Articolo metodologico

Imaging in tempo reale della risposta allo stress indotto dall'ospite negli aggregati di Pseudomonas aeruginosa

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DOI:

10.3791/70682

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15 maggio 2026

 , 
1Department of Molecular Medicine, University of South Florida

In questo articolo

Sommario

Gli aggregati di Pseudomonas aeruginosa mostrano una maggiore tolleranza agli antibiotici e alle cellule immunitarie. Il ruolo dell'integrità della membrana nella sopravvivenza degli aggregati è attualmente poco esplorato. Questo studio dimostra un metodo per quantificare i cambiamenti nella dinamica della membrana cellulare all'interno degli aggregati di P. aeruginosa, al fine di comprendere come l'integrità cellulare possa influenzare la vitalità complessiva degli aggregati.

Abstract

Le infezioni croniche come quelle della fibrosi cistica (FC) sono sostenute da piccoli aggregati di Pseudomonas aeruginosa altamente tolleranti che persistono nonostante le pressioni immunitarie e terapeutiche. A differenza dei biofilm classici, questi aggregati rappresentano un'unità patogenica distinta: comunità su scala microscopica, spazialmente organizzate, che mantengono integrità strutturale e omeostasi fisiologica sotto stress indotto dall'ospite. Tuttavia, i meccanismi che permettono agli aggregati di rimanere intatti in queste condizioni, e se questi processi omeostatici possano essere selettivamente interrotti, restano poco definiti. Un ostacolo chiave per colmare questa lacuna è stata la mancanza di strumenti in grado di catturare i processi dinamici e spazialmente risolti che collegano lo stress fisiologico alla stabilità strutturale e al collasso in tempo reale. Questo studio presenta un flusso di lavoro integrato di imaging e analisi per quantificare le risposte aggregate agli stress rilevanti per l'ospite. Utilizzando il colorante sensibile alla tensione DiBAC4(5), la depolarizzazione della membrana è stata monitorata come indicatore precoce di una rottura fisiologica all'interno degli aggregati formati nel mezzo sintetico per la fibrosi cistica dell'esputo. La microscopia confocale time-lapse ad alta risoluzione consente la visualizzazione degli aggregati sia in stati stabili che indotti da stress, mentre la segmentazione dell'immagine e l'analisi basata su voxel forniscono una mappatura quantitativa dell'eterogeneità spaziale nell'integrità della membrana e dello smontaggio degli aggregati a risoluzione di singola cella. Questo flusso di lavoro stabilisce una piattaforma riproducibile e adattabile per collegare lo stress fisiologico agli esiti strutturali negli aggregati batterici multicellulari. Consentendo la dissezione quantitativa dei processi che preservano – o compromettono – l'integrità degli aggregati, questo approccio fornisce una base fondamentale per identificare e mirare ai meccanismi omeostatici che sostengono la resilienza degli aggregati, promuovendo nuove strategie per interrompere questa modalità clinicamente significativa di persistenza batterica.

Introduzione

Le infezioni batteriche croniche sono spesso sostenute non da grandi biofilm attaccati alla superficie, ma da piccoli aggregati multicellulari che si formano all'interno degli ambienti associati all'ospite. Nella fibrosi cistica (FC) e in altre malattie croniche delle vie aeree, Pseudomonas aeruginosa esiste comunemente come aggregati sospesi incastrati nel muco o nell'expectorato, piuttosto che come biofilm classici attaccati alle superfici epiteliali. Questi aggregati rappresentano una modalità di crescita distinta, caratterizzata da un'organizzazione spaziale su scala micrometrica, una marcata eterogeneità fisiologica e un'eccezionale tolleranza agli stressori immunitari e antimicrobici 1,2,3,4. Nonostante la loro rilevanza clinica, i meccanismi che regolano la stabilità aggregata, che in questo protocollo è definita come la capacità di mantenere l'integrità della membrana e l'organizzazione spaziale sotto tali stressori, restano poco compresi, con studi precedenti che si concentrano maggiormente sui componenti della matrice che supportano la formazione di biofilm attaccati alla superficie 5,6.

