Profilazione lisosomica con LysoTracker per la valutazione quantitativa della senescenza cellulare nei fibroblasti umani

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo LysoTracker per cellule vive per misurare il rimodellamento lisosomico durante la senescenza nei fibroblasti umani IMR-90.

Abstract

La senescenza cellulare è uno stato stabile di arresto del ciclo cellulare associato a fenotipi caratteristici, tra cui morfologia cellulare ingrandita, segnalazione segretaria alterata e un marcato rimodellamento lisosomico. Le cellule senescenti mostrano comunemente l'espansione del compartimento endo-lisosomico acido, accompagnata da variazioni nell'acidità luminale e nella capacità degradativa, creando un'opportunità per semplici letture cellulari vive del rimodellamento degli organelli legati alla senescenza. Questo lavoro descrive un protocollo di imaging a cellule vive che utilizza LysoTracker Deep Red, un colorante fluorescente acidotropico, per fornire un proxy indiretto e dipendente dal pH del compartimento acido degli organi come correlato del carico di senescenza. Il metodo è dimostrato in fibroblasti polmonari umani IMR-90 sottoposti a senescenza replicativa attraverso il passaggio seriale. Il protocollo dettaglia la coltura cellulare e il tracciamento del passaggio, la colorazione con LysoTracker, l'imaging a fluorescenza e la quantificazione basata su immagini dell'intensità del segnale lisosomico e dell'area segnale positiva per cellula. La colorazione con β-galactosidasi (SA-β-Gal) associata alla senescenza sulle colture parallele è inclusa come marcatore confermativo opzionale piuttosto che come standard di riferimento. Gli esiti rappresentativi mostrano un segnale di colorante fluorescente acidotropico più elevato e regioni più grandi di lisopositivi nelle colture a passaggio avanzato rispetto ai controlli a passaggio precoce, coerente con l'espansione del compartimento organello acido durante la senescenza. Poiché la lettura dipende dal volume del compartimento, dal gradiente protonico e dalla disponibilità di coloranti, è meglio interpretarla come un correlato indiretto del rimodellamento lisosomale piuttosto che come una misura diretta del numero di lisosomi o della biogenesi. Il protocollo è semplice da adottare e può essere adattato ad altri tipi cellulari o a sollecitazioni che inducono la senescenza, fornendo un complemento pratico e quantitativo ai saghi endpoint convenzionali.

Introduzione

La senescenza cellulare è un programma duraturo di arresto del ciclo cellulare attivato da vari stress e fattori scatenanti legati^{all'invecchiamento} 1,2,3,4. Le cellule senescenti sono classicamente identificate da una costellazione di marcatori, poiché nessun singolo marcatore è completamente specifico. I tratti distintivi includono una morfologia cellulare ingrossata e appiattita, attività di β-galactosidasi (SA-β-Gal) associata alla senescenza, formazione di focolai di danno al DNA e un profilo secretorio pro-infiammatorio (SASP^)2,4,5. Tra queste caratteristiche, il rimodellamento lisosomico è emerso come un tratto prominente e funzionalmente significativo della^{senescenza 6,7}. Le cellule senescenti mostrano profondi cambiamenti lisosomi, inclusa una drastica espansione della dimensione e del numero lisosomico insieme a alterazioni della funzione (spesso con una parziale neutralizzazione del pH lisosomico e accumulo di materiale non degradato⁾6,7,8,9. Questa espansione lisosomica contribuisce a un aumento dell'attività di SA-β-Gal, un marcatore di senescenza consolidato che riflette un'elevata attività lisosomale di β-galactosidasi nelle cellule^senescenti 10,11,12. Infatti, la colorazione SA-β-Gal sfrutta questo fenomeno utilizzando un'incubazione a pH subottimale (6,0) per precipitare selettivamente il colorante nei lisosomi delle cellule senescenti, che hanno accumulato l'enzima e mostrano un pH più alto rispetto alle cellule^giovani 10,12,13.

I lisosomi svolgono ruoli centrali nel ricambio e nella segnalazione delle proteine, e la loro disregolazione è ora considerata un segno distintivo dell'invecchiamento e^{della senescenza} 1,2,4,6. Le cellule senescenti spesso mostrano disfunzioni lisosomiali, evidenziate da pH luminale elevato, alterazione dell'attività enzimatica e accumulo di lipofuscina (un pigmento autofluorescente delle macromolecole ossidate^)6,14. La biogenesi lisosomica è frequentemente aumentata o alterata attraverso la rete coordinata di espressione e regolazione lisosomica (CLEAR) sotto il controllo del fattore di trascrizione EB (TFEB) e fattori^{correlati 6,7,15}. Questo processo può aumentare la massa lisosomica nelle cellule senescenti mentre si adattano allo stress espandendo il compartimento^{degradativo 6,7,10}. Al contrario, le cellule senescenti possono anche sperimentare un declino funzionale lisosomico (ad esempio, acidità ridotta), che può influenzare processi come l'autofagia e conferire resistenza a determinati sollecitamenti, inclusa la morte cellulare ferroptotica ^6,8. La misurazione del contenuto e della funzione lisosomica è quindi centrale per comprendere e identificare la senescenza ^6,16.

