Identificazione dei potenziali candidati anti-TB: una guida passo dopo passo alla sintesi, alla determinazione della CIM e alla valutazione della citotossicità nelle cellule di mammiferi

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per identificare potenziali candidati farmaci antitubercolosi tramite screening fenotipico, comprendendo la sintesi chimica di un composto di 4-aminochinolina, la determinazione della sua concentrazione inibitoria minima contro Mycobacterium tuberculosis e la valutazione della sua citotossicità nelle linee cellulari di mammiferi.

Abstract

La tubercolosi (TB) rimane una delle principali cause di morte da un singolo agente infettivo nel mondo, con tassi crescenti di resistenza ai farmaci che rendono lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici una priorità sanitaria globale. Questo protocollo descrive un approccio fenotipico di screening per identificare potenziali candidati farmaci anti-TB attraverso tre fasi integrate. Per prima cosa, un composto della classe delle 4-aminochineline viene sintetizzato tramite un percorso in tre fasi e completamente caratterizzato da cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS). In secondo luogo, l'attività antimicrobica del composto viene valutata contro Mycobacterium tuberculosis utilizzando il saggio a microplacche di riduzione della resazurina colorimetrica (REMA), che determina la concentrazione inibitoria minima (CMI) tramite una semplice lettura visiva di cambiamento del colore. In terzo luogo, la citotossicità del composto viene valutata in due linee cellulari di mammiferi, Vero (rene della scimmia verde africana) e HepG2 (carcinoma epatocellulare umano), utilizzando il saggio MTT (bromuro 3-[4,5-dimetiltiazolo-2-il]-2,5-difenile tetrazolio) e il saggio di assorbimento rosso neutro (NRU). Questi due saggi complementari misurano parametri cellulari distinti, consentendo la validazione incrociata dei risultati della citotossicità. Insieme, i dati MIC e di citotossicità permettono di calcolare un indice di selettività (SI) per valutare il potenziale terapeutico di ciascun composto. Questo protocollo fornisce un quadro riproducibile e passo dopo passo per l'identificazione dei colpi anti-TB nelle prime fasi e la valutazione preclinica.

Introduzione

Causata principalmente dal bacillo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), la tubercolosi (TB) è una malattia respiratoria infettiva nell'uomo che colpisce principalmente i polmoni, anche se possono verificarsi varianti extrapolmonari. La tubercolosi si diffonde attraverso bacilli MTB trasportati dall'aria rilasciati da individui con malattia^{attiva 1}. A seconda della progressione della malattia, una persona infetta da tubercolosi può sviluppare immediatamente la tubercolosi attiva. Di solito, tuttavia, un individuo appena infetto svilupperà tubercolosi latente, dove le cellule Mtb con bassa attività metabolica sopravvivono all'interno dei^{granulomi 1,2}. Una persona con tubercolosi latente può infine sviluppare la forma attiva della malattia, manifestando sintomi^{clinici 3}. Attualmente, si stima che un quarto della popolazione mondiale abbia un'infezione latente da^{tubercolosi 4}.

Nonostante i numerosi progressi, la tubercolosi rimane un grave problema di salute pubblica a livello mondiale. I dati dell'ultimo Rapporto Globale sulla Tubercolosi mostrano che 10,7 milioni di persone hanno sviluppato la malattia nel 2024. Nello stesso anno, sono stati registrati 1,23 milioni di decessi per tubercolosi in tutto il mondo, rendendo la TB la principale causa di morte per un singolo agente^{infettivo 5}. Oltre alla patologia e alla complessa biologia del Mtb, aspetti socio-economici come povertà e malnutrizione, insieme a fattori legati alla salute come fumo, diabete e co-infezione da HIV, rendono il controllo delle malattie ancora più^{difficile 5}. Questo contribuisce alla permanenza di lunga data della TB come problema sanitario globale.

Inoltre, i trattamenti attuali per la tubercolosi presentano limitazioni che complicano la lotta contro la malattia. Contro ceppi suscettibili di Mtb, il trattamento standard consiste in una terapia combinata di 4 farmaci: isoniazide (INH), rifampicina (RIF), etambutolo (EMB) e pirazinamide (PZA). Questi antibiotici vengono somministrati per un minimo di 6 mesi, richiedendo un'aderenza rigorosa durante tutto il trattamento. Questo regime terapeutico, pur essendo efficace nella maggior parte dei casi e con un tasso di successo di circa l'85%, affronta ancora molte^{sfide 5,6}. Tra i problemi maggiori ci sono gli effetti collaterali e la durata prolungata, che spesso portano a un'interruzione prematura da parte del paziente. Questa interruzione, insieme alla somministrazione errata degli antibiotici, favorisce la scelta di ceppi Mtb resistenti, che richiedono regimi terapeutici più tossici, costosi ed^{estesi 7,8}.

Considerando questo scenario, lo sviluppo di nuovi farmaci potenti contro la tubercolosi è urgente. Questo protocollo delinea le prime fasi della ricerca di nuovi candidati farmaci utilizzando lo screening fenotipico. Per illustrare l'applicazione di questo protocollo, abbiamo selezionato un composto a 4-aminochinolina derivato da LABIO-17 per la valutazione. LABIO-17 era stato precedentemente identificato dal nostro gruppo di ricerca come inibitore dell'enzima enoil-ACP-reduttasi (InhA) nella Mtb, che è lo stesso bersaglio molecolare dell'isoniazide (INH^)9,10. InhA è coinvolto nella biosintesi dell'acido micolico in M. tuberculosis ed è essenziale per la sopravvivenza del bacillo, evidenziandone la rilevanza come promettente bersaglio molecolare¹¹

Protocollo

1. Sintesi chimica e caratterizzazione

NOTA: La sintesi e la caratterizzazione del composto chimico vengono eseguite come descritto^{in precedenza 10}. Tutti i passaggi da 1.1 a 1.4 devono essere eseguiti in una cappa fumaria ben ventilata utilizzando guanti in nitrilo.

