Stabilire una co-cultura epiteliale-endoteliale polmone su chip per l'indagine in condizioni sane e BPCO

Sommario

Questo protocollo stabilisce un sistema dinamico di co-coltura polmonare su chip che combina cellule epiteliali primarie delle vie aeree umane e cellule endoteliali microvascolari polmonari per due modelli: modello sano e modello BPCO. Il sistema riproduce le interazioni via aeree-vascolari sotto interfaccia aria-liquido e flusso di scorrenza, e fornisce valutazione della barriera, fenotipizzazione cellulare e analisi dell'RNA.

Abstract

Sono stati sviluppati due modelli dinamici di co-coltura polmonare su chip per ricreare l'interfaccia via aerea–vascolare incorporando cellule endoteliali primarie delle vie aeree e cellule endoteliali microvascolari polmonari. Un modello utilizza cellule commercialmente disponibili da donatori sani, mentre l'altro impiega cellule derivate da pazienti con broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), consentendo il confronto diretto di condizioni sane e malate in condizioni di coltura identiche. Entrambi i modelli supportano la differenziazione epiteliale in condizioni di perfusione continua e interfaccia aria-liquido (ALI), risultando in una barriera epiteliale fisiologicamente rilevante sostenuta da uno strato endoteliale sottostante. Il flusso di lavoro include il rivestimento della matrice extracellulare, la semina cellulare, l'istituzione di ALI, la valutazione della funzione barriera, il fenotipaggio cellulare e l'estrazione di RNA specifica per tipo cellulare. I saggi di permeabilità hanno dimostrato robusta integrità della barriera in entrambi i sistemi, mentre l'immunofluorescenza ha confermato la localizzazione continua di Zonula Occludens-1 (ZO-1) e della caderina endoteliale vascolare (VE-cadherina) alle giunzioni cellulari. La differenziazione epiteliale è stata confermata tramite la colorazione con β-tubulina IV e la visualizzazione del battito ciliare. Da ciascun compartimento è stato ottenuto RNA di alta qualità, supportando analisi molecolari specifiche per tipo cellulare. Il modello BPCO ha ripresentato caratteristiche chiave della malattia, in particolare una maggiore produzione di muco, senza compromettere la funzione della barriera o la vitalità cellulare. L'uso di cellule epiteliali ed endoteliali derivate dal paziente preserva le caratteristiche patologiche individuali, consentendo di indagare i meccanismi intercellulari nella BPCO. Questo approccio offre un'alternativa fisiologicamente rilevante ai modelli statici in vitro e animali e supporta studi preclinici su farmaci inalati, esposizione a patogeni e interazioni epiteliali-endoteliali. È importante sottolineare che i modelli polmone su chip sani e BPCO possono essere utilizzati sia in combinazione per studi comparativi diretti sia indipendentemente per indagini meccanicistiche, test terapeutici e scoperta di farmaci. Il sistema può anche essere adattato ad altre condizioni respiratorie che coinvolgono compartimenti epiteliali o endoteliali alterati, offrendo una piattaforma versatile e traslazionale per la ricerca respiratoria.

Introduzione

L'interazione tra le cellule epiteliali delle vie aeree e le cellule endoteliali microvascolari polmonari è essenziale per mantenere l'omeostasi polmonare e coordinare le risposte a lesioni, infezioni e infiammazione. Insieme, questi tipi cellulari formano una barriera funzionale che regola lo scambio gasso, la sorveglianza immunitaria e la permeabilità vascolare. La loro diafonia dinamica coinvolge segnalazioni paracrine, interazioni dirette cellula-cellula e risposte a stimoli meccanici, tutti elementi fondamentali per la funzione polmonare e l'integrità^{strutturale 1}.

Nella broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), un disturbo polmonare progressivo caratterizzato da infiammazione cronica, rimodellamento delle vie aeree e distruzione dell'interfaccia alveolare–capillare, la funzione barriera sia dell'epitelio delle vie aeree che dell'endotelio vascolare polmonare è compromessa e accompagnata da un rilascio aberrante di citochine e da meccanismi di riparazione dei tessuti^{disregolati 2,3}. Tuttavia, l'interazione tra cellule endoteliali epiteliali delle vie aeree e cellule endoteliali microvascolari polmonari rimane poco compresa. Questa limitazione è dovuta in parte alle carenze dei modelli in vitro e in vivo esistenti. Sebbene i modelli animali abbiano fornito importanti intuizioni sulla fisiologia e patologia respiratoria, la loro rilevanza è limitata dalle differenze interspecie nella funzione immunitaria, nell'architettura polmonare, nella segnalazione cellulare e nel metabolismo dei farmaci, che possono ostacolare la traduzione nella biologia umana.

I sistemi convenzionali in vitro, come le colture bidimensionali (2D) di linee cellulari epiteliali delle vie aeree immortalate, non riescono a riprodurre caratteristiche chiave dell'epitelio delle vie aeree, inclusa una corretta differenziazione e risposta biomeccanica. Sebbene le monocolture tridimensionali (3D) di interfaccia aria–liquido (ALI) delle cellule epiteliali primarie delle vie aeree migliorino la rilevanza fisiologica, rimangono statiche e privano di interazioni con altri tipi cellulari e stimoli^{meccanici 4}. Il polmone è un organo dinamico continuamente esposto al flusso d'aria, allo stress da taglio, alla rigidità della matrice extracellulare e all'allungamento ciclico generato dalla respirazione. Questi fattori influenzano fortemente il comportamento cellulare e il rimodellamento dei^{tessuti 5}. Pertanto, i modelli statici sono insufficienti per replicare processi come l'adesione dei leucociti, il traffico di cellule immunitarie e le risposte in tempo reale all'esposizione ai farmaci.

Per affrontare queste limitazioni, sono emerse piattaforme organo-on-a-chip come sistemi avanzati per modellare interazioni cellulari complesse. I modelli polmone su chip integrano la tecnologia microfluidica con cellule di origine umana per replicare caratteristiche strutturali e meccaniche chiave del microambiente polmonare. Queste piattaforme permettono la co-coltura di cellule endoteliali epiteliali delle vie aeree e vascolari polmonari all'interno di un ambiente dinamico tridimensionale che imita più da vicino le condizioni in vivo ⁶. L'integrazione di movimenti fisiologici di respirazione, flusso di fluidi e monitoraggio in tempo reale migliora lo studio della comunicazione epiteliale–endoteliale sia in condizioni normali che malate^7–9.

Nonostante questi progressi, la maggior parte dei sistemi polmonari su chip esistenti si basa su cellule derivate da donatori^{sani 10}, limitandone la capacità di modellare interazioni specifiche per malattia. Inoltre, molte piattaforme non hanno la flessibilità di incorporare cellule derivate dal paziente o di ricreare il complesso microambiente della BPCO. Inoltre, i protocolli dettagliati per la co-coltura di cellule endoteliali epiteliali primarie delle vie aeree e microvascolari polmonari—sia provenienti da fonti commerciali che da pazienti con BPCO—utilizzando rivestimenti della matrice extracellulare (ECM) specifici per tipo cellulare rimangono limitati.