Un ostacolo importante allo studio degli eventi che contribuiscono alla destabilizzazione degli aggregati, come i cambiamenti nella depolarizzazione delle membrane e nell'architettura degli aggregati, è la mancanza di flussi di lavoro sperimentali che catturino in tempo reale cambiamenti fisiologici e strutturalidinamici 7,8. I tradizionali saggi di massa e gli approcci di imaging finale non possono risolvere come emergano le risposte allo stress all'interno degli aggregati, come queste risposte siano distribuite spazialmente, o come l'indebolimento fisiologico, come la depolarizzazione della membrana e la perdita dell'omeostasi ionica, si traduca in segni precoci di stress cellulare e eventuale collasso fisico. Sebbene la microscopia confocale sia stata ampiamente applicata ai biofilm attaccati alla superficie, meno approcci integrano l'imaging risolto nel tempo con analisi quantitativa che collega direttamente la fisiologia cellulare all'architettura aggregata e all'attività delle membrane.

I cambiamenti nel potenziale della membrana batterica forniscono un indicatore precoce e sensibile dello stress cellulare e della perdita dell'omeostasi. I coloranti sensibili alla tensione come il bis-(acido 1,3-dibutilbarbiturico) pentametina oxonolo (DiBAC4(5)) si accumulano nelle cellule depolarizzate e offrono una lettura non distruttiva basata sulla fluorescenza dell'integrità della membrana. Sebbene i coloranti DiBAC siano stati utilizzati per valutare la depolarizzazione della membrana in colture planctoniche e biofilm attaccati alla superficie 9,10, la loro applicazione ad aggregati multicellulari, in particolare in condizioni di crescita fisiologicamente rilevanti e nell'imaging time-lapse, è stata limitata.

Qui presentiamo un flusso di lavoro integrato di imaging e analisi che consente la visualizzazione e la quantificazione in tempo reale della depolarizzazione della membrana e del cedimento strutturale negli aggregati di P. aeruginosa. Gli aggregati si formano nel mezzo sintetico per la fibrosi cistica dell'espetto (SCFM2), un mezzo chimicamente definito che riproduce caratteristiche nutrizionali e ioniche chiave delle vie aeree della fibrosi cistica e supporta la formazione spontanea di aggregati senza superfici imposte o flusso11,12. In queste condizioni, P. aeruginosa forma aggregati sospesi di dimensioni ed eterogeneità strutturale comparabili a quelli osservati nei campioni di esputo e vie aeree di CF, fornendo una piattaforma fisiologicamente rilevante per lo studio del comportamentoaggregato 13.

Utilizzando microscopia laser confocale a tempo di tempo sotto temperatura e umidità controllate, questo flusso di lavoro cattura sia stati aggregati stabili sia stati indotti dallo stress caratterizzati da una maggiore depolarizzazione della membrana e dalla perdita dell'omeostasi cellulare su lunghi periodi di imaging. Combinando la segnalazione del potenziale di membrana basata su DiBAC con l'imaging z-stack ad alta risoluzione, questo metodo consente la quantificazione della fluorescenza DiBAC₄(5) a livello di singola cella, con valori mappati e analizzati nel contesto spaziale di aggregati individuali. La segmentazione dell'immagine a valle e l'analisi superficiale basata su voxel permettono di quantificare in parallelo cambiamenti nell'architettura aggregata e nella depolarizzazione della membrana.

È importante sottolineare che, sebbene questo protocollo venga dimostrato utilizzando aggregati di P. aeruginosa formati in SCFM2, il flusso di lavoro è ampiamente generalizzabile. La strategia di imaging, la lettura fisiologica basata su coloranti e il quadro analitico possono essere facilmente adattati ad altre specie batteriche, mezzi che favoriscono aggregati e fattori di stress, inclusi agenti antimicrobici, effettori immunitari o perturbazioni ambientali. Di conseguenza, questo approccio fornisce una piattaforma trasferibile e riproducibile per indagare sulla stabilità delle comunità batteriche attraverso diversi contesti sperimentali.

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Protocollo

Tutto il lavoro con P. aeruginosa deve essere condotto sotto condizioni di contenimento BSL-2 appropriate e con approvazioni istituzionali di biosicurezza. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Generazione di aggregati di Pseudomonas aeruginosa in mezzo sintetico per fibrosi cistica (SCFM2)

NOTA: Questo passaggio descrive la preparazione delle colture di P. aeruginosa e la formazione di aggregati multicellulari sospesi in condizioni fisiologicamente rilevanti che imitano l'ambiente delle vie aeree della fibrosi carbonica.

