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Articolo metodologico

Valutazioni dell'ossigenazione e della perfusione vascolare in modelli preclinici di cancro e guarigione delle ferite utilizzando OS-DCE OAI

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DOI:

10.3791/70689

7 aprile 2026

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per l'esecuzione dell'Imaging Optoacustico Sensibile all'Ossigeno – Dynamic Contrast Enhanced Optoacoustic Imaging (OS-DCE OAI) per valutare modelli preclinici di cancro e guarigione delle ferite. L'OS OAI può visualizzare ossi- e desossiemoglobina, mappando l'ossigenazione dei tessuti. Il DCE-OAI può visualizzare la farmacocinetica di un agente di contrasto esogeno, mappando così la perfusione vascolare.

Abstract

L'imaging optoacustico sensibile all'ossigeno (OS OAI) e l'imaging optoacustico dinamico con contrasto (DCE OAI) forniscono letture complementari e non invasive della fisiologia tissutale. OS OAI sfrutta la rilevazione multispettrale di ossiemoglobina e desossiemoglobina endogene per generare mappe della saturazione di ossigeno nel sangue (%sO₂), mentre la DCE OAI monitora la farmacocinetica in vivo di un assorbitore nel vicino infrarosso per quantificare la perfusione vascolare e la permeabilità. L'obiettivo di questo protocollo è presentare un flusso di lavoro unificato OS-DCE OAI che consenta la valutazione simultanea di ossigenazione e perfusione in due contesti preclinici ampiamente utilizzati: tumori ortotopici per il cancro al seno e ferite cutanee a spessore completo.

In questo protocollo, abbiamo dimostrato OAI di modelli murini di cancro al seno o ferita da lacerazione. Per OS OAI, vengono acquisite scansioni multispettrali multi-sliccio a 700–875 nm per consentire la dismescolazione spettrale e la stima di percentuali di sO₂. Per la DCE OAI, acquisizioni ripetute a risoluzione temporale ≤5-s vengono eseguite prima e dopo l'iniezione endovenosa di bolus di indocyanina verde (ICG), utilizzando campionamento multispettrale a 700-875 nm o campionamento a lunghezza d'onda singola a 800 nm per generare curve di ampiezza del segnale in funzione del tempo rispetto all'OA. Lo sviluppo di modelli animali, la preparazione per l'imaging OA, le acquisizioni OAI OS e DCE OAI, e le analisi per misurare le caratteristiche di ossigenazione e perfusione vascolare sono dettagliati, insieme a linee guida chiave per la risoluzione dei problemi per artefatti di movimento, assorbitori superficiali e iniezioni fallite.

Insieme, questo protocollo OS-DCE OAI produce un ritratto funzionale integrato dell'ipossia e del trasporto vascolare che può rilevare cambiamenti fisiologici in tumori e ferite prima delle misure anatomiche grossolane. L'OS-DCE OAI è facilmente adattabile ad altri modelli di patologia.

Introduzione

L'imaging optacustico (OAI), noto anche come imaging fotoacustico o tomografia optoacustica multispettrale, è una modalità relativamente nuova che abbina l'eccitazione ottica alla rilevazione a ultrasuoni (US) per consentire l'imaging dei tessutiprofondi 1,2. Nell'OAI, impulsi laser brevi in nanosecondi eccitano cromofori endogeni come ossi- e desossiemoglobina, generando espansione termoelastica localizzata e onde acustiche a banda larga rilevate dai trasduttori americani. Questi segnali permettono all'OAI di ottenere immagini con contrasto ottico a risoluzione spaziale simile a quella di ultrasuoni, raggiungendo al contempo una profondità visiva in vivo su scala centimetrica. Quando i dati vengono acquisiti a più lunghezze d'onda e analizzati con unmixing spettrale, l'OAI sensibile all'ossigeno (OS) può stimare le concentrazioni relative di ossi- e desossiemoglobina e quindi inferire la saturazione di ossigeno dei tessuti (%sO₂)2. La saturazione di ossigeno nel sangue fornisce una valutazione funzionale della fisiologia microvascolare difficile da raggiungere in modo non invasivo con altri metodi.

La perfusione vascolare è utile anche per valutare la fisiologia microvascolare. La perfusione vascolare rappresenta una combinazione di flusso vascolare, permeabilità e superficievascolare 3. Per quantificare la perfusione, l'OAI può essere utilizzata con un agente di contrasto esogeno per eseguire l'OAI Dinamico Potenziato dal Contrasto (DCE OAI). In questo approccio, l'imaging temporale prima, durante e dopo l'iniezione dell'agente di contrasto monitora la farmacocinetica (PK) dell'agente. Questi risultati possono essere modellati per misurare il tasso di lavaggio (NKtrans) dal compartimento plasmanico sanguigno al compartimento extravascolare extracellulare tumorale, e il tasso di lavaggio (kep) dal compartimento extravascolare extracellulare tumorale al compartimento plasmamico. Abbiamo sviluppato un metodo di modellazione PK che evita il noto problema della fluenza luminosa (cioè scattering e assorbenza nei tessuti che causano energia radiante variabile attraverso il tessuto)4. Il nostro metodo normalizza la variazione del segnale OAI dinamico da 0% (pre-iniezione) al 100% (massimo potenziamento) e poi utilizza equazioni differenziali per stimare la velocità di wash-in NKtrans e la kep. Altri studi OAI DCE hanno utilizzato metodi standard di modellazione PK che soffrono dell'assunzione principale che la fluenza della luce sia uniforme in tutto il tessuto 5,6.