In questo studio, è stata utilizzata una piattaforma microfluidica a due canali a due canali polmonari su chip per stabilire due modelli di co-coltura comprendenti cellule epiteliali primarie delle vie aeree e cellule endoteliali microvascolari polmonari. Un modello sano è stato generato utilizzando cellule commercialmente disponibili derivate da diversi donatori, mentre un modello per la BPCO è stato stabilito utilizzando cellule epiteliali delle vie aeree ed endoteliali ottenute dallo stesso paziente. Entrambi i modelli utilizzano un rivestimento ECM specifico per tipo di cellula per imitare meglio il microambiente polmonare in vivo. Questi sistemi consentono di studiare le interazioni epiteliali-endoteliali in condizioni fisiologiche e patologiche. I modelli sani e BPCO possono essere utilizzati sia in combinazione per studi comparativi diretti sia indipendentemente per indagini meccanicistiche e test terapeutici.

Questo sistema di co-coltura riflette l'organizzazione anatomica dell'epitelio delle vie aeree e della vascolatura polmonare, che funzionano come un'unità integrata epitelio-endoteliale. L'epitelio delle vie aeree è uno strato pseudostratificato composto da cellule basali, secretorie e ciliate, situato sopra uno strato di tessuto congiuntivo vascolarizzato (lamina propria) e separato dall'endotelio da una membrana basale. In questo modello, il rivestimento ECM (collagene tipo I, fibronectina e laminina) approssima la composizione delle membrane basale epiteliali ed endoteliali. La membrana porosa che separa i due canali imita il tessuto connettivo subepiteliale, sebbene non abbia complessità vascolare. Molteplici meccanismi contribuiscono alla comunicazione epiteliale–endoteliale, tra cui la segnalazione paracrina, la regolazione coordinata della permeabilità, il reclutamento delle cellule immunitarie e le risposte a stimoli meccanici come l'allungamento indotto dalla respirazione, che influenzano la resistenza vascolare e le vie meccanotrasduzionali.

Questo studio metodologico delinea i passaggi necessari per stabilire un epitelio delle vie aeree completamente differenziato, coltivato in condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI) con un endotelio microvascolare polmonare sottostante. Il sistema consente una valutazione qualitativa e funzionale dell'integrità della barriera, raggiungendo valori di permeabilità apparente riproducibile (Papp) ≤ 1 × 10⁻⁶ cm/s. Inoltre, sono previsti protocolli per la fenotipizzazione cellulare e per l'estrazione e quantificazione dell'RNA da ogni compartimento, che producono costantemente RNA di alta qualità (numero di integrità dell'RNA > 7). Questo metodo non è destinato all'analisi quantitativa dell'mRNA o alla valutazione dettagliata della produzione di muco, né indaga gli effetti dello stiramento meccanico, sebbene tali applicazioni siano possibili con questo sistema.

Protocollo

Tutto l'uso di cellule umane primarie è stato approvato dal Comitato Etico Locale per la Ricerca UZ Leuven (S51577/S57114/S70453). Cellule bronchiali primarie umane (HBEC) e cellule endoteliali microvascolari polmonari (HPMEC) disponibili commercialmente sono state prelevate da due donatori non fumatori (Tabelle Supplementari 1, 2). Le cellule primarie per il modello BPCO sono state isolate da tessuto polmonare espiantizzato di tre pazienti con BPCO con una storia di fumo (Tabella Supplementare 3), secondo un protocollo ben consolidato (approvazione etica S51577) e conservate nella biobanca BREATHE. Sia HBEC che HPMEC sono stati ottenuti dallo stesso paziente con BPCO.

Per stabilire il modello sano di polmone su chip, sono stati utilizzati HBEC e HPMEC commerciali. Per il modello BPCO, le cellule endoteliali bronchiali primarie e microvascolari polmonari sono state isolate da tessuto polmonare espiantato, ottenuto dallo stesso paziente dopo il trapianto polmonare. Il sistema polmone su chip utilizzato in questo studio è una piattaforma microfluidica a due canali composta da microcanali paralleli delle vie aeree (superiori) e vascolari (inferiori), separati da una membrana porosa rivestita da matrice extracellulare (Figura 1). Lo stesso protocollo è stato utilizzato per costruire sia modelli sani che BPCO. Le sostanze chimiche, i reagenti e i kit utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Stabilimento dei modelli di co-cultura polmone su chip sotto flusso laminare