1. Preparazione dei reagenti
   1. Preparazione di MeOH/CH₃CN (1:1) con acido formico allo 0,1%
      1. Misurare volumi uguali di metanolo (MeOH) e acetonitrile (CH₃CN) per preparare una miscela 1:1 (v/v) (grado HPLC).
      2. Combina i solventi in un contenitore pulito e asciutto (ad esempio, una fiaschetta volumetrica). Aggiungere acido formico per ottenere una concentrazione finale dello 0,1% (v/v) (ad esempio, aggiungere 1 mL di acido formico a 1 L di miscela solvente).
      3. Mescola bene con un leggero roteamento o mescolamento. Conserva in un contenitore ben chiuso a temperatura ambiente, protetto dalla luce.
   2. Preparazione di acido acetico all'1% (v/v) in acqua ultrapura
      1. Sciacquare la fiaschetta volumetrica con acqua ultrapura, poi posarla sul banco di lavoro. Aggiungere ~80% del volume finale di acqua ultrapura alla fiaschetta (cioè 80 mL per una fiaschetta da 100 mL; 800 mL per una fiaschetta da 1 L).
      2. Utilizzando una pipetta calibrata, aggiungere acido acetico glaciale per ottenere l'1% (v/v): per un volume finale di 100 mL → aggiungere 1,0 mL di acido acetico; per 1 L di volume finale → aggiungere 10,0 mL di acido acetico.
      3. Mescola bene facendo roteare o mescolare. Riempi la fiaschetta fino all'ultimo punto con acqua Ultrapura e mescola.
      4. Degassare la soluzione tramite sonicazione utilizzando un purificatore a ultrasuoni (frequenza del serbatoio ~40 kHz) impostato in modalità degassaggio per 20 minuti alla temperatura ambiente.
      5. Trasferisci su una bottiglia ambrata etichettata (etichetta: contenuto, concentrazione, grado solvente, data, preparatrice). Conserva ben chiuso a temperatura ambiente.
   3. Preparazione dell'Acetonitrile: Metanolo (1:1, v/v), grado HPLC
      1. Misurare volumi uguali di acetonitrile e metanolo: per un volume finale di 100 mL → 50,0 mL acetonitrile + 50,0 mL metanolo; per 1 L volume finale → 500 mL acetonitrile + 500 mL metanolo.
      2. Unisci i solventi in una fiaschetta o bottiglia volumetrica pulita e mescola invertendola o mescolando. Filtra la miscela attraverso un filtro da 0,45 μm in un contenitore pulito per rimuovere le particelle.
      3. Degassare la soluzione tramite sonicazione utilizzando un purificatore a ultrasuoni (frequenza del serbatoio ~40 kHz) impostato in modalità degassaggio per 20 minuti alla temperatura ambiente.
      4. Trasferisci in una bottiglia ambrata etichettata (etichetta: composizione, grado solvente, data, preparatrice). Conserva ben chiuso a temperatura ambiente, lontano da calore e luce.
   4. Preparazione della soluzione 7:3 (v/v) di esano/acetato di etil per cromatografia a colonna
      1. Misura il 70% del volume finale in esano. Esempio: per un volume finale di 100 mL → 70 mL di esano.
      2. Misurare il 30% del volume finale in acetato di etile. Esempio: per un volume finale da 100 mL → 30 mL di etilaceto.
      3. Combina entrambi i solventi in un contenitore pulito e asciutto (ad esempio, fiaschetta volumetrica o bottiglia).
      4. Mescola accuratamente invertendo o mescolare fino a ottenere un risultato omogeneo. Etichetta il contenitore con composizione, data, grado solvente e preparatorio.
   5. Preparazione di soluzione 1:1 (v/v) di esano/acetato di etil per cromatografia a colonna
      1. Misura il 50% del volume finale in esano. Esempio: per un volume finale da 100 mL → 50 mL di esano.
      2. Misurare il 50% del volume finale in acetato di etile. Esempio: per un volume finale da 100 mL → 50 mL di acetato di etile.
      3. Combina entrambi i solventi in un contenitore pulito e asciutto (ad esempio, fiaschetta volumetrica o bottiglia). Mescola accuratamente invertendo o mescolare fino a ottenere un risultato omogeneo.
      4. Etichetta il contenitore con composizione, data, grado solvente e preparatorio.
   6. Preparazione di una soluzione di bicarbonato di sodio saturo (NaHCO₃)
      1. Pesa una quantità eccessiva di bicarbonato di sodio (NaHCO₃) (circa 15–20 g ogni 100 mL d'acqua).
      2. Aggiungi il bicarbonato di sodio in un becher pulito contenente un volume noto di acqua distillata (ad esempio, 100 mL). Mescolare continuamente la miscela a temperatura ambiente (20–25 °C) utilizzando uno agitatore magnetico o una barra di vetro.
      3. Continuare a mescolare finché non si dissolve più alcun solido e rimane una piccola quantità di bicarbonato di sodio non disciolto sul fondo — questo indica che la soluzione è satura.
      4. Lascia riposare la sospensione per 10–15 minuti per far sedimentare il solido non disciolto. Filtra la miscela attraverso un filtro di carta o un imbuto di vetro sinterizzato per rimuovere l'eccesso di bicarbonato non disciolto.
      5. Raccogli il filtrato trasparente, che è la soluzione satura di bicarbonato di sodio.
      6. Conserva la soluzione in una bottiglia ben chiusa, correttamente etichettata con il nome del composto, la concentrazione (saturato), la data di preparazione e le tue iniziali.
      7. Tieni la soluzione a temperatura ambiente e prepara fresca quando necessario, poiché il_CO2 può sfuggire lentamente e modificare la concentrazione nel tempo.
2. Sintesi del 6-bromo-2-metilquinolina-4-ol (3)
   1. Prepara una soluzione contenente 4-bromoanilina (1,2 g, 7,3 mmol) e solfato di magnesio anidro (1,08 g, 9,0 mmol) in etanolo (15 mL).
   2. Aggiungere acido acetico glaciale (0,33 mL) e acetacetato etil (1,8 mL, 14,1 mmol) alla soluzione. Mescolare la miscela di reazione a 90 °C per 16 ore.
   3. Filtrare la miscela di reazione attraverso cellulosa, ritenzione di 11 μm e carta filtrante di qualità per rimuovere il solfato di magnesio sospeso.
   4. Evaporare l'etanolo utilizzando un evaporatore rotativo per ottenere l'intermediario acrilato.
   5. Riscaldare l'intermedio utilizzando un bagno d'olio appropriato contenente un fluido sintetico di trasferimento termico ad alte prestazioni (vedi Tabella dei Materiali) (15 mL) a 230–250 °C per 15 minuti per completare la reazione.
