Integrazione Semi-Automatica dell'Analisi del Periodo di Salute Motoria e della Durata della Vita Mediante la Pipeline FlyTrDT in Drosophila melanogaster

Durga Nandan; Nikhil Raj Selvaraj; Bipin G. Nair; Parvathy Venugopal; Rajaguru Aradhya

doi:10.3791/70697

Articolo metodologico

Integrazione Semi-Automatica dell'Analisi del Periodo di Salute Motoria e della Durata della Vita Mediante la Pipeline FlyTrDT in Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/70697

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30 ottobre 2026

Durga Nandan^*¹ , Nikhil Raj Selvaraj^*¹ , Bipin G. Nair¹ , Parvathy Venugopal¹ , Rajaguru Aradhya¹

¹Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amrita University campus

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Drosophila melanogaster si rivela un organismo modello potente per la ricerca sull'invecchiamento. Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere una misurazione riproducibile, basata sulla popolazione, sia della longevità che dell'arco temporale di salute funzionale.

Abstract

L'invecchiamento è caratterizzato da un declino funzionale progressivo e da una riduzione della durata della vita; questi due parametri sono spesso valutati in modo indipendente negli studi sperimentali. In Drosophila melanogaster, i saggi di durata della vita e le misurazioni della locomozione basate sulla geotassi negativa sono comunemente utilizzati per studiare l'invecchiamento e la neurodegenerazione. Tuttavia, mancano quadri standardizzati che integrino quantitativamente le prestazioni motorie precoci con la sopravvivenza a lungo termine. Qui descriviamo un flusso di lavoro riproducibile e semi-automatico che combina l'analisi della durata della vita con una quantificazione oggettiva del periodo di salute motoria nei moscerini invecchiati.

Il protocollo integra condizioni controllate di allevamento delle mosche, il conteggio della mortalità e saggi di geotassi negativa basati su video utilizzando registrazioni MP4 standardizzate (risoluzione minima 1280 × 720, 30 fotogrammi/s). Le prestazioni locomotorie vengono quantificate mediante una pipeline personalizzata basata su Python, implementata in Python 3.12.1 con OpenCV 4.9.0, NumPy 1.26.4, Pandas 2.2.0 e Matplotlib 3.5.2. Il flusso di lavoro esegue il rilevamento del baricentro fotogramma per fotogramma ed estrae la pendenza attiva di arrampicata (pixel/s) come misura continua della funzione motoria. Le traiettorie di sopravvivenza vengono analizzate calcolando la frazione di sopravvivenza ed eseguendo un'integrazione numerica trapezoidale per ottenere l'area sotto la curva (AUC) della sopravvivenza. La normalizzazione delle prestazioni motorie precoci consente un confronto diretto tra il declino funzionale e la longevità complessiva.

Il flusso di lavoro è stato valutato confrontando misurazioni semiautomatiche della capacità di arrampicata con la valutazione manuale tradizionale dei punti finali in moscerini di controllo ed esprimenti amiloide-β, entrambi i metodi rilevando un declino motorio dipendente dall'età. Dati rappresentativi hanno dimostrato traiettorie di longevità riproducibili nei controlli Canton S e un misurabile deterioramento motorio precoce nel modello neurodegenerativo. Questo metodo riduce al minimo il bias dell'osservatore, migliora la riproducibilità ed è comunque compatibile con sistemi di acquisizione video a basso costo. Il flusso di lavoro può essere facilmente adattato a modelli genetici, interventi farmacologici e paradigmi neurodegenerativi, fornendo una piattaforma scalabile per la fenotipizzazione integrata dell'invecchiamento in Drosophila.