1. Preparazione delle chips
   1. Posiziona la culla per chip in una teglia di coltura cellulare quadrata da 120 mm, con gli angoli rivolti verso l'alto, per garantire la corretta orientazione, poi inserisci i chip nella culla. Assicurati che tutti i chip siano posizionati correttamente prima della fase di attivazione (Figura 2).
   2. Preparare la soluzione di attivazione dissolvendo la polvere del reagente di attivazione nel corrispondente tampon, entrambi forniti dal produttore, per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mg/mL.
   3. Attiva le superfici interne dei canali del chip per favorire l'attacco della matrice extracellulare (ECM) introducendo con cura circa 35 μL della soluzione di attivazione attraverso l'ingresso inferiore del canale. Pipetta finché la soluzione non inizia a uscire dall'uscita del canale inferiore. Ripete la procedura introducendo circa 50 μL della soluzione nell'ingresso superiore del canale.
      NOTA: La polvere del reagente di attivazione è fotosensibile. Prepara la soluzione di attivazione immediatamente prima dell'uso e scarta qualsiasi soluzione residua 1 ora dopo la ricostituzione.
   4. Rimuovere tutta la soluzione di attivazione in eccesso dalla superficie del chip tramite una lieve aspirazione. Assicurati di rimuovere solo la soluzione di attivazione dalla superficie del chip — non aspirarla dai canali.
      NOTA: Prima dell'attivazione ultravioletta (UV), ispezionare i canali al microscopio per rilevare bolle. Se ce ne sono, spostale lavandole delicatamente con una soluzione attivante finché tutte le bolle non saranno rimosse.
   5. Esponi i chip a una lampada UV per 10 minuti, poi lava ogni canale due volte con 200 μL del corrispondente buffer.
   6. Pipettare una soluzione di attivazione fresca in entrambi i canali come descritto sopra ed esporre i chip ai raggi UV per altri 5 minuti.
   7. Aspirare completamente la soluzione da entrambi i canali, lavare ciascun canale due volte con 200 μL di corrispondente tampone, poi lavare ogni canale una volta con 200 μL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato freddo senza Ca²⁺ e Mg²⁺ (DPBS -/-).
   8. Prepara una soluzione di rivestimento ECM in DPBS (-/-) contenente collagene umano tipo I (100 μg/mL), fibronectina umana (50 μg/mL) e laminina umana (50 μg/mL). Usa 100 μL di soluzione come volume di riferimento per chip.
   9. Aggiungere 50 μL al canale superiore e 35 μL al canale inferiore, aspirando contemporaneamente il flusso di uscita attraverso le porte di uscita.
      NOTA: Ispeziona i canali al microscopio per rilevare eventuali bolle. Se presente, lava delicatamente con la soluzione ECM per rimuoverli.
   10. Lasciare piccole gocce di soluzione ECM sia sulle porte di ingresso che di uscita del canale per evitare l'evaporazione durante l'incubazione notturna (ON).
   11. Incubare i chips a 37 °C con il 5% di CO₂. Il giorno successivo, aspirare la soluzione ECM e lavare entrambi i canali con 200 μL di DPBS preriscaldato (-/-) a 37 °C.
2. Semina cellulare e coltura sommersa
   Espandere l'HBEC in 2 fiaschette di T25 cm rivestite con collagene umano tipo IV (150 μg/mL in DPBS (-/-)) utilizzando un mezzo di espansione cellulare epiteliale delle vie aeree fino a raggiungere una confluenza del 60%–70%.
   In parallelo, espandere HPMEC in T75^{cm 2} fiasche rivestite di gelatina (2 mg/mL in DPBS (-/-)) utilizzando un mezzo di crescita delle cellule endoteliali (EC) fino a raggiungere una confluenza del 90%–100%.
   Consulta la Tabella Supplementare 4 per la composizione dei principali reagenti e dei mezzi di coltura.
3. Semina HPMEC
   1. Aspira il substrato. Lavare le celle con 10 mL DPBS (-/-).
   2. Aggiungi 3 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% (1X). Incubare per 30 secondi a temperatura ambiente (RT).
   3. Aggiungere 12 mL di mezzo di crescita EC (4× il volume di tripsina utilizzato) per inattivare la tripsina. Aggiungere 5 mL di mezzo di crescita EC per raccogliere eventuali cellule residue (volume finale = 20 mL).
   4. Confermare il distacco cellulare completo al microscopio.
   5. Prendi ~20 μL per contare le cellule vive usando il blu di tripano.
   6. Centrifugare la sospensione a celle di rimanenza a 900 × g per 5 minuti a RT in un tubo conico da 50 mL.
   7. Risospendi il pellet nel mezzo di crescita EC. Regola a 7 × 10⁶ cellule/mL.
   8. Semina HPMEC (passaggio 5) nel canale inferiore (~20 μL; 1,4 × 10⁵ celle/canale).
   9. Invertire immediatamente i chips e incubare per 2 ore a 37 °C con il 5% di CO₂ (Figura 3).
   10. Riporta i chip all'orientamento originale.
   11. Lavare con un mezzo di crescita EC caldo da 200 μL (37°C).
   12. Verifica l'attacco al microscopio. Estendi l'incubazione se necessario.
4. Testa di serie HBEC
   1. Aspira il substrato. Lavare con 5 mL di DPBS caldo (-/-).
   2. Aggiungi 1 mL di tripsina. Incubare per 5 minuti a 37 °C con il 5% di CO₂.
   3. Monitora il distacco sotto il microscopio.
   4. Aggiungere 1 mL di inibitore della tripsina definito (DTI) con un rapporto 1:1 per inattivare la tripsina.
   5. Aggiungere 8 mL di mezzo di espansione delle cellule epiteliali delle vie aeree (volume finale = 10 mL).
   6. Trasferisci su un tubo da 50 mL.
   7. Prendi ~20 μL per il conteggio delle cellule usando il blu di tripano.
   8. Centrifuga la sospensione a celle rimanenti a 200 × g per 5 minuti in RT.
   9. Scartate il soprannatante.
   10. Risospendere il pellet nel mezzo di espansione delle cellule epiteliali delle vie aeree. Regola a 3,5 × 10⁶ celle/mL.
   11. Integrare il mezzo di espansione delle cellule epiteliali delle vie aeree con acido retinoico sintetico a temperatura luminosa da 50 nM e 10 ng/mL fattore di crescita epidermica umana ricombinante (rhEGF).
   12. Inserire HBEC (passaggio 2) nel canale superiore (~35 μL; 1,2 × 10⁵ celle/canale).
   13. Incubare per 4 ore a 37 °C con il 5% di CO₂ (Figura 4).
   14. Sostituisci il mezzo in entrambi i canali.
   15. Incubare durante la notte (ON) in condizioni statiche a 37 °C con il 5% di CO₂.
       NOTA: Da questo passaggio in poi, utilizzare solo il mezzo degassato, per tutti i passaggi. La degassazione deve essere effettuata con un'unità Steriflip collegata a un sistema a vuoto per minimizzare il rischio di formazione di bolle nel chip.
5. Connessione al flusso
   1. Aggiungere un mezzo di espansione epiteliale delle vie aeree caldo (37°C) integrato con acido retinoico sintetico stabile alla luce e rhEGF al serbatoio superiore dell'ingresso.
   2. Aggiungi mezzo di crescita EC caldo (37°C) al serbatoio inferiore dell'ingresso.
   3. Riempire ogni serbatoio di ingresso con un mezzo da 3 mL e ogni serbatoio di uscita con 300 μL.
   4. Inserire i moduli portatili nel modulo di cultura (Figura 5).
   5. Premi la manopola per selezionare il ciclo "Prime" usando la manopola rotante.
   6. Premi la manopola per avviare il ciclo.
   7. Lascia che il ciclo proceda (~1 minuto).
   8. Ispezionare il fondo di ogni modulo per trovare gocce in tutte e quattro le porte fluidiche.
   9. Ripeti il ciclo "Prime" se le gocce non sono visibili.
   10. Lava entrambi i canali a chip una volta con il mezzo appropriato.
   11. Lascia una goccia su ogni porta di ingresso e uscita per evitare la formazione di bolle.
   12. Tieni il chip nella mano dominante e il modulo portatile nell'altra.
   13. Fai scivolare il chip nelle guide finché non si sistema completamente.
   14. Inserire l'unità assemblata nel modulo di cultura.
   15. Imposta la portata a 30 μL/h per entrambi i canali utilizzando la manopola rotante.
   16. Mantenere le condizioni di interfaccia liquido-liquido (LLI).
   17. Tieni i chip al modulo sotto interfaccia liquido-liquido (LLI) per permettere la formazione uniforme degli strati epiteliali ed endoteliali
   18. Sostituisci il medium ogni 3 giorni. Aspira il mezzo dai serbatoi di uscita. Aggiungi 3 mL di mezzo fresco a ogni serbatoio di ingresso.
       NOTA: Controlla le bolle al microscopio. Se presente, scollega il chip, risciacqua i canali con il mezzo e ricollega.
6. Differenziazione delle cellule epiteliali e coltura dell'interfaccia aria-liquido
   1. Monitorare le cellule quotidianamente al microscopio.
   2. Confermare la formazione di uno strato cellulare epiteliale omogeneo senza spazi (tipicamente 3–5 giorni).
   3. Stabilire l'interfaccia aria-liquido (ALI).
   4. Aspira il mezzo dai serbatoi di ingresso e uscita superiori.
   5. Elimina il materiale residuo dal canale superiore aumentando la portata a 600μL/h usando la manopola rotante
   6. Aspira rapidamente il mezzo dai serbatoi di uscita superiori.
   7. Aspira il mezzo dai serbatoi di ingresso inferiori.
   8. Aggiungere 3 mL di mezzo di differenziazione epiteliale integrato con 10 ng/mL di fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e 1 μg/mL di vitamina C.
   9. Imposta il canale superiore su "air" usando la manopola rotante.
   10. Imposta la portata del canale inferiore a 30 μL/h.
   11. Mantieni la cultura ALI per 2 settimane.
   12. Osserva lo sviluppo della differenziazione epiteliale al microscopio.
   13. Confermare la formazione di un epitelio pseudostratificato. Monitorare il battito delle ciglia e la produzione di muco.
   14. Monitorare la morfologia delle cellule endoteliali nelle regioni di ingresso e uscita.

