Il giorno 7 prima dell'inizio del trattamento, si suddivide casualmente il gruppo lesionato LPS in sette sottogruppi con 6 topi ciascuno: gruppo modello, gruppo positivo (desametasone, 50 mg·^kg-1·^d-1), gruppo trattamento LYXT (200 mg·^kg-1·^d-1), gruppo beta-carotene (50 mg·^kg-1·^d-1), gruppo spatoluleno (50 mg·^kg-1·^d-1), e gruppo beta-sitosterolo (50 mg·^kg-1·^d-1).
      NOTA: La somministrazione del trattamento e le valutazioni degli esiti sono state cieche.
3. Modello di infiammazione polmonare indotta da LPS
   1. Somministrare il 2% di pentobarbital sodio tramite iniezione intraperitoneale a una dose di 60 mg/kg per anestesia. Confermare una profondità moderata dell'anestesia in assenza di una risposta di pizzicamento della coda. Infine, sulla base del peso corporeo registrato, calcola il volume di iniezione richiesto di LPS a una concentrazione di 10 mg/mL.
   2. Preparati per l'amministrazione nasale prelevando il volume calcolato con precisione della soluzione LPS nella pipetta. Tieni saldamente il topo afferrando la base della coda con la mano destra, mentre con il pollice e l'indice della mano sinistra si fissa delicatamente la testa vicino alle orecchie.
   3. Espelle lentamente il liquido finché non si forma una piccola goccia (circa 2 μL) sulla punta della pipetta. Avvicina con attenzione la goccia alla narice destra del topo finché non entra in contatto. Immediatamente e rapidamente solleva la mano sinistra di 30–40 cm, poi riporta delicatamente la mano e il topo nella posizione iniziale.
      NOTA: È necessario prestare attenzione alle narici del topo per mantenere lo stato verso l'alto.
   4. Usa lo stesso metodo per iniettare piccole gocce liquide nella narice sinistra del topo, aggiungendole successivamente alle narici sinistra e destra fino al completamento dell'infusione.
   5. Poi lascia andare il mouse, fissare il mouse sulla tavola con del nastro adesivo e mantenere la posizione con l'addome sollevato e la testa sollevata per più di 4 ore. Dopo che il topo si sveglia, lo rimetti nella gabbia per l'osservazione, seguendo il metodo descritto da Lorenz et ^al.11.
4. Raccolta del liquido di lavaggio broncoalveolare
   1. Separare casualmente i topi del gruppo lesionato da LPS in sette gruppi: gruppo di controllo negativo, gruppo modello, gruppo positivo (desametasone, 50 ^mg.kg-1.d-1), gruppo trattamento LYXT (200 ^mg.kg-1.d-1), gruppo beta-carotene (50 ^{mg.kg-1.d-1),} gruppo spatoluleno (50 ^mg.kg-1.d-1) e gruppo beta-sitosterolo (50 ^{mg.kg-1.d-1),} con sei topi in ciascun gruppo.
      NOTA: Prepara LYXT come segue: Mescola Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L. e Zingiber officinale Roscoe in polvere di massa di 5:3:2.  Mescola la polvere con acqua a 1:30 (g/mL) e il reflusso a 80 °C per 2 ore. Filtrare e concentrare la soluzione (30 °C, 0,01–0,08 MPa) e scioglierla in acqua per preparare una soluzione da 2 g/mL. Beta-carotene, beta-sitosterolo e spatolulenolo sono stati utilizzati come standard di riferimento per la validazione sperimentale. Somministrare i farmaci a ogni gruppo una volta al giorno per 2 settimane, a partire da una settimana dopo il trattamento LPS. Eutanasiare gli animali con un'overdose di tiopentalo (100 mg/kg), secondo Jin et ^al.12.
   2. Intubare il ventricolo con una cannula n. 23. Successivamente, iniettare lentamente 10 mL di PBS nel tessuto polmonare sotto una pressione di 25 cm H₂O, e ripetere questo lavaggio circa 6 volte per ottenere il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF), seguendo il metodo descritto da Pinheiro et ^al.13.