Introduzione

L'invecchiamento si caratterizza non solo per la riduzione della durata della vita, ma anche per il declino progressivo delle funzioni fisiologiche e comportamentali¹. Nelle condizioni neurodegenerative, i primi deficit di coordinazione motoria spesso si manifestano prima di un aumento significativo della mortalità e riflettono una disfunzione neuronale sottostante²^,³. Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster si è affermato come un modello sperimentale potente per lo studio dell'invecchiamento e della neurodegenerazione grazie alla sua breve durata della vita, alla facilità di manipolazione genetica e ai test comportamentali ben consolidati⁴. L'analisi della durata della vita in Drosophila fornisce una misura robusta della sopravvivenza dell'organismo, mentre i saggi di geotassi negativa sono ampiamente utilizzati per valutare la funzione locomotoria e il declino motorio legato all'età⁵^,⁶. Tuttavia, questi due parametri sono spesso analizzati separatamente, limitando la possibilità di stabilire una relazione quantitativa tra il precoce deterioramento funzionale e le traiettorie di sopravvivenza a lungo termine. Un'analisi integrata dell'healthspan motorio e della durata della vita può fornire informazioni meccanicistiche su se e come determinati interventi influenzino la velocità di invecchiamento, il decorso della malattia o specifici sistemi fisiologici. Questo approccio risulta particolarmente adatto ai modelli genetici, farmacologici e neurodegenerativi in cui deficit locomotori precoci precedono un aumento significativo della mortalità, consentendo una rilevazione sensibile del declino funzionale ancor prima che emergano differenze osservabili nella sopravvivenza.

I saggi tradizionali di geotassi negativa si basano su valutazioni a tempo definito, come la proporzione di moscerini che raggiungono un'altezza definita entro un intervallo di tempo fisso. Sebbene semplici ed economici, il conteggio manuale può introdurre bias dell'osservatore e potrebbe trascurare lievi differenze nella cinetica motoria. Le misurazioni continue derivate dalle traiettorie possono migliorare la sensibilità nel rilevare lievi deficit locomotori rispetto ai metodi convenzionali di valutazione a tempo definito. Analogamente, i saggi di durata della vita richiedono un rigoroso monitoraggio della mortalità e una standardizzazione ambientale per garantire la riproducibilità⁷. Rimane la necessità di approcci accessibili e riproducibili che integrino metriche funzionali del periodo di salute con dati di sopravvivenza all'interno dello stesso gruppo.

Qui viene descritto un flusso di lavoro semi-automatico che combina l'analisi standardizzata della longevità con la quantificazione basata su video della performance motoria in Drosophila invecchianti. Utilizzando strumenti computazionali open source, viene effettuata una rilevazione frame per frame del baricentro per estrarre la pendenza dell'arrampicamento (pixel/s) come parametro continuo della funzione motoria. I dati sulla sopravvivenza vengono elaborati calcolando la frazione di sopravvivenza ed eseguendo un'integrazione numerica trapezoidale per ottenere l'area sotto la curva (AUC) della sopravvivenza. Normalizzando la performance motoria iniziale e integrandola con l'AUC della sopravvivenza, questo protocollo consente un confronto diretto tra il declino funzionale e la longevità complessiva. Questo approccio fornisce un quadro oggettivo ed economico per associare il periodo di salute motoria alla durata della vita, permettendo una fenotipizzazione completa delle traiettorie di invecchiamento in DrosophilaFigura 1).

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando Drosophila melanogaster e condotti in conformità con le norme del laboratorio istituzionale linee guida. L'approvazione etica non era richiesta poiché lo studio coinvolgeva organismi invertebrati. Mantenere tutte le procedure in conformità con le linee guida istituzionali per la cura degli animali nella ricerca sugli invertebrati.

NOTA: Conservare gli alimenti sperimentali a 4 °C e utilizzarli entro 1 settimana, purché rimangano asciutti. Mantenere condizioni ambientali standard incubando le mosche a 25 °C in un ciclo luce–buio 12:12 h e un'umidità relativa di circa il 60%.