   6. Raffredda la miscela a temperatura ambiente. Filtrare il precipitato formato e lavarlo con esano e cloroformio.
   7. Concentrare il prodotto finale a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotativo finché tutti i solventi residui non vengono rimossi (vedi Tabella dei Materiali).
3. Sintesi di 6-bromo-4-cloro-2-metilquinolina (4)
   1. Prepara una soluzione di 6-bromo-2-metilquinolina-4-ol (0,65 g, 2,8 mmol) nel toluene (10 mL). Aggiungere fosforo(V) ossicloruro (0,65 mL, 6,9 mmol) alla soluzione.
   2. Mescolare la miscela di reazione a 110 °C per 2 ore. Rimuovere l'eccesso di fosforo(V) ossicloruro utilizzando un evaporatore rotante.
   3. Raffreddare i residui in un bagno di ghiaccio. Neutralizza la miscela di reazione con una soluzione di bicarbonato di sodio saturo.
   4. Estrai il prodotto con acetato di etil (3 x 50 mL). Unisci le fasi organiche e asciugale su solfato di sodio anidro.
   5. Evapora il solvente usando un evaporatore rotante per ottenere un residuo solido. Asciuga il solido risultante usando un evaporatore rotativo per ottenere il prodotto grezzo.
   6. Purificare il composto tramite cromatografia flash su gel di silice (mesh 35–70) utilizzando esano:acetato di etil (7:3) come eluente.
4. Sintesi di 6-Bromo-2-metil-N-(4-(piperidina-1-il)fenil)chinolina-4-ammina (6)
   1. Prepara una miscela reazionale contenente 6-bromo-4-cloro-2-metilquinolina (0,53 g, 2 mmol), 4-(piperidina-1-il)anilina (0,57 g, 3 mmol), piridina (0,24 mL) e HCl al 37% (0,2 mL) in isopropanolo (20 mL).
   2. Mescolare la miscela di reazione a 85 °C per 16 ore. Rimuovere il solvente utilizzando un evaporatore rotante.
   3. Tratta i residui con una soluzione satura di bicarbonato di sodio.
   4. Filtrare il solido risultante attraverso una carta filtrante qualitativa a ritenzione di cellulosa a 11 μm e scioglierlo nel cloroformio (50 mL).
   5. Lava la soluzione di cloroformio con acqua (3 x 15 mL). Asciuga la fase organica su solfato di sodio anidro.
   6. Evapora il solvente utilizzando un evaporatore rotante per ottenere un solido verde. Purificare il prodotto con lavaggi successivi con esano caldo (4 x 10 mL).
   7. Eseguire la purificazione finale tramite cromatografia flash su gel di silice (mesh 35–70) utilizzando esano:acetato di etil (1:1) come eluente.
5. Cromatografia a Strati Sottili (TLC)
   1. Monitorare il progresso della reazione utilizzando cromatografia a strato sottile (TLC) su piastre TLC Silica gel 60 F254.
   2. Usa il materiale di partenza 4 come riferimento per monitorare la reazione e valutarne il consumo.
6. Punto di fusione (m.p.)
   1. Aggiungi una punta a spatola del composto all'apparato del punto di fusione. Registra l'intervallo del punto di fusione.
   2. Non applicare correzioni ai valori misurati. Esegui l'esperimento in triplice.
7. Cromatografia Liquida ad Alte Prestazioni (HPLC)
   1. Pesa 1–2 mg di composto 6. Prepara una soluzione di stocco del composto a 1,0 mg/mL in acetonitrile/metanolo (1:1, v/v).
   2. Diluire la soluzione originale a 0,5 mg/mL per l'analisi. Analizza i campioni utilizzando un sistema HPLC (vedi Tabella dei Materiali) dotato di doppia pompa, iniettore automatico e rivelatore UV.
   3. Acquisire e processare i dati utilizzando software per l'acquisizione dati per cromatografia (vedi Tabella dei Materiali).
   4. Impostare le condizioni cromatografiche come segue: utilizzare una colonna C18 a fase inversa, 5 μm (250 x 4,6 mm) (vedi Tabella dei Materiali). Imposta la portata a 1,5 mL/min e monitora il rilevamento UV a 254 nm. Mantenere la fase mobile al 100% acqua (0,1% acido acetico) da 0 a 7 minuti; applicare un gradiente lineare dal 100% acqua (0,1% acido acetico) al 90% acetonitrile/metanolo (1:1, v/v) da 7 a 15 minuti; Torna al 100% acqua (0,1% acido acetico) per 5 minuti e tieni per altri 10 minuti.
8. Risonanza magnetica nucleare (¹H, ¹³C)
   1. Pesa 15–20 mg di composto 6 in un tubo NMR. Aggiungi_{DMSO-d 6} come solvente.
   2. Acquisire spettri NMR ^{di 1}H e ¹³C su uno spettrometro NMR (vedi Tabella dei Materiali) utilizzando sequenze di impulsi standard.
   3. Azionare lo strumento a 400 MHz per i nuclei ^{di 1}H e a 100 MHz per ^{i 13}nuclei C. Usa il tetrametilsilano (TMS) come riferimento interno.
   4. Esprime spostamenti chimici (δ) in parti per milione (ppm). Usa il file FID ottenuto dall'esperimento per visualizzare ed elaborare i dati NMR.
9. Spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS)
   1. Pesa 1–2 mg di composto 6. Prepara il campione in una miscela 1:1 di MeOH/CH₃CN contenente acido formico allo 0,1%.
   2. Eseguire l'analisi su uno spettrometro di massa Orbitrap ad alta risoluzione (vedi Tabella dei Materiali), che combina uno spettrometro di massa a trappola ionica lineare con un analizzatore di massa Orbitrap.
   3. Introdurre il campione tramite infusione diretta a una portata di 10 μL/min in modalità ioni positivi utilizzando ionizzazione elettrospray (ESI).
   4. Determinare la composizione elementare utilizzando lo strumento di composizione elementare nel software di analisi dati di spettrometria di massa (vedi Tabella dei Materiali).
10. Cromatografia a colonna – Composto 4
    1. Prepara una colonna di gel di silice utilizzando gel di silice 60 Å (70–230 mesh, 0,063–0,200 mm). Imballa la colonna in modo appropriato con il gel di silice.
    2. Usa esano/acetato di etil (7:3, v/v) come fase mobile. Carica il composto grezza 4 sulla colonna. Eludi il composto e raccogli le frazioni.
    3. Monitorare le frazioni tramite TLC e combinare quelle contenenti il prodotto puro.
11. Cromatografia a colonna – Composto 6
    1. Prepara una colonna di gel di silice utilizzando gel di silice 60 Å (70–230 mesh, 0,063–0,200 mm). Imballa la colonna in modo appropriato con il gel di silice.
    2. Usa esano/acetato di etil (1:1, v/v) come fase mobile. Carica il composto grezzo 6 sulla colonna. Eludi il composto e raccogli le frazioni.
    3. Monitorare le frazioni tramite TLC e combinare quelle contenenti il prodotto puro.