LysoTracker Deep Red è una sonda fluorescente permeabile alla membrana che si accumula selettivamente negli organelli acidi attraverso il trapolamento guidato dalla protonazione attraverso la membrana^{lisosomicale 16,17}. Il segnale risultante riflette il volume combinato del compartimento acido, la forza del gradiente protonico e la disponibilità locale di colorante piuttosto che la massa lisosomica, e può variare con variazioni del pH lisosomico o dello stato della membrana che si verificano indipendentemente dal numero totale del^{lisosoma 6,16}. Nel contesto della senescenza cellulare, le cellule mostrano compartimenti LysoTracker-positivi espansi e marcati in modo più intenso rispetto alle controparti pre-senescenti⁹, coerente con l'espansione del compartimento acido e l'aumento della biogenesi lisosomicale riportato da studi biochimici e^{ultrastrutturali 6,7,10}. Questo approccio a cellule vive offre diversi vantaggi rispetto alla colorazione convenzionale con endpoint SA-β-Gal: consente un'analisi quantitativa e spazialmente risolta di singole cellule, può essere combinato con altri reporter fluorescenti, non richiede fissazione e cattura l'eterogeneità riportando caratteristiche continue invece che un endpoint^{binario 6,16}. In tutto questo protocollo, il segnale LysoTracker viene utilizzato come lettura del compartimento acido degli organi nelle cellule viventi, e i cambiamenti dipendenti dalla condizione vengono interpretati di conseguenza invece di essere trattati come una misura assoluta del numero del^{lisosoma 6,16}.

Questo protocollo dettaglia l'uso di LysoTracker Deep Red per profilare i cambiamenti lisosomici nei fibroblasti IMR-90 sottoposti a senescenza replicativa. IMR-90 è una linea normale di fibroblasti diploidi umani (femmina, origine polmonare fetale) ampiamente utilizzata nella ricerca sull'invecchiamento; come altri fibroblasti primari (ad esempio, WI-38), le cellule IMR-90 entrano in senescenza dopo ~50–60 raddoppi della popolazione (il limite di Hayflick) dovuto all'accorciamento dei telomeri e alla segnalazione di danni al DNA^18,19. Il protocollo descrive come coltivare cellule IMR-90 per indurre la senescenza tramite passaggio seriale, verificare la senescenza tramite morfologia e colorazione SA-β-Gal, e colorare colture vive con LysoTracker Deep Red per immagini a^fluorescenza 5,10,12,13. Sono incluse l'acquisizione e l'analisi delle immagini, con letture quantitative come il conteggio lisosomale per cellula, l'area lisosomica totale per cellula e l'intensità media della fluorescenza. Si sottolineano i controlli sperimentali e le considerazioni di sicurezza, tra cui la gestione attenta di coloranti e fissativi, la minimizzazione della fototossicità durante l'imaging e la spiegazione dell'autofluorescenza cellulare nelle cellule invecchiate. Il metodo è dimostrato utilizzando la senescenza replicativa ma può essere adattato ad altri modelli, inclusa la senescenza indotta da farmaci (ad esempio, trattamento con doxorubicina o etoposidi) o la senescenza prematura indotta da stress (SIPS) tramite^ossidanti 2,3,4,19,20. In ogni caso, le letture basate su LysoTracker dovrebbero essere confrontate con i controlli appropriati (cellule proliferanti o quiescenti) e, quando possibile, convalidate incrociate con almeno un marcatore di senescenza tradizionale (come l'espressione SA-β-Gal o p16INK4a⁾3,5,12,13.

La profilazione lisosomica a cellule vive colma una lacuna pratica nei saghi di senescenza fornendo una misurazione riproducibile e con risoluzione cellulare singola di un fenotipo chiave di organello—espansione lisosomica—direttamente collegata alla funzione cellulare senescente (ad esempio, maggiore capacità degradativa e attività secretoria⁾2,3,4,6 . Poiché la colorazione LysoTracker è compatibile con imaging ad alta produttività e citometria di flusso, il protocollo può essere scalato per applicazioni come lo screening farmacologico (ad esempio, test di senolitici o modulatori della funzione lisosomiale^)2,3,6. Come direzione futura, le caratteristiche lisosomiche per cellula generate da questo protocollo sono adatte ad approcci di classificazione a valle, inclusi modelli di apprendimento automatico; La formazione e la validazione di tali classificatori vanno oltre l'ambito di questo protocollo. Nel complesso, questo metodo (Figura 1) consente la visualizzazione e la quantificazione della dimensione lisosomica della biologia della senescenza, fornendo informazioni su come la biogenesi e la morfologia lisosomica cambiano durante l'invecchiamento o lo stress e offrendo una piattaforma per testare interventi che mirano ai lisosomi nelle cellule senescenti. Il flusso di lavoro di analisi delle immagini utilizzato per segmentare nuclei, derivare regioni associate alle celle, soglia e quantificare le caratteristiche di LysoTracker, e riprodurre le analisi per pozzo e per cella presentate qui è implementato come pacchetto open-source complementare (SenTrackLite v0.5.0), fornito come File Supplementare 1 e archiviato con un DOI persistente per citazione e^{riutilizzo 21}.