  1. Preparazione delle colture batteriche
    1. Il giorno prima dell'esperimento, inoculare la Pseudomonas aeruginosa PAO1 di tipo selvatico che trasporta il plasmide pMRP9-1 (GFP)14 da scorte di glicerolo congelato in un brodo di lisogenesi (LB) da 5 mL.
    2. Aggiungere carbenicillina (300 μg/mL) per mantenere la selezione dei plasmidi.
    3. Coltivare le colture durante la notte a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
  2. Retrodiluzione e preparazione per la formazione degli aggregati
    1. Il giorno dell'esperimento, si diluiscono colture notturne 1:5 (1 mL durante la notte: 4 mL LB. Gli antibiotici non vengono riaggiunti in questa fase; il residuo residuo è minimo e non influisce sulla crescita).
    2. Coltivare le colture per ~2 ore a 37 °C con scuotimento (200 rpm) per raggiungere la fase logaritmica.
      NOTA: Le cellule si trovano tipicamente nella fase esponenziale iniziale dopo ~2 ore in queste condizioni. Inoltre, le cellule vengono successivamente lavate prima dell'inoculazione in SCFM2 per minimizzare eventuali residui di antibiotici.
  3. Preparazione e bilanciamento di SCFM2
    1. Circa 30 minuti prima della fine del periodo di diluizione inversa, l'aliquota pre-preparava SCFM2 in tubi sterili e riscaldava a 37 °C.
    2. Per l'imaging in una piastra ottica a fondo di vetro a 4 pozzi, allocare 500 μL SCFM2 per pozzo. Prepara un volume in eccesso per tenere conto degli errori di pipettatura.
      NOTA: SCFM2 viene immagazzinato a 4 °C. Il preriscaldamento minimizza lo shock termico e migliora la riproducibilità della formazione degli aggregati.
  4. Lavaggio e standardizzazione dell'inoculo
    1. Coltivare pellet per centrifugazione a 4200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Se sono necessari calcoli fino a giri, il raggio del rotore del rotore oscillante è di 172 mm.
    2. Rimuovere il soprantantante e risospendere i pellet in 3 mL di PBS sterile (pH 7,0).
    3. Ripeti i passaggi di lavaggio altre due volte (in totale tre lavaggi).
    4. Misura OD₆₀₀ e calcola il volume necessario per inoculare SCFM2 a un OD₆₀₀₀ iniziale pari a 0,05.
    5. Vortice brevemente per omogeneizzare le cellule e inoculare ogni pozzo contenente 500 μL di SCFM2.
  5. Formazione degli aggregati in condizioni statiche
    1. Incubare staticamente SCFM2 inoculato a 37 °C per 4 ore per permettere la formazione degli aggregati.
      NOTA: Un'incubazione di 4 ore produce in modo riproducibile aggregati sospesi con dimensioni ed eterogeneità comparabili a quelli osservati nei campioni di sputto e vie aeree di fibrose colcolica, minimizzando al contempo la maturazione del biofilm in stadio successivo 1,15.

2. Preparazione di uno stressore immunoassociato (elastasi neutrofila umana)

NOTA: Questo passaggio descrive la preparazione di uno stressore derivato dall'ospite utilizzato per indurre lo stress cellulare e la destabilizzazione degli aggregati batterici.

  1. Ricostituzione e stoccaggio dell'elastasi neutrofila umana (HNE)
    1. Ricostituire l'elastasi dei neutrofili umani secondo le raccomandazioni del produttore utilizzando 50 mM di acetato di sodio, 200 mM di NaCl e acqua sterile.
    2. Prepara una soluzione di calcio da 50 μg/L e sterilizza con il filtro usando un filtro da 0,2 μm.
    3. Aloquota in volumi da 50 mL e conserva a −20 °C.
    4. La notte prima dell'uso, scongelare un'aliquota a 4 °C.
      NOTA: L'allicitazione riduce al minimo i cicli di congelamento-disgelo, che possono ridurre l'attività enzimatica e introdurre variabilità. Le aliquote sono stabili a 4 °C per circa 1 mese.

3. Preparazione e applicazione di DiBAC4(5) per segnalare la depolarizzazione della membrana

NOTA: Questo passaggio descrive la preparazione e l'uso di un colorante sensibile alla tensione per visualizzare la depolarizzazione della membrana all'interno degli aggregati.