Figura 1: Piattaforma microfluidica polmone su chip. Sezione trasversale (a sinistra) e vista dall'alto (a destra) del dispositivo microfluidico a due canali polmone su chip. Le illustrazioni schematiche sono fornite solo a scopo illustrativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Posizionamento del chip nella culla del chip. Immagine rappresentativa che mostra l'orientamento corretto della culla del chip e la posizione del chip. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Semina delle cellule endoteliali nel chip microfluidico. Immagini rappresentative in campo chiaro delle cellule endoteliali microvascolari polmonari immediatamente dopo la semina (A) e dopo 2 ore di incubazione (B). Barra di scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Semina delle cellule epiteliali delle vie aeree nel chip microfluidico.
Immagini rappresentative in campo chiaro delle cellule epiteliali delle vie aeree immediatamente dopo la semina (A) e dopo 4 ore di incubazione (B). Barra di scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Configurazione del sistema microfluidico polmone su chip.
La parte superiore della figura mostra il modulo portatile con quattro serbatoi (due ingressi e due uscite) utilizzati per l'alimentazione del mezzo e la raccolta degli effluenti. Il dispositivo microfluidico è collegato a un modulo di coltura che regola le portate e a un modulo hub che fornisce gas, aria ed energia. La rappresentazione schematica è fornita solo a scopo illustrativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Valutazione dell'integrità delle barriere

L'integrità della barriera è stata valutata in due modi: primo, funzionalmente, valutando la permeabilità al destrono marcato fluorescente nel tempo (prima dell'ALI e dopo 10 giorni di ALI), e in secondo luogo, qualitativamente, tramite immunorilevamento di Zonula Occludens-1 (ZO-1) nell'epitelio bronchiale e della Vascular Endotelial-cadherin (VE-cadherina) nell'endotelio vascolare polmonare.

1. Funzione barriera
   1. Sotto il flusso laminare, aggiungere 1 mL di mezzo di differenziazione epiteliale integrato con VEGF e vitamina C e contenente 100 μg/mL di destrano marcato fluorescente nel serbatoio superiore dell'ingresso del canale aereo. Contemporaneamente, aggiungere 1 mL di mezzo senza tracciatori al serbatoio di ingresso inferiore del canale vascolare.
   2. Introduci il mezzo contenente il tracciante nel canale superiore. Utilizzando il quadrante rotante, imposta la portata in entrambi i canali a 600 μL/h per 3 minuti, poi aspira il mezzo sia dal serbatoio di uscita superiore che da quello inferiore.
   3. Rimetti il chip, collegato al modulo portatile, nel modulo di cultura. Utilizzando la manopola rotante, imposta entrambi i canali a una portata di 45 μL/h e mantieni questa portata per 3 ore.
   4. Raccogliere 100 μL di mezzo dai serbatoi di uscita superiore e inferiore e misurare l'intensità di fluorescenza utilizzando un lettore di piastre.
   5. Calcola la permeabilità apparente (Papp) usando l'equazione di permeabilità:
      
      dove SA rappresenta l'area superficiale del canale di co-coltura (0,17 cm²), Q_R e_{Q D} indicano rispettivamente i flussi del fluido nei canali di dosaggio e ricezione (cm³/s) e C_R,0 & C_D,0 corrispondono rispettivamente alle concentrazioni recuperate nei canali di dosaggio e ricezione.
      NOTA: Un valore di Papp inferiore a 1 x ^10-6 cm/s indica una forte integrità della barriera, riflettendo una bassa permeabilità dello strato epiteliale al tracciatore. Questa soglia è stabilita dal produttore del sistema come misura interna di controllo qualità.
2. Immunorilevamento delle giunzioni strette e aderenti
   1. Dopo 2 settimane di ALI, rimuovi con cura il chip dal modulo portatile.
   2. Fissare le celle aggiungendo 50 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% su entrambi i canali per 20 minuti a RT.
      ATTENZIONE: La PFA è tossica; Esegui tutti i passaggi in una cappa chimica certificata.
   3. Lavare entrambi i canali due volte con 200 μL di DPBS (-/-) e conservare i trucioli a 4 °C fino alla macchia.
   4. Permeabilizza le cellule aggiungendo 50 μL di 0,1% di Triton X-100 in DPBS (-/-) per 5 minuti a RT. Poi bloccare con 50 μL 0,1% di Triton X-100 in DPBS (-/-) contenente il 10% di siero di capra, per canale per 1 ora a RT.
   5. Incubare il canale superiore (epiteliale bronchiale) con 50 μL dell'anticorpo primario ZO-1 monoclonale anti-umano (1:100) e il canale inferiore (endoteliale vascolare polmonare) con 50 μL di anticorpo primario monoclonale anti-umano VE-cadherina del coniglio (1:600).
   6. Diluire entrambi gli anticorpi in soluzione anticorpale (0,1% Triton X-100 in PBS (-/-) con siero di capra all'1%) e incubare ON a 4°C in condizioni statiche.
   7. Lava i chip tre volte con 200 μL di DPBS (-/-). Poi incubare ciascun canale per 1 ora a RT con 50 μL di anticorpi secondari coniugati con fluorofori adeguati, diluiti in soluzione anticorpale (1:500): anticorpo secondario anti-topo di capra nel canale superiore e anti-coniglio anti-anticorpo di capra nel canale inferiore.
   8. Lavare entrambi i canali tre volte con 200 μL DPBS (-/-). Eseguire la colorazione nucleare con 50 μL per ogni canale di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1 μg/mL in DPBS (-/-)) per 10 minuti a RT.
   9. Eseguire un lavaggio finale con 200 μL di DPBS (-/-) e conservare il chip in DPBS (-/-) a 4°C al buio fino all'immaginione.
   10. Immagini i trucioli sui coli (20x60 mm con spessore 0,16-0,19 mm) utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita dotato di modulo a disco rotante, una fotocamera ad alta sensibilità e un obiettivo 20X (NA 0,8). Utilizzare software appropriati per acquisizione e analisi delle immagini per la post-elaborazione.