I risultati OAI del DCE possono anche essere utilizzati per valutare i tassi di wash-in effettuando misurazioni empiriche del Massimo Potenziamento del Segnale (MSE), Time-to-Peak (TTP) per raggiungere il MSE, pendenza (tipicamente per l'iniezione al TTP) e Area Iniziale sotto la Curva (IAUC; sempre tipicamente per l'iniezione nel TTP post-iniezione)7. Va notato che se il TTP si verifica più tardi nella curva PK, la pendenza o IAUC può essere rilevata durante la porzione lineare della curva o dal momento dell'iniezione fino a 1 minuto dopo l'iniezione. Abbiamo dimostrato che le misurazioni empiriche possono essere utili anche nella valutazione dei trattamenti somministrati a modelli tumorali o nella valutazione della guarigionedelle ferite 8,9. Altri studi hanno inoltre dimostrato valore nell'utilizzare misurazioni empiriche per valutare la permeabilità vascolare tumorale e la fibrosiepatica 10,11. La forma della curva PK può anche essere utilizzata per classificare qualitativamente la perfusione vascolare tumorale come alta obassa 12,13,14.

Inoltre, il segnale OAI in un singolo punto temporale post-iniezione può essere utilizzato come valutazione empirica della perfusione, nota come OAI Potenziato con Contrasto Non Dinamico (CE OAI)15. Un'immagine OA di CE che mostra un tumore o una ferita luminosa è semplice e altamente visiva, eppure viene spesso utilizzata solo per una valutazione qualitativa di perfusione alta rispetto a bassa. In generale, il cambiamento dinamico dei segnali OAI dopo la TTP non viene analizzato per valutare empiricamente la perfusione vascolare nei tumori. Tuttavia, come mostrato di seguito, i tassi di lavaggio nelle ferite sono estremamente veloci, quindi NKtrans, TTP, slope e IAUC sono difficili da misurare. Pertanto, abbiamo utilizzato la pendenza lineare o esponenziale della fase di lavaggio come misura empirica della perfusione vascolare nelleferite 9.

La maggior parte degli agenti OAI assorbe nella gamma di lunghezze d'onda nel vicino infrarosso (NIR), che può penetrare più in profondità nei tessuti16,17. Tuttavia, l'assorbimento dell'acqua a lunghezze d'onda superiori a 900 nm limita l'intervallo di lunghezze d'onda OAI utilizzabile in vivo a 700–900 nm per la maggior parte delle applicazioni2. L'indocyanina verde (ICG) è un agente prototipico dell'OAI DCE perché offre un forte assorbimento del NIR a 780–800 nm, produce un segnale OAI moderatamente forte e presenta una biocompatibilità favorevole con l'approvazione FDA per l'uso clinico. Queste caratteristiche consentono contrasto intravascolare e curve PK interpretabili.

Abbiamo sviluppato un protocollo combinato OS-DCE OAI per valutare l'ossigenazione e la perfusione vascolare in modelli preclinici di tumori solidi eferite 8,9. La parte OS di questo protocollo può valutare l'ossigenazione in più fette di imaging che possono coprire l'intero volume di tumori e ferite nei modelli murini. La parte DCE del nostro protocollo prevede l'opzione di visualizzare una singola fetta del tumore o della ferita utilizzando più lunghezze d'onda laser (migliorando la precisione del rilevamento degli agenti di contrasto), oppure di visualizzare fino a 5 fette con una singola lunghezza d'onda laser (migliorando la copertura spaziale). Abbiamo utilizzato OS-DCE OAI per monitorare il cambiamento nell'ossigenazione e nella perfusione vascolare dopo aver trattato un modello tumorale con radioterapia o con combretastatina A4 fosfato, un agente disturbantevascolare 4,8. Abbiamo anche utilizzato OS-DCE OAI per monitorare la guarigionedelle ferite 9. La DCE OAI conferisce all'OAI la capacità di monitorare la progressione tramite perfusione vascolare, applicabile a una varietà di malattie.

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Protocollo

Esegui tutte le procedure con l'approvazione del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) della tua istituzione. Tutte le procedure del protocollo qui sotto sono state approvate dall'IACUC della nostra istituzione.

1. Anestesia (per procedure successive)

  1. Induzca l'anestesia. Inizialmente indurre e mantenere l'anestesia con il 5% di isoflurano in un gas portatore di ossigeno al 100% finché il topo non è più sveglio.
  2. Mantieni l'anestesia. Continuare ad anestetizzare il topo con 1,5–2% di isoflurano in un gas portatore di ossigeno al 100%. Verifica l'assenza del riflesso del pedale.
  3. Mantieni la normotermia. Assicurati di mantenere gli animali su una superficie calda e monitora la temperatura durante tutto il periodo di anestetismo.
    NOTA: (Punto di pausa) Procedere all'impianto tumorale o alla formazione della ferita una volta che l'animale è completamente anestetizzato.

2. Preparazione del modello

NOTA: Tutto il lavoro cellulare deve essere eseguito in un armadietto di biosicurezza per evitare esposizione e potenziali contaminazioni.