Figura 1: Panoramica del saggio di senescenza lisosomica a cellule vive. (A) Flusso di lavoro sperimentale. Le cellule vengono colorate vive con LysoTracker Deep Red e un colorante nucleare, ottenute tramite microscopia a fluorescenza standard e opzionalmente elaborate in parallelo per la colorazione SA-β-Gal per la validazione. (B) Misurazioni per cellula derivate dall'immagine. Il canale nucleare viene utilizzato per identificare singole cellule, mentre l'espansione ancorata al nucleo definisce una regione per cellula per estrarre misurazioni associate ai lisosomi dal canale LysoTracker. Le misurazioni rappresentative per cellula includono l'area lisosomiale, l'intensità media di LysoTracker e il conteggio dei lisosomi. La colorazione SA-β-Gal può essere utilizzata come etichetta di validazione opzionale nella generazione o conferma di dataset di riferimento. (C) Quantificazione e output. Le misurazioni lisosomiche per cellula vengono combinate in un singolo punteggio o probabilità di senescenza per cellula utilizzando un semplice approccio di punteggio. Gli output includono valori per cellula e riassunti a livello di pozzo o di condizione del carico di senescenza, che possono essere confrontati tra condizioni di induzione di senescenza o trattamento senolitico. Creato con BioRender.com
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Protocollo

Le cellule IMR-90 sono una linea cellulare di fibroblasti umani consolidata e non costituiscono ricerca su soggetti umani. Non era richiesta alcuna approvazione etica o consenso informato. Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le linee guida di biosicurezza dell'Università di Albany, State University of New York, per il lavoro con linee cellulari di origine umana in condizioni di Biosicurezza Livello 2 (BSL-2).