Figura 1. Reagenti e condizioni: i = MgSO₄, AcOH, EtOH, 90 °C, 16 h; ii =_{C 12}H₁₀, C_{12H 10}O, 230-250 °C, 15 min; iii =_{POCl 3}, Toluene, 110 °C, 2 h; iv = Piridina, HCl, (CH₃)₂CHOH, 85 °C, 16 h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Determinazione della concentrazione inibitoria minima

1. Progettazione sperimentale e disposizione delle lastre
   1. Valutare i composti per la loro capacità di inibire la crescita di M. tuberculosis utilizzando il saggio a microplacche di riduzione della resazurina colorimetrica (REMA) per determinare la Concentrazione Inibitoria Minima (MIC), come descritto^{in precedenza 11,12,13}.
   2. Eseguire tre esperimenti indipendenti (tre repliche biologiche) per ciascun composto testato senza repliche tecniche (una riga per composto e una lastra per esperimento).
   3. Valuta i composti che agiscono come controlli positivi insieme a composti di prova per garantire che le condizioni del saggio permettano l'inibizione della crescita.
   4. Analisi con isoniazide (INH) e rifampicina (RIF) come controlli positivi.
   5. Assegnare le righe A e B per i composti di controllo (rispettivamente INH e RIF).
   6. Assegnare le righe successive per i composti di prova (composti da A a F nella Figura 2).
   7. Preparare le colonne da 1 a 10 con diluizioni seriali doppie di composti di controllo e di prova, ciascun composto occupando una riga, con la concentrazione più alta nella colonna 10 e la più bassa nella colonna 1.
   8. Preparare la colonna 11 come controllo di vitalità contenente substrato di crescita e batteri a una concentrazione finale di DMSO del 2,5%, senza aggiungere alcun composto di controllo o di prova.
   9. Preparare la colonna 12 come controllo della sterilità aggiungendo composti di controllo o test a concentrazione più elevata della diluizione seriale (uguale alla colonna 10) al mezzo di crescita senza cellule batteriche.
   10. Consulta la Figura 2 per una disposizione rappresentativa di una targa MIC.
2. Preparazione dei reagenti
   1. Preparazione del brodo Middlebrook 7H9 integrato con acido oleico, albumina, destrosio e catalasi (OADC).
      1. A una bottiglia di vetro da 200 mL contenente 90 mL di acqua ultrapura, aggiungi 0,47 g di polvere 7H9, 0,24 mL di glicerolo all'85% e 0,5 mL di 10% Tween-80.
      2. Autoclave il mezzo per 10 minuti a 121 °C e 98,07 kPa.
      3. Lascia raffreddare il substrato finché non è caldo al tatto (circa 45–50 °C).
      4. Aggiungiamo 10 mL di OADC (usiamo OADC commerciale; vedi Tabella dei Materiali per i dettagli).
      5. Conserva a 4 °C.
         NOTA: Prepara la quantità appropriata per l'esperimento, considerando le proporzioni dei reagenti.
   2. Preparazione del brodo Middlebrook 7H9 con ADC
      1. A una bottiglia di vetro da 200 mL contenente 90 mL di acqua ultrapura, aggiungi 0,47 g di polvere 7H9. Autoclave il mezzo per 10 minuti a 121 °C e 98,07 kPa.
      2. Lascia raffreddare il substrato finché non è caldo al tatto (circa 45–50 °C). Aggiungi 10 mL di ADC. Conserva a 4 °C.
         NOTA: Preparare la quantità appropriata per l'esperimento, mantenendo le proporzioni dei reagenti.
   3. Preparazione di soluzioni per stock composto
      1. Prepara una soluzione di stocco di ogni composto a 2 mg/mL disciolta in DMSO.
      2. Conserva a –20 °C.
         NOTA: Prima dell'esperimento, la concentrazione massima di prova è definita sulla base di una valutazione della solubilità. Per determinare il limite di solubilità, si ispeziona visivamente le soluzioni alla presenza di cristalli. Se si osservano cristalli, si diluisce ulteriormente l'aliquota a metà della concentrazione precedente. Esegui questa valutazione utilizzando il 5% di DMSO.
   4. Preparazione di soluzioni per lavorazione composta
      NOTA: Le soluzioni operative devono essere preparate fresche al momento dell'esperimento diluendo i composti di base nel brodo 7H9 integrato con ADC al 10%. La concentrazione finale di DMSO nella soluzione di lavoro dovrebbe essere del 5%, e la concentrazione del composto dovrebbe essere il doppio della concentrazione massima prevista per il test. In particolare, la concentrazione finale di DMSO a cui i batteri sono esposti durante il test è del 2,5%, poiché il volume raddoppia dopo l'aggiunta della sospensione batterica (vedi sezione 2.3, passo 2.3.8).
      NOTA: Il 2,5% di DMSO è tollerato dai ceppi batterici utilizzati nel nostro laboratorio (M. tuberculosis H37Ra, H37Rv e isolati clinici). Se si lavora con altri ceppi o specie batteriche, esegui un esperimento preliminare di MIC utilizzando il DMSO come composto di prova per determinare le concentrazioni più alte di DMSO che possono essere usate senza favorire l'inibizione della crescita.
   5. Preparazione della soluzione di resazurina
      1. Prepara una soluzione di resazurina allo 0,01% sciogliendo 1 mg di resazurina in 10 mL di acqua ultrapura.
      2. Sterilizza la soluzione usando un filtro da 0,22 μm.
         NOTA: La resazurin sterilizzata con filtro può essere conservata a 4 °C per 1 settimana^{e 14}. Tuttavia, prepara questa soluzione immediatamente prima dell'uso come prassi standard.
3. Preparazione dei micobatteri
   1. Inoculare una singola colonia di M. tuberculosis in un tubo centrifugo da 50 mL contenente 10 mL di brodo 7H9 integrato con 10% OADC, 0,2% glicerolo e 0,05% Tween-80.
   2. Incubare con scuotimento costante (100 rpm) a 37 °C finché la coltura non raggiunge una densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) di 0,6-0,8 (circa 3-4 settimane).
      ATTENZIONE: M. tuberculosis H37Rv è classificato come patogeno del Gruppo di Rischio 3, capace di trasmissione aerea e di causare malattie potenzialmente letali negli esseri umani. Esegui tutte le manipolazioni in un armadietto di biosicurezza certificato all'interno di un laboratorio di biosicurezza livello 3 (BSL-3), utilizzando l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata.
   3. Omogeneizzare la coltura batterica vorticando con perline di vetro sterili (1 mm) per 3 minuti.
   4. Lascia riposare la sospensione per 15 minuti per far sedare i grumi.
   5. Misurare il diametro OD₆₀₀ del sovrantantante e memorizzare le aliquote a −80 °C.
      NOTA: Per gli esperimenti, diluire la sospensione batterica a un OD_{teorico di 600} di 0,006 in brodo fresco 7H9 integrato con ADC al 10%. Distribuire 100 μL per pozzo in piastre da 96 pozzi durante il saggio.
4. Preparazione delle lastre a 96 pozzi
   1. Aggiungere 100 μL di brodo 7H9 integrato con ADC al 10% nella colonna 12.
   2. Aggiungere 100 μL di brodo 7H9 integrato con ADC al 10% (contenente 5% di DMSO) nelle colonne 11 e 9 fino a 1.
   3. Aggiungere 200 μL della soluzione composta (preparata al doppio della concentrazione di prova più alta) alla colonna 10 (assegnare una riga per composto).
   4. Aggiungere 100 μL della soluzione composta alla colonna 12. Eseguire una diluizione seriale a doppio livello: trasferire 100 μL dalla colonna 10 alla colonna 9 e mescolare bene tramite pipetta.
   5. Continuare la diluizione seriale dalla colonna 9 alla colonna 1. Scartare gli ultimi 100 μL dalla colonna 1.
   6. Aggiungere 100 μL della sospensione batterica (OD_{teorico 600} di 0,006) alle colonne 11 a 1.
   7. Copri la placca, sigilla con parafilm e incuba a 37 °C per 7 giorni.
      NOTA: La Figura 2 è una disposizione rappresentativa di una piastra MIC. Consulta questa figura per interpretare i passaggi 2.3.1 fino a 2.3.9.
5. Aggiunta di Resazurin e Analisi dei Dati
   1. Aggiungi 60 μL di soluzione di resazurina allo 0,01% in ciascun pozzetto della placca. Copri la placca, sigilla con parafilm e incuba a 37 °C per 48 ore.
   2. Osserva il cambiamento di colore dal blu (inibizione della crescita) al rosa (crescita batterica).
      NOTA: In alcuni esperimenti, un cambiamento di colore incompleto porta a un pozzo viola. Interpreta questo come crescita batterica.