  1. Stabilire un modello tumorale ortotopico 4T1 (Figura 1).
    1. Preparare le cellule sul ghiaccio: Risospendere le 4T1 in PBS gelato a una concentrazione di 2 × 107 cellule/mL.
    2. Mescola le cellule con la matrice: combina la sospensione cellulare 1:1 (v/v) con idrogel biologico gelido che possiede una ricca matrice extracellulare. La combinazione dovrebbe produrre una soluzione di cellule a 1 × 107 cellule/mL.
    3. Carica la siringa: carica la miscela di cellule in una siringa da laboratorio sterile con un volume non superiore a 1,0 mL. Limitare il volume a 100 μL per iniezione (1 × 106 celle). Come opzione, riscalda delicatamente la siringa a 30 °C, il che rende l'idrogel biologico leggermente viscoso e più trattenuto focalmente nel sito di iniezione.
      ATTENZIONE: Fai attenzione che le siringhe sono affilate ed evita di ricapperle.
    4. Anestesiare il topo come descritto nella sezione 1.
    5. Rimuovere il pelo se presente: depilare l'area del petto. Ometti questo passaggio se usi topi nudi atimici.
    6. Posiziona l'ago e inietta: sterilizza il quarto cuscinetto adiposo inguinale mammario. Inserisci il ferro smussato verso l'alto e inietta lentamente 100 μL nel cuscinetto adiposo per evitare il reflusso.
    7. Recupera l'animale dall'anestesia: Riporta il topo in una gabbia riscaldata e monitora il topo fino a quando non cammina.
    8. Lasciare che il tumore cresca: Prevedi 8-10 giorni affinché i tumori 4T1 raggiungano un diametro minimo di 0,3 cm prima dell'imaging.
      NOTA: Anche i tumori di diametro maggiore possono essere fotografici. Il diametro del tumore può essere misurato con un calibro vernier calibrato. I tumori che superano il diametro massimo approvato dall'IACUC (o da un comitato istituzionale equivalente) dovrebbero essere soppressi. Segui l'iniezione ortotopica e adatta il numero/volume cellulare al protocollo di ingertimento desiderato.
  2. Generazione di una ferita escisionale in un topo (Figura 2)
    1. Prepara il campo chirurgico: sterilizza l'area di lavoro e gli strumenti.
    2. Anestesiare il topo come descritto nella sezione 1.
    3. Rimuovere il pelo se presente: depilare la regione dorsale. Ometti questo passaggio se usi topi nudi atimici.
    4. Somministrare analgesia: Fissare il topo su una superficie chirurgica sterile. Iniettare buprenorfina 0,05–0,1 mg/kg sottocutaneamente (SC) nella regione dorsale.
    5. Disinfettare l'area della ferita: Disinfettare la pelle dorsale con povidone-iodio seguito dal 70% di etanolo.
    6. Crea una ferita escisionale: Usa un perforatore da 6 mm per delimitare il sito. Espelle la pelle e il panniculus carnosus per formare un difetto a spessore completo.
    7. Posiziona la tutora in silicone:
      1. Centra una stecca in silicone a forma di ciambella intorno alla ferita. Assicurarsi che il diametro interno della spaccatura sia 2–4 mm superiore al diametro della ferita e che la larghezza della stecca sia di ~5 mm.
      2. Taglia una stecca in silicone a forma di ciambella da un foglio di materiale in silicone. Usa un materiale trasparente per cucire la stecca. Se necessario, usa una pellicola adesiva sottile per fissare l'anello.
        NOTA: I materiali pigmentati per suture possono assorbire la luce NIR e, pertanto, non dovrebbero essere utilizzati.
    8. Sutura della stecca: Posiziona otto suture interrotte a distanza uniforme per fissare la stecca alla pelle circostante senza strangolamento.
    9. Applica una medicazione occlusiva: Copri la ferita e lo stecco con una medicazione oclusiva per proteggere il letto e standardizzare l'ambiente della ferita.
    10. Recupera l'animale dall'anestesia: Riporta il topo in una gabbia riscaldata e monitora il topo fino a quando non cammina.
    11. Permettere all'animale di guarire: Continuare la cura e le valutazioni quotidiane secondo il disegno dello studio o finché la ferita non sarà completamente guarita.
    12. Sostituisci la medicazione ogni giorno: sostituisci la medicazione occlusiva ogni giorno dopo immagini o fotografie per limitare la contaminazione e mantenere la sterilità.
      NOTA: (Passo critico) Steccare la ferita per sopprimere la contrazione e favorire la riepitelizzazione, migliorando la rilevanza traslazionale per la guarigione umana. (Punto di pausa) Dopo aver applicato la medicazione, fermarsi fino alla prossima valutazione o sessione di imaging programmata.