1. Preparazione generale e panoramica del flusso di lavoro

1. Definire l'obiettivo sperimentale come un saggio di profilazione lisosomica a cellule vive utilizzando la colorazione LysoTracker Deep Red e un colorante nucleare vivo per quantificare il rimodellamento lisosomico come lettura continua del carico di senescenza nelle cellule IMR-90. Definisci il confronto biologico primario come uno dei seguenti disegni:
   1. Induzione da senescenza vs. controllo non indotto abbinato.
   2. Condizioni di senescenza elevate vs. basse di senescenza su una dose o serie temporale.
   3. Condizioni di senescenza elevate trattate con un senolitico vs. Controllo ad alto controllo della senescenza trattato da veicolo.
   4. Serie di trattamenti senolitici che includono sia un gruppo con senescenza bassa e un gruppo con senescenza alta.
2. Stabilire la struttura minima di controllo per tutti gli esperimenti.
   1. Includere un gruppo di controllo a bassa senescenza abbinato per densità di placcatura, tempistica di colorazione e impostazioni di imaging.
   2. Includere un gruppo ad alto livello di senescenza generato da un trigger di senescenza definito o da senescenza replicativa a passaggio tardivo.
   3. Includere repliche biologiche per condizione e eseguire colorazioni e immagini con tempi identici in varie condizioni.
3. Definire i risultati del saggio come misure dirette basate su immagini della rimodellazione lisosomale:
   1. Misurare l'intensità media per cellula di LysoTracker all'interno della maschera lyso-positiva utilizzando una soglia di intensità costante come lettura primaria del saggio. A livello di singola cellula, questa metrica separa le condizioni a senescenza bassa da quelle ad alta senescenza con la dimensione dell'effetto più grande ed è insensibile alla densità nucleare a livello di campo (Figura Supplementare 1).
   2. Registrare i seguenti come letture secondarie, che documentano l'espansione del compartimento ma sono più sensibili alle scelte di segmentazione o alla densità nucleare a livello di campo: area arricchita di lisosomi per cellula e intensità integrata di LysoTracker per nucleo a livello di campo. L'intensità integrata per nucleo è informativa in campi ben popolati ma diventa instabile quando un campo contiene un piccolo numero di nuclei, poiché la normalizzazione per nucleo diventa dominata da singole cellule.
   3. Registra le metriche opzionali del numero di punti e delle dimensioni dei lisosomi quando la risoluzione di imaging supporta la discriminazione dei puncti.
4. Utilizzare la colorazione β-galattosidasi (SA-β-Gal) associata alla senescenza come fase opzionale di validazione eseguita su pozzi paralleli o campioni abbinati, a seconda dei vincoli sperimentali. Utilizzare questa validazione per confermare che le colture a passaggio tardivo mostrano una positività aumentata tra SA-β e Gal rispetto a quelle a passaggio precoce.
5. Standardizzare il saggio in diverse condizioni fissando le seguenti variabili prima della raccolta dei dati:
   1. Concentrazione di lavoro LysoTracker (75 nM) e durata della colorazione (30 min).
   2. Identità del colorante nucleare e intervallo di concentrazione di lavoro (ad esempio, Hoechst 33342 a 1 μg/mL a 2 μg/mL).
   3. Parametri di imaging, inclusi ingrandimento oggettivo, tempo di esposizione, intensità di illuminazione, binning e strategia di messa a fuoco.
   4. Formato della lastra e configurazione di imaging (piastre a fondo trasparente o piatti con fondo di vetro), inclusa la disposizione replicativa del pozzo.
   5. Selezione della soglia e normalizzazione dell'intensità.
      1. Applicare una singola soglia di intensità fissa al canale LysoTracker su tutti i pozzi all'interno di un esperimento per definire la maschera lyso-positiva.
      2. Selezionare la soglia una volta durante la configurazione del saggio usando un set di campi di calibrazione che coprono l'intervallo di intensità atteso (ad esempio, due campi a senescenza bassa e due campi ad alta senescenza), e mantenerla costante su tutti i pozzi all'interno di quella sessione; permettere che la soglia vari per pozzo introduce una dipendenza circolare tra misurazione e risultato.
      3. Per confronti tra esperimenti, acquisire tutte le condizioni in una singola sessione sotto impostazioni identiche di potenza, esposizione e guadagno laser e riportale nella legenda della figura.
      4. Se sono necessari confronti di intensità assoluta tra sessioni, includere uno standard di riferimento fluorescente (ad esempio, una piastra di riferimento o un pozzo di riferimento fisso) e normalizzare di conseguenza le intensità misurate.
         NOTA: Non confrontare i valori grezzi di intensità tra sessioni senza impostazioni di acquisizione identiche o normalizzazione basata su riferimenti.
   6. Normalizzazione della densità nucleare.
      NOTA: Poiché le colture senescenti tipicamente mostrano una proliferazione ridotta e una densità nucleare più bassa a tempi di semina comparabili7,10, le metriche a livello di campo basate sul conteggio assoluto di pixel (ad esempio, area totale di lyso-positivi) possono essere influenzate dal numero di cellule per campo.
      1. Riporta sia i valori grezzi che quelli normalizzati per nucleo (valore grezzo diviso per il numero di nuclei segmentati in Hoechst).
         NOTA: La normalizzazione per nucleo controlla i confonditori legati alla densità ed è il confronto appropriato per l'interpretazione per cellula. Per le letture basate sull'area, il valore normalizzato funge da metrica primaria, mentre il totale non normalizzato viene mantenuto per completezza.
6. Acquisire immagini in condizioni che preservino la qualità del segnale delle cellule vive e minimizzino la variabilità tecnica. Mantenere le placche di passaggio precoce e tardi protette dalla luce durante la colorazione e il trasporto, e ridurre al minimo il tempo al di fuori delle condizioni di coltura controllata durante l'imaging.
7. Salva le immagini di fluorescenza come file TIFF a singolo piano, a canale singolo e senza perdite. Utilizzare uno schema di denominazione coerente che preservi l'accoppiamento tra immagini nucleari e immagini LysoTracker e mantenga la tracciabilità a placcare, pozzo, condizionare e replicare. Usa un nome base condiviso con suffissi di canale (ad esempio, _Hoechst.tif e _Lyso.tif). Conserva le immagini in una cartella dedicata organizzata per esperimenti, con sottocartelle secondo necessità.
   NOTA: Un punto di pausa pratico avviene dopo aver stabilito le coorti di passaggio precoce e tardi e aver confermato che le colture di passaggio tardivo mostrano una crescita lenta e una morfologia simile a quella di senescenza.
8. (Opzionale) Includere l'ossigeno come variabile sperimentale mantenendo coorti IMR-90 abbinate in condizioni ambientali e a basso ossigeno. Elabora tutti i gruppi allo stesso modo.

