Trasduzione lentivirale doppia per generare cellule staminali neurali mutanti per la ricerca sul glioma

Sommario

Questo protocollo descrive la generazione di cellule staminali neurali murine mutanti (NSC) per la ricerca sul glioma utilizzando trasduzioni lentivirali sequenziali. Le mutazioni oncogeniche vengono introdotte per prime nei NSC, seguite da un lentivirus bicistronico contenente geni reporter. Dopo la doppia selezione degli antibiotici, i NSC mutanti consentono l'imaging in tempo reale della crescita tumorale e della risposta al trattamento.

Abstract

I gliomi sono i tumori cerebrali primari più diffusi negli adulti, e la modellazione murina suggerisce che possano derivare da mutazioni oncogeniche nelle NSC o nei progenitori differenzianti precoce. I modelli di trapianto ortotopico derivati da NSC mutanti hanno quindi il potenziale di fornire preziose informazioni precliniche sulla patogenesi del glioma, sugli esiti e sulla risposta al trattamento. Questi modelli richiedono l'introduzione di una mutazione oncogenica nelle NSC, preferibilmente abbinata a segnalatori per aiutare nella determinazione dell'efficienza della trasfezione/trasduzione e per monitorare la crescita tumorale in vivo. Questo protocollo delinea una metodologia basata sulla doppia trasduzione per generare NSC mutanti adatti al monitoraggio tumorale in vivo . In questa tecnica, i NSC isolati vengono prima trasdotti con lentivirus che contengono un gene di interesse (mutazione oncogenica o controllo della proteina fluorescente verde [GFP]) oltre a un elemento di resistenza alla blasticidina. Dopo la selezione della blasticidina, le cellule vengono trasdotte secondariamente da un vettore lentivirale bicistronico che esprime luciferasi e proteine fluorescenti rosse (RFP), oltre a un elemento di resistenza alla puromicina. Dopo la selezione della puromicina, le cellule possono essere espanse per saghi di proliferazione, trapianto ortotopico o altre applicazioni a valle. Questo approccio di doppia trasduzione consente di stimare l'efficienza della trasduzione in entrambe le fasi di infezione, nonché di monitorare in vivo l'insediamento, la crescita e la risposta alla terapia del tumore tramite imaging bioluminescente non invasivo (BLI). Questo sistema rappresenta uno strumento utile per la ricerca sul glioma, unendo la rilevanza biologica della modellazione tumorale derivata da cellule staminali neurali adulte con il vantaggio pratico della capacità di imaging in tempo reale, migliorando così la comprensione della biologia del glioma e lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.

Introduzione

I gliomi sono la forma più diffusa di tumori cerebrali primari che colpiscono gli adulti, costituendo circa l'80% di tutte le neoplasie cerebrali maligne in questa^popolazione. La maggior parte di questi sono gliomi^{di alto grado 2}, tipicamente molto invasivi e portano una prognosi negativa ^3,4 nonostante i significativi progressi nelle tecniche neurochirurgiche, radioterapia e approcci ^{chemioterapici 5}. L'elevato tasso di mortalità nei pazienti affetti da questi tumori evidenzia la necessità di una ricerca continua sulla formazione e progressione del glioma.

La gliomagenesi nel sistema nervoso centrale può essere innescata introducendo mutazioni oncogeniche nelle NSC 6,7,8,9 o nella loro progenie differenziativa ^precoce 10,11,12 negli studi di modellazione murina. In particolare, questi studi hanno dimostrato che le stesse mutazioni oncogeniche spesso non producono tumori quando vengono introdotte in cellule più^{differenziate 13}, stabilendo una gerarchia cellulare di origine in cui l'aumento della restrizione della linea di discendenza si correla con una minore suscettibilità alla^{trasformazione 14}. I NSC geneticamente modificati sono quindi comunemente utilizzati per generare modelli di glioma biologicamente rilevanti e versatili, utilizzando sia tecniche transgeniche sia metodi di trapianto^{ortotopico 15}. Entrambi gli approcci permettono di studiare la formazione de novo del tumore nell'ambiente cerebrale nativo da una cellula non trasformata. Modelli geneticamente modificati permettono questo studio in animali con un sistema immunitario intatto, spesso imitando meglio l'istologia e l'eterogeneità cellulare osservate nei tumori^{umani 16}. Tuttavia, generare questi modelli richiede molto lavoro e costi, e spesso presentano lunghi tempi di latenza e basse frequenze di formazione^{tumorale 16}. Al contrario, i modelli ortotopici NSC sono più facilmente manipolabili ed economici. I NSC mutanti possono essere generati da cellule primarie o immortalate sia di topi che di esseri umani, in base alle esigenze sperimentali, e sono anche adatti per sperimentazioni in vitro. ^16,17. Inoltre, questi modelli offrono la capacità di regolare con precisione lo stadio di sviluppo sia dei NSC che dei topi riceventi, nonché la localizzazione spaziale da cui i NSC derivano e a cui vengono introdotti. Questo permette ai ricercatori di indagare come l'età e specifiche regioni cerebrali influenzino la tumorogenesi guidata da particolari^{mutazioni 17}.