1. Preparazione del terreno di coltura standard per Drosophila

Preparazione di base del cibo
1. Mescolare 6 g di amido di mais, 5 g di lievito, 4 g di D-glucosio, 3 g di saccarosio, 1 g di estratto di lievito, 1 g di agar, e 0,25 g di estratto di malto in un contenitore contenente 100 mL di acqua distillata.
2. Mescolare accuratamente il contenuto con una spatola fino a ottenere una sospensione omogenea.
3. Riscaldare la miscela a circa 85–100 °C su un fornello a induzione per 12–15 min quando si preparano volumi ≥500 mL, oppure per 5–10 min quando si preparano volumi compresi tra 100–400 mL. Mescolare continuamente durante il riscaldamento.
4. Autoclavare la miscela riscaldata seguendo le procedure standard di sterilizzazione di laboratorio.
5. Lasciare raffreddare il mezzo autoclavato. Monitorare la temperatura con un termometro fino a quando non raggiunge 50–55 °C.
6. Aggiungere 600 µL di acido propionico e 100 mg di acido benzoico in 1 mL di etanolo al 100% al mezzo raffreddato e mescolare accuratamente.
7. ATTENZIONE: L'acido propionico e l'etanolo devono essere manipolati in un'area ben ventilata indossando guanti e occhiali protettivi poiché entrambe le sostanze chimiche sono volatili e possono causare irritazione in caso di inalazione o contatto con la pelle.
8. Distribuire 5 mL di cibo in ciascun vial sterile di dimensioni pari a 10 cm di lunghezza e 20 mm di diametro.
9. Lasciare i vial scoperti per almeno 5–6 h a temperatura ambiente. Coprirli con carta da filtro per evitare l'ingresso di moscerini. Utilizzare questo passaggio per ridurre al minimo le variabilità nelle misurazioni della longevità derivanti da differenze nella preparazione e nelle condizioni di conservazione del mezzo.
Preparazione del cibo contenente farmaco
1. Preparare un piccolo lotto di cibo per adulti come descritto nei passaggi 1.1.1–1.1.5.
2. Lasciare raffreddare il cibo a 50–55 °C.
3. Preparare una soluzione madre del composto in esame alla concentrazione desiderata utilizzando un veicolo appropriato, come acqua distillata o dimetilsulfossido (DMSO). Sciogliere il composto in esame nel veicolo scelto per ottenere una soluzione madre concentrata, quindi aggiungere tale soluzione al cibo raffreddato (50–55 °C) per raggiungere la concentrazione finale desiderata, mantenendo concentrazioni identiche di veicolo tra i gruppi trattati e i gruppi di controllo.
4. Mescolare accuratamente per garantire una distribuzione uniforme.
5. Distribuire 2 mL di cibo contenente il farmaco in ciascun vial sperimentale, stratificandolo sulla superficie del cibo base già solidificato.
6. Preparare i vial di controllo aggiungendo un volume equivalente di solo veicolo (ad esempio, acqua distillata o DMSO alla stessa concentrazione finale utilizzata nei gruppi trattati) al cibo stratificato sul cibo base.
7. Lasciare solidificare completamente il cibo stratificato a temperatura ambiente prima di introdurre le mosche.
  NOTA: Manipolazione e conservazione del cibo: se il cibo viene preparato alla sera, lasciare i vial coperti con carta da filtro durante la notte a temperatura ambiente e inserire tappi di cotone la mattina seguente. Lavare, decontaminare e autoclavare sempre i vial prima dell'uso. Autoclavare separatamente i rotoli di cotone prima di tappare. Inserire i tappi di cotone solo dopo che il cibo si è completamente solidificato, per almeno 5–6 h.

2. Generazione di D. melanogaster esprimenti l'amiloido-β

Raccolta e conferma dello stato di verginità delle femmine driver
1. Mantenere la linea di moscerini driver a 25 °C in un ciclo luce–buio di 12 h:12 h prima della raccolta delle vergini.
2. Raccogliere femmine appena schiuse dalla linea driver due volte al giorno, una al mattino e una nel tardo pomeriggio, utilizzando una breve anestesia con anidride carbonica.
3. Trasferire immediatamente le femmine raccolte in provette fresche monosessuali per prevenire l'accoppiamento.
4. Incubare le provette a 25 °C per ulteriori 48 h per confermare lo stato di verginità.
5. Ispezionare le provette giornalmente per verificare la presenza di larve.
6. Confermare lo stato di verginità verificando l'assenza di uova o prole larvale.
7. Mantenere solo le femmine che non mostrano segni di produzione larvale per l'uso negli incroci genetici.
Impostazione dell'incrocio genetico
1. Raccogliere maschi adulti UAS-APPE693G appena schiusi utilizzando una breve anestesia con anidride carbonica nel giorno dell'allestimento dell'incrocio.
2. Impostare gli incroci posizionando 20 femmine elav-GAL4 vergini con 10 maschi UAS-APPE693G in una provetta con nuovo terreno di coltura.
3. Incubare le provette degli incroci a 25 °C in condizioni di umidità controllata e in un ciclo luce–buio di 12 h:12 h.
4. Lasciare che i moscerini si accoppino e depongano le uova per 48 h.
5. Trasferire gli adulti in provette fresche se è richiesta una progenie aggiuntiva.
6. Rimuovere i moscerini parentali dopo la deposizione delle uova per evitare sovraffollamento e sovrapposizione delle generazioni.
7. Lasciare sviluppare la progenie fino all'età adulta in condizioni standard fino all'eclosione.
8. Utilizzare moscerini adulti F1 che esprimono l'amiloid-β nei neuroni per esperimenti successivi sulla longevità e sullo stato di salute.
  NOTA: Il driver elav-GAL4 consente l'espressione pan-neuronale della proteina precursore dell'amiloidina umana portatrice della mutazione artica E693G. L'espressione avviene durante tutto lo sviluppo e l'età adulta in condizioni standard di allevamento. Per esperimenti sull'invecchiamento, utilizzare background genetici costanti e controlli appropriati. Mantenere condizioni di temperatura costanti all'interno di ciascun
  esperimento. Temperature di incubazione più basse, come 18 °C, possono essere utilizzate durante lo sviluppo per
  ritardare la patologia associata al transgene prima dell'età adulta.