2. Coltura cellulare e induzione della senescenza replicativa

1. Scongelare i fibroblasti polmonari umani IMR-90 secondo le pratiche standard di coltura cellulare ed espandere le cellule in Medium Essenziale Minimo (MEM) integrato con siero bovino fetale al 10%. Aggiungere penicillina-streptomicina all'1% se coerente con la pratica di laboratorio e il disegno sperimentale. Mantenere le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Mantenere le colture in crescita logaritmica e passaggio prima della confluenza del 70% all'80%. Utilizzare una gestione costante dei mezzi e programmi di alimentazione per ridurre la variabilità tra le prove sperimentali. Sostituisci l'intero mezzo di coltura ogni 2-3 giorni tra un passaggio e l'altro.
   NOTA: Non lasciare che il substrato rimanga invariato per più di 72 ore, poiché la depurtazione dei nutrienti e l'accumulo di fattori secreti possono favorire fenotipi indotti dallo stress che confondono la senescenza replicativa.
3. Definire il gruppo basale a senescenza bassa come colture IMR-90 attivamente proliferanti, mantenute in condizioni che preservano il comportamento normale di crescita. Abbinare la densità e la manipolazione della placcatura a tutti i gruppi sperimentali.
4. Genera un gruppo ad alta senescenza utilizzando uno dei seguenti approcci, scelti in base a obiettivi sperimentali.
   1. Indurre la senescenza replicativa tramite passaggi seriali con raddoppio della popolazione fino a quando non sono evidenti una proliferazione rallentata e una morfologia associata alla senescenza.
      NOTA: Il livello di raddoppio della popolazione (PDL) e il numero di passaggio sono misure distinte e vengono monitorate separatamente. PDL si riferisce ai raddoppi cumulativi post-disgelo ed è calcolato in ogni passaggio come:
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂ (cellule raccolte / celle seminate)¹⁸,
      mentre il numero di passaggio conta il numero di sottoculture dal disgelo. Poiché le culture sono tipicamente suddivise 1:4 con una confluenza approssimativamente 70%–80%, ogni passaggio contribuisce con circa due raddoppi della popolazione, quindi numero di passaggio e PDL cumulativo non sono intercambiabili.
      NOTA: Le colture ad alta senescenza si osservano tipicamente a livelli avanzati di raddoppio della popolazione, quando la proliferazione rallenta e diventa evidente la morfologia associata alla senescenza. Le soglie esatte dovrebbero essere determinate empiricamente per ogni lotto IMR-90, poiché i PDL variano tra i fornitori.
   2. Senescenza indotta dallo stress applicando un trigger di senescenza definito e permettendo una finestra di sviluppo fenotipica appropriata.
   3. Senescenza indotta dal trattamento esponendo le cellule alla condizione in esame quando l'obiettivo è verificare se quella condizione induce la senescenza.
5. Validare che l'approccio selezionato produca un fenotipo ad alto livello di senescenza utilizzando almeno una lettura ortogonale eseguita su pozzi paralleli. Esegui la colorazione SA-β-Gal come metodo opzionale di validazione e documenta la frazione di cellule positive per condizione quando inclusa.
   1. Una coltura si qualifica come senescenza alta quando almeno il 50% delle cellule mostra una colorazione perinucleare blu con SA-β-Gal dopo 12-16 ore di incubazione a pH 6,0, mentre il controllo senescenza-basso abbinato mostra non più del 10% di cellule positive sotto condizioni di colorazione^{identiche 13}.
   2. I valori al di fuori di questi limiti indicano un'induzione di senescenza incompleta o un background elevato e richiedono una riottimizzazione prima di procedere con l'imaging (imaging).
      NOTA: Pausa dopo aver stabilito le coorti di senescenza bassa e senescenza alta e aver confermato una chiara differenza fenotipica tramite morfologia e colorazione di validazione opzionale.
6. Opzionale: Progettazione del trattamento senolitico
   1. Le condizioni di senescenza a placche basse e alte nelle pozze replicanti permettono alle cellule di aderire e recuperare prima del trattamento.
   2. Trattare i pozzi ad alta senescenza con composto senolitico e includere un controllo ad alta senescenza trattato da veicoli.
   3. Includere un gruppo a bassa senescenza trattato con lo stesso veicolo e, quando rilevante, la stessa concentrazione composta per monitorare la sensibilità non senescente.
   4. Procedi con LysoTracker e colorazione nucleare in un orario costante dopo il trattamento in tutte le condizioni.
7. Monitorare le colture durante il passaggio tardivo o la progressione del trattamento e documentare morfologia e modelli di crescita. Identificare le colture senescenti tramite proliferazione rallentata, morfologia ingrandita e appiattita e aumento della granularità citoplasmatica. Una volta che l'arresto della crescita è evidente, mantenere la coltura come coorte ad alta senescenza per colorazione e imaging piuttosto che per il passaggio più lontano.
8. Minimizza gli stress di confusione durante la manutenzione della coltura utilizzando una preparazione costante del substrato, orari di alimentazione coerenti e tempi di manipolazione costanti fuori dall'incubatore. Considerare le fluttuazioni di temperatura, il tempo prolungato fuori controllata CO₂ e il riscaldamento incoerente dei medi come fonti di variabilità tecnica evitabile.
9. Opzionale: Mantenere colture corrispondenti sotto ossigeno ambiente e basso livello di ossigeno. Mantenere colture sotto il 21% di O₂ e sotto il 5% di O₂ come coorti separate e mantenere ogni coorte sotto la condizione di ossigeno assegnata durante la gestione di coltura di routine, quando possibile. Limitare l'esposizione all'ossigeno ambiente durante i trasferimenti e la preparazione per immagini per coorti a basso contenuto di ossigeno.
   NOTA: Un punto di pausa pratico avviene dopo aver definito e stabilizzato le coorti di passaggio precoce e tardivo e aver confermato che le colture di passaggio tardivo mostrano una crescita costante rallentata e una morfologia associata alla senescenza.