Questo protocollo delinea la metodologia per generare NSC murini mutanti a partire da colture primarie, adatti sia per applicazioni sperimentali in vitro che in vivo (Figura 1). Il protocollo è composto da due fasi di trasduzione distinte che avvengono in una specifica sequenza temporale. Nella fase iniziale di trasduzione, le NSC murine isolate sono infettate da lentivirus ricombinanti che portano il costrutto genetico bersaglio, sia una mutazione oncogenica sia un controllo di proteina fluorescente verde (GFP), insieme a una cassetta di resistenza alla blasticidina. Successivamente, viene applicata la pressione di selezione antibiotica usando blasticidina, permettendo solo alle cellule trasdotte sopravvissute di procedere a un evento di trasduzione secondario. Questo evento secondario impiega una costruzione lentivirale bicistronica che codifica sia i geni segnalatori luciferasi della lucciola che quelli della proteina fluorescente rossa (RFP), accoppiati con elementi di resistenza alla puromicina per la successiva selezione. Dopo la selezione con puromicina, le popolazioni di NSC dualmente trasdotte risultanti vengono espanse in vitro prima di ulteriori esperimenti. Questo approccio di trasduzione sequenziale offre diversi vantaggi metodologici: (1) facilita una valutazione quantitativa dell'efficienza della trasduzione a ogni^{passo 18}, (2) stabilisce linee cellulari reporter stabili adatte al tracciamento longitudinale, e (3) consente il monitoraggio non invasivo dell'inizio tumorale, della cinetica della progressione e delle risposte terapeutiche tramite metodologie^{BLI 18,19,20}. Può essere utilizzato anche con i NSC primari o^{immortalati 21, 22, 23}.

Il protocollo qui presentato risponde all'urgente necessità di un approccio standardizzato, efficiente e biologicamente rilevante per generare modelli di glioma derivati dal NSC da animali adulti con capacità di imaging integrate. Si prevede che i modelli risultanti forniscano informazioni clinicamente rilevanti riguardo alla patogenesi del glioma, faciliteranno l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e presenteranno solide piattaforme per la valutazione preclinica delle nuove strategie terapeutiche.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con gli standard etici e le linee guida normative stabilite dalla Washington University di St. Louis. Per questo protocollo, la corteccia dei topi adulti è stata micro-dissezionata secondo la tecnica²⁴ descritta dal laboratorio Brossier e utilizzata per isolare i NSC primari murini per l'espansione successiva in colture non aderenti secondo il protocollo^{stabilito 24,25,26}. Tutti i reagenti utilizzati in coltura sono forniti in formato sterile o passati attraverso un filtro a membrana da 0,2 μM per garantire la sterilità. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Isolamento di cellule staminali neurali da tessuto microdissezionato

1. Prepara Media di Dissociazione (DM) e Medium di Digestione della Tripsina (TDM), come riportato nella Figura 2.
   1. Aggiungi 200 μL di Trypsin Digest Medium in tubi microcentrifughe da 1,5 mL e lascia sul ghiaccio per almeno 20 minuti prima dell'uso. La DM può essere lasciata a temperatura ambiente per le fasi successive del protocollo.
   2. Mentre i tubetti sono pre-raffreddati, si prepara il Neuro Staminale Cell Medium (NSC; ricetta mostrata nella Figura 2) e si posiziona il NSC e il Siero Bovino Fetale (FBS) a 37 °C in un bagno d'acqua o di perline per preriscaldarli. Mettere aliquote di integratori (B27, N2) e fattori di crescita (EGF, FGF) in un secchio del ghiaccio per farli scongelare lentamente.
      NOTA: Il TDM deve essere preparato fresco ogni volta prima dell'uso, anche se NSC e DM possono essere conservati a 4 °C tra un utilizzo e l'altro; le ricette sono mostrate nella Figura 2. Le scorte di N2, B27, EGF e FGF devono essere alquotate e conservate a -20 °C fino all'uso; evitare ripetuti congelamenti e disgelo delle scorte ricostituite (vedi Tabella dei materiali per ulteriori dettagli nella preparazione degli stock di EGF e FGF).
2. Dopo che i tubi microcentrifughe contenenti TDM sono stati sufficientemente raffreddati, si microdisseziona il tessuto come descritto^{in precedenza 24}. Dopo ogni microdissezione, inserire il tessuto in un tubo per microcentrifuga. Riportare il tubo al ghiaccio fino al completamento di tutte le dissezioni, poiché qualsiasi riscaldamento del tessuto potrebbe iniziare precocemente il processo di digestione enzimatica e causare una sovradigestione.
3. Incubare il/i tubo/i della microcentrifuga a 37 °C in un bagno d'acqua o di perle per 15 minuti per iniziare la digestione enzimatica. Durante l'incubazione, preparare il 10% di FBS in NSC aggiungendo 0,5 mL FBS a 4,5 mL di NSC.
   1. Dopo l'incubazione, si tratta delicatamente di pipettare il campione 5–10 volte con una micropipetta da 1 mL per dissociare ulteriormente le cellule, poi neutralizza la tripsina aggiungendo 200 μL di FBS al 10% di NSC a ciascun campione. Pipetta su e giù delicatamente per mescolare.
      NOTA: È fondamentale seguire il tempo raccomandato di incubazione a 37 °C. La tripsinizzazione eccessiva può portare alla morte cellulare, mentre la sotto-tripsinizzazione può rendere difficile dissociare il campione (vedi Tabella 1, Punti 1–2 per questo e altri consigli di risoluzione dei problemi).
      NOTA: Per incubare i campioni possono essere utilizzati sia un bagno d'acqua che un bagno di perline; quest'ultimo può ridurre il rischio di^{contaminazione 27}, ma questo può comportare il rischio di un trasferimento di calore^{meno efficiente 28}.
4. Centrifuga le celle primarie isolate a 630 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspira il soprandante, facendo attenzione a non disturbare le cellule sul fondo del pozzo. Lava le cellule aggiungendo 2,5 mL di DM al pellet cellulare e risospendendo pipettando delicatamente su e giù 3–4 volte. Centrifuga di nuovo a 630 × g per 5 minuti a 4 °C, e aspira con cura il soprantantante.
5. Ripeti il Passo 1.3 per eseguire un secondo lavaggio. Durante il lavaggio finale, aggiungere B27, N2, FGF ed EGF a un mezzo NSC di base preriscaldato per creare un mezzo NSC completo (ricetta mostrata nella Figura 2).
6. Aspira il soprandante. Aggiungi 2 mL di mezzo NSC caldo e completo a ogni pellet cellulare, poi risospendi pipettando delicatamente su e giù 3–4 volte. Inserire le cellule risospese in un pozzo di una piastra di attacco basso a 6 pozzi e incubare a 37 °C.
   NOTA: Sebbene il substrato NSC di base possa essere conservato a 4 °C tra un utilizzo e l'altro, integratori e fattori di crescita possono subire degradazione a questa temperatura. Pertanto, B27, N2, FGF ed EGF dovrebbero essere aggiunti al supporto NSC per creare un mezzo NSC completo immediatamente prima dell'uso.

