Valutazioni dell'ossigenazione e della perfusione vascolare in modelli preclinici di cancro e guarigione delle ferite utilizzando OS-DCE OAI

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per l'esecuzione dell'Imaging Optoacustico Sensibile all'Ossigeno – Dynamic Contrast Enhanced Optoacoustic Imaging (OS-DCE OAI) per valutare modelli preclinici di cancro e guarigione delle ferite. L'OS OAI può visualizzare ossi- e desossiemoglobina, mappando l'ossigenazione dei tessuti. Il DCE-OAI può visualizzare la farmacocinetica di un agente di contrasto esogeno, mappando così la perfusione vascolare.

Abstract

L'imaging optoacustico sensibile all'ossigeno (OS OAI) e l'imaging optoacustico dinamico con contrasto (DCE OAI) forniscono letture complementari e non invasive della fisiologia tissutale. OS OAI sfrutta la rilevazione multispettrale di ossiemoglobina e desossiemoglobina endogene per generare mappe della saturazione di ossigeno nel sangue (%sO₂), mentre la DCE OAI monitora la farmacocinetica in vivo di un assorbitore nel vicino infrarosso per quantificare la perfusione vascolare e la permeabilità. L'obiettivo di questo protocollo è presentare un flusso di lavoro unificato OS-DCE OAI che consenta la valutazione simultanea di ossigenazione e perfusione in due contesti preclinici ampiamente utilizzati: tumori ortotopici per il cancro al seno e ferite cutanee a spessore completo.

In questo protocollo, abbiamo dimostrato OAI di modelli murini di cancro al seno o ferita da lacerazione. Per OS OAI, vengono acquisite scansioni multispettrali multi-sliccio a 700–875 nm per consentire la dismescolazione spettrale e la stima di percentuali di sO₂. Per la DCE OAI, acquisizioni ripetute a risoluzione temporale ≤5-s vengono eseguite prima e dopo l'iniezione endovenosa di bolus di indocyanina verde (ICG), utilizzando campionamento multispettrale a 700-875 nm o campionamento a lunghezza d'onda singola a 800 nm per generare curve di ampiezza del segnale in funzione del tempo rispetto all'OA. Lo sviluppo di modelli animali, la preparazione per l'imaging OA, le acquisizioni OAI OS e DCE OAI, e le analisi per misurare le caratteristiche di ossigenazione e perfusione vascolare sono dettagliati, insieme a linee guida chiave per la risoluzione dei problemi per artefatti di movimento, assorbitori superficiali e iniezioni fallite.

Insieme, questo protocollo OS-DCE OAI produce un ritratto funzionale integrato dell'ipossia e del trasporto vascolare che può rilevare cambiamenti fisiologici in tumori e ferite prima delle misure anatomiche grossolane. L'OS-DCE OAI è facilmente adattabile ad altri modelli di patologia.

Introduzione

L'imaging optacustico (OAI), noto anche come imaging fotoacustico o tomografia optoacustica multispettrale, è una modalità relativamente nuova che abbina l'eccitazione ottica alla rilevazione a ultrasuoni (US) per consentire l'imaging dei tessuti^{profondi 1,2}. Nell'OAI, impulsi laser brevi in nanosecondi eccitano cromofori endogeni come ossi- e desossiemoglobina, generando espansione termoelastica localizzata e onde acustiche a banda larga rilevate dai trasduttori americani. Questi segnali permettono all'OAI di ottenere immagini con contrasto ottico a risoluzione spaziale simil....

Protocollo

Esegui tutte le procedure con l'approvazione del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) della tua istituzione. Tutte le procedure del protocollo qui sotto sono state approvate dall'IACUC della nostra istituzione.

1. Anestesia (per procedure successive)

1. Induzca l'anestesia. Inizialmente indurre e mantenere l'anestesia con il 5% di isoflurano in un gas portatore di ossigeno al 100% finché il topo non è più sveglio.
2. Mantieni l'anestesia. Continuare ad anestetizzare il topo con 1,5–2% di isoflurano in un gas portatore di ossigeno al 100%. Verifica....