3. Protocolli di acquisizione OS-DCE OAI

  1. Prepara un mouse e l'agente di contrasto per la scansione OAI.
    1. Prepara l'agente di contrasto.
      1. Prepara una soluzione di 1,62 mM dell'agente di contrasto ICG in acqua sterile. Filtra la soluzione con un filtro a siringa da 0,3 μm. Riempi una siringa da laboratorio sterile con 100 μμL di questa soluzione.
        NOTA: Questa dose è di 162 nmol o 125,5 μμg basata su un peso molecolare di ICG di 775 g/mol. La dose è di 6,28 mg/kg di peso corporeo del topo, considerando che un topo pesa circa 20 g. Una dose equivalente animale è 12,3 volte superiore a una doseequivalente umana di 18. Pertanto, la dose equivalente umana è di 0,51 mg/kg di peso corporeo umano. La dose massima tollerata per l'uomo è di 2 mg/kg 19. Pertanto, la dose utilizzata in questo studio preclinico è circa 1/4 della dose massima tollerata nell'uomo.
    2. Prepara lo scanner OAI.
      1. Riempi il serbatoio di imaging con acqua deionizzata e distillata. Imposta la temperatura dell'acquario a 36 °C per un topo con <25 g di peso corporeo.
        NOTA: La temperatura di questo acquario manterrà la temperatura corporea centrale intorno ai 37 °C perché il topo è avvolto in un sacchetto di plastica nella culla. La temperatura dell'acquario dovrebbe essere impostata a 35 °C per un topo più grande con >25 g di peso corporeo per evitare il surriscaldamento, poiché un topo più grande ha più tessuto adiposo sottocutaneo che funge da strato isolante.
    3. Anestesiare il topo come descritto nella sezione 1. Per il resto del protocollo di acquisizione, assicurarsi che il topo rimanga anestetizzato con 1,5–2% di isoflurano in un gas portatore di ossigeno al 100%.
    4. Se esegui l'OAI DCE, posiziona l'accesso venoso.
      1. Lavare un catetere della vena caudale da 27 G con soluzione salina eparinizzata. Inserire il catetere in una vena caudale laterale e fissare il catetere per evitare che si stacchi dalla vena caudale (Figura 3A). Assicurati che non ci siano bolle d'aria.
        NOTA: (Passo critico) Usare soluzione salina eparinizzata per mantenere la permanenza del catetere.
      2. Inoltre, preparare una siringa da laboratorio sterile con un volume non superiore a 500 μL che possa collegarsi al catetere. Assicurarsi che la siringa contenga 100 μL di 2,14 mM ICG (~322 nmol; ~16 μmol/kg per un topo da 20 g).
    5. Copri il topo e la culla con gel per ultrasuoni (Figura 3B).
      1. Applicare uno strato sottile di gel trasparente per ultrasuoni sull'area del tumore o della ferita (Figura 3C). Inoltre, applica il gel per ultrasuoni sulla culla per creare una sigillatura tra la culla e il tumore o l'area della ferita.
        NOTA: Elimina le bolle d'aria. Come opzione, il gel per ultrasuoni può essere centrifugato per rimuovere l'aria prima dell'uso. Inoltre, usa una quantità minima di gel per ultrasuoni per evitare bolle che possono formarsi negli strati spessi di gel.
    6. Posiziona il mouse nella culla (Figura 3D): Consulta le istruzioni del produttore per lo strumento. Metti il topo in un supporto con il naso del topo saldamente dentro il naso. Usa le manette per tenere mani e piedi del topo. Usa l'anello del dente per stabilizzare la testa.
      1. (OPZIONALE) Usa la culla con un cono a forma di naso di ratto quando immagini un topo. Il cono naso del ratto solleva la testa del topo dal fondo della culla, il che può evitare l'annegamento accidentale se una piccola quantità d'acqua entra nella culla.
    7. Metti il mouse e la culla nello strumento OAI. Consulta le istruzioni del produttore per lo strumento.
      1. Osserva eventuali perdite nella culla del topo. Se sono presenti perdite, rimuovere il topo e la culla dallo strumento e sigillare nuovamente il topo nella culla per evitare annegamenti accidentali.
      2. Se si desidera l'OAI DCE, collegare il catetere alla siringa con l'agente di contrasto.
    8. Bilanciare il topo prima dell'immagini: prevedi 10 minuti per la stabilizzazione della fisiologia del topo nel serbatoio di acqua calda prima dell'acquisizione dell'immagine (Figura 3E).
    9. Posiziona il mouse rispetto al trasduttore OAI:
      1. Sposta il topo o il trasduttore OAI secondo le istruzioni del produttore in modo che il tumore o la ferita si trovino nel set di immagini multi-slice.
      2. Ottimizza la velocità del suono per il set di immagini. Completare questo passaggio mentre il topo è in fase di equilibrio prima dell'imaging (passo 3.1.7).
      3. (Passo critico) Mantieni un'orientazione e una posizione di taglio costante per tutti i topi e in ogni momento per garantire risultati rigorosi
  2. Imposta i parametri OAI del sistema operativo.
    1. Seleziona i parametri della sezione immagine in modo che più fette vengano visualizzate per coprire l'intera area del tumore o della ferita con uno spessore di 1 mm.
    2. Seleziona le lunghezze d'onda di assorbimento. Per l'OAI OS, seleziona lunghezze d'onda di assorbimento da 700, 730, 760, 800, 850 e 875 nm.