2. Fondazione ed espansione della cultura della neurosfera

1. Somministrare 0,5–1 mL di mezzo alimentare fresco per NSC (ricetta mostrata nella Figura 2) a ciascun pozzo delle colture NSC ogni 3 giorni.
2. Monitorare la formazione della neurosfera. Quando sono visibili piccole sfere completamente formate, la coltura è pronta per il passaggio (tipicamente 5–10 giorni dalla placcatura iniziale).
   NOTA: Le cellule crescono meglio quando sono passate frequentemente e quando sono ancora nella fase logaritmica di crescita. Le neurosfere più grandi sono più difficili da dissociare e più soggette alla morte cellulare durante questo processo. Pertanto, si raccomanda un passaggio più precoce e frequente per promuovere la salute cellulare. Quando pronte per il passaggio, le neurosfere isolate avranno un diametro di ~100–200 μm, con cellule strettamente compatte e bordi lisci e ben definiti sotto microscopia a campo chiaro. Le neurosfere non mostreranno proiezioni o estensioni irregolari. Il centro delle neurosfere sarà leggermente più scuro dei bordi esterni, ma non in modo eccessivo; nuclei eccessivamente scuri spesso derivano da necrosi delle cellule centrali dovuta alla privazione di nutrienti quando le neurosfere sono state sovracresciute. Il passaggio di neurosfere sovradimensionate spesso porta a elevate quantità di morte cellulare, che può influire sulle applicazioni a valle. Vedi la Tabella 1, Punti 3–4 per questo e altri consigli di risoluzione dei problemi.
3. Preriscaldare il mezzo NSC, DM, 0,05% di tripsina-EDTA e soluzione salina tamponata fosfato (PBS) a 37 °C utilizzando un bagno d'acqua o di perle. Metti in pausa le scorte di B27, N2, FGF, EGF e FBS finché non serve.
4. Per il passaggio, trasferire neurosfere ben sviluppate in un tubo conico sterile da 15 mL utilizzando una pipetta siologica. Centrifugare a 630 × g per 1 minuto a 4 °C per calmare le neurosfere. Aspira il soprandante, facendo attenzione a non disturbare le neurosfere a pellet. Lava le cellule risospendendole in 1x PBS sterile, poi centrifuga di nuovo a 630 × g per 5 minuti a 4 °C e aspira il soprantantante.
5. Aggiungi 1 mL di tripsina/EDTA allo 0,05% al pellet cellulare. Pipetta su e giù 3–5 volte con una micropipetta da 1 mL per mescolare, poi incuba a 37 °C in un bagno d'acqua o di perline per 5–6 minuti.
   1. Dopo l'incubazione, si pipetta delicatamente su e giù 5–10 volte con una micropipetta da 1 mL per rompere le neurosfere. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 1 mL al 10% FBS nel mezzo NSC; Pipetta delicatamente per mescolare.
      NOTA: Evitare la sovra-tripsinizzazione e/o la pipettazione troppo vigorosa delle neurosfere, poiché potrebbe danneggiare i NSC e compromettere la vitalità cellulare.
6. Aggiungi 2,5 mL di DM e centrifuga a 630 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspira il soprandante. Ripeti il passaggio di lavaggio con altri 2,5 mL DM, seguiti dalla centrifugazione e aspirazione del soprantantante, per rimuovere tracce di FBS nel mezzo.
7. Sospendere le cellule in 1 mL di mezzo NSC fresco e completo. Sospensione della cella filtrante inserendo un filtro sterile da 40 μm in un tubo microcentrifuga da 50 mL, poi aggiungendo la soluzione della cella sulla parte superiore del filtro e lasciando che la gravità dreni la soluzione nel tubo. Eventuali cellule non dissociate rimanenti verranno catturate dal filtro, mentre le singole cellule passeranno alla soluzione sottostante.
8. Dalle cellule risospese e filtrate, si prelevano 10 μL per il conteggio delle cellule e si mescolano con 10 μL di blu di tripano. Utilizzando un emocitometro manuale, carichi 10 μL del campione e conteggi le cellule vitali (cioè quelle che non sono blu) secondo la prassi^{standard 29}. In alternativa, può essere utilizzato un contatore automatico di celle, anche se può essere meno accurato in presenza di detriti cellulari o^{aggregati 30,31}.
   NOTA: Generalmente, meno del 10%–15% del totale delle cellule dovrebbe mostrare segni di morte cellulare (ad esempio, non poter escludere il blu tripano). Tassi più elevati di morte cellulare possono derivare da una sovra-tripsinizzazione, da una forza meccanica eccessiva nelle cellule in separazione o da una cattiva salute complessiva della coltura prima della tripsinizzazione (vedi Tabella 1, Punti 1–3). Poiché ciò può influire negativamente sulle applicazioni a valle, si raccomanda che le cellule vengano riplaciate (Passo 2.9) e nuovamente espanse (ad esempio, ripetere i Passaggi 2.1–2.9) se si osservano alti tassi di mortalità cellulare invece di procedere con la trasduzione.
9. Diluire 5 x 10⁵ celle in 2 mL di mezzo NSC fresco completo e placcare in un pozzetto di una piastra a 6 pozzi con attacco ultra-basso. Somministrare 0,5–1 mL di alimentazione NSC fresca a ciascun pozzo ogni tre giorni per garantire una salute ottimale della coltura. Quando sono completamente formate e sane sono visibili (vedi Tabella 1, Punto numero 4), la coltura è pronta per l'uso nel Passaggio 3 o 4.
   NOTA: A questo punto si possono immagazzinare NSC extra risopendendo un milione di NSC in 1 mL di mezzo congelante cellulare senza siero in un crioviale da 1,5 mL e conservandoli a -80 °C. Gli NSC possono anche essere ulteriormente espansi se necessario impiegando celle aggiuntive in pozzi aggiuntivi della piastra a 6 pozzi o impiegandoli in fiaschette T-25.