3. Raccolta delle mosche

Raccolta delle mosche per il saggio di geotassi negativa
1. Mantenere tutte le linee di mosche su alimento standard per moscerini a 25 °C, circa il 60% di umidità relativa e un ciclo luce-buio di 12 h:12 h prima dell’allestimento sperimentale.
2. Raccogliere maschi adulti appena schiusi entro una finestra temporale di 2–3 giorni utilizzando una breve anestesia con anidride carbonica.
3. Trasferire i maschi in provette con alimento contenente il farmaco o in provette con alimento di controllo, a seconda della condizione sperimentale.
4. Sostituire l’alimento ogni 3 giorni o prima, se la qualità dell’alimento peggiora.
5. Mantenere le mosche in queste condizioni fino all’età prestabilita per la valutazione della geotassi negativa.
  NOTA: Per il saggio di geotassi negativa si utilizzano esclusivamente mosche maschio per evitare variabilità derivanti da differenze legate al sesso nelle prestazioni locomotorie e nell’invecchiamento.
Raccolta delle mosche per il saggio di longevità
1. Anestetizzare brevemente piccoli gruppi di mosche su un tappetino anestetico.
2. Identificare i maschi utilizzando un morbido pennello da pittura.
3. Minimizzare l’esposizione alla CO₂ durante il raggruppamento per evitare effetti fisiologici persistenti che potrebbero alterare le misurazioni della longevità.
4. Posizionare 10 mosche maschio e 10 femmine, in rapporto sessuale 1:1, in ciascuna provetta con alimento fresco, in base al disegno sperimentale.
5. Completare il raggruppamento e il travaso entro 3–4 minuti per ogni lotto.
6. Assicurarsi che l’esposizione totale all’anestesia non superi i 9–10 minuti.
7. ATTENZIONE: L’anestesia con anidride carbonica deve essere applicata utilizzando regolatori adeguati e un’appropriata ventilazione del laboratorio per ridurre al minimo l’esposizione dell’operatore e prevenire stress fisiologici prolungati indotti dall’anestesia nelle mosche.
8. Ripetere i passaggi 3.2.1–3.2.6 fino a quando non vengono allestite 4–6 provette replicate per ciascuna condizione sperimentale.