3. Colorazione lisosomica e nucleare a cellule vive con LysoTracker Deep Red e un colorante nucleare

1. Placcare le cellule IMR-90 per tutte le condizioni sperimentali in piastre di imaging a fondo trasparente o piatti a fondo di vetro. Includere una condizione di controllo a bassa senescenza e almeno una condizione di senescenza ad alta generazione dal fattore scatenante selezionato, e includere repliche biologiche per ciascuna condizione.
2. Cellule semi per ottenere un monostrato subconfluente il giorno della tintura. Annota la densità di semina e il tempo tra la placcatura e la colorazione per ogni esperimento per supportare la comparabilità tra le partite.
3. Calda la coltura completa a 37 °C. Prepara una soluzione di lavoro LysoTracker Deep Red a 75 nM nel mezzo riscaldato e proteggila dalla luce. La soluzione operativa viene preparata diluendo il materiale LysoTracker Deep Red da 1 mM (fornito dal produttore in DMSO) 1:13.333 in mezzo di coltura completo riscaldato (ad esempio, 0,75 μL di materiale da 1 mM per 10 mL di mezzo riscaldato).
   NOTA: Le cellule senescenti a passaggio tardivo e indotte dallo stress accumulano lipofuscina e altro materiale autofluorescente non specifico che emette su ampi intervalli di lunghezze d'onda e può contribuire al segnale apparente di LysoTracker nei controlli non^{colorati 14}. Per stimare il contributo dell'autofluorescenza in un dato esperimento, includere almeno un pozzo non colorato per ogni condizione e acquisirlo in contesti di imaging identici. Sottrai il segnale medio del pozzo non colorato dalle misurazioni del pozzo colorato, oppure riporta sia i valori grezzi che quelli sottratti di fondo.
   NOTA: In pratica, il segnale del canale LysoTracker non colorato nelle colture IMR-90 è piccolo rispetto al segnale senescente colorato (circa dal 5% al 10% della media senescente colorata nell'attuale dataset), ma il contributo aumenta con il numero di passaggi e può diventare sostanziale (superiore al 20%) nelle colture senescenti profondamente senescenti o indotte da^{oncogeni 6,14}. Verifica sempre la grandezza dell'autofluorescenza quando si adotta questo protocollo per un nuovo tipo di cellula o modello di indutzione della senescenza.
4. Prepara una soluzione di lavoro LysoTracker sufficiente per tutti i pozzi che verranno macchiati durante la scavata. Mescola la soluzione di lavoro con una delicata inversione e proteggila dalla luce fino all'uso.
5. Aspira il mezzo esaurito da ogni pozzo. Aggiungi delicatamente la soluzione lavorante LysoTracker lungo la parete del pozzo per evitare di disturbare il monostrato e mantenere un volume di colorazione costante tra i pozzi.
6. Incubare le cellule con LysoTracker per 30 minuti a 37 °C in 5% di CO₂. Mantenere tutti i gruppi sperimentali sotto la stessa durata di incubazione e temperatura.
7. Aggiungi un colorante nucleare vivo durante gli ultimi 10 minuti di incubazione con LysoTracker. Aggiungere Hoechst 33342 direttamente al mezzo contenente LysoTracker alla concentrazione di lavoro raccomandata dal produttore, ad esempio da 1 μg/mL a 2 μg/mL, e mescolare oscillando delicatamente la piastra con un leggero dondolo.
8. Rimuovi il mezzo di colorazione alla fine dell'incubazione. Risciacquare le cellule una volta con soluzione salina preriscaldata con fosfato tamponata per ridurre la fluorescenza di fondo.
9. Aggiungi un mezzo di coltura rosso senza fenolico preriscaldato o un tampone per immagini subito dopo il risciacquo. Procedere direttamente all'imaging dal vivo e mantenere un tempo costante tra lo scambio del buffer e l'acquisizione dell'immagine su tutti i pozzi dell'esperimento.
10. Proteggi le piastre dalla luce durante i trasferimenti e l'installazione di imaging. Minimizzare il tempo trascorso fuori dalle condizioni controllate di temperatura e CO₂ durante la gestione e l'acquisizione dell'immagine.
    ATTENZIONE: Maneggia i coloranti fluorescenti usando guanti e protezione per gli occhi. Smaltire liquidi contenenti coloranti e consumabili contaminati secondo le procedure di sicurezza chimica istituzionale.
    NOTA: Usa un punto di pausa dopo il Passo 3.9 se l'imaging richiede di staging più placche. Mantieni le piastre protette dalla luce a 37 °C e riprendi l'imaging il prima possibile per limitare la deriva delle macchie.
    NOTA: Se il disegno sperimentale include ossigeno come variabile, mantenere ogni coorte sotto la condizione di ossigeno assegnata durante la colorazione e l'incubazione, e registrare il tempo di manipolazione al di fuori della condizione assegnata.