3. Curva di uccisione della blasticidina nelle cellule genitori

NOTA: Una volta che le NSC passate formano neurosfere sane, le cellule sono pronte per ulteriori sperimentazioni. Prima della trasduzione, è fondamentale determinare la concentrazione ottimale dell'antibiotico di selezione (blasticidina, in questo caso). Questo deve essere eseguito empiricamente, poiché diverse popolazioni di NSC possono avere una suscettibilità differente all'antibiotico. Se questo è già stato determinato per il tipo di cellula indicato, si passa allo Passo 4.

1. Preriscalda il mezzo NSC di base, DM, 0,05% di Tripsina-EDTA e PBS a 37 °C. Scongela le scorte di B27, N2, FGF, EGF, FBS e blasticidina. Prima di iniziare, o durante i passaggi di incubazione qui sotto, prepara un substrato NSC fresco e completo e il 10% di FBS in un mezzo NSC come descritto sopra.
2. Utilizzando neurosfere appena espanse (dopo la coltura del Passo 2.9 sopra), tripsinizzare e successivamente dividere come nei passaggi 2,5–2,6, quindi risospendere 1 mL di NSC fresco per il conteggio. Filtrare le cellule attraverso un filtro sterile da 40 μm come descritto sopra per rimuovere le cellule non dissociate, poi contare le cellule come descritto nel Passo 2.8.
3. Risospendere 25.000 cellule vitali in 2,5 mL aliquote di NSC fresco completo in 15 mL conici, con 1 aliquota preparata per ogni concentrazione di antibiotico da testare. Prevedi di testare almeno 4–6 diverse concentrazioni, anche se si possono testare altre se si desidera.
4. Aggiungere la quantità appropriata di blasticidina a ciascuna aliquota di 2,5 mL per ottenere la concentrazione finale desiderata (vedi i calcoli campionari nella Tabella 2). Piastra 500 μL di celle sospese (5.000 celle) per pozzo in una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzi, con ogni concentrazione placcata in quadruplicata.
   NOTA: Per ottenere la giusta concentrazione finale, potrebbe essere necessario diluire il materiale di blasticidina prima di essere aggiunto al mezzo. La blasticidina può essere diluita in mezzo NSC o PBS; per un stock diluito 1:1000 (10 mg/mL), aggiungere 1 mL di stocco di blasticidina non diluito (10 mg/mL) a 999 mL di NSC o PBS. Si raccomanda che gli investigatori effettuino tutti i calcoli necessari per raggiungere le concentrazioni desiderate mentre i materiali si riscaldano nel Passo 3.1; calcoli campione mostrati nella Tabella 2.
5. Incubare le cellule a 37 °C. Controlla attentamente le cellule con microscopia a campo chiaro ogni 24 ore per eventuali cambiamenti nella morfologia e la morte cellulare/neurosfera. Alimentare le cellule ogni 3 giorni aggiungendo 0,5–1 mL di mezzo nutritivo NSC fresco integrato con la giusta concentrazione di blasticidina.
6. Determinare la concentrazione appropriata per la successiva selezione di blasticidina identificando la concentrazione più bassa che uccide le cellule non trasdotte tra 72 e 120 ore dopo la placcatura.
   NOTA: Per le NSC murine adulte, 1000 ng/mL (1 mg/mL) di blasticidina è stata identificata come la concentrazione migliore per la selezione degli antibiotici (Figura 3). I passaggi successivi vengono eseguiti usando blasticidina a questa concentrazione. Va notato che la concentrazione ottimale di blasticidina può variare considerevolmente tra le preparazioni cellulari, tipicamente variando da 0,5 a 10 μg/mL a seconda del tipo di campione, del numero di passaggio e delle condizioni di^{coltura 32,33}; Le curve di kill empiriche sono quindi essenziali piuttosto che opzionali per ogni nuovo tipo di cellula. Consulta la Tabella 1, Punto numero 5 per ulteriori consigli di risoluzione dei problemi.

4. Prima trasduzione lentivirale

NOTA: Prima di procedere con la trasduzione, è essenziale conoscere la molteplicità ottimale dell'infezione (MOI) a cui trasducere le particelle lentivirali (LVP). Questo deve essere determinato empiricamente per diversi tipi cellulari; I metodi per farlo sono stati precedentemente ben^{descritti 34,35}. Nei risultati illustrativi raffigurati, è stato utilizzato un MOI di 20 basato sull'esperienza precedente nella trasduzione di NSC primari murini.