4. Esperimento sulla longevità

Trasferimento e mantenimento delle mosche
1. Mantenere le mosche in condizioni standard.
2. Trasferire le mosche in provette con nuovo terreno alimentare a intervalli regolari per evitare sovraffollamento, contaminazione da larve e deterioramento del cibo.
3. Trasferire le mosche su cibo fresco ogni 3 giorni.
4. Utilizzare questa frequenza di trasferimento per minimizzare le perturbazioni delle condizioni di alimentazione, prevenendo la crescita delle larve nella provetta.
5. Eseguire tutti i trasferimenti senza anestesia.
  NOTA: Evitare l’anestesia durante gli esperimenti sulla durata della vita, poiché può indurre mortalità acuta, specialmente nelle mosche anziane.
Valutazione della mortalità durante i trasferimenti
1. Registrare l’età del gruppo in giorni a ogni trasferimento.
2. Ispezionare attentamente la vecchia provetta.
3. Contare e registrare il numero di mosche morte rimaste nella vecchia provetta.
4. Contare e registrare il numero di mosche morte trasferite nella nuova provetta.
5. Registrare questi valori separatamente per evitare doppie conte.
6. Calcolare il numero totale di morti per ogni trasferimento utilizzando la seguente equazione:
  Morti totali = mosche morte nella vecchia provetta + mosche morte trasferite nella nuova provetta.
7. Determinare il numero di nuove morti dall’ultimo trasferimento sottraendo il numero di mosche registrate come “trasferite” nel precedente trasferimento dal totale delle morti nel trasferimento attuale.
8. Utilizzare questo calcolo per assicurarsi che le mosche trasferite tra le provette non vengano conteggiate più volte.
Identificazione delle mosche vive ma inattive
1. Battere delicatamente sul lato della provetta prima di considerare una mosca morta, quando mosche anziane appaiono immobili o giacciono supine.
2. Osservare se si verifica alcun movimento.
3. Considerare vive le mosche che mostrano movimento dopo stimolazione.
4. Non registrare come morte le mosche che mostrano movimento dopo stimolazione.
5. Battere delicatamente sulla provetta per staccare eventuali mosche vive attaccate alla superficie del cibo nella vecchia provetta.
6. Trasferire le mosche vive staccate nella nuova provetta.
7. Non considerare morte le mosche vive staccate.
  NOTA: Una corretta distinzione tra mosche morte e mosche inattive è fondamentale nelle fasi finali della vita. Una stimolazione meccanica delicata deve essere sempre applicata prima di assegnare lo stato di morte.
Criteri di censura
1. Considerare una mosca censurata a destra se esce dall’esperimento prima della morte naturale a causa di fuga dalla provetta, lesione accidentale o problemi di manipolazione.
2. Registrare le mosche censurate in una colonna separata nel giorno in cui la mosca esce dall’esperimento.
3. Non registrare le mosche censurate come morte.
4. Escludere le mosche censurate dai conteggi di mortalità nell’analisi della sopravvivenza.
5. Applicare la censura con cautela poiché un’eccessiva censura può introdurre bias sperimentale.
  NOTA: Separare le mosche “morte” da quelle “trasferite” durante l’inserimento dei dati evita un’inflazione dei conteggi di mortalità e garantisce una corretta ricostruzione della curva di sopravvivenza.
Proseguimento del saggio
1. Ripetere i passaggi 4.1–4.4 per tutta la durata dell’esperimento.
2. Proseguire il saggio fino a quando l’ultima mosca sopravvissuta muore.