  1. Preparazione e conservazione di DiBAC4(5)
    1. Inizia preparando una soluzione stock di DiBAC4(5). Ricostituire la polvere diDiBAC 4(5) in DMSO anidro a 1 mg/mL.
      NOTA: La ricostituzione del DiBAC4(5) in DMSO segue le raccomandazioni standard del produttore.
    2. Aloquota in volumi da 100 μL e conserva a −20 °C protetto dalla luce.
    3. Usa ogni aliquota non più di due volte.
      NOTA: DiBAC4(5) è funzionalmente equivalente a DiBAC4(3) ma qui selezionato per corrispondere agli spettri di eccitazione/emissione della GFP. In questo protocollo, DiBAC4(3) viene utilizzato solo per una colorazione aggiuntiva discussa nella sezione risultati. Il colorante principale utilizzato in tutto questo protocollo è DiBAC4(5).

4. Imaging confocale time-lapse della depolarizzazione della membrana negli aggregati di P. aeruginosa

NOTA: Questo passaggio descrive l'acquisizione di immagini confocali ad alta risoluzione e risoluzione temporale per catturare cambiamenti fisiologici e strutturali dinamici negli aggregati.

  1. Microscopio e preparazione della camera ambientale
    1. Installa un micropiastra riscaldata o una camera ambientale sul palco del microscopio confocale.
    2. Attiva il controllo temperatura e umidità almeno 1 ora prima dell'imaging e imposta a 37 °C.
    3. Nella scheda Acquisizione , localizza la scheda Laser e, circa 1 ora prima dell'uso, accendi i laser necessari per consentire un adeguato riscaldamento (laser ad argon per GFP; DPSS 561-10 per DiBAC4(5)) (Figura supplementare 1A).
      NOTA: Un controllo ambientale stabile riduce la deriva di concentrazione e preserva l'integrità degli aggregati durante lunghi esperimenti a time-lapse.
  2. Applicazione dello stressore immunitario
    1. Dopo 4 ore di formazione degli aggregati, si aggiunge HNE ai pozzi sperimentali fino a una concentrazione finale di 20 μg/L16.
    2. Lasciare i pozzi di controllo non trattati.
    3. Trasferire la piastra a 4 pozzi sul palco del microscopio.
      NOTA: L'HNE è stata preparata a concentrazioni fisiologicamente rilevanti (μg/L), basandosi sui livelli riportati nell'espettorato indusso, piuttosto che come stock concentrato. Le concentrazioni utilizzate per questo studio si trovano in McGarvey et al.16 sotto IS (sputum indusso), NE-AAT (complesso NE/a1-anti-tripsina) HV (volontario sano).
  3. Identificazione delle regioni aggregate di interesse
    1. Utilizzando la scheda Locate e un obiettivo del 20×, accendi la Luce Trasmessa per identificare regioni ricche di aggregato utilizzando immagini in campo chiaro (Figura supplementare 1B).
    2. Pur utilizzando ancora l'imaging in campo chiaro, naviga nella scheda Acquisizione e salva le coordinate x, y e z usando il modulo Posizioni (Figura Supplementare 1C).
    3. Ripeti per più repliche tecniche per pozzo.
  4. Acquisizione z-stack ad alta risoluzione e serie temporali
    1. Spostati in una posizione salvata e passa a un obiettivo a immersione nell'olio del 63×.
    2. Applica l'olio a immersione prima di posizionare il piatto.
    3. Nella scheda Acquisizione, configurare i canali usando Smart Setup (Figura Supplementare 1D): GFP (488/509 nm) – assegnare verde, DiBAC4(5) (591/615 nm) – assegnare rosso.
    4. Naviga nella visualizzazione in tempo reale , poi usando il modulo Z-stack , identifica la parte inferiore della copertura regolando la messa a fuoco fine e impostalo come prima posizione z cliccando su Imposta prima (Figura supplementare 1E).
    5. Spostarsi verso l'alto finché la distanza indica 60 μm e impostare la posizione z finale cliccando su Imposta l'ultimo (Figura supplementare 1E).
    6. Disattiva la visualizzazione in diretta e attiva la Messa a fuoco definite. Seleziona Trova Superficie e successivamente seleziona Stocca Focus solo quando lo stato indica Riflesso Trovato (Figura Supplementare 1F).
    7. Ripeti la calibrazione della messa a fuoco per ogni posizione salvata utilizzando i moduli Z-stack e Definite Focus .
    8. Configura l'acquisizione delle serie temporali per visualizzare ogni posizione ogni 3 minuti per 6 ore (Figura supplementare 1G).
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui per scongelare, aggiungere e incubare il colorante DiBAC4(5), e può essere ripreso dopo il periodo di incubazione.
    9. Seleziona Avvia esperimento.
      NOTA: Intervalli di tre minuti bilanciano la risoluzione temporale con la fototossicità e le considerazioni di fotosbiancante.
  5. Aggiunta e incubazione di DiBAC4(5)
    1. Aggiungere DiBAC4(5) a ciascun pozzo fino a una concentrazione finale di 5 μg/mL 9.
    2. Incubare al buio per 30 minuti prima di iniziare l'imaging time-lapse.
      NOTA: Questa incubazione permette l'equilibrio dei coloranti minimizzando la fluorescenza di fondo.