1. Inizia con NSC espansi e non trasdotti che formano neurosfere sane (generate dopo l'espansione delle cellule nel Passo 2.9 sopra). Dividere, risospese, filtrare e contare le cellule come indicato nei passaggi 2.3–2.8 sopra, poi le cellule a piastra a una densità di 1,5 x 10⁶ cellule per pozzo in due pozzi (uno per il virus oncogenico, uno per il controllo) di una piastra a 6 pozzi a ultra bassa adesione. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
2. Il giorno seguente, esamina le cellule. I NSC saranno pronti all'infezione se si formano piccoli grumi.
3. Prima di infettare le cellule, scongela con cura l'aliquota lentivirale sul ghiaccio, permettendo uno scongelamento graduale. È fondamentale non affrettare questo processo.
   NOTA: A scopo illustrativo, questo protocollo descrive la trasduzione lentivirale utilizzando due costrutti rappresentativi: (1) un vettore di controllo che esprime GFP sotto il promotore EF1-α con resistenza alla blasticidina, e (2) un vettore sperimentale che esprime un mutante oncogenico BRAF V600E marcato con HA N-terminale sotto il promotore EF1-α, anch'esso con resistenza alla blasticidina. La generazione di lentivirus è al di fuori dell'ambito di questo protocollo, ma è stata precedentemente ben^{descritta 36,37}.
4. Dopo lo scongelamento, riscaldare brevemente il virus a 37 °C immediatamente prima dell'infezione. Determina il volume di LVP da aggiungere a ciascun pozzo, usando la formula MOI x numero di cellule/titolo virale. Utilizzando una micropipetta impostata al volume calcolato, aggiungi lentamente le LVP a goccia sulle cellule coltivate. Fai roteare delicatamente la piastra per distribuire, facendo attenzione a non far schizzare il substrato nei pozzi adiacenti. Incubare le cellule a 37 °C per 24 ore.
   NOTA: Una volta che l'aliquota virale è stata scongelata a temperatura ambiente, non può essere ricongelata e deve essere utilizzata entro 24 ore. Una volta riscaldata l'aliquota a 37 °C, deve essere utilizzata entro un intervallo di 30 minuti.
5. Dopo questo periodo di incubazione, centrifugare le neurosfere a 630 × g per 5 minuti a 4 °C, poi aspirare il soprandante. Risospendere in 2 mL di NSC fresco completo, senza alcun virus o antibiotico, e ripiattirlo in un pozzo fresco di una piastra a 6 pozzetti a basso attacco.
6. Il giorno seguente, si valuta l'efficienza della trasduzione nelle celle di controllo GFP determinando la proporzione di cellule/grumi marcati fluorescenti rispetto al totale delle cellule/grumi tramite microscopia a fluorescenza in più campi. L'espressione attesa del reporter (GFP) dovrebbe essere superiore all'80% per una trasduzione riuscita.
   NOTA: Se si nota un'efficienza di trasduzione subottimale, può essere eseguito un secondo ciclo di infezione (ripetendo i passaggi 4.4–4.6). Se l'efficienza non migliora, si può considerare una riottimizzazione del MOI o la sperimentazione di una preparazione diversa del lentivirus. Consulta la Tabella 1, Punto numero 6 per questi e altri consigli di risoluzione dei problemi.
7. Dopo aver osservato che le neurosfere in via di sviluppo appaiono sane e che sono presenti segni di infezione (GFP positivo; ~80%), procediamo alla divisione delle cellule secondo i Passaggi 2.3–2.6 sopra. Risospendere le cellule in un fresco 5 mL di mezzo NSC completo contenente la giusta concentrazione di blasticidina (1000 ng/mL), poi filtrare attraverso filtri sterili da 40 μm per eliminare gli ammassamenti cellulari. Contare le cellule, poi placcare a circa 5 x 10⁴ cellule/mL in fiaschette T-25 a bassissimo attacco.
   NOTA: Dopo l'aggiunta iniziale dell'antibiotico, può verificarsi un alto tasso di morte cellulare poiché le cellule non trasdotte muoiono; Questo è previsto e dovrebbe migliorare con la selezione continua.
8. Espandi le cellule alimentandole ogni 3 giorni con un integratore che contiene blasticidina. Quando sono completamente formate, sono visibili sfere sane; di solito 5–10 giorni dopo la divisione, la coltura è pronta per l'uso al Passaggio 5 o 6.
   NOTA: Dopo un'ulteriore espansione dei cloni resistenti, si possono raccogliere cellule per il Western blotting (descritto nel Passo 7) per validare che il costrutto oncogenico marcato non fluorescente e marcato con HA venga espresso correttamente. Se in questa fase viene eseguito il Western blotting, si raccomanda comunque di controllare l'espressione dopo la^{seconda trasduzione} (al Passo 7), per garantire un'espressione corretta e continua.

5. Curva di uccisione della puromicina nei NSC resistenti alla blasticidina

NOTA: La concentrazione ottimale di selezione per la seconda trasduzione deve essere determinata empiricamente. In questa fase vengono utilizzati NSC trasdotti resistenti alla blasticidina, e le cellule sono mantenute sotto selezione di blasticidina (1000 ng/mL) per tutta la durata, poiché la trasduzione e la selezione concomitante di blasticidina possono alterare la sensibilità alla puromicina.