4. Colorazione SA-β-Gal per la validazione (opzionale)

1. Utilizzare la colorazione SA-β-Gal come passaggio opzionale di validazione per confermare che la condizione di senescenza alta mostra un'attività aumentata di SA-β-Gal rispetto al controllo di senescenza bassa. Eseguire la validazione su pozzi paralleli processati nello stesso formato di lastre e seguendo la stessa tempistica di gestione dei pozzi di immagini.
2. Imaging completo in tempo reale per i pozzi di validazione prima della fissazione. Quando si desiderano confronti pre- e post-fissazione dello stesso campo (Figura 2), registrare le coordinate di stadio all'acquisizione, riposizionare manualmente ogni campo dopo fissazione e colorazione, e controllare visivamente la posizione nucleare e la morfologia cellulare per confermare che i campi corrispondono prima di includerli nell'analisi a valle.
3. Fissare le cellule utilizzando la soluzione di fissazione fornita nel kit di colorazione SA-β-Gal preparata alla concentrazione di lavoro raccomandata di 1x contenente il 2% di formaldeide e lo 0,2% di glutaraldeide. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Per riferimento, la soluzione di fissazione contiene formaldeide al 2% (p/v) e 0,2% (p/v) glutaraldeide in soluzione salina tamponata con fosfato. La soluzione di colorazione SA-β-Gal a pH 6,0 contiene 1 mg/mL di X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranoside) disciolto in dimetilformamide immediatamente prima dell'uso, 40 mM di tampone acido citrico / fosfato di sodio a pH 6,0, 5 mM ferrocianuro di potassio, 5 mM ferricianuro di potassio, 150 mM di NaCl e 2 mM ^{di MgCl��12,13}. I kit commerciali che soddisfano queste specifiche possono essere usati in modo intercambiabile, a condizione che il pH del tampone di colorazione sia verificato a 6,0.
4. Rimuovere il fissativo e risciacquare due volte i pozzi con soluzione salina tamponata con fosfato. Aggiungi soluzione di colorazione SA-β-Gal a pH 6.0 contenente substrato X-gal in ogni pozzo.
5. Sigilla la piastra per limitare l'evaporazione durante l'incubazione. Posizionare il piatto in un incubatore privo di CO₂ a 37 °C per 12-16 ore.
6. Ispezionare i pozzi con microscopia a campo chiaro e documentare il modello di colorazione. Acquisire immagini rappresentative per ogni condizione e riportare la frazione di cellule SA-β-Gal-positive per pozzo durante la validazione dei risultati.
   ATTENZIONE: Formaldeide e glutaraldeide sono tossici e volatili. Prepara e usa la soluzione di fissazione in una cappa chimica e indossa l'attrezzatura di protezione individuale appropriata, inclusi guanti, protezione per gli occhi e un camice da laboratorio.
   NOTA: Se la colorazione SA-β-Gal mostra un alto fondo nel controllo senescenza bassa o una colorazione debole nella condizione senescenza-alta, si ripete la validazione dopo aver regolato densità di placcaggio, durata di fissazione, durata di incubazione e coerenza della temperatura, mantenendo il pH del tampone a 6,0.

Risultati

L'applicazione di questo protocollo ai fibroblasti IMR-90 in condizioni di senescenza bassa e senescenza alta produce letture quantitative lisosomiche che possono essere riassunte a livello di singola cellula e, quando richiesto, a livello di tutto il campo.

Il dataset rappresentativo mostrato nelle figure e nelle tabelle deriva da un singolo esperimento biologico che ha confrontato colture IMR-90 al passaggio 13 (P13; senescenza bassa, ~PDL 26) e al passaggio...