    3. Utilizzare la media del segnale: selezionare i parametri per acquisire 10 medie per lunghezza d'onda prima di acquisire la successiva lunghezza d'onda e prima di passare alla successiva fetta di immagini. Le 10 medie per lunghezza d'onda aumentano la rapporto segnale/rumore di ogni fetta di immagine.
    4. Imposta il numero di ripetizioni:
      1. Imposta il numero di ripetizioni come mostrato nella Tabella 1 per mantenere un tempo totale di acquisizione di circa 2 minuti. Per gli utenti di uno strumento con una frequenza di ripetizione di 10 Hz, il tempo totale di acquisizione è di 6,0 s per ogni taglio di immagine.
      2. Spostare il mouse alla successiva fetta di imaging e poi tornare alla posizione della prima fetta richiede una media di 0,2 s, quindi ogni fetta richiede 6,2 s.
      3. Esegui almeno 3 ripetizioni per garantire la stabilità delle misurazioni. Un tempo totale di acquisizione superiore a 2 minuti è accettabile se si desiderano più ripetizioni.
  3. Acquisire le immagini OA del sistema operativo.
  4. Imposta i parametri OAI DCE.
    1. Imposta i parametri di acquisizione DCE OAI per un protocollo di imaging a singolo slice con più lunghezze d'onda.
      1. Posiziona le fette di immagini. Seleziona ≤5 fette di imaging centrate sul tumore o sull'area della ferita con spessore di 1 mm.
      2. Seleziona la lunghezza d'onda ottimale di assorbimento per l'agente di contrasto. Per il verde di indocyanina in un ambiente in vivo , imposta la lunghezza d'onda a 800 nm.
      3. Imposta il numero di medie e ripetizioni come mostrato nella Tabella 2. Queste raccomandazioni manterranno una risoluzione temporale ≤ 5 s e un tempo totale di acquisizione di 11,0–11,2 min per gli utenti dello strumento OAI, che ha una frequenza di ripetizione di imaging di 10 Hz.
        NOTA: Gli utenti di altri strumenti con un tasso di ripetizione di imaging diverso dovrebbero regolare il numero di medie per mantenere una risoluzione temporale di ≤ 5 secondi per ogni set di immagini.
    2. Come alternativa al passaggio 3.4.1, impostare i parametri di acquisizione OAI DCE per un protocollo di imaging multi-slice con una singola lunghezza d'onda.
      1. Posiziona le fette di immagini. Seleziona ≤ 5 fette di imaging centrate sull'area del tumore o della ferita con spessore di 1 mm.
      2. Seleziona la lunghezza d'onda ottimale di assorbimento per l'agente di contrasto. Per il verde di indocyanina in un ambiente in vivo , imposta la lunghezza d'onda a 800 nm.
      3. Imposta il numero di medie e ripetizioni come mostrato nella Tabella 2. Queste raccomandazioni manterranno una risoluzione temporale ≤ 5 s e un tempo totale di acquisizione di 11,0–11,2 min per gli utenti dello strumento OAI, che ha una frequenza di ripetizione di imaging di 10 Hz.
        NOTA: Gli utenti di altri strumenti con una diversa velocità di ripetizione di imaging dovrebbero regolare il numero di medie per mantenere una risoluzione temporale di ≤ 5 s per ogni set di immagini.
  5. Acquisire le immagini DCE OA.
    1. Registra le immagini di base: Inizia l'acquisizione e raccogli 12 set di immagini (~1 min).
    2. Iniettare l'agente di contrasto: somministrare 100 μL tramite catetere continuando l'acquisizione.
      NOTA: L'iniezione del bolo dovrebbe essere costante per circa 10–15 secondi per evitare un accumulo di pressione nel catetere nella fragile vena caudale. Questa consistenza può essere controllata con una pressione costante sullo sturalavandini durante l'iniezione manuale, oppure utilizzando un iniettore automatico. È importante sottolineare che tassi di iniezione di 10–15 s levigano la somministrazione iniziale dell'agente al tumore, invece di creare picchi cinetici nel primo passaggio nella curva PK causati da tempi di iniezione più rapidi, migliorando così la modellazione PK e le analisi delle misurazioni empiriche.
      1. (Passo critico) Evitare la fuoriuscita di agenti di contrasto dal vaso sanguigno ai tessuti circostanti nel sito dell'iniezione per mantenere un tempismo accurato del bolus.
    3. Continuare l'immagini: acquisire i restanti 128 set di immagini per 10,2 minuti dopo l'iniezione per catturare la cinetica di wash-in/washout.
    4. Monitorare il processo di imaging per assicurarsi che le immagini vengano acquisite: monitorare la frequenza respiratoria del topo per garantire che la fisiologia del topo sia stabile durante le scansioni.
    5. Rimuovi il topo e la culla dallo strumento: Togli il topo dalla culla. Lascia che il topo si riprenda dall'anestesia. Riporta il topo in una gabbia riscaldata e monitora il topo fino a quando non cammina.
      NOTA: Utilizzare il software appropriato e consultare le istruzioni del produttore per lo strumento OAI. I passaggi seguenti descrivono le fasi di ricostruzione e analisi per uno strumento OAI che utilizza il software viewMSOT v4.0 e Matlab R2019b o una versione più recente del software Matlab.