1. Preriscalda il mezzo NSC di base, DM, 0,05% di Tripsina-EDTA e PBS a 37 °C. Scongela le scorte di B27, N2, FGF, EGF, FBS, blasticidina e puromicina. Prima di iniziare, o durante i passaggi di incubazione qui sotto, prepara un substrato NSC fresco e completo e il 10% di FBS in un mezzo NSC come descritto sopra.
2. Utilizzando neurosfere resistenti alla blasticidina, tripsinizzare e successivamente dividere come previsto dai Passaggi 2.5–2.7, risospendendo 1 mL di NSC fresco per contare e filtrare per rimuovere grumi. Contare le cellule come descritto nello Passo 2.8, poi risospendere 25.000 cellule vitali in 2,5 mL aliquote di NSC fresco completo in 15 mL conici, con 1 aliquota preparata per ogni concentrazione di antibiotico da testare. Prevedi di testare almeno 4–6 diverse concentrazioni, anche se si possono testare altre se si desidera.
3. Aggiungere blasticidina per ottenere la concentrazione precedentemente ottimizzata (1000 ng/mL = 0,25 mL di stock non diluito / 2,5 mL aliquot). Successivamente, aggiungere la quantità appropriata di puromicina a ogni tubo per raggiungere la concentrazione finale desiderata (vedi i calcoli campioni nella Tabella 2).
4. Piastra 500 μL di celle sospese (5.000 celle) per pozzo in una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzi, con ogni concentrazione placcata in quadruplicata.
5. Incubare le cellule a 37 °C. Controlla attentamente le cellule con microscopia a campo chiaro ogni 24 ore per eventuali cambiamenti nella morfologia e la morte cellulare/neurosfera. Alimentare le cellule ogni 3 giorni aggiungendo 0,25 mL di substrato nutritivo NSC fresco integrato con blasticidina e la giusta concentrazione di puromicina.
6. Determinare la concentrazione appropriata per la successiva selezione della puromicina identificando la concentrazione più bassa che uccide le cellule tra 72 e 120 ore dopo la placcatura.
   NOTA: Per i NSC murini adulti trasdotti con lentivirus illustrativi GFP e/o BRAF-V600E, è stata determinata empiricamente che 100 ng/mL puromicina è stata la migliore concentrazione per la selezione degli antibiotici (Figura 4). Per le trasduzioni esempi, i passaggi successivi sono stati eseguiti utilizzando 1000 ng/mL di blasticidina (dal Passo 3 sopra) e 100 ng/mL di puromicina (dal Passo 5 sopra). Vedi la Tabella 1, punto numero 5 per consigli di risoluzione dei problemi.

6. Seconda trasduzione lentivirale

NOTA: Le cellule rimangono in medi contenenti blasticidina durante la seconda fase di trasduzione per garantire che il costrutto oncogenico o il controllo GFP introdotto nella prima fase di trasduzione venga mantenuto nelle cellule.

1. Avvia la procedura utilizzando NSC resistenti alla blasticidina, in fase di proliferazione attiva e trasdotti stabilmente (generati nello Passo 4). Iniziare dissociando i NSC in una sospensione a cella singola (Passaggi 2.3–2.7) per garantire l'uniformità durante la placcatura.
2. Cellule a lastre a densità di 1,5 x 10⁶ celle per pozzo in un mezzo NSC completo con blasticidina (1000 ng/mL, come determinato nel Passo 3) in una piastra a 6 pozzi a ultra bassa adesione. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
3. Il giorno seguente, le cellule saranno pronte per la trasduzione se formano piccoli grumi. Scongelare il lentivirus bicistronico (contenente luciferasi e RFP) sul ghiaccio, poi riscaldarlo brevemente a 37 °C immediatamente prima dell'infezione. Determinare il volume di LVP da aggiungere a ciascun pozzo, usando la formula MOI x numero di celle/titolo del virus; qui viene utilizzato un MOI di 20.
   1. Utilizzando una micropipetta impostata al volume calcolato, aggiungi lentamente le LVP a goccia sulle cellule coltivate. Fai roteare delicatamente la piastra per distribuire, facendo attenzione a non far schizzare il substrato nei pozzi adiacenti. Incubare le cellule a 37 °C per 24 ore.
4. Il giorno seguente, centrifugare le neurosfere a 630 × g per 5 minuti a 4 °C e riimpigliarle in un NSC fresco e completo contenente blasticidina (1000 ng/mL, come previsto dal Passaggio 3).
5. Il giorno seguente, valuta l'efficienza del secondo passaggio di trasduzione determinando la proporzione di cellule/grumi RFP positivi rispetto al totale delle cellule/grumi tramite microscopia a fluorescenza in più campi, con un'efficienza ottimale di ~60%.
6. Osservando che le neurosfere appaiono sane e che il secondo passaggio di trasduzione è stato efficace (ad esempio, la maggior parte degli ammassamenti cellulari è RFP+), le cellule sono pronte per la doppia selezione. Iniziare dissociando i NSC in una sospensione a singola cella (Passaggi 2.3–2.7), poi riplaccare a circa 5 x 10⁴ cellule/mL in fiaschette T-25 a bassissimo attacco in NSC completo contenente blasticidina (1000 ng/mL) e puromicina (100 ng/mL).
   NOTA: Come nel Passo 4.6 sopra, se si nota un'efficienza di trasduzione subottimale, può essere eseguito un secondo ciclo di infezione (ripetendo i Passaggi 6.3–6.6). Consulta la Tabella 1 per ulteriori consigli di risoluzione dei problemi.
7. Nutrire le cellule ogni 3 giorni con un integratore che contiene blasticida e puromicina.
   NOTA: Un monitoraggio attento delle colture è essenziale per identificare i cloni dualmente resistenti, che saranno caratterizzati dalla loro sopravvivenza a entrambe le pressioni selettive. Quando sono completamente formate e sane, sono visibili sfere di solito 5–10 giorni dopo la divisione, la coltura è pronta per ulteriori validazioni (Passo 7).

7. Validazione e caratterizzazione dei NSC doppiamente trasdotti

NOTA: Prima di eseguire ulteriori sperimentazioni in vitro o in vivo, si raccomanda un'ulteriore validazione per garantire che i costrutti marcati con HA e la luciferasi siano espressi in modo appropriato.