Discussione

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di imaging a cellule vive che misura la senescenza tramite rimodellamento lisosomale e fornisce letture quantitative per cellula e per pozzo del carico di senescenza. Alcuni passaggi sono particolarmente importanti per ottenere un test affidabile. Innanzitutto, il modello biologico stesso deve essere ben controllato. L'induzione della senescenza replicativa nei fibroblasti IMR-90 richiede un attento monitoraggio dei raddoppi della popolazion...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)	CellTreat Scientific Products	229124	Qualsiasi piastra di coltura multi-well a fondo chiaro compatibile con l'imaging a fluorescenza di cellule vive (ad esempio, piastre in polistirene TC-treated da 6, 12 o 24 well; le piastre di imaging a fondo in vetro possono essere preferite per un imaging ad alta risoluzione).
Beta-galattosidasi staining kit (test di senescenza)	Cell Signaling Technology	9860	Qualsiasi kit commerciale SA-β-galattosidasi con buffer di staining verificato a pH 6,0. Per riferimento, la soluzione di fissazione contiene il 2% di formaldeide e lo 0,2% di glutaraldeide in PBS, e la soluzione di staining contiene 1 mg/mL di X-gal in DMF, 40 mM citrato/fosfato pH 6,0, 5 mM potassio ferrocianuro, 5 mM potassio ferricianuro, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2.
BioRender (software di illustrazione scientifica)	BioRender	N/A — applicazione web	Utilizzato per creare figure schematiche (Figure 1-3). https://www.biorender.com
Anidride carbonica gassosa (CO2), bombola compressa	Airgas (o fornitore simile)	N/A	CO2 di grado medico utilizzato per mantenere un'atmosfera al 5% nell'incubatore per colture cellulari e nella camera di imaging sul palco.
Siero fetale bovino (FBS), inattivato termicamente	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	Qualsiasi FBS di grado per colture cellulari, inattivato termicamente a 56 °C; utilizzato al 10% v/v nel mezzo di coltura completo.
Microscopio a fluorescenza con capacità di cellule vive	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	Qualsiasi microscopio a fluorescenza a campo ampio o confocale con controllo della temperatura e del CO2 per cellule vive, set di filtri per i canali far-red (eccitazione ~647 nm / emissione ~670 nm) e DAPI/Hoechst (eccitazione ~405 nm / emissione ~460 nm), e un obiettivo 20x-40x con NA sufficiente per risolvere le caratteristiche lisosomiali. In questo studio è stato utilizzato il sistema di imaging EVOS M7000.
Hoechst 33342 colorazione nucleare	Thermo Fisher Scientific	H3570	Colorante per DNA permeabile alle cellule per colorazione nucleare in cellule vive (fluorescenza blu, eccitazione ~405 nm). Non intercambiabile con DAPI, che non è permeabile alle cellule in condizioni fisiologiche.
Software di analisi delle immagini	Python Software Foundation	N/A	Qualsiasi ambiente di calcolo scientifico che supporti la segmentazione del nucleo, l'espansione della regione nucleo-cellulare, la soglia di intensità e le statistiche di base dell'immagine (ad esempio, Python con scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). Il pipeline SenTrack (vedi File Supplementare S1) è stato sviluppato per questo studio.
Fibroblasti polmonari umani IMR-90 (linea cellulare)	ATCC	CCL-186	Linea cellulare di fibroblasti diploidi fetali umani normale usata per modellare la senescenza replicativa; può essere sostituita da qualsiasi linea di fibroblasti umani caratterizzata in modo simile.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	Dye fluorescente acidotropo per la colorazione in vivo di organelli acidi; fornito come stock 1 mM in DMSO. La concentrazione di lavoro è 75nM nei media di coltura cellulare preparati. L'emissione far-red (ex 647 nm / em 668 nm) minimizza la sovrapposizione con l'autofluorescenza della lipofuscina ma non l'eliminazione.
Medium essenziale minimo (MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	Medium di coltura basale per fibroblasti IMR-90; integrato con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina. Qualsiasi formulazione standard di Medium Essenziale Minimo di Eagle con sali di Earle e L-glutammina può essere sostituito.
Soluzione di penicillina-streptomicina (100x)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	Supplemento antibiotico per mezzo di coltura completo; utilizzato al 1% v/v (concentrazione finale 100 U/mL penicillina, 100 μg/mL streptomicina). Qualsiasi soluzione pen-strep standard può essere sostituita.
Medium di imaging privo di rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	DMEM o HBSS privo di rosso fenolo utilizzato per l'imaging di cellule vive per ridurre la fluorescenza di fondo durante l'acquisizione. Il FluoroBrite DMEM è una delle opzioni comunemente usate; può essere sostituito da qualsiasi buffer di imaging privo di rosso fenolo integrato con 10% FBS.
Soluzione tampone fosfato (PBS), pH 7,4 (1x)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	Buffer isotonico per il lavaggio delle cellule e la diluizione dei reagenti; può essere sostituito da qualsiasi PBS sterile 1x a pH 7,4.
SenTrackLite v0.5.0 (software)	Open-Source (Estrada / Melendez Lab)	v0.5.0	Applicazione Python / Tkinter open-source con file singolo per l'analisi di immagini di senescenza lisosomiale. Distribuito come File Supplementare S1. Archiviato su Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. Licenza MIT. Fonte: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
Camera ambientale sul palco	Thermo Fisher Scientific	AMC2000	Camera ambientale per imaging in vivo su microscopio con controllo della temperatura (37 °C) e CO2 (5%). In questo studio è stato utilizzato l'Incubatore EVOS Onstage; può essere sostituito da qualsiasi incubatore sul palco equivalente.