Figura 2. Rappresentazione schematica di una piastra di microdiluizione del brodo utilizzata per determinare la Concentrazione Minima Inibitoria (CMI). Diluizioni seriali doppie dei composti testati sono state distribuite tra le colonne 1–10, le successive diluizioni vengono eseguite in sequenza dalla colonna 10 alla colonna 1, con la concentrazione più alta di composto nella colonna 10. Le righe A e B corrispondono a controlli positivi contenenti rispettivamente i farmaci di riferimento isoniazide e rifampicina. Le file C–H corrispondono ai composti testati. La colonna 11 rappresenta il controllo della vitalità (mezzo contenente il 2,5% di DMSO e inoculo batterico), mentre la colonna 12 corrisponde al controllo della sterilità (mezzo contenente i composti in assenza dell'inoculo batterico). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Valutazione della citotossicità nelle linee cellulari di mammiferi

NOTA: Eseguire tutte le manipolazioni di colture cellulari in condizioni sterili in un armadietto di sicurezza biologica certificato di Classe II.

1. Preparazione delle linee cellulari dei mammiferi
   1. Coltivare le linee cellulari del carcinoma epatico umano (HepG2) e dei reni della scimmia verde africana (Vero) nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco.
   2. Integrare il mezzo con 1,8 g/L di bicarbonato di sodio, 10% di siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina/streptomicina e 0,1% di anfotericina B (chiamata mezzo completo).
   3. Incubare le colture cellulari a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂.
   4. Prelevare cellule sub-confluenti (70%–80%) trattandole con una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% per 5–10 minuti.
   5. Neutralizza la tripsina aggiungendo un volume uguale di mezzo completo. Trasferisci la sospensione a celle su un tubo conico da 15 mL e centrifuga a 200 x g per 5 minuti.
   6. Scartare il soprantantante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di mezzo fresco e completo.
   7. Determinare la concentrazione e la vitalità cellulare utilizzando un contatore cellulare automatico o un emocitometro con esclusione del blu di tripano.
      NOTA: Per l'esclusione del blu di tripano, miscela 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di soluzione blu di tripano allo 0,4% e carica sull'emocitometro (o sul vetrino di conteggio). Le cellule morte o con membrane compromesse appaiono blu, mentre le cellule vitali rimangono non colorate. Calcola la vitalità come % di vitalità = (cellule non colorate / cellule totali) x 100. Procedi con la semina solo se la vitalità è ≥ il 90%.
   8. Diluire la sospensione della cella alla densità di semina target. Semina 100 μL di sospensione della cella in ogni pozzo delle colonne da 2 a 12 di una piastra a fondo piatto da 96 pozzi.
      Densità di semina: 4.000 celle/pozzo per celle Vero; 5.000 cellule/pozzo per cellule HepG2.
      NOTA: Ottimizzare queste densità per garantire che le cellule rimangano nella fase di crescita logaritmica e non raggiungano il 100% di confluenza prima del termine del test di 48 ore.
   9. Riempire la colonna 1 con 100 μL di mezzo completo (senza celle) per servire come spazio vuoto per le misurazioni di assorbimento.
   10. Preparare quattro lastre identiche per ciascuna linea cellulare: due per il test MTT e due per il test NRU.
   11. Incubare le placche per 24 ore a 37 °C, 5% di CO₂ per consentire l'attacco cellulare.
2. Diluizione dei composti e trattamento cellulare
   1. Prepara soluzioni stock per ogni composto di prova nella soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco o in un solvente appropriato (ad esempio, dimetilsolfosido; DMSO).
      NOTA: Verifica che il composto sia solubile nel mezzo di coltura cellulare e che la concentrazione di solvente sia non tossica (ad esempio, <0,1% v/v per DMSO) prima del saggio.
   2. Progetta la disposizione delle lastre includendo elementi a vuoto, controlli appropriati e repliche tecniche. Una disposizione rappresentativa per testare fino a 9 composti in 8 concentrazioni è mostrata nella Figura 3.
   3. Preparare diluizioni seriali del/i composto di prova in mezzo completo per coprire l'intervallo di concentrazione previsto. Assicurarsi che sia preparato un volume sufficiente per tutte le piastre replicate.
      NOTA: Se si utilizza un solvente (ad esempio, DMSO), integrare il mezzo di diluizione in modo che la concentrazione finale del solvente rimanga costante per tutta la serie di diluizione seriale.
      NOTA: I pozzi trattati con solvente (controllo veicolo) fungono da controllo negativo funzionale, definendo la vitalità cellulare del 100% contro cui i pozzi trattati con composti sono normalizzati. Per la validazione del saggio, includere un composto citotossico di riferimento (ad esempio, 0,1% Triton X-100 o 1 mM dodecile solfato di sodio) a una concentrazione nota per produrre morte cellulare completa (0% di vitalità). I valori di assorbanza in questi pozzi di controllo positivo non dovrebbero differire significativamente da quelli dei pozzi vuoti, confermando così la vitalità dello 0%.
   4. Dopo il periodo di attacco delle cellule di 24 ore, si ispezionano visivamente le lastre al microscopio rovesciato per confermare che le cellule siano attaccate, si diffondano e coprono circa il 70%–80% della superficie del pozzo con confluenza omogenea. Piastre di scartamento che mostrano contaminazione o attacco insufficiente.
   5. Aspirare con cura il mezzo di coltura usando una punta di pipetta, inclinando la punta verso il lato di ciascun pozzo per evitare di disturbare il monostrato cellulare. Lavora le lastre in sezioni per prevenire la disidratazione.
   6. Aggiungere immediatamente 100 μL delle diluizioni o dei mezzi di controllo appropriati ai pozzi corrispondenti.
   7. Incubare le placche trattate per 48 ore a 37 °C, 5% di CO₂.
3. Protocollo di analisi MTT
   1. Prepara una soluzione MTT da 0,5 mg/mL in DMEM senza siero. Filtra attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm e proteggi dalla luce.
   2. Dopo il trattamento di 48 ore, ispezionare visivamente le cellule per confermare gli effetti attesi del trattamento.
   3. Aspira con cura il mezzo dalle piastre MTT. Aggiungi 50 μL della soluzione funzionante MTT da 0,5 mg/mL in ciascun pozzo.
   4. Incubare per 3 ore a 37 °C, 5% di CO₂, protetto dalla luce.
      NOTA: Sebbene sia comune 2–4 ore, un'incubazione di 3 ore è tipicamente sufficiente per le cellule Vero e HepG2. Ottimizza se necessario.
   5. Aggiungere 100 μL di DMSO al 100% in ciascun pozzo per sciogliere i cristalli di formazan. Posiziona le piastre su uno shaker orbitale a 100 giri/min per 15 minuti, protette dalla luce. Ispezionare i pozzi di controllo per garantire la completa dissoluzione cristallina. Leggi l'assorbanza a 570 nm usando un lettore di microplacche. Se disponibile, imposta una lunghezza d'onda di riferimento da 630–690 nm.
4. Protocollo di Analisi per la Rilevazione Neutra del Rosso (NRU)
   1. Prepara una soluzione di rosso neutro (NR) da 40 μg/mL in DMEM e filtro senza siero. Prepara la Soluzione di Desorbo NR: acido acetico glaciale al 1% (v/v), 49% (v/v) etanolo e 50% (v/v) acqua ultrapura.
      ATTENZIONE: L'acido acetico glaciale è corrosivo; Maniglia in una cappa fumi.
   2. Dopo il trattamento di 48 ore, ispezionare visivamente le cellule. Aspira con attenzione il mezzo dalle piastre NRU.
   3. Aggiungere 100 μL della soluzione di lavoro da 40 μg/mL NR in ciascun pozzo. Incubare per 2 ore a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: Un'incubazione di 2 ore è sufficiente per il massimo assorbimento dei coloranti in queste linee cellulari.
   4. Aspira la soluzione di funzionamento NR. Risciacquo delicatamente ogni pozzo una volta con 150 μL di PBS sterile.
   5. Aggiungere 150 μL della Soluzione di Desorbo NR a ciascun pozzo. Posiziona su uno shaker orbitale a 150 giri al minuto per 15 minuti per estrarre il colorante.
   6. Ispezionare i pozzi di controllo per garantire l'estrazione completa del colorante. Leggi l'assorbanza a 540 nm usando un lettore di microplacche.
5. Analisi dei Dati
   1. Esegui la sottrazione di fondo calcolando l'assorbanza media delle colonne vuote e sottraendo questo valore da tutti i pozzi.
   2. Effettuare un controllo della tossicità dei solventi confrontando i pozzi di controllo con quelli non trattati. Se la vitalità è al di sotto di una soglia definita (ad esempio, 80%), considera la citotossicità del solvente.
   3. Calcola la percentuale di vitalità rispetto ai pozzi di controllo dei solventi:
      % di vitalità = (assorbenza del pozzo trattato / assorbenza media del controllo del solvente) x 100.
   4. Traccia la percentuale di vitalità (asse y) rispetto al log₁₀ della concentrazione composta (asse x). Utilizzare un modello di regressione non lineare (dose-risposta sigmoide, pendenza variabile) per determinare CC₅₀.
   5. Calcola l'Indice di Selettività (SI) dividendo CC₅₀ per MIC.