1. Western blotting per validare l'espressione del costrutto marcato con HA
   1. Culture NSC (controllo GFP e BRAF marcato con HA. V600E, nell'esempio fornito) nelle fiaschette a ultra-bassa aderenza T-25 fino a quando non sono pronte a spaccarsi (come da Passo 2.2).
      NOTA: Prima di procedere al passo successivo, si raccomanda di verificare due volte le colture per l'espressione continua di GFP (nelle cellule di controllo della GFP) e l'espressione RFP (in tutte le cellule).
   2. Rimuovere metà della coltura e dividere come previsto dai Passaggi 2.2–2.7, poi riplaccare in un mezzo NSC fresco e completo con blasticidina (1000 ng/mL) e puromicina (100 ng/mL) per l'espansione continua della coltura. Fai girare il resto delle neurosfere a 630 × g a 4 °C, poi aspira via il soprantantante.
   3. Successivamente, lavare due volte i NSC con PBS gelato, centrifugando a 630 × g a 4 °C e aspirando dal sovrantato dopo ogni lavaggio. Aggiungere circa 200 μL di tampone di lisi RIPA gelato integrato con proteasi e proteasi a ogni campione.
   4. Lascia incubare i lisati sul ghiaccio per 30 minuti, assicurando vortici intermittenti ogni 10 minuti. Centrifugare i campioni a 14.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Trasferisci con cura il soprantantante, designato come lisato sgombroso, in un tubo fresco pre-raffreddato. Conserva i lisati a -80 °C in un congelatore profondo.
   5. Il lisato può quindi essere utilizzato per il Western blotting (per validare l'espressione dei costrutti) secondo i protocolli³⁸ già stabiliti.
      NOTA: Se non si usa immediatamente, conserva i lisati a -80 °C fino all'uso. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento per mantenere l'integrità del campione (vedi Tabella 1, Punto n. 7).
2. Intensità della bioluminescenza (BLI) per convalidare l'espressione appropriata della luciferasi delle lucciole
   NOTA: Questo protocollo valida l'espressione della luciferasi utilizzando il monitoraggio BLI delle cellule vive utilizzando hardware e software specifici (vedi Tabella dei Materiali per ulteriori dettagli). Se si utilizza un sistema diverso per il rilevamento e quantificazione del BLI, la metodologia può variare.
   1. Dividere le NSC e quantificare come indicato nei Passaggi 2.2–2.8 sopra, poi diluire le cellule in mezzo e piastra NSC complete a concentrazioni variabili (ad esempio, 2,5 x 10⁴ cellule, 1 x 10⁵ cellule/pozzo) in una piastra di 24 pozzi a ultra-bassa aderenza (500 mL/pozzo), con ogni concentrazione cellulare placcata in quadruplicato. Le cellule sono mantenute in un mezzo NSC completo contenente blasticidina (1000 ng/mL) e puromicina (100 ng/mL).
      NOTA: Per evitare che l'intensità di luminescenza secreta da luciferasi di un pozzo si riversi nei pozzi adiacenti durante la misurazione, si evitano le placche di contenimento delle NSC nei pozzi adiacenti.
   2. Accendi il sistema di imaging almeno 30 minuti prima per permettere alla telecamera del dispositivo accoppiato a carica di raffreddarsi fino alla temperatura di funzionamento ottimale (circa -90 °C). Avviare il software di quantificazione e sanificare la camera di imaging usando il 70% di etanolo, permettendole di asciugare completamente prima dell'uso.
      NOTA: Mantieni la temperatura della camera di imaging a 37 °C per garantire la vitalità cellulare durante sessioni di imaging prolungate.
   3. Scongelare le aliquote stock di D-luciferina, assicurandone che siano protette dall'esposizione alla luce. Aggiungi delicatamente un volume di 5 μL di soluzione lavorativa di D-luciferina da 15 mg/mL su ciascuna cellula contenente per raggiungere una concentrazione finale di 150 mg/mL. Fai ruotare leggermente la piastra per garantire una distribuzione uniforme della soluzione.
   4. Incubare la piastra a 37 °C per 10 minuti per facilitare la diffusione del substrato nelle cellule, favorendo così la massima produzione di luce.
   5. Posizionare la piastra all'interno del sistema di imaging a bioluminescenza sensibile. Metti una griglia sopra la placca. Seleziona la modalità di immagine luminosa , iniziando con l'auto-esposizione per il tempo di esposizione. Imposta il binning su medium e regola il f-stop a 1 per ottimizzare la raccolta della luce.
      1. Imposta il campo visivo su 'D' per le piastre a 24 pozzi e fissa l'altezza del soggetto a 1,5 cm. Acquisire immagini utilizzando il software di imaging. Se il segnale sembra basso, il tempo di esposizione può essere regolato manualmente (vedi Troubleshooting Table Point No. 8).
   6. Eseguire la correzione di fondo contro i pozzi di controllo e quantificare le unità di luce relative necessarie per l'analisi successiva utilizzando il software di imaging.
      NOTA: Dopo la validazione del BLI, le cellule possono essere trapiantate ortotopicamente nel cervello di topi sintetici o immunocompromessi, in conformità con i protocolli precedentemente^{stabiliti 19}.

Risultati

I NSC adulti sono stati isolati dalla corteccia di topi adulti C57BL/6 e coltivati in coltura non aderente³⁹, con il risultato della formazione di neurosfere primarie (20 – 250 μm) entro 7-10 giorni (Figura 1). Le cellule sono poi state espanse in vitro. L'ottimizzazione della selezione della blasticidina è stata poi eseguita nei NSC non trasdotti (Passo 3). Dopo 24 ore di selezione, concentrazioni pari o superiori a...