Risultati

Il segnale OAI può generare mappe della saturazione di ossigeno in tumori e ferite
Dopo l'acquisizione e la ricostruzione di dataset OAI multispettrali, le regioni di interesse (ROI) possono essere definite all'interno di tumori o letti di ferite per quantificare l'intensità del segnale a diverse lunghezze d'onda. Vengono quindi applicati algoritmi di dismix spettrale per separare i contributi di ossiemoglobina (_{HbO 2}) e disossiemoglobina (Hb) dal segnale o.......

Discussione

Le curve PK OAI DCE possono essere influenzate da una varietà di artefatti che riducono l'affidabilità dell'analisi PK. Un problema comune è la presenza di ferite superficiali, croste o sangue secco all'interno del campo di immagini, che possono introdurre un forte assorbimento aspecifico alla superficie cutanea e oscurare segnali più profondi (Figura 8). Quando si disegnano i ROI all'interno del tumore, bisogna fare attenzione a evitare di includere queste .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ago da 20 g	Exel INT	26417	Ago ipodermico; 20G x 1", utilizzato per la preparazione delle soluzioni di eparina
Cellule 4T1	ATCC	CRL-2539	Linea cellulare tripla negativa per il cancro al seno
Anti-Anti (100x)	Gibco	15240-062	Cocktail di antibiotici
Perforatore per biopsia	Integra	33-36	Punch per biopsia usa e getta da 6 mm
Acqua di grado coltura cellulare	Corning	25-055-CV	500 mL; testato con un SATER sterile USP per specifiche di inection
Soluzione della matrice di collagene	Corning	354262	Matrice di collagene per la formazione e iniezione tumorale
Etanolo	Deacon Laboratory	2701	Antisettico generico
Lubrificante per gli occhi	Optixcare	50-218-8442	20 g/0,70 oz; solo per uso animale
Garza	Fisherbrand	22-415-468	Garza di cotone; 3" x 3" (7,6 x 7,6 cm); 12 strati
Guanti	VWR	76457-130	Guanti d'esame in nitrilo
Eparina	Meitheal	NDC71288-402-10	10.000 unità USP per 10 mL, 1000 unità USP per mL; Fiala multidosaggio da 10 mL
Verde di indocyanina	TCI	I0535	Agente di contrasto optoacustico
Isoflurano	Isospira	17033-091-25	Un anestetico inalatorio non infiammabile e non esplosivo da usare su cavalli e cani; 250 mL
Film di laboratorio	Parafilm	PM-992	2" x 250'; Nucleo di diametro 1"
Rimuovente di peli per dorata nair	Nair	LL4038	Crema depilatoria; Ricco burro di cacao e burro di cacao vitamina E
Ago	Terumo	NN2732R	27G x 1 1/4" (6,40 mm x 32 mm); R.W. Reg. Bevel
Macchina per l'imaging optoacustico	iTheraMedical	MSOT in Vision 512	Scanner optoacustico
PBS, 1x	Corning	21-040-CV	500 mL; Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio
RPMI	Corning	10-040-CV	Mezzi di coltura cellulare
Soluzione salina	Hospira	NDC0409-4888-02	10 mL a dose singola; Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, USP
Cronometro	iTheraMedical	4135333	Usato per registrare minuti e secondi
Siringhe	Cardinal Health	1188128012	1 mL di siringa per insulina; Solo insulina U-100; 27G x 1/2" (0,35 x 12,7 mm)
Medicazione trasparente per ferite	Tegaderm	1624W	stile di fotogramma trasparente a pellicola; 2 3/8" x 2 3/4" (6 cm x 7 cm)
Pinzette	Termo Electron	7626	Usato per tirare indietro la pelle quando si iniettano cellule nei topi
Gel per ultrasuoni	EcoVue	283	Confezione da 32 g, senza prpylene glicole, solubile in acqua, senza parabeno e senza coloranti
Suture non tinte	Ethicon	VR493	taglio da 18"; P-3 3/8 13 mm; non tinta e intrecciata, sutura assorbibile sintetica, non USP
Pad riscaldante	Repti Therm UTH	120VAC 60Hz 8W	Usato per riscaldare gli animali sotto anestesia;
Stecche	Grace Bio-Labs	476684	Silicone trasparente, diametro diametrale 14 mm x diametro diametrale 10 mm spessore 0,5 con punti di sutura e nbsp;
Clip per ferite	Reflex 7	203-1000	Sistema di chiusura reflex della pelle, 7 mm, acciaio inox stee