4. Analisi dei risultati OS-DCE OAI

  1. Ricostruisci le immagini OA.
    1. Seleziona i parametri di ricostruzione dell'immagine: Imposta la ricostruzione dell'immagine per utilizzare un metodo di retroproiezione filtrata con un filtro passa-banda da 50 kHz–6,5 MHz e abilita la correzione automatica dell'energia impulso-impulso.
    2. Ricostruisci tutte le immagini: Ottieni immagini a tutte le lunghezze d'onda laser, a tutte le posizioni delle tazze dell'immagine e a tutti i punti temporali. Questo volume di dati può richiedere tempo significativo per la ricostruzione dell'immagine.
  2. Analizza le immagini OA del sistema operativo.
    1. Smixare i cromofori: Eseguire la dismix spettrale per generare mappe parametriche di ossiemoglobina (HbO 2), desossiemoglobina (Hb), emoglobina totale (dove HbT = HbO2 + Hb) e %sO 2 (dove %sO 2 = HbO2/HbT).
    2. Definisci il ROI:
      1. Disegna manualmente un ROI che rappresenta il tumore o la ferita in ogni taglio dell'immagine. Traccia un ROI conservativo che sbaglia dalla parte dell'escludere i pixel della periferia tumorale o della ferita piuttosto che includere i pixel del tessuto normale alla periferia.
      2. In alternativa, si disegna manualmente un ROI che rappresenta il bordo tumorale e un secondo ROI che rappresenta il nucleo tumorale. Il bordo tumorale può avere una maggiore vascolarizzazione rispetto al nucleo tumorale, fornendo un'analisi potenzialmente utile della sotto-regione.
        NOTA: Sebbene possano essere disegnati ulteriori ROI di sottoregioni tumorali o di ferite, o possano essere valutati i valori pixel per pixel diHbO 2, Hb, HbT o %sO 2 (senza necessità di ROI), queste regioni più piccole hanno un rapporto segnale-rumore inferiore, il che porta a misurazioni imprecise.
      3. Mantieni le posizioni ROI coerenti su tutte le immagini a ogni lunghezza d'onda e punto temporale.
    3. Calcola i parametri medi per l'intero tumore.
      1. Calcola il valore medio diHbO 2, Hb, HbT e %sO 2 nel ROI tumorale o ROI della ferita per ogni taglio di imaging e ogni momento temporale.
      2. Per l'OAI OSO multi-slice, calcola il valore medio diHbO 2, Hb, HbT e %sO 2 da tutte le fette di imaging per ottenere un valore medio singolo per ogni parametro dell'intero tumore o ferita.
    4. Valuta la stabilità dei parametri. Traccia il valore di %sO 2 per ogni ripetizione (vedi passo 3.2.4). Valutare se il valore di %sO 2 è cambiato di oltre il 10% durante le scansioni, il che indica una misurazione temporalmente instabile.
  3. Analizza le immagini DCE OA.
    1. Smixare i cromofori nelle immagini DCE OA multilunghezza d'onda: eseguire la dismix spettrale per generare mappe parametriche diHbO 2, Hb e dell'agente di contrasto. Questo passaggio non è necessario per l'OAI DCE a lunghezza d'onda singola.
    2. Definisci il ROI.
      1. Disegna manualmente un ROI che rappresenta il tumore o la ferita in ogni taglio dell'immagine. Traccia un ROI conservativo che sbaglia dalla parte dell'escludere i pixel della periferia tumorale o della ferita piuttosto che includere i pixel del tessuto normale alla periferia.
      2. In alternativa, si disegna manualmente un ROI che rappresenta il bordo tumorale e un secondo ROI che rappresenta il nucleo tumorale. Il bordo tumorale può avere una maggiore vascolarizzazione rispetto al nucleo tumorale, fornendo un'analisi potenzialmente utile della sotto-regione.
        NOTA: Sebbene possano essere tracciati ROI aggiuntivi delle sotto-regioni tumorali, o possano essere valutati i valori pixel per pixel dell'agente di contrasto (senza richiedere ROI), queste regioni più piccole hanno un rapporto segnale-rumore inferiore, il che porta a misurazioni imprecise.
      3. Mantieni le posizioni ROI coerenti su tutte le immagini a ogni lunghezza d'onda e punto temporale.
    3. Estrae curve PK dalle immagini DCE OA.
      1. Per il ROI in ogni fetta di immagine, esportare i punti temporali rispetto al segnale medio ICG (da DCE OAI multi-lunghezza d'onda) o al segnale OAI alla singola lunghezza d'onda selezionata (per DCE OAI a lunghezza d'onda singola).
      2. Calcola il segnale medio per tutte le fette di immagine. Un grafico del segnale medio lungo il tumore o la ferita in funzione del tempo è noto come curva PK.
      3. Trasferire il segnale medio di tutte le fette di immagine in ogni punto temporale a un programma informatico che possa valutare i parametri empirici elencati di seguito. Ad esempio, Microsoft Excel e Graphpad Prism possono eseguire semplici analisi dei grafi.
    4. Calcolare i parametri empirici come descritto nei passaggi 4.3.5–4.3.11.
    5. Normalizzare la curva PK: Determinare il valore medio dei punti temporali pre-iniezione, noto come segnale di base. Sottrai il valore di base del segnale da tutti i valori del segnale post-iniezione.
    6. Determinare il Massimo Potenziamento del Segnale (MSE): Identificare il valore più alto del segnale post-iniezione nella curva PK.
    7. Determina il Time-to-Peak (TTP): Identifica il valore temporale del MSE.
    8. Calcola la pendenza iniziale della curva PK.
      1. Ottieni questa pendenza iniziale dal momento dell'iniezione iniziale fino al TTP. In alternativa, calcola la pendenza 1 minuto dopo l'iniezione se la forma della curva è troppo ripida o se il TTP è troppo tardi.
      2. In questo scenario, acquisire le immagini di pre-iniezione per 1 minuto e calcolare questa pendenza dal minuto 1.0 al minuto 2.0 sulla curva PK.
    9. Calcola l'area iniziale sotto la curva (IAUC): Calcola il valore medio dei valori del segnale dal momento dell'iniezione iniziale fino al TTP sulla curva PK.
    10. Calcola un tasso empirico della fase di lavaggio.
      1. Per la porzione della curva PK da 1 minuto dopo il TTP fino all'ultimo punto temporale, si adatta questa porzione della curva con una retta o una funzione monoesponenzialmente decadiente con un tempo di offset costante.
      2. Usa la pendenza della retta o la costante di decadimento esponenziale come misura empirica del tasso PK della fase di lavaggio.
    11. Calcola OAI con contrasto migliorato.
      1. Seleziona un punto temporale più lungo del TTP. Determina il valore del segnale in questo momento come misura dell'aumento del contrasto.
        NOTA: Il momento di 10 minuti dopo l'iniezione è spesso selezionato, ma possono essere selezionati altri punti temporali secondo necessità.