Discussione

Questo metodo di trasduzione lentivirale in due fasi ha generato con successo NSC geneticamente modificati adatti alla ricerca oncologica. Qui, è stata illustrata l'integrazione efficace della mutazione oncogenica BRAF V600E (presente in un sottoinsieme di gliomi adulti di alto grado e utilizzata qui come prova di concetto) o del controllo GFP con sistemi di doppio reporter per l'imaging di bioluminescenza (luciferasi) e la rilevazione microscopica a fluorescenza (RFP). La trasd...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
β-mercaptoetanolo (BME)	Sigma	M3148-25ML	Utilizzare all'interno del gabinetto di sicurezza biologica. Preparare stock da 50 mM aggiungendo 35 mL di BME a 10 mL di DMEM a basso contenuto di glucosio, filtrare in modo sterile e distribuire in aliquote da 500 mL per l'uso nella preparazione dei media.
Anticorpo legato a HRP anti-IgG topo	Cell Signal Technology	7076	Utilizzato alla diluizione 1: 2000 in 1% di latte scremato
Supplemento B-27 (50X),	Gibco	17504-044	Al primo utilizzo, scongelare e preparare aliquote da 1 ml per uso futuro; conservare le aliquote a -20 °C. Tenere i supplementi sul ghiaccio dopo lo scongelamento fino al momento di aggiungerli ai media
Blasticidina S HCl (10 mg/mL)	Gibco	A1113903	Preparare aliquote dello stock da 10 mg/mL; mettere in tubi piccoli da 200 mL e conservare a  -20 °C fino all'uso.
Albumina sierica bovina (BSA)	Millipore-Sigma	A1470-10G	Usato come BSA al 10% in peso/volume in 1x PBS. La BSA è appiccicosa; assicurarsi di pesarla correttamente e aggiungere un volume appropriato di diluente per ottenere la soluzione esatta.
Filtro cellulare (40 µm)	Midsci	40ICS	Pre-sterilizzato e confezionato individualmente. Deve essere aperto all'interno del gabinetto di sicurezza biologica. Non toccare con le mani nude
D-Lucifericina, sale di potassio	Gold Biotechnology	eLUCK-100	Preparare una soluzione di lavoro da 15 mg/mL (diluito in acqua di grado molecolare) e filtrare in modo sterile prima dell'uso. Preparare un nuovo stock ogni volta e aggiungerlo direttamente ai media per ottenere la concentrazione di lavoro finale di 150 mg/mL (ad esempio 5 mL di soluzione di lavoro per 500 mL di coltura)
DMEM, a basso contenuto di glucosio	Gibco	11885-084	Usato per preparare il mezzo base NSC
Fattore di crescita epidermica (EGF)	Corning	354001	Fornito come polvere liofilizzata sterile; per ricostituire lo stock 1000X, aggiungere 4,95 mL di PBS e 50 µL di BSA al 10% (in 1x PBS) a 100 µg di polvere liofilizzata di EGF e pipettare per combinare.  Preparare aliquote da 500 µL o inferiori in piccoli tubi e conservare a -20° C fino all'uso per il mezzo NSC completo e il supplemento di alimentazione NSC. Evitare ripetuti scongelamenti.
Fattore di crescita dei fibroblasti, basico (FGF)	R&D systems	233-FB	Fornito come polvere liofilizzata sterile; per ricostituire lo stock 1000X, aggiungere 1,24 mL di PBS e 12,5  µL di BSA al 10% (in 1x PBS) a 25 µg di polvere liofilizzata di FGF e pipettare per combinare.  Preparare aliquote da 500 µL o inferiori in piccoli tubi e conservare a -20° C fino all'uso per il mezzo NSC completo e il supplemento di alimentazione NSC. Evitare ripetuti scongelamenti.
Glucosio, 45%	Corning	25-037-CI	Fornito come soluzione sterile. Non aprire al di fuori del gabinetto di sicurezza biologica
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	3724	Utilizzato alla diluizione 1: 1000 in 3% di albumina sierica bovina (blotting occidentale, per verificare l'espressione di HA-tag)
HBSS, 10x	Gibco	14185-052	Fornito come soluzione sterile. Non aprire al di fuori del gabinetto di sicurezza biologica
HEPES, 1 M	Corning	25-060-CI	Fornito come soluzione sterile. Non aprire al di fuori del gabinetto di sicurezza biologica
IVIS 50	PerkinElmer		Lo strumento deve essere acceso 30 minuti prima dell'uso per consentire al camcorder di raffreddarsi alla temperatura ottimale. Il software Living Image (versione 4.3.1) viene utilizzato per la quantificazione.
Lentivirus-Luciferasi (Firefly)-2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	LVP deve essere aliquotato e conservato in frigorifero a -80 °C
L-Glutammina, 200 mM	Corning	25-005-CI	Fornito come soluzione sterile. Non aprire al di fuori del gabinetto di sicurezza biologica
Acqua di grado molecolare	Corning	46-000-CM	Fornito come soluzione sterile. Non aprire al di fuori del gabinetto di sicurezza biologica
Supplemento N-2 (100x)	Gibco	17502-048	Al primo utilizzo, scongelare e preparare aliquote da 1 ml per uso futuro; conservare le aliquote a -20 °C. Tenere i supplementi sul ghiaccio dopo lo scongelamento fino al momento di aggiungerli ai media
Nestin (E5C7I) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	89529	Utilizzato alla diluizione 1: 1000 in 3% di albumina sierica bovina (blotting occidentale, per verificare l'espressione del marcatore NSC)
Media Neurobasal	Gibco	21103-049	Usato per preparare il mezzo base NSC
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122	Fornito come soluzione sterile; preparare aliquote e conservare a -20°C fino all'uso.
Soluzione salina tamponata con fosfati, 1x (PBS)	Corning	MT21040CV	Fornito come soluzione sterile. Non aprire al di fuori del gabinetto di sicurezza biologica
Inibitore di proteasi/fosfatasi	Cell Signal Technology	5872S	Deve essere conservato a -20 °C
Diidrocloruro di puromicina	Gibco	A1113803	Preparare aliquote dello stock da 10mg/ml; mettere in tubi piccoli da 200 mL e conservare a  -20 °C fino all'uso.
Buffer di lisi RIPA, 10x	Millipore-Sigma	20-188	Conservare a -80 °C e preparare aliquote da 1x in acqua doppiamente distillata sterile
Mezzo di congelamento cellulare privo di siero	Bambanker (Nippon Genetics)