Figura 3. Esempio di progettazione della lastra per il test di viabilità delle cellule MTT/NRU, configurazione precoce per testare la citotossicità di fino a 9 composti. (A) Schema di progettazione delle lastre. La colonna 1 è assegnata a "vuoto", senza celle, e riempita con DPBS o mezzo completo. Le colonne 2 e 12 sono seminate con cellule e trattate con mezzi completi ("controllo non trattato") o mezzi interi con solvente ("controllo solvente"). Le colonne da 3 a 11 sono incapsulate con cellule e trattate con diluizioni seriali dei composti testati, fino a 9 composti con una replica per concentrazione testata per ogni composto. (B) Fotografie rappresentative di una targa Vero NRU (sopra) e di una targa Vero MTT (sotto) dopo il trattamento di 48 ore e i passaggi finali del saggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

La sintesi ha prodotto il composto target 6 come solido verde chiaro (0,53 g, resa del 67%). Il composto presenta un punto di fusione di 227–229 °C e una purezza UHPLC del 99% (t_R = 14,11 min) (Figura 4). La struttura chimica è stata confermata tramite spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS). Lo spettro NMR ^{a 1}H (Figura 5) mostrava segnali corrispondenti alla parte piperidina tra 1,50 e 3,13 ppm. Il gruppo metile nella posizione 2 è apparso come un tipico singolatore a 2,38 ppm. L'idrogeno nella posizione 3 appariva come un singoletto a 6,56 ppm. L'anello fenilico mostrava due doppietti a 6,97 e 7,17 ppm, con una costante di accoppiamento di 8,9 Hz. Gli idrogeni nelle posizioni 7 e 8 generavano un multipletto a 7,63–7,75 ppm, mentre l'idrogeno nella posizione 5 del nucleo quinolino produceva un doppio a 8,59 ppm (J = 2,0 Hz). L'idrogeno aminato è stato osservato come un singoletto a 8,66 ppm. Lo spettro NMR ^{a 13}°C (Figura 6) mostrava un segnale a 23,81 ppm attribuito al gruppo metile nella posizione 2, mentre segnali tra 24,85 e 49,70 ppm corrispondevano alla parte piperidina. Il carbonio nella posizione 3 è apparso a 100,52 ppm. I segnali residui a valle sono stati attribuiti al nucleo della quinolina e ai carboni dell'anello fenilico. HRMS ha confermato la formula molecolare del composto 6, mostrando uno ione [M+H^]+ a m/z 396.1063 (calcd per C₂₁H₂₃BrN₃: 396.1070).

Figura 4. Cromatogramma HPLC e spettri UV del composto 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. ¹Spettri H NMR (400 MHz, DMSO-d6) del composto 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. ^{Spettri NMR 13C}(101 MHz, DMSO-d6) del composto 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'attività inibitoria del composto contro M. tuberculosis è stata valutata determinando la MIC, definita come la concentrazione più bassa di un composto che previene completamente la crescita batterica visibile. Nel saggio REMA, la mancanza di cambiamento di colore (rimanendo blu) indica inibizione della crescita, mentre uno spostamento verso il rosa indica la crescita batterica. L'isoniazide (INH) e la rifampicina (RIF) fungevano da controlli antidroga. I risultati sono presentati nella Figura 7. Ogni piastra includeva un controllo della crescita (colonna 11, senza farmaci) e un controllo della sterilità (colonna 12, senza micobatteri). I composti sono stati diluiti serialmente dalla colonna 10 (concentrazione più alta) alla colonna 1 (concentrazione più bassa). Come mostrato nella Figura 7, il valore di CMI per il composto nella riga A (isoniazide) è osservato nella colonna 4, mentre i valori di CMI per i composti nelle righe B (rifampicina) e C (composto sintetizzato) sono osservati nella colonna 5. Nelle nostre mani, i valori di MIC per l'INH sono 0,31 μg/mL per la deformazione H37Rv e 0,16 μg/mL per H37Ra, mentre per RIF otteniamo 0,08 μg/mL per H37Rv e 0,01 μg/mL per la deformazione H37Ra.

Figura 7. Determinazione della concentrazione minima inibitoria (CMI) in Mycobacterium tuberculosis utilizzando il saggio con microplacche con resazurina (REMA). Righe A–C, colonne 1–10: diluizioni seriali doppie di isoniazide (riga A), rifampicina (riga B) e il composto sintetizzato (riga C). Colonna 11: Controllo della vitalità (mezzo contenente 2,5% di DMSO + batteri). Colonna 12: Controllo della sterilità (medium + composto). Un colore blu indica l'inibizione della crescita batterica, mentre un colore rosa indica la vitalità batterica dovuta alla riduzione della resazurina a resorufina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Una piastra rappresentativa a 96 pozzi sia per il saggio NRU (Vero, in alto) che per quello MTT (Vero, in basso) è mostrata nella Figura 3B. Nella piastra MTT è visibile un gradiente di colore chiaro, che passa da traslucido (nessuna cellula vitale) ad alte concentrazioni composte a un viola intenso (alta vitalità cellulare) a basse concentrazioni. Analogamente, la piastra NRU mostra un gradiente da traslucido a rosa intenso, indicando l'assorbimento del colorante rosso neutro nei lisosomi delle cellule vitali.