5. Analisi quantitativa delle immagini della struttura aggregata e co-localizzazioneDiBAC 4(5)

NOTA: Questo passaggio descrive un flusso di lavoro quantitativo per collegare la depolarizzazione della membrana all'architettura aggregata e alla destabilizzazione.

  1. Importazione immagine e separazione dei canali
    1. Carica file immagine (.czi o equivalenti) nel software Imaris x64 versione 10.2.0 o superiore.
    2. Verifica la calibrazione dei voxel verificando che le dimensioni dei pixel x, y e z (dimensione del voxel) nei metadati dell'immagine riflettano accuratamente i parametri di acquisizione confocale (obiettivo, zoom, dimensione z-step). Una calibrazione errata porterà a errori nelle misurazioni spaziali e volumetriche.
  2. Renderizzazione superficiale degli aggregati batterici e segnale DiBAC4(5)
    1. Usa il modulo Surfaces per renderizzare gli aggregati di P. aeruginosa :
      1. Sotto Impostazione della Segmentazione, seleziona il canale GFP (Figura Supplementare 2A).
      2. Seleziona abilita Split Touching Objects (Regione in crescita) e regola la soglia di intensità per catturare completamente gli aggregati (Figura supplementare 2B).
      3. Nel modulo Filter Seed Points , cambia il tipo di filtro in Numero di Voxel Img = 1 e imposta al 90% (Figura Supplementare 2C).
      4. Dopo il processamento, imposta le superfici al 100% (Figura Supplementare 2D).
    2. Completare il rendering e assegnare la colorazione verde alle superfici batteriche (Figura supplementare 2E).
    3. Ripeti il rendering per il canale DiBAC4(5) e assegna la colorazione rossa.
  3. Co-localizzazione e quantificazione basata sul volume
    1. Seleziona il rendering della superficie DiBAC4(5) (Figura Supplementare 3A) e determina in quale momento o punti temporali verrà eseguita l'analisi di co-localizzazione.
    2. Naviga a Statistica > scheda Dettagliata > Valori Specifici (Figura Supplementare 3B).
    3. Definire la co-localizzazione selezionando oggetti con una distanza minima dalle superfici batteriche di 0,00 (Figura supplementare 3B).
    4. Localizza, modifica, poi duplica questi oggetti per generare una superficie che si sovrappone a celle con DiBAC (Figura supplementare 3C). Assicurati di rinominare questa superficie per indicare le sue qualità sovrapposte.
    5. Nella scheda Dettagliati sotto Valori Medi, registra i valori sommati dei volumi in ciascun(i) momento(i) selezionato(i) per: (1) segnale totale DiBAC4(5) (Figura supplementare 3D); (2) Segnale DiBAC4(5) co-localizzato (Figura supplementare 3E).
    6. Calcola la percentuale di sovrapposizione come:
      figure-protocol-1
      NOTA: La sovrapposizione percentuale riflette la proporzione di segnale DiBAC₄(5) associato alle cellule all'interno degli aggregati, riflettendo la depolarizzazione della membrana in un dato momento temporale.
      NOTA: Sebbene dimostrato utilizzando aggregati di P. aeruginosa in SCFM2 e sottoposto a stress con HNE, questo flusso di lavoro è ampiamente adattabile ad altre specie batteriche, medi promotori degli aggregati, reporter fluorescenti e fattori di stress, inclusi agenti antimicrobici o perturbazioni ambientali.