5. Esperimento di geotassi negativa

Preparazione delle mosche
1. Raccogliere le mosche da provette sperimentali senza utilizzare anestesia con CO₂.
2. Trasferire delicatamente le mosche in un tubo di arrampicata pulito, o tubo per geotassi negativa, utilizzando un imbuto piccolo per evitare fughe.
3. Lasciare che le mosche si ambientino nella camera di prova per 5 minuti prima di iniziare il saggio.
4. Eseguire tutti i saggi di arrampicata alla stessa ora del giorno, ad esempio nel pomeriggio, per minimizzare la variabilità circadiana.
  NOTA: Evitare la luce solare diretta durante il test, poiché l'intensità luminosa può alterare il comportamento locomotorio.
Impostazione del tubo di arrampicata
1. Utilizzare un tubo cilindrico trasparente alto 12 cm e con diametro di 2 cm.
2. Tracciare una linea orizzontale a 10 cm dalla base del tubo.
3. Posizionare il tubo verticalmente contro uno sfondo bianco uniforme per facilitare il tracciamento video.
4. Fissare uno smartphone o una videocamera digitale su un supporto stabile.
5. Assicurarsi che l'intero tubo sia compreso nell'inquadratura.
Procedura del saggio
1. Battere energicamente il tubo tre volte su un tappetino in schiuma o su un mouse pad posizionato su una superficie solida in modo che tutte le mosche cadano simultaneamente sul fondo.
2. Avviare immediatamente la registrazione video per 10–12 secondi a circa 30 fotogrammi/s.
3. Permettere alle mosche di arrampicarsi liberamente per 10 secondi.
4. Registrare almeno tre prove indipendenti per ogni provetta.
5. Prevedere un intervallo di riposo di 10 minuti tra una prova e l'altra.
6. Eseguire il saggio per ogni condizione sperimentale, ad esempio gruppi controllo, trattati con farmaco e controllo solvente.
7. Contare il numero di mosche che raggiungono o superano il segno dei 10 cm entro 10 secondi.
8. Registrare E come il numero di mosche che raggiungono i 10 cm.
9. Registrare T come il numero totale di mosche vive testate.
10. Calcolare l'attività percentuale di arrampicata come (E/T) × 100.
11. Fare la media dei valori ottenuti nelle tre prove.
12. Esprimere i valori come media ± DS.
Analisi semiautomatica dell'arrampicata mediante script Python
1. Acquisizione video
  1. Registrare i saggi di geotassi negativa utilizzando una videocamera dello smartphone posizionata perpendicolarmente a un tubo di arrampicata trasparente alto 12 cm e con diametro di 2 cm. Registrare i video con uno smartphone o una videocamera digitale a circa 30 fotogrammi/s e una risoluzione minima di 1280 × 720 pixel. Posizionare la videocamera a una distanza fissa di circa 15–20 cm dal tubo di arrampicata e mantenere la stessa geometria di acquisizione in tutte le registrazioni. Utilizzare l'altezza nota del tubo (12 cm) come riferimento interno di calibrazione spaziale per le misurazioni basate sui pixel.
  2. Posizionare il tubo contro uno sfondo bianco uniforme.
  3. Registrare i video per 10–12 secondi.
  4. Mantenere costanti le condizioni di illuminazione in tutte le registrazioni.
  5. Mantenere costante la distanza della videocamera in tutte le registrazioni.
  6. Mantenere costante il posizionamento del tubo in tutte le registrazioni.
  7. Minimizzare la variabilità nel rilevamento del baricentro.
  8. Salvare i video registrati in formato .mp4.
  9. Trasferire i video registrati su un computer desktop per l'analisi.
2. Elaborazione video basata su Python
  1. Analizzare i video utilizzando uno script Python personalizzato fornito come File Supplementare 1. Eseguire tutte le analisi utilizzando Python 3.12.1 con OpenCV (cv2) versione 4.9.0, NumPy versione 1.26.4, Pandas versione 2.2.0, Matplotlib versione 3.5.2 e Scikit-learn versione 1.4.2.
    1. Specificare il percorso del video di input e la directory di output all'interno del File Supplementare 1 prima di eseguire lo script da un ambiente Python o da un'interfaccia a riga di comando.
    2. Eseguire lo script utilizzando il comando python climbing_analysis.py dopo aver modificato le variabili VIDEO_PATH e OUTPUT_CSV.
  2. Utilizzare OpenCV, o cv2, per l'elaborazione dei fotogrammi e il rilevamento degli oggetti.
  3. Utilizzare NumPy per i calcoli numerici.
  4. Utilizzare Pandas per l'esportazione dei dati.
  5. Utilizzare Matplotlib per la visualizzazione.
  6. Elaborare ogni video fotogramma per fotogramma.
  7. Leggere il video utilizzando la funzione VideoCapture di OpenCV.
  8. Elaborare i singoli fotogrammi in sequenza.
  9. Convertire i fotogrammi in scala di grigi.
  10. Applicare un'offuscamento gaussiano per ridurre il rumore di fondo.
  11. Applicare la sogliatura di Otsu in modalità binaria inversa per segmentare le mosche dallo sfondo.
  12. Eseguire operazioni morfologiche di apertura e chiusura per rimuovere piccoli artefatti e riempire le lacune nei contorni.
  13. Identificare i contorni che superano una soglia minima di area di 60 pixel² per escludere artefatti di fondo e piccole particelle di rumore.
  14. Calcolare i momenti spaziali per ogni contorno valido.
  15. Determinare le coordinate del baricentro, x e y, per ogni contorno valido.
  16. Fare la media delle coordinate del baricentro quando vengono rilevate più mosche in un fotogramma.
  17. Ottenere una singola posizione media del gruppo per ogni fotogramma.
3. Valutazione del controllo qualità
  1. Verificare il corretto segmentamento delle mosche confermando che i contorni rilevati corrispondano alle mosche visibili durante tutta la registrazione.
  2. Assicurarsi di avere un contrasto adeguato tra le mosche e lo sfondo utilizzando uno sfondo bianco uniforme e condizioni di illuminazione stabili.
  3. Escludere i video contenenti eccessivo bagliore, ombre, movimento del tubo, sovrapposizione grave delle mosche o visibilità incompleta del tubo.
  4. Considerare i video non idonei per l'analisi quando il tracciamento del baricentro fallisce per porzioni significative della registrazione o quando la sogliatura produce artefatti persistenti di fondo.
4. Estrazione delle metriche di arrampicata
  1. Calcolare manualmente il punteggio di arrampicata come descritto nel Passaggio 5.3.7.
  2. Calcolare l'altezza di arrampicata in pixel come differenza tra la posizione verticale iniziale e finale del baricentro.
  3. Calcolare la velocità media in pixel/s come lunghezza totale della traiettoria divisa per la durata della registrazione.
  4. Calcolare la velocità massima in pixel/s come massimo spostamento istantaneo tra fotogrammi consecutivi.
  5. Calcolare la lunghezza della traiettoria in pixel come distanza cumulativa percorsa tra i fotogrammi.
  6. Calcolare l'area della traiettoria in pixel² come area dell'inviluppo convesso che racchiude tutte le posizioni del baricentro.
  7. Calcolare il numero di cambi di direzione orizzontale.
  8. Calcolare il numero di arresti come numero di fotogrammi in cui lo spostamento del baricentro rimane al di sotto di una soglia di arresto di 3 pixel tra fotogrammi consecutivi.
  9. Tracciare la posizione verticale in funzione del tempo per ottenere una misura oggettiva della performance attiva di arrampicata.
  10. Calcolare la pendenza di arrampicata in pixel al secondo utilizzando una finestra di regressione lineare mobile di 1 secondo durante la fase attiva di arrampicata della registrazione.
  11. Utilizzare il valore della pendenza come metrica primaria di performance motoria per l'integrazione con l'analisi della sopravvivenza.
  12. Esportare le metriche locomotorie quantificate, incluse altezza di arrampicata, velocità media, velocità massima, lunghezza della traiettoria, area della traiettoria, numero di cambi di direzione, numero di arresti e pendenza di arrampicata, in file .csv. Salvare i grafici di visualizzazione della pendenza in file immagine .png per la verifica della qualità e l'analisi successiva.