3. Fenotipizzazione

1. Preparazione delle sezioni a scheggiature
   1. Fissare i chip con il 4% di PFA come descritto nella sezione 2.2.2.
   2. Taglia via il polidimetilsossiano circostante (PDMS) dal chip usando una lametta.
   3. Riempire entrambi i canali con 50 μL di agarosio al 2% a bassa fusione in DPBS (-/-), e lasciare che l'agarosio si solidifichi a RT.
   4. Taglia il truciolo trasversalmente in due parti con una lametta, inserisci ciascuna metà in un mezzo di incasaggio a temperatura ottimale (OCT) e conserva a −80 °C fino alla sezione.
2. Criosezione
   1. Prepara un criostato e taglia criosezioni da 200 μm dalle due parti del chip.
   2. Raccogli le sezioni a scheggia con una pinzetta in pozzi di una piastra da 48 pozzi riempita con DPBS (-/-) e conservale a 4 °C fino all'immunocolorazione.
3. Colorazione immunofluorescente
   NOTA: Esegui ogni passaggio nella piastra a 48 pozzi, utilizzando 400 μL come volume di riferimento.
   1. Permeabilizza le cellule e blocca il legame aspecifico come descritto in precedenza nella sezione 2.2.4.
   2. Incubare ogni sezione ON a 4°C con anticorpi primari specifici per cellule ciliate epiteliali (β-tubulina IV, 1:2000) o per cellule endoteliali (CD31, 1:25), diluite in soluzione anticorpale (0,1% Triton X-100 in DPBS con siero di capra all'1%).
   3. Lava le sezioni tre volte con DPBS (-/-).
   4. Incubare sezioni per 1 ora a RT con anticorpi secondari anti-topo anti-topo coniugati con fluorofori (1:500) per β-tubulina IV e CD31, diluiti in soluzione di anticorpi, protetti dalla luce.
   5. Lavare le sezioni tre volte con DPBS (-/-) ed eseguire la colorazione nucleare con DAPI (1 μg/mL in DPBS (-/-)) per 10 minuti a RT.
   6. Lava le sezioni una volta con DPBS (-/-) prima di montarle.
   7. Usando una pinzetta, posiziona un distanziatore su ogni vetrata del microscopio, poi posiziona una sezione al centro. Aggiungi 1–2 gocce di mezzo di montaggio e metti un copertino circolare.
   8. Lasciali asciugare AL buio al RT, poi sigillare i bordi del copertino con uno smalto trasparente.
   9. Conserva i vetrini a 4°C al buio fino all'imaging (imagining).
   10. Immagini delle sezioni dei chip utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita, dotato di modulo a disco rotante, una fotocamera ad alta sensibilità e un obiettivo 40X (NA 1.25). Elabora le immagini utilizzando software di microscopia appropriato.

4. Estrazione e quantificazione dell'RNA

1. Raccolta di celle da chip sotto flusso laminare
   1. Dopo 2 settimane di coltura ALI, scollega i chip dai moduli portatili e lava entrambi i canali due volte con 200 μL di DPBS (-/-) preriscaldato a 37 °C.
   2. Aggiungere 35 μL di 0,25% di Tripsina-EDTA (1X) alle cellule endoteliali nel canale inferiore e incubare per circa 30 secondi in RT.
   3. Ispezionare le cellule al microscopio per confermare il distacco completo. Poi raccogli la sospensione della cella in un tubo e centrifuga a 900 × g per 5 minuti a RT.
   4. Risospendere il pellet cellulare in 50 μL di reagente di isolamento a base di fenolo e conservare a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.
   5. Aggiungere 50 μL di reagente di isolamento a base di fenolo direttamente nel canale superiore per lisare le cellule epiteliali, sigillare le porte con le punte e incubare sul ghiaccio per 3-4 minuti.
   6. Pipetta delicatamente per garantire una lisi completa, raccogli il lisato in un tubo e conservalo a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.
   7. Ispezionare entrambi i canali al microscopio per confermare la completa raccolta cellulare.
2. Estrazione di RNA
   1. Aggiungere cloroformio (0,2 volume per 1 volume di reagente isolante a base di fenolo usato per la lisi; 10 μL per campione), mescolare accuratamente i tubetti scuotendoli e incubare sul ghiaccio per 2-3 minuti.
   2. Centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C per separare le fasi e trasferire con cura la fase acquosa superiore in un nuovo tubo senza disturbare l'interfase. Successivamente, si aggiungono 5 μg di glicogeno privo di RNA alla fase acquosa come vettore.
   3. Aggiungere isopropanolo (0,5 volume per 1 volume di reagente di lisi; 25 μL per campione), incubare i campioni a 4 °C per 10 minuti e centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
   4. Scartare il soprandanante mantenendo il pellet di RNA.
3. Lavaggio e risospensione dell'RNA
   1. Lavare il pellet di RNA con etanolo al 75% (1 volume ogni 1 volume di reagente di lisi; 50 μL per campione), il vortice brevemente e centrifugare a 7.500 × g per 5 minuti a 4 °C.
   2. Scartare il sovrantantante e lasciare asciugare il pellet all'aria per 5–10 minuti.
   3. Risospendere l'RNA in 30 μL di acqua priva di RNasi tramite pipetatura delicata e conservare l'RNA a -80 °C fino a un ulteriore utilizzo.
   4. Valutare l'integrità e la quantificazione dell'RNA utilizzando un sistema di separazione degli acidi nucleici a microfluidico basato su chip.

Risultati

Stabilizione dei modelli di co-cultura polmone su chip

L'imaging a campo chiaro ha rivelato l'adesione e la crescita cellulare nel tempo nel sistema di co-coltura polmone su chip. Le cellule epiteliali delle vie aeree bronchiali proliferarono in coltura sommersa all'interfaccia liquido-liquido (LLI), formando uno strato uniforme lungo il canale superiore (Figura 6A), mentre le cellule endoteliali vascolari polmonari si espansero coprendo l'intero canale inferiore, formando un monostrato confluente (Figura 6B).

Una volta stabilita la co-coltura, le cellule endoteliali venivano monitorate nelle regioni di ingresso e uscita del canale inferiore, che sono le uniche aree accessibili per l'ispezione microscopica. Come mostrato nella Figura 7, le cellule endoteliali rimasero vitali e presentavano una morfologia allungata allineata con la direzione del flusso. Dopo 14 giorni di coltura ALI, lo strato epiteliale sia nei modelli sani che in quelli con BPCO mostrava un visibile battito ciliare (Video Supplementare). Come previsto, il modello per la BPCO ha mostrato una produzione di muco notevolmente aumentata rispetto al modello sano (Figura 8), riproponendo caratteristiche chiave della patologia della BPCO.