La microscopia fornisce una conferma visiva dello stato del test dopo il tempo di incubazione di 48 ore (Figura 8). La Figura 8A confronta cellule di controllo sane e non trattate (Vero e HepG2) con cellule trattate con una concentrazione citotossica del composto. Le cellule trattate appaiono arrotondate, staccate e non vitali. La Figura 8B fornisce un punto di controllo visivo critico prima dell'ultimo passaggio di solubilizzazione. Mostra la formazione attesa di cristalli di formazan viola scuro all'interno delle cellule vitali (test MTT) e l'accumulo di colorante rosso all'interno dei lisosomi (saggio NRU) in entrambi i tipi cellulari.

I dati grezzi di assorbanza sono stati normalizzati al controllo del veicolo e analizzati tramite regressione non lineare per generare curve dose-risposta come dettagliato nel passo 3.5 del protocollo. Per il composto bersaglio 6 (derivato da LABIO-17), questa analisi ha prodotto un CC₅₀ di 12,2 μM (Vero) e 18,3 μM (HepG2) nel saggio NRU, e un CC₅₀ >20 μM per entrambe le linee cellulari nel saggio MTT. Questo ha portato a un Indice di Selettività (SI) che variava da 30,5 a >50, come precedentemente^{riportato 10}.

Figura 8. Immagini microscopiche rappresentative degli saggi di citotossicità nelle cellule Vero e HepG2. Tutte le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 100x. (A) Confronto della morfologia cellulare dopo 48 ore di trattamento. I pozzi di controllo non trattati per le cellule Vero (superiore) e HepG2 (inferiore) mostrano un monostrato sano e confluente. Al contrario, le cellule trattate con una concentrazione citotossica di un composto appaiono arrotondate, rimpicciolite e staccate dalla superficie della placca. (B) Punti di controllo visivi critici dopo l'aggiunta del reagente e prima della solubilizzazione. Nel saggio MTT (pannelli a sinistra per ciascuna linea cellulare), le cellule vitali contengono cristalli di formazan viola scuro visibili. Nel test NRU (pannelli destri per ciascuna linea cellulare), le cellule vitali mostrano un accumulo di colorante rosso all'interno dei lisosomi intatti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Un approccio fenotipico di screening, che si basa sull'attività delle cellule intere piuttosto che su enzimi isolati, è una strategia efficace per identificare composti attivi contro M. tuberculosis. Qui abbiamo descritto i primi passaggi di questo approccio, comprendendo la sintesi chimica di un composto candidato, la valutazione della sua attività inibitoria tramite determinazione della concentrazione inibitoria minima (MIC) e la valutazione della sua citotossicità nelle cellule mammiferiche (Vero e HepG2) utilizzando saghi MTT e NRU.

La via sintetica consisteva in tre passaggi principali (Figura 1), che forniscono il composto bersaglio ad alta purezza utilizzando trasformazioni operativamente semplici. Sono stati identificati diversi passaggi critici come determinanti per la riproducibilità e l'efficienza. La condensazione iniziale richiede un controllo stechiometrico preciso e un reflusso sostenuto per garantire una formazione intermedia completa. Una rimozione incompleta del solvente prima della ciclizzazione termica può influire negativamente sull'efficienza di chiusura dell'anello. La fase di ciclizzazione stessa richiede un rigoroso controllo della temperatura, poiché un riscaldamento insufficiente porta a un'aromatizzazione incompleta, mentre un riscaldamento eccessivo o prolungato può favorire la formazione di sottoprodotti. Durante la clorurazione si raccomanda un attento controllo della temperatura della reazione e l'aggiunta graduale di cloruro di fosforile per minimizzare le reazioni collaterali e garantire un'attivazione selettiva nella posizione 4. Durante l'ottimizzazione del metodo, piccoli aggiustamenti procedurali miglioravano la robustezza. Nei casi di precipitazione incompleta dopo la ciclizzazione, il raffreddamento graduale piuttosto che la tempra rapida ha migliorato il recupero dei solidi. Se sono state osservate rese ridotte nella fase di sostituzione nucleofila, allungare i tempi di reazione o verificare la purezza delle ammini si è rivelato vantaggioso.

Le principali limitazioni del metodo sono la necessità di ciclizzazione ad alta temperatura e reagenti cloruranti corrosivi come il cloruro di fosforile, che richiedono infrastrutture di laboratorio specifiche e sicurezza. Gli effetti elettronici sostituenti possono richiedere una riottimizzazione per diverse aniline o ammine, limitando la diversificazione ampia dell'impalcatura senza adattamento. Tuttavia, l'approccio Conrad–Limpach è operativamente più semplice rispetto alle sintesi di tipo Skraup (ossidanti aggressivi) o ai protocolli catalizzati da metalli di transizione (catalizzatori specializzati/atmosfere inerti). Questa strategia senza metalli produce efficacemente intermedi di quinolina funzionali per la chimica medicinale.

Il protocollo utilizzato per determinare la MIC è un saggio colorimetrico che si basa sull'ispezione visiva. Una possibile sfida con questo metodo è un cambiamento di colore incompleto, che porta a un pozzo viola invece di un blu distinto (inibizione) o rosa (crescita). Se ciò accade, dovrebbe essere interpretato come un fallimento nell'inibire la crescita dei micobatterici. Inoltre, poiché il composto viene valutato tramite diluizione seriale, la concentrazione massima testabile è determinata dalla solubilità del composto. Di conseguenza, in alcuni casi, l'esito può essere inconcludente se non si osserva inibizione alla concentrazione solubile massima. Inoltre, è importante riconoscere che altri laboratori possono adattare alcune fasi del protocollo alle loro specifiche condizioni, il che può portare a variazioni nei risultati ottenuti. Per aumentare la produttività, questo protocollo può essere adattato per l'automazione. L'implementazione di sistemi di movimentazione dei liquidi per la preparazione delle lastre a 96 pozzi ridurrebbe gli errori di pipettatura, migliorando così la precisione e la riproducibilità.

Il protocollo di valutazione della citotossicità utilizza due distinte linee cellulari di mammiferi (Vero e HepG2) e due saghi di vitalità complementare (MTT e NRU). Diversi passaggi all'interno di questo protocollo sono fondamentali per garantire la riproducibilità e l'accuratezza dei dati, e ogni laboratorio dovrebbe effettuare la propria validazione. Ad esempio, la densità iniziale di semina cellulare deve essere ottimizzata con attenzione, poiché la sovraconfluenza può portare all'inibizione del contatto e a alterazioni degli stati metabolici, confondendo i risultati, mentre la sottosemina può rendere le cellule più suscettibili a piccoli insulti, potenzialmente sopravvalutando la^{tossicità 15}. Inoltre, la concentrazione più alta testata è spesso limitata dalla solubilità del composto e le precipitazioni possono portare a risultati imprecisi. Inoltre, la disposizione suggerita delle placche (Figura 3A) è progettata per lo screening primario, massimizzando il numero di composti testati rinunciando alle repliche tecniche e ignorando gli effetti di bordo a favore della validazione tramite repliche biologiche indipendenti.