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Risultati

Nel protocollo sopra descritto è fornito un metodo per monitorare i cambiamenti nella dinamica delle membrane degli aggregati di P. aeruginosa modellati in un ambiente polmonare con fibrosi cistica (Figura 1). Utilizzando un ceppo PAO1 di tipo selvatico che trasporta un plasmide pMRP9-1 (GFP) (Figura 1A), HNE per simulare lo stress immunitario e un colorante di membranaDiBAC 4(5) (

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Discussione

Il potenziale di membrana funge da lettura sensibile e precoce dello stress cellulare e dell'omeostasi interrotta. All'interno degli aggregati batterici multicellulari, questi cambiamenti fisiologici avvengono prima e possono guidare la successiva destabilizzazione strutturale. Qui presentiamo un flusso di lavoro basato sull'imaging che utilizza il colorante a risposta lenta e sensibile al potenziale bis-(acido 1,3-dibutilbarbiturico) pentametina oxonolo (DiBAC4(5)) per monito...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

S.E.D. è sostenuto da fondi iniziali forniti dal Dipartimento di Medicina Molecolare dell'Università della Florida del Sud, oltre a sovvenzioni di ricerca della Cystic Fibrosis Foundation (CFF) (DARCH19G0, DARCH22P0, DARCH25G0).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
acido 1,3-dibutilbarbiturico) pentametina oxonolo (DiBAC4(3))AAT Bioquest21411  molecola lipofila, anionica  
1,3-dibutilbarbiturico) pentametina oxonolo (DiBAC4(5))AAT Bioquest21410  molecola lipofila, anionica  
Carbenicillina  Prodotti di ricerca internazionali e nbsp;C46000-5.0Utilizzato per la selezione dei ceppi di PAO1 che esprimono GFP
Cellvis a 4 camere con fondo di vetro da 35mmFisherNC0600518la piastra a camera di vetro consente la manutenzione degli aggregati sospesi nel mezzo di crescita durante l'imaging  
CentrifugaBeckman Coulter Scienze della Vita  B06320abbinato al rotore a secchio oscillante Beckman Coulter Life Sciences SX4400 (numero di parte B01425)
Microscopio a scansione laser confocale (CLSM)ZeissLSM 880il modello di CLSM utilizzato per gli esperimenti descritti in questo protocollo non è più disponibile, ma l'LSM 900 è un'opzione equivalente aggiornata  
Tubi di culturaGenesee21-130sterile; polipropilene  
DAPIThermo Fisher62248utilizzato per applicazioni future proposte per colorare neutrofili con DiBAC4(5)
Cuvette usa e getta Tecnologia del Brand759086D1,5 mL, semi-micro
DMSOMillipore-Sigma276855-100MLutilizzato per la ricostituzione di DiBAC4(3,5)
DRAQ5Thermo Fisher65-0880-92utilizzato per applicazioni future proposte di colorazione dei neutrofili con DiBAC4(3)
Camera Ambientale per il CLSMPECONLSM 880questo sistema è stato realizzato esclusivamente per i prodotti Zeiss ed è generalmente chiamato "Sistema di Incubazione S" e tutti i componenti possono essere ordinati tramite Zeiss come aggiunta al sistema LSM 880 (o simile)
Gentamicina solfato  FisherBP918-1Utilizzato per la selezione di ceppi RFP che esprimono di PA1633
Glicerolo Genesee18-205usata per congelare ceppi per conservazione a lungo termine a -80  ° C
Elastasi Neutrofila Umana (HNE)Millipore-Sigma324681-50UGuna volta ricostituito è stabile per 1 mese a 4  ° C o 1 anno a 20  ° C
Software Imaris x64Oxford Instruments Versione 10.2.0
Olio per immersione Scienze di Microscopia Elettronica 16919-12non seccanti; standardizzato a 37  ° C
Incubator Benchmark ScientificH1001-Mcapace di tremare
Brodo di Lisogenesi (LB)Genesee11-118Miscela Miller
plasmide di ciliegio & nbsp;ottenuto da un collabooratore 
Ceppo mutante trasposone PA1633  ottenuto da un collabooratore 
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher3002pH 7.0
Acetato di sodioThermo FisherAM97403M; pH 5,5; Priva di RNasi
Cloruro di sodioFisher S271-500Utilizzato per la ricostituzione dell'HNE
Spettrofotometro VWR634-0882usata per misurare la densità cellulare per l'inoculazione di PAO1/PA1633 in SCFM2
Sterile .22µ m FiltroGenesee25-244Usata per purificare l'HNE ricostituita
Tubi microcentrifughe steriliGenesee24-272LR0,6 mL
Siringa sterileFisher14955459Usata per purificare l'HNE ricostituita
SX4400 rotore a canna oscillante  Beckman Coulter Scienze della Vita  B01425accoppiata con la centrifuga Beckman Coulter Life Sciences (parte n. B06320)
Mezzo Sintetico per Fibrosi Cistica (SCFM2)SyntheBiome10002-500Lotto #: 001-CF2-0724
Acqua Ultra PuraGenesee18-195Utilizzato per la ricostituzione dell'HNE
Pseudomonas aeruginosa di tipo selvatico PAO1 con plasmide pMRP9-1 e nbsp;Questo plasmide pMRP9-1 contiene GFP ed esprime resistenza alla carbenicillina  
ZEN Black Edition 2.3 Zeiss Imaging software & nbsp;Zeisscompatibile con la LSM 880