5. Analisi di leucociti e citochine in BALF e siero
   1. Centrifugare il BALF raccolto a 500 × g per 10 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS, diluire 1:10 con tripan blu e contare i leucociti totali usando un emocitometro al microscopio luminoso a un ingrandimento del 400×.
   2. Raccogli il supernatant BALF e i campioni di siero da puntura cardiaca.
   3. Misurare le concentrazioni di TNF-α, IL-1β e IL-18 utilizzando kit ELISA commerciali secondo le istruzioni del produttore, leggendo l'assorbanza a 450 nm con un lettore di microplacche e calcolando le concentrazioni da curve standard. Determinare la concentrazione proteica nel BALF utilizzando il saggio BCA.
6. Validazione dei componenti attivi tramite analisi HE e WB
   1. Per identificare i componenti attivi che contribuiscono all'efficacia di LYXT, ristabilire il modello di infiammazione polmonare indotta da LPS seguendo la sezione 6.3.
   2. Acquista 60 topi, acclimata per una settimana e dividi casualmente in cinque gruppi (n = 12 ciascuno): gruppo modello, gruppo LYXT (200 mg·^kg-1·^d-1), gruppo beta-carotene (50 mg·^kg-1·^d-1), gruppo spatoluleno (50 mg·^kg-1·^d-1) e gruppo combinato (25 mg·^kg-1·^d-1 ciascuno).
   3. Somministrare LPS al giorno 0 e trattamenti dal giorno 7 al giorno 20 come descritto nel passo 6.3. Al giorno 21, raccolta del tessuto^{polmonare 14}.
7. Analisi istologica
   1. Fissare il lobo superiore del polmone sinistro con paraformaldeide al 4% per 24 ore, immergersi nella paraffina, tagliare sezioni da 5 μm ed eseguire colorazioni di ematossilina ed eosina (HE).
   2. Esaminare le sezioni al microscopio ottico con ingrandimenti del 200× e 400× per valutare l'infiltrazione cellulare infiammatoria e l'ispessimento della parete alveolare. Cattura immagini rappresentative.
8. Analisi del western blot
   1. Omogeneizzare il tessuto polmonare con un tampone di radioimmunoprecipitazione (RIPA) con inibitori di proteasi e fosfatasi. Centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C e determinare la concentrazione proteica utilizzando il saggio dell'acido bicinconinico (BCA).
   2. Carica 30 μg di proteine per pozzo sui gel di elettroforesi gel dodecil solfato di sodio-poliacrilammide (SDS-PAGE), trasferisci nelle membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) e blocca con il 5% di latte scremato.
   3. Incubare con anticorpi primari contro p-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18 e β-actin durante la notte a 4 °C, poi con anticorpi secondari coniugati con HRP.
      NOTA: La diluizione degli anticorpi è fornita nella Tabella dei Materiali.
   4. Visualizza le bande usando substrato ECL, cattura immagini e quantifica le intensità usando ImageJ. Normalizza l'espressione della proteina bersaglio in β-actina o p38 totale.

Risultati

Il database TCMSP è stato utilizzato per raccogliere 409 ingredienti attivi di LYXT. Tra questi, 58 ingredienti provenivano da Verbena officinalis L., 86 da Semen Pharbitidis e 265 ingredienti attivi provenivano da Zingiber officinale Roscoe. Ventisei principi attivi chiave sono stati selezionati secondo l'indice: OB ≥ 30,1% e DL ≥ 0,12 per Verbena officinalis L., OB ≥ 60%, DL ≥ 0,13 per Zingiber officinale Roscoe, OB ≥ 16,93% e DL ≥ 0,50 per Sperm Pha...