6. Integrazione dell'analisi della salute motoria precoce e della sopravvivenza

Esportare i dati di sopravvivenza come file .csv contenente colonne per gruppo, giorno e numero di moscerini vivi.
Calcolare la frazione di sopravvivenza per ogni gruppo in ogni punto temporale dividendo il numero di moscerini vivi per la dimensione iniziale del gruppo.
Calcolare l'area sotto la curva di sopravvivenza, o AUC, mediante integrazione numerica trapezoidale della frazione di sopravvivenza rispetto al tempo.
Esportare i dati di prestazione motoria come file .csv contenente la pendenza della scalata al Giorno 7 per ogni gruppo.
Normalizzare la prestazione motoria al Giorno 7 rispetto al gruppo di controllo, Canton S, dividendo il valore di pendenza al Giorno 7 di ciascun gruppo per la corrispondente pendenza del controllo.
Unire i valori normalizzati di prestazione motoria al Giorno 7 con i corrispondenti valori di AUC di sopravvivenza per ogni genotipo.
Eseguire un confronto descrittivo tra la prestazione motoria normalizzata al Giorno 7 e l'AUC di sopravvivenza per valutare la relazione tra il declino motorio precoce e gli esiti di sopravvivenza.
Generare una rappresentazione grafica dei valori normalizzati di prestazione motoria al Giorno 7 e dell'AUC di sopravvivenza (File Supplementare 2).
NOTA: Eseguire tutte le analisi di integrazione tra sopravvivenza e funzione motoria utilizzando lo script Python personalizzato fornito come File Supplementare 2. Utilizzare Pandas per la gestione dei dati e l'unione dei dataset, NumPy per l'integrazione numerica trapezoidale e Matplotlib per la rappresentazione grafica.