      2. In alternativa, si calcola il segnale medio dal TTP al punto temporale selezionato, il segnale medio dal TTP all'ultimo punto, o un altro intervallo di punti temporali secondo necessità.
      3. Si noti che il segnale medio è equivalente all'area sotto la curva PK per questi due punti temporali, che tecnicamente è nota come misura dell'intensità del segnale piuttosto che come misura dell'ampiezza del segnale.
    12. Esegui la modellizzazione PK come descritto nei passaggi 4.3.13–4.3.20.
      NOTA: I seguenti passaggi analizzano le immagini DCE OA acquisite con uno strumento OAI inVision. Altri strumenti OAI possono produrre immagini in un formato dati diverso. I passaggi seguenti possono ancora essere seguiti per analizzare le immagini DCE OA utilizzando altri strumenti OAI se il formato dei dati degli altri strumenti può essere trasferito in MatLab e il formato dei dati viene adattato per corrispondere ai file dati di esempio forniti con il pacchetto software.
    13. Scarica il software.
      1. Per OAI DCE multilunghezza d'onda, scarica OE-DCE_MSOT_Matlab dal repository CAMEL-MartyPagel su Github, o https://github.com/CAMEL-MartyPagel/OE-DCE_MSOT_Matlab.
      2. Per l'OAI DCE a lunghezza d'onda singola, scarica DCE-MSOT_SingleWavelength_Matlab dal repository CAMEL-MartyPagel su Github, o https://github.com/CAMEL-MartyPagel/DCE_MSOT_SingleWavelength_Matlab.
      3. Sblocca il file compresso. Apri il file SOP nella cartella doc e segui la procedura standard per installare e utilizzare il software.
    14. Organizza i componenti software in cartelle diverse. Memorizza i seguenti file software in una singola cartella:
      Codice principale: run_MSOT_nonneg.m
      Sottocodici: run_DCE_MSOT_MSP.m ; run_OE_MSOT_AK_nonneg.m
      Altri codici: Negative_pixel_count.m ; Voxel_count.m; ROI_modification.m
      Cartella intitolata: com.itheramedical.msotlib_beta_rev723_20221128_M2022b
      Dati esportati da ViewMSOT dopo la ricostruzione e la dismescolazione spettrale.
    15. Lancia il programma su MatLab.
      1. Fai doppio clic su run_MSOT_nonneg.m per avviare il programma in Matlab. Clicca sul pulsante "Run" in alto nella finestra di Matlab. Il codice può segnalare un errore che run_OE_MSOT_AK_nonneg non si trova nella cartella corrente o sul percorso MATLAB.
      2. Per correggere questo errore, digita addpath e poi metti la posizione del file tra virgolette (ad esempio addpath 'C:\Users\Nome\Documenti\Non negativo') prima di eseguire il codice.
    16. Seleziona il tipo di analisi: inserisci N per l'analisi OE e Y per l'analisi DCE.
      NOTA: Il programma è in grado di analizzare immagini OA Oxygen Enhanced (OE), che consistono in una combinazione di mappe %sO 2 acquisite con gas respirabile al 21%O2 (aria di grado medico) o gas respirabile al 100%O2 , che non è utilizzato negli studi OS-DCE OAI descritti in questo protocollo.
    17. Seleziona i dati:
      1. Seleziona la cartella che contiene i file OAI DCE. Seleziona la cartella principale di scansione e non la sottocartella MSP.
      2. Poi verifica il nome della scansione. Infine, seleziona la cartella per salvare i dati analizzati.
    18. Inserisci 3 per il numero di cromofori. I cromofori sono Hb,HbO 2 e l'agente di contrasto.
      NOTA: Il programma è progettato per consentire l'analisi DCE OAI di più cromofori che vengono co-iniettati nel modello del muro, se necessario. Tuttavia, il protocollo DCE OAI in questo protocollo utilizza un solo cromoforo.
    19. Ritira il ROI come descritto nei passaggi 4.3.19.1–4.3.19.4.
      1. Disegna il ROI del vaso sanguigno che fungerà da Funzione di Ingresso Arterioso per l'analisi: apparirà un'immagine in scala di grigi della scansione. Traccia manualmente il ROI che rappresenta il vaso sanguigno.
        NOTA: Zooma cliccando sulla lente d'ingrandimento con il segno più appena sopra l'angolo in alto a destra dell'immagine. Clicca di nuovo sulla lente d'ingrandimento per tornare alla modalità in cui disegna il ROI. La vena cava inferiore vicino alla colonna vertebrale può spesso essere identificata e utilizzata come AIF.
      2. Disegna il ROI del tumore: apparirà un'immagine in scala di grigi della scansione. Traccia il ROI che rappresenta l'intero tumore, il bordo tumorale o il nucleo tumorale. Per analizzare più di un ROI, ripetere tutta questa procedura di modellizzazione PK (Passo 4.3.12) per ottenere un ROI aggiuntivo.
      3. Estrai il ROI di una regione muscolare: Non usare questo ROI nel calcolo dell'OAI DCE. Utilizzare il ROI del muscolo per l'analisi OAI DCE utilizzando il Modello Lineare della Regione di Riferimento, che non è utilizzato in questo rapporto. Questo passaggio deve comunque essere eseguito affinché il programma possa continuare.
      4. Verifica che il ROI corretto. Inizierà la modellazione della curva PK.
    20. Visualizza i risultati analizzati dell'OAI DCE.
      1. Per caricare i dati DCE analizzati, vai nella barra del browser e seleziona DCE_MSOT_MSP.
      2. Nella finestra di comando, inserisci cancella tutto.
        NOTA: La scheda attuale delle cartelle è ora popolata con dati OAI DCE analizzati, che includono:
        Average_signal_Wavelength_ICG.mat: Doppia clic su questo per visualizzare i valori tabellati di NKtrans e kep per il ROI del tumore. I parametri cinetici sono tabulati in 3 modi:
        NK tras_avg: Media dellatransazione NK calcolata per ogni pixel.
        NKtrans _avg_signal: Singolo valoreNK trans calcolato dopo aver mediato i segnali per l'intero tumore
        NKtrans _nz: NK trans_avg calcolato solo con valori di pixel diversi da zero.
        Analogamente, si possono visualizzare k valoridi ep .
        NKtrans.fig: Mostra la mappa_avg trans NK sovrapposta a un'immagine in scala di grigi.
        kep.fig: Mostra la mappak ep_avg sovrapposta a un'immagine in scala di grigi.
        Maps_Wavelength_ICG.mat: Questo deve essere caricato per visualizzare altre mappetrans o kep di NK. Dopo aver caricato questa matrice, usa il "codice di sovrapposizione" (incluso separatamente) per visualizzare il parametro desiderato.
        Muscle_Average_signal_Wavelength_ICG.mat e Muscle_Maps_Wavelength_ICG.mat: Parametri di visualizzazione per il ROI muscolare.
        Segnale normalizzato per ICG. figa: Indica il segnale medio di ICG nel tempo nei tre ROI, normalizzato al segnale massimo.
        Segnale per ICG.fig: Indica il segnale medio di ICG nel tempo nei tre ROI.