Discussione

Questo articolo ha identificato con successo 26 ingredienti attivi e 207 potenziali bersagli di LYXT, una decoction tradizionale di medicina Dong usata per febbre e tosse. I risultati chiave includono l'identificazione di CYP3A4 come proteina bersaglio critica tramite analisi topologica della rete e la validazione sperimentale di LYXT, beta-carotene e spatolulenolo come composti attivi con effetti antinfiammatori significativi in un modello di infiammazione polmonare indotta da LPS. Ques...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-IL-18	Proteintech, Wuhan, Cina	27095-1-AP	Coniglio policlonale, 1:500
Anti-IL-1 e beta;	Proteintech, Wuhan, Cina	66737-1-IG	Monoclonale per topo, 1:500
Anti-p38	Proteintech, Wuhan, Cina	14064-1-AP	Coniglio policlonale, 1:1000
Anti-p-p38	Proteintech, Wuhan, Cina	28796-1-AP	Coniglio policlonale, 1:1000
Anti-TNF-& alpha;	Proteintech, Wuhan, Cina	80258-6-RR	Coniglio monoclonale, 1:500
Anti-β-actin	Proteintech, Wuhan, Cina	66009-1-IG	Monoclonale di topo, 1:2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	Versione 1.5.6	Software di docking molecolare
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	Versione 1.5.6	Strumento di preparazione dell'aggancio molecolare
Kit per il test proteico BCA	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	23225	Per la determinazione della concentrazione di proteine
Beta-carotene	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	83-46-5	Standard di alta purezza, >95%
Beta-sitosterolo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	83-46-5	Standard di alta purezza, >95%
Mouse C57BL/6	Centro Medico per Animali dell'Università di Lanzhou  	-	Maschio adulto, 25 anni e plus; 4 g
Cytoscape	https://cytoscape.org/	Versione 3.8.1	Software per la visualizzazione e l'analisi delle reti
Desametasone	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D4902	Controllo positivo
Substrato ECL	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	WBKLS0500	Per il rilevamento del Western blot
Kit ELISA
GraphPad Prism	https://www.graphpad.com/	Versione 8.0 o superiore	Software per analisi statistica e grafica
Ematossilina ed eosina (H&; E) Kit per la Tintura	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pechino, Cina	G1120	Per la colorazione del tessuto polmonare
Istologia
Anti-topo coniugato con HRP	Proteintech, Wuhan, Cina	SA00001-7G	Anticorpo secondario, 1:5000
Anti-coniglio coniugato con HRP	Proteintech, Wuhan, Cina	SA00001-7H	Anticorpo secondario, 1:5000
IL-18 ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pechino, Cina	SEKH-0016	Per misurare l'IL-18 nel BALF e nel siero
IL-1 e beta; ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pechino, Cina	SEKM-0004	Per la misurazione di IL-1 e beta; nel BALF e nel siero
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	Versione 1.53	Software per l'analisi delle immagini
Lipopolisaccaride (LPS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L2630	Da   Escherichia coli  O111:B4
Materie Prime LYXT	Università di Huaihua	-	Miscela in polvere di  Pharbitis nil  (L.) Scelta,   Verbena officinalis L., and  Zingiber officinale  Roscoe (5:3:2, pa/l/l)
Altri materiali
Pentobarbital sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P3761	Soluzione al 2% per l'anestesia
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	Profilatore di interazione proteina-ligando
Membrane PVDF	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	IPVH00010	Per il trasferimento di Western Blot
PyMOL	https://pymol.org/	Versione 2.5	Software di visualizzazione molecolare
R	https://www.r-project.org/	Versione 4.0 o superiore	Software di calcolo statistico e grafica
Spathulenolo	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-N1205	Standard di alta purezza, >95%
STRING	https://stringdb.org/	-	Strumento di ricerca per il recupero di geni/proteine interagenti
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	Database dei Sistemi di Farmacologia della Medicina Tradizionale Cinese
Tiopentalo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T102	Per l'eutanasia
TNF-α ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pechino, Cina	SEKM-0034	Per misurare TNF-&alfa; nel BALF e nel siero
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	Database di sequenze e annotazioni proteiche