7. Analisi statistica

Presentare i dati relativi alla locomozione e alla sopravvivenza come set rappresentativi ottenuti da provette replicate a livello biologico.
Indicare le misurazioni della locomozione come valori medi calcolati su prove indipendenti di arrampicata.
Utilizzare la rappresentazione grafica della pendenza di arrampicata (pixel/s) e dei valori AUC di sopravvivenza per mostrare le relazioni tipiche tra prestazione motoria e risultati di sopravvivenza.

Risultati

Profili di durata della vita riproducibili in condizioni standardizzate di allevamento
Quando le mosche sono state mantenute in condizioni ambientali controllate (25 °C, 60% di umidità, ciclo luce-buio 12 h:12 h) utilizzando un alimento standard appena preparato, i gruppi di controllo hanno mostrato traiettorie di sopravvivenza costanti in esperimenti indipendenti. Le mosche di controllo Canton S hanno mostrato una durata media della vita di circa 65–72 giorni, con una sopravvivenza massima che raggiunge i 75 giorni (Figura 2). Gli esperimenti sulla durata della vita sono stati eseguiti con 2 repliche biologiche per condizione, ciascuna contenente 20 mosche. Le traiettorie di sopravvivenza rappresentative ottenute in condizioni ambientali e alimentari standardizzate hanno dimostrato profili di durata della vita riproducibili nei gruppi di controllo.

Al contrario, le mosche che esprimevano l'amiloide-β in modo pan-neuronale hanno mostrato una ridotta sopravvivenza rispetto ai controlli Canton S, in accordo con i fenotipi neurodegenerativi precedentemente riportati nei modelli di Drosophila della malattia di Alzheimer⁴^,⁵^,⁶.

Risultati subottimali per la durata della vita possono verificarsi quando la qualità del cibo peggiora o quando le condizioni di manipolazione non sono costanti. In tali condizioni, sono stati osservati picchi di mortalità precoce entro i primi 7–10 giorni e una maggiore variabilità tra provette (>25%), indicanti una riproducibilità sperimentale compromessa e una ridotta coerenza tra i replicati biologici.

Declino motorio dipendente dall'età rilevato mediante analisi semiautomatica dell'arrampicamento
La valutazione manuale convenzionale del geotassi negativo ha rilevato un declino locomotorio dipendente dall'età nelle mosche che esprimono l'amiloido-β rispetto ai controlli Canton S (Figura 3). Al Giorno 7, la performance nell'arrampicamento è rimasta sostanzialmente comparabile tra i gruppi, mentre al Giorno 28 le mosche che esprimevano l'amiloido-β hanno mostrato un'attività di arrampicamento ridotta rispetto alle mosche di controllo. I gruppi di controllo hanno mantenuto una performance nell'arrampicamento relativamente stabile durante i diversi punti temporali dell'invecchiamento. Queste tendenze comportamentali valutate manualmente si sono rispecchiate in una riduzione dei valori di pendenza dell'arrampicamento ottenuti dalla pipeline semiautomatica FlyTrDT, mostrando andamenti dipendenti dall'età simili a quelli osservati con la valutazione manuale convenzionale e con il flusso di lavoro computazionale di tracciamento (Figura 4). Il declino locomotorio osservato nelle mosche che esprimono l'amiloido-β è coerente con il deterioramento comportamentale dipendente dall'età precedentemente descritto nei modelli di neurodegenerazione di Drosophila mediante saggi convenzionali di geotassi negativo⁶^,⁷.

L'analisi semiautomatica dell'arrampicata mediante FlyTrDT ha rivelato una funzione motoria precoce preservata nelle mosche di controllo. Al Giorno 7, le mosche di controllo hanno mostrato una pendenza media di arrampicata di 86,64 pixel/s, indicativa di uno spostamento verso l'alto sostenuto durante la fase attiva di arrampicata (Figura 4). Al Giorno 28, la pendenza si è avvicinata a zero (−1,50 pixel/s), in accordo con un rallentamento associato all'età.

Al contrario, le mosche che esprimevano l'amiloide-β mostravano un precoce deterioramento motorio. Al giorno 7, la pendenza della scalata era ridotta a 34,25 pixel/s, pari a circa il 39% della prestazione del gruppo di controllo dopo la normalizzazione. Entro il giorno 28, la pendenza della scalata diminuiva notevolmente fino a -72,25 pixel/s, indicando un deterioramento della capacità locomotoria verso