Figura 6: Co-coltura delle cellule epiteliali e endoteliali delle vie aeree nel dispositivo microfluidico.
Immagini rappresentative delle cellule epiteliali bronchiali primarie sulla superficie superiore (A) e delle cellule endoteliali microvascolari polmonari primarie sulla superficie inferiore (B) della membrana porosa in condizioni di interfaccia liquido-liquido (LLI). Barra di scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Cellule endoteliali nel canale microfluidico inferiore durante l'interfaccia aria-liquido.
Immagini rappresentative in campo chiaro che mostrano cellule endoteliali microvascolari polmonari all'ingresso (superiore) e all'uscita (inferiore) del canale inferiore durante l'interfaccia aria-liquido (ALI). Barra di scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Accumulo di muco nel canale aereo.
Immagini rappresentative che mostrano la produzione di muco dopo 14 giorni di interfaccia aria–liquido (ALI) in modelli di co-coltura sani (A) e BPCO (B). Lo strato marrone nel compartimento delle vie aeree rappresenta il muco accumulato. Barra di scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Valutazione quantitativa dell'integrità delle barriere

La valutazione funzionale dell'integrità della barriera ha mostrato una permeabilità apparente (Papp) inferiore sia nei modelli sani che in quelli con BPCO rispetto al controllo positivo (chip rivestito in ECM senza cellule) (Figura 9).

In assenza di cellule, valori elevati di Papp indicavano una formazione minima di barriere. Al contrasto, in presenza di strati epiteliali ed endoteliali, il tracciante fluorescente di destrano non attraversava l'ECM, causando una permeabilità notevolmente ridotta e indicando una barriera forte. Questo effetto è stato osservato sia prima dell'ALI che dopo 10 giorni di ALI, dimostrando che la funzione barriera viene stabilita precocemente durante la differenziazione.

Come mostrato nella Figura 10, nel modello sano, i valori medi di Papp prima dell'ALI erano già al di sotto della soglia indicativa di integrità robusta della barriera (1 × 10⁻⁶ cm/s) e diminuivano ulteriormente durante la cultura dell'ALI. Nel modello BPCO, i valori medi di Papp erano anch'essi all'interno dell'intervallo di barriera forte prima dell'ALI e, sebbene leggermente aumentati dopo 10 giorni di ALI, l'integrità della barriera è rimasta robusta.

Figura 9: Valutazione della funzione barriera nel modello polmone su chip.
Permeabilità apparente (Papp) misurata in chip rivestiti in ECM senza cellule (controllo positivo per perdite; nero), e in modelli sani (rosa) e COPD (verde) prima e dopo 10 giorni di interfaccia aria-liquido (ALI). Ogni punto rappresenta un singolo chip. Il modello sano include cellule provenienti da donatori separati, mentre il modello BPCO utilizza cellule derivate da un singolo paziente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Confronto della funzione barriera in modelli sani e BPCO.
Permeabilità apparente (Papp) misurata prima e dopo 10 giorni di interfaccia aria-liquido (ALI) in modelli di co-coltura sani (sinistra) e BPCO (destra). Ogni punto rappresenta un singolo chip. I valori sono media ± SD. Il modello BPCO include cellule di tre pazienti, mentre il modello sano combina cellule di diversi donatori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Immunorilevamento delle giunzioni strette e aderenti

L'analisi di immunofluorescenza ha confermato l'organizzazione strutturale delle proteine giunzionali. ZO-1 ha mostrato una localizzazione continua lungo i confini delle cellule epiteliali bronchiali, indicando una barriera epiteliale intatta (Figura 11A). Analogamente, la colorazione con VE-cadherina ha rivelato una distribuzione uniforme alle giunzioni endoteliali, coerente con un monostrato endoteliale confluente. Le cellule endoteliali hanno mostrato una morfologia allungata allineata con la direzione del flusso (Figura 11B).

Non sono state osservate differenze tra i modelli sani e quelli con BPCO nella localizzazione delle proteine di giunzione strette e aderente. Questi risultati sono coerenti con i dati sulla barriera funzionale, supportando la presenza di un'interfaccia epiteliale-endoteliale fisiologicamente rilevante con integrità giuntale preservata in entrambi i modelli.

Figura 11: Espressione proteica giuntale nel modello di co-coltura polmone su chip.
Immagini di immunofluorescenza in vista dall'alto ottenute dopo 14 giorni di interfaccia aria-liquido (ALI) che mostrano la localizzazione di ZO-1 nel compartimento epiteliale delle vie aeree (A) e la localizzazione di VE-cadherina nel compartimento endoteliale (B). I nuclei sono colorati con DAPI. La freccia indica la direzione del flusso. Barra di scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fenotipizzazione

La colorazione immunofluorescente delle criosezioni a chip ha rivelato cellule positive alla β-tubulina IV sul lato apicale della membrana, indicando la differenziazione delle cellule epiteliali delle vie aeree in cellule ciliate, una caratteristica distintiva dell'epitelio bronchiale maturo (Figura 12A). La colorazione CD31 ha confermato la presenza di uno strato monoteliale endoteliale confluente lungo il lato basale della membrana (Figura 12B). Questi risultati dimostrano che il sistema di co-coltura supporta l'instaurazione di fenotipi epiteliali ed endoteliali fisiologicamente rilevanti in entrambi i modelli.

Figura 12: Immagini di immunofluorescenza delle sezioni d'urto polmone su chip. Colorazione immunofluorescente rappresentativa delle sezioni trasversali a chip dopo 14 giorni di interfaccia aria–liquido (ALI) che ha mostrato espressione di β-tubulina IV nel compartimento epiteliale delle vie aeree (A) e espressione di CD31 nel compartimento endoteliale (B). I nuclei sono colorati con DAPI. Barra di scala: 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Estrazione e quantificazione dell'RNA

L'RNA isolato da cellule epiteliali delle vie aeree ha prodotto concentrazioni che variavano da 59 a 135 ng/μL, con Numeri di Integrità dell'RNA (RIN⁾¹¹ pari a 7,4–9,6, mentre l'RNA delle cellule endoteliali microvascolari variava da 12 a 46 ng/μL, con valori RIN di 9,6–10, in entrambi i modelli. I dati indicarono che entrambi i modelli raggiunsero quantità sufficienti di RNA di alta qualità, adatte per analisi molecolari a valle.

Tabella supplementare 1: Informazioni sui donatori per le cellule epiteliali delle vie aeree bronchiali. La tabella rappresenta le cellule epiteliali delle vie aeree dei bronchi utilizzate nel modello sano. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Informazioni sui donatori per le cellule endoteliali microvascolari polmonari. Informazioni sul donatore per le cellule endoteliali microvascolari polmonari utilizzate nel modello sano. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Informazioni sul paziente. La tabella rappresenta le informazioni sulle cellule endoteliali epiteliali delle vie aeree e microvascolari polmonari utilizzate nel modello BPCO. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 4: Panoramica dei principali reagenti e dei mezzi di coltura utilizzati nel protocollo.Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare 1: Battito ciliare nel canale delle vie aeree (modello sano).
Video rappresentativo che mostra il battito ciliare dopo 14 giorni di interfaccia aria-liquido (ALI). Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare 2: Battito ciliare nel canale delle vie aeree (modello BPCO).
Video rappresentativo che mostra il battito ciliare dopo 14 giorni di interfaccia aria-liquido (ALI). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo studio presenta un protocollo dettagliato per stabilire un sistema di co-coltura polmonare su chip al fine di generare sia un modello sano, utilizzando cellule endoteliali bronchiali e microvascolari polmonari disponibili in commercio, sia un modello per la BPCO che utilizza cellule derivate dal paziente provenienti da polmoni espiantati. In entrambi i modelli, i due tipi cellulari sono separati da una membrana porosa ed elastica rivestita da una matrice extracellulare specifica per il tipo cellulare (ECM), creando un microambiente che assomiglia maggiormente al polmone in vivo . Il protocollo include anche metodi per valutare l'integrità della barriera, il fenotipaggio cellulare e l'estrazione di RNA da ciascun compartimento. Entrambi i modelli sono stati mantenuti con successo in condizioni di perfusione dinamica e interfaccia aria-liquido (ALI), risultando in una barriera epiteliale-endoteliale fisiologicamente rilevante con un epitelio delle vie aeree pseudostratificate completamente differenziato. Cellule endoteliali allineate con la direzione del flusso, come osservato in vivo, e da entrambi i compartimenti sono stati ottenuti RNA di alta qualità.

Sono essenziali diversi passaggi critici per stabilire con successo questo sistema di co-cultura. È necessaria una semina precisa delle cellule epiteliali per ottenere una copertura uniforme, poiché una distribuzione non uniforme può portare a una copertura superficiale incompleta e a una formazione di barriere compromessa. In tali casi, il compartimento apicale dovrebbe essere delicatamente aspirato e le cellule epiteliali riseminate. L'istituzione dell'ALI dovrebbe essere effettuata solo una volta che sia gli strati epiteliali che endoteliali formano monostrati continui, poiché un'esposizione prematura all'ALI può causare perdite di mezzo vascolare nel compartimento delle vie aeree e una differenziazione compromessiva. Se non si raggiunge la confluenza, l'istituzione dell'ALI dovrebbe essere rimandata.

Una rimozione incompleta del mezzo apicale o un'esposizione incoerente all'ALI può portare a una maturazione epiteliale eterogenea. Il mezzo residuo nel canale superiore può essere rimosso aumentando la portata a 600 μL/h per 3–4 minuti. La formazione di bolle, che interrompe la perfusione e influisce sulla vitalità cellulare, può verificarsi a causa di un equilibrio insufficiente. Le bolle possono essere rimosse aumentando temporaneamente il flusso a 600μL/h per 3-4 minuti o, se persistenti, scollegando il chip e slogandole manualmente con una pipetta. Nel modello BPCO, una produzione eccessiva di muco può ostruire il canale delle vie aeree e compromettere la perfusione; in tali casi si raccomanda un lavaggio delicato con DPBS seguito dal ripristino dell'ALI.

La maggior parte dei sistemi di co-coltura esistenti che combinano cellule endoteliali delle vie aeree e polmonari si basano su cellule primarie commercialmente disponibili e rivestimenti generici ECM come collagene o fibronectin ^10,12. Sebbene questi supportino l'adesione, riproducono solo parzialmente le proprietà biochimiche e meccaniche dell'interfaccia via aerea–vascolare. Al contrario, l'attuale sistema utilizza rivestimenti ECM specifici per tipo cellulare, fornendo un microambiente che imita più da vicino il tessuto polmonare^{umano 13}.

La funzione barriera viene comunemente valutata utilizzando la resistenza elettrica transepiteliale/transendoteliale (TEER), anche se questo metodo può essere influenzato dall'organizzazione epiteliale^{multistrato 14}. In questo studio, la permeabilità al dextrano è stata utilizzata per valutare l'integrità funzionale. I valori osservati di Papp erano al di sotto della soglia per una forte integrità della barriera (1 × 10⁻⁶ cm/s), indicando un'interfaccia robusta epiteliale-endoteliale. L'epitelio delle vie aeree ha mostrato caratteristiche di differenziazione tra cui battiti ciliari e produzione di muco, insieme a una localizzazione continua di ZO-1 e VE-cadherin alle giunzioni cellulari. Inoltre, è stato costantemente ottenuto RNA di alta qualità da entrambi i compartimenti, permettendo analisi specifiche per tipo cellulare a valle.

Un passo chiave di questo lavoro è lo sviluppo di un modello polmone su chip per BPCO, in cui sia cellule epiteliali che endoteliali derivano dallo stesso paziente. A conoscenza recente, una co-cultura così compatibile con i pazienti non era stata precedentemente segnalata. Studi precedenti hanno incorporato cellule epiteliali derivate dalla^{BPCO 7,8} ma si sono basati su cellule endoteliali provenienti dal commercio, limitando l'indagine sulle interazioni epiteliali-endoteliali specifiche per malattia. Il modello attuale supera questa limitazione preservando le interazioni cellulari specifiche del paziente.

Il modello BPCO ricapitolava caratteristiche chiave della malattia, inclusa l'aumento della produzione di^{muco 3}, mantenendo al contempo l'allineamento endoteliale e l'integrità giuntale durante il flusso. È importante sottolineare che la co-coltura di cellule epiteliali ed endoteliali derivate dal paziente non ha compromesso la funzione o la vitalità della barriera, nonostante l'aumento della produzione di muco. Il sistema rimaneva stabile in condizioni di AL e perfusione continua, supportandone l'uso per studi a lungo termine. Inoltre, la piattaforma consente allungamento meccanico, aumentando ulteriormente la sua rilevanza fisiologica.

Un punto di forza importante di questo flusso di lavoro è la capacità di valutare condizioni sane e BPCO all'interno della stessa piattaforma sotto parametri sperimentali comparabili. Ciò consente una valutazione diretta delle differenze associate alla malattia nella differenziazione epiteliale, nella funzione endoteliale e nell'integrità della barriera. I modelli possono anche essere utilizzati indipendentemente, a seconda della domanda di ricerca. Il modello sano è adatto a studi meccanicistici e modulazione dei percorsi, mentre il modello BPCO fornisce una piattaforma per la valutazione terapeutica e i test farmacologici. La capacità di estrarre RNA di alta qualità da ogni compartimento separatamente consente ulteriormente una profilazione molecolare specifica per tipo cellulare. L'utilizzo di cellule abbinate al paziente nel modello BPCO preserva interazioni rilevanti per la malattia che altrimenti si perderebbero combinando fonti cellulari non correlate.

Nonostante questi vantaggi, dovrebbero essere considerate diverse limitazioni. L'uso di sistemi lungo-on-chip richiede attrezzature specializzate e competenze tecniche, il che può limitarne l'accessibilità. Inoltre, il modello attualmente non include altri tipi rilevanti di cellule polmonari, come le cellule immunitarie o stromali, che possono influenzare le risposte a patogeni e farmaci. Tuttavia, la piattaforma può essere adattata per incorporare cellule immunitarie circolanti, consentendo di indagare le loro interazioni con i compartimenti epiteliali ed endoteliali. L'accesso al materiale per la BPCO derivato dal paziente può essere limitato e la variabilità tra pazienti può influire sulla riproducibilità. Inoltre, una produzione eccessiva di muco può interferire con la perfusione.