Riferimenti

  1. Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. mBio. 8 (2), e00240-17(2017).
  2. Rada, B. Interactions between neutrophils and Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. Pathogens. 6 (1), 10(2017).
  3. Kragh, K. N., Tolker-Nielsen, T., Lichtenberg, M. The non-attached biofilm aggregate. Commun Biol. 6 (1), 898(2023).
  4. Gannon, A. D., Matlack, J., Darch, S. E. Exploring aggregation genes in a P. aeruginosa chronic infection model. J Bacteriol. 207 (1), e00429-24(2025).
  5. Melaugh, G., et al. Distinct types of multicellular aggregates in Pseudomonas aeruginosa liquid cultures. npj Biofilms Microbiomes. 9 (1), 52(2023).
  6. Letizia, M., Diggle, S. P., Whiteley, M. Pseudomonas aeruginosa: Ecology, evolution, pathogenesis and antimicrobial susceptibility. Nat Rev Microbiol. 23, 701-717 (2025).
  7. Andersen, J. B., et al. Identification of small molecules that interfere with c-di-GMP signaling and induce dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 59(2021).
  8. Andersen, J. B., et al. Induction of native c-di-GMP phosphodiesterases leads to dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 65 (4), e02431-20(2021).
  9. Lee, W., Woo, E. R., Lee, D. G. Phytol exhibits antibacterial activity by inducing oxidative stress in Pseudomonas aeruginosa. Free Radic Res. 50 (12), 1309-1318 (2016).
  10. Shirazi, F., et al. Biofilm filtrates of Pseudomonas aeruginosa inhibit preformed Aspergillus fumigatus biofilms via apoptosis. PLoS One. 11 (3), e0150155(2016).
  11. Palmer, K. L., Mashburn, L. M., Singh, P. K., Whiteley, M. Cystic fibrosis sputum supports growth and key physiological traits of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (15), 5267-5277 (2005).
  12. Turner, K. H., et al. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  13. Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for real-time assessment of a Pseudomonas aeruginosa infection model. J Vis Exp. (170), e62420(2021).
  14. Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
  15. Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4779-4784 (2018).
  16. McGarvey, L. P. A., et al. Cytokine concentrations and neutrophil elastase activity in bronchoalveolar lavage and sputum in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 1 (4), 269-275 (2002).
  17. Adams, D. S., Levin, M. Measuring resting membrane potential using fluorescent voltage reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 459-464 (2012).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  19. Lagendijk, E. L., et al. Genetic tools for tagging Gram-negative bacteria with mCherry for visualization. FEMS Microbiol Lett. 305 (1), 81-90 (2010).
  20. Meylan, S., et al. Carbon sources tune antibiotic susceptibility in Pseudomonas aeruginosa via TCA cycle control. Cell Chem Biol. 24 (2), 195-206 (2017).
  21. Wickremasinghe, H., et al. Polymyxin B and meropenem synergistically kill multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and reduce biofilm formation. Antibiotics (Basel). 10 (4), 405(2021).

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