Un punto di forza chiave di questo protocollo è l'implementazione parallela sia degli saghi MTT che di quelli NRU. Sebbene entrambi siano ben affermati, misurano parametri cellulari diversi. Il saggio MTT quantifica l'attività metabolica delle deidrogenasi mitocondriali, che generalmente corrisponde alla vitalità^{cellulare 16}. Tuttavia, questo saggio è suscettibile all'interferenza di composti con proprietà riducenti o ossidanti o che disturbano la respirazione mitocondriale, portando a potenziali risultati^{falsi 15}. Eseguire il test NRU in parallelo aiuta a risolvere questi artefatti. Il saggio NRU misura la capacità delle cellule vitali di mantenere l'integrità lisosomica e i gradienti di pH necessari per l'assorbimento del^{colorante 17}. Le discrepanze tra i risultati MTT e NRU possono rivelare meccanismi specifici di tossicità, come la disfunzione mitocondriale, che richiedono ulteriori indagini.

In sintesi, questo protocollo delinea i passaggi fondamentali per identificare potenziali candidati farmaci anti-tubercolari. I composti che dimostrano selettività e potenza promettenti possono essere successivamente avanzati verso modelli di infezione più complessi, come gli studi in vivo .

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
LINEE CELLULARI
HepG2 (carcinoma epatocellulare umano)	ATCC	HB-8065	Linea cellulare di carcinoma epatico umano
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	ATCC	25177
Mycobacterium tuberculosis H37Rv	ATCC	27294
Vero (rene di scimmia verde africana)	ATCC	CCL-81	Linea cellulare di epitelio renale di primate
CHIMICA – SINTESI
4-(Piperidin-1-il)anilina	Sigma-Aldrich	TCI: P0887	Precursore amminico per il composto 5/6
4-Bromoanilina	Sigma-Aldrich	108-67-8	Materiale di partenza per la sintesi della chinolina
Acido acetico (glaciale)	Sigma-Aldrich	695092	Reagente in sintesi e preparazione della fase mobile
Acetonitrile (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	34967	Componente della fase mobile HPLC e solvente NMR
Cloruro di metilene	Sigma-Aldrich	C2432	Solvente per l'estrazione del prodotto
DMSO-d6 (deuterato)	Sigma-Aldrich	175641	Solvente NMR
Dowtherm A (fluido di trasferimento di calore)	Sigma-Aldrich / Solutia	TBD	Solvente ad alto punto di ebollizione per ciclizzazione termica (230–250 °C); precedentemente elencato come Dowtherm® A
Etanolo (assoluto)	Sigma-Aldrich	459836	Solvente di reazione per la fase Conrad–Limpach
Acetato di etile (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	270989	Componente del solvente di colonna
Etil acetoacetato	Sigma-Aldrich	E12806	Reagente beta-chetoetilere per la formazione dell'anello della chinolina
Acido formico (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	F0507	Additivo allo 0,1% nella fase mobile per HPLC e HRMS
Sfere di vetro (1 mm, sterili)	Sigma-Aldrich	G8772	Per l'omogeneizzazione della coltura di M. tuberculosis
HCl (acido cloridrico, 37%)	Sigma-Aldrich	320331	Catalizzatore acido nella sostituzione nucleofila
Esano (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	34859	Solvente non polare per cromatografia su colonna
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	278475	Solvente di reazione per la sintesi del composto 6
Solfato di magnesio (MgSO4, anidro)	Sigma-Aldrich	M7506	Agente essiccante e catalizzatore di reazione
Metanolo (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	34860	Fase mobile HPLC e componente del solvente NMR
Ossicloruro di fosforo (POCl3)	Sigma-Aldrich	201170	Reagente di clorurazione per l'intermedio 4
Piridina	Sigma-Aldrich	270970	Catalizzatore di base nella sostituzione nucleofila
Gel di silice (35–70 mesh) per cromatografia flash	Macherey-Nagel	815349	Fase stazionaria per le fasi di cromatografia flash
Gel di silice 60 Å (70–230 mesh) per cromatografia su colonna	Macherey-Nagel	815381	Fase stazionaria per la cromatografia su colonna
Solfato di sodio (Na2SO4, anidro)	Sigma-Aldrich	239313	Agente essiccante per la fase organica
Lastre di cromatografia sottile Silica gel 60 F254	Merck	1.05554	Monitoraggio della cromatografia sottile
Toluene	Sigma-Aldrich	244511	Solvente per la fase di clorurazione
Acqua ultrapura	Millipore / equivalente	N/A	Usata nella preparazione della fase mobile; precedentemente citata come acqua Milli-Q nel testo
ATTREZZATURE & STRUMENTI
Filtro per siringa da 0,22 µm	Millipore / qualsiasi	SLGP033RS	Sterilizzazione della soluzione di resazurina (2.1.4); filtrazione della soluzione di lavoro MTT (3.3); filtrazione della soluzione di lavoro di Neutral Red (3.4)
Filtro per siringa da 0,45 µm	Millipore / qualsiasi	SLHA033SS	Filtrazione delle soluzioni di fase mobile
Tubo conico da 15 mL (sterile)	Falcon / qualsiasi	352097 o equivalente	Raccolta e centrifugazione della sospensione cellulare dopo la tripsinizzazione
Piastra da 96 pozzetti (fondo piatto, trattata per coltura tissutale)	Corning / qualsiasi	3596	Per i saggi di citotossicità e MIC
Carta stagnola	Qualsiasi	—	Protezione dalla luce delle piastre durante l'incubazione e le fasi di agitazione MTT e NRU
Autoclave	Qualsiasi	—	Sterilizzazione dei media (121 °C, 98,07 kPa, 10 min)
Gabinetto di biosicurezza (Classe II, certificato)	Qualsiasi (certificato BSL-3)	—	Richiesto per le manipolazioni di M. tuberculosis (BSL-3)
Contatore cellulare (automatizzato) o ematocitometro	ad es., Bio-Rad TC20 / Neubauer	TBD	Per la determinazione della concentrazione e della vitalità cellulare
Centrifugatrice (capace di 200 × g)	Qualsiasi	—	Fase di pellettizzazione cellulare
Incubatore CO2 (37 °C, 5% CO2, umidificato)	Qualsiasi	—	Incubazione per coltura cellulare e trattamento
Mantello riscaldante	Fisotom	12M	Mantello riscaldante a temperatura controllata con Dowtherm® A
Sistema HPLC (Dionex UltiMate 3000)	Thermo Fisher Scientific	5035.9200	Doppia pompa, iniettore automatico, rilevatore UV; per l'analisi della purezza del composto 6
Microscopio invertito (o equivalente)	Qualsiasi	—	Ispezione visiva delle cellule all'attacco (3.2), durante il controllo di trattamento (3.3, 3.4) e per la verifica dello stato del saggio
Agitatore magnetico / piastra calda