L'impatto dello stiramento meccanico ciclico non è stato studiato in questo studio, ma rappresenta una direzione futura importante. La membrana elastica consente la simulazione delle forze meccaniche associate alla respirazione, note per influenzare la funzione cellulare, la riparazione e l'omeostasi ^15,16. Studi precedenti hanno dimostrato che lo sforzo meccanico può aumentare l'assorbimento e il trasporto delle nanoparticelle attraverso la barriera^{epiteliale 10}.

In conclusione, i modelli sani e BPCO polmone su chip presentati qui forniscono una piattaforma fisiologicamente rilevante per studiare le interazioni epiteliali-endoteliali in ambito salute e malattia. La natura dinamica del sistema consente un controllo preciso delle condizioni di flusso e supporta applicazioni come test farmacologici e studi di esposizione a patogeni. Questo protocollo offre un'alternativa robusta ai modelli tradizionali in vitro e animali e rappresenta uno strumento prezioso per far avanzare la ricerca respiratoria traslazionale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% trypsin-EDTA (1X)  (per cellule endoteliali)	Gibco	25200-056	Usato per il distacco enzimatico delle cellule endoteliali microvascolari polmonari.
Piatto di coltura cellulare quadrato da 120 mm x 120 mm	VWR	688161	Usato per tenere il chip cradle durante la preparazione e la manipolazione del chip.
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939A	Usato per valutare la qualità e l'integrità dell'RNA.
2-propanolo	Sigma-Aldrich	I9516	Usato per precipitare l'RNA durante l'estrazione.
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Invitrogen	D1306	Usato per colorare i nuclei cellulari durante l'immunofluorescenza.
Tubi conici da 50 mL	Cellstar	227261	Usati per la raccolta cellulare, la centrifugazione e la preparazione di sospensioni cellulari.
Kit Agilent RNA 6000 Nano	Agilent	5067-1511	Usato per l'analisi della qualità dell'RNA con il Bioanalyzer.
Anfotericina B	Gibco	15290-026	Usato per prevenire la contaminazione fungina durante la coltura cellulare.
Contatore cellulare automatico	NanoEntek	EVE PLUS	Usato per determinare la concentrazione e la vitalità cellulare prima della seminazione.
Piastre multipozzo per coltura cellulare, 48 pozzetti, sterili	Falcon	353078	Usate per tenere le sezioni trasversali durante le procedure di colorazione.
Centrifugatrice	Hettich	320R	Usata per fare sedimentare le cellule prima della seminazione.
Chip Cradle	Emulate	support@emulatebio.com	Usato per sostenere e tenere i chip durante l'attivazione della superficie, il rivestimento e la seminazione cellulare.
Cloroformio	Sigma-Aldrich	366927	Usato per la separazione di fase durante l'estrazione dell'RNA.
Modulo a disco rotante Cicero	CrestOptics S.p.A.		Usato per eseguire immagini a fluorescenza confocale ad alta velocità.
Vetrini	Epredia	BB02400600AC13MNZ0	Usati per sostenere i chip durante l'imaging confocale. Descrizione: 24 x 60 mm, #1.5
Criostato	Thermo Fisher Scientific	NX70	Usato per sezionare campioni incorporati in OCT.
Modulo di coltura (Zoë-CM)	Emulate	support@emulatebio.com	Usato per controllare le condizioni ambientali per la coltura cellulare all'interno del sistema microfluidico.
Inibitore di tripsina definito (DTI)	Thermo Fisher	R007100	Usato per neutralizzare l'attività della tripsina dopo il distacco delle cellule epiteliali.
Dextrano Cascade Blue 3KDa	Thermo Fisher	D7132	Usato come tracciante fluorescente per valutare la permeabilità della barriera.
Kit di mezzo di crescita per cellule endoteliali Growth Medium MV2	PromoCell	C-22022	Usato per la manutenzione e l'espansione delle cellule endoteliali microvascolari polmonari.
ER-1  reagente di attivazione superficiale (polvere di reagente di attivazione sensibile alla luce)	Emulate	support@emulatebio.com	Usato per attivare le superfici del chip per il successivo rivestimento.
ER-2  reagente di attivazione superficiale (buffer)	Emulate	support@emulatebio.com	Usato come buffer durante l'attivazione della superficie del chip.
Etanolo assoluto	Thermo Fisher Scientific	437433T	Usato per lavare i pellet di RNA durante l'estrazione.
Lettore di piastre fluorescente	Agilent	Lettore di micropiastre BioTek Sinergy H1	Usato per misurare l'intensità della fluorescenza per i test di permeabilità.
Gelatina da pelle bovina	Sigma-Aldrich	G9391	Usata per rivestire le superfici di coltura per promuovere l'adesione delle cellule endoteliali.
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 (per ZO-1 e β-tubulina IV)	Thermo Fisher	A11001	Usato per rilevare gli anticorpi primari di topo con fluorescenza verde.
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 (per CD31)	Thermo Fisher	A11005	Usato per rilevare gli anticorpi primari di topo con fluorescenza rossa.
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 555 (per VE-cadherina)	Thermo Fisher	A21429	Usato per rilevare gli anticorpi primari di coniglio con fluorescenza arancio-rosso.
Modulo Hub (Orb-HM)	Emulate	support@emulatebio.com	Usato per fornire gas e alimentazione al modulo di coltura.
Cellule epiteliali bronchiali umane (HBEC)	Lonza	CC-2540S	Usate come cellule epiteliali delle vie aeree per stabilire il modello di co-coltura sano.
Collageno umano  IV	Sigma	C5533	Usato per rivestire i flaconi T25 per promuovere l'adesione delle cellule epiteliali.
Collageno umano di tipo I	Advanced Biomatrix	5007	Usato come componente della soluzione di matrice extracellulare per il rivestimento del chip.
Fibronectina umana	Sigma-Aldrich	F0895	Usato come componente della soluzione di matrice extracellulare per il rivestimento del chip.
Laminina umana	Sigma -Aldrich	L4544	Usato come componente della soluzione di matrice extracellulare per il rivestimento del chip.
Cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HPMEC)	PromoCell	C-12281	Usate come cellule endoteliali microvascolari polmonari per stabilire il modello di co-coltura sano.
fattore di crescita epidermico umano ricombinante (hrEGF)	PromoCell	C-60182	Usato per promuovere la proliferazione delle cellule epiteliali.
Soluzione di idrocortisone in stock	StemCell Technologies	7925	Usato come supplemento nel mezzo di coltura per supportare la differenziazione delle cellule epiteliali delle vie aeree.
ImageJ	Software Fiji	versione ImageJ 1.54p	Usato per elaborare e analizzare le immagini acquisite.
Microscopio invertito per coltura cellulare	Leica Microsystems	DMi1	Usato per monitorare la morfologia cellulare e la confluenza durante la coltura.
iSpacer	SUNJin Lab	IS307