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Risultati

Il segnale OAI può generare mappe della saturazione di ossigeno in tumori e ferite
Dopo l'acquisizione e la ricostruzione di dataset OAI multispettrali, le regioni di interesse (ROI) possono essere definite all'interno di tumori o letti di ferite per quantificare l'intensità del segnale a diverse lunghezze d'onda. Vengono quindi applicati algoritmi di dismix spettrale per separare i contributi di ossiemoglobina (HbO 2) e disossiemoglobina (Hb) dal segnale o...

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Discussione

Le curve PK OAI DCE possono essere influenzate da una varietà di artefatti che riducono l'affidabilità dell'analisi PK. Un problema comune è la presenza di ferite superficiali, croste o sangue secco all'interno del campo di immagini, che possono introdurre un forte assorbimento aspecifico alla superficie cutanea e oscurare segnali più profondi (Figura 8). Quando si disegnano i ROI all'interno del tumore, bisogna fare attenzione a evitare di includere queste ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse riguardo a quest'opera.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il dottor Neal Burton di iThera Medical, GmbH per la consulenza. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione NRSA di radiologia dell'Università di Madison (2T32CA009206-46), dal finanziamento pilota ITPT Radiological Sciences Trainee, dal programma Clinical and Translational Science Award (CTSA), dal National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), dal UL1TR002373 e TL1TR002375 di finanziamento NIH R43 CA265603, NIH R01 EB034261, NIH R21 EB037731 e da un Falk Catalyst Award del Falk Medical Research Trust.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago da 20 gExel INT26417Ago ipodermico; 20G x 1", utilizzato per la preparazione delle soluzioni di eparina
Cellule 4T1ATCCCRL-2539Linea cellulare tripla negativa per il cancro al seno
Anti-Anti (100x)Gibco15240-062Cocktail di antibiotici
Perforatore per biopsiaIntegra 33-36Punch per biopsia usa e getta da 6 mm  
Acqua di grado coltura cellulareCorning25-055-CV500 mL; testato con un SATER sterile USP per specifiche di inection  
Soluzione della matrice di collageneCorning354262Matrice di collagene per la formazione e iniezione tumorale
EtanoloDeacon Laboratory2701Antisettico generico
Lubrificante per gli occhi  Optixcare 50-218-844220 g/0,70 oz; solo per uso animale 
Garza Fisherbrand22-415-468Garza di cotone; 3" x 3" (7,6 x 7,6 cm); 12 strati
GuantiVWR76457-130Guanti d'esame in nitrilo
EparinaMeithealNDC71288-402-1010.000 unità USP per 10 mL, 1000 unità USP per mL; Fiala multidosaggio da 10 mL
Verde di indocyaninaTCII0535Agente di contrasto optoacustico
IsofluranoIsospira17033-091-25Un anestetico inalatorio non infiammabile e non esplosivo da usare su cavalli e cani; 250 mL 
Film di laboratorioParafilm PM-9922" x 250'; Nucleo di diametro 1"
Rimuovente di peli per dorata nair NairLL4038Crema depilatoria; Ricco burro di cacao e burro di cacao vitamina E
Ago TerumoNN2732R27G x 1 1/4" (6,40 mm x 32 mm); R.W. Reg. Bevel 
Macchina per l'imaging optoacusticoiTheraMedical MSOT in Vision 512Scanner optoacustico
PBS, 1xCorning 21-040-CV500 mL; Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio  
RPMICorning 10-040-CVMezzi di coltura cellulare
Soluzione salinaHospiraNDC0409-4888-0210 mL a dose singola; Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, USP
CronometroiTheraMedical 4135333Usato per registrare minuti e secondi  
SiringheCardinal Health11881280121 mL di siringa per insulina; Solo insulina U-100; 27G x 1/2" (0,35 x 12,7 mm)
Medicazione trasparente per feriteTegaderm1624Wstile di fotogramma trasparente a pellicola; 2 3/8" x 2 3/4" (6 cm x 7 cm)
PinzetteTermo Electron 7626Usato per tirare indietro la pelle quando si iniettano cellule nei topi
Gel per ultrasuoniEcoVue283Confezione da 32 g, senza prpylene glicole, solubile in acqua, senza parabeno e senza coloranti
Suture non tinteEthiconVR493taglio da 18"; P-3 3/8 13 mm; non tinta e intrecciata, sutura assorbibile sintetica, non USP
Pad riscaldanteRepti Therm UTH120VAC 60Hz 8W Usato per riscaldare gli animali sotto anestesia;  
SteccheGrace Bio-Labs476684Silicone trasparente, diametro diametrale 14 mm x diametro diametrale 10 mm spessore 0,5 con punti di sutura e nbsp;
Clip per feriteReflex 7203-1000Sistema di chiusura reflex della pelle, 7 mm, acciaio inox stee

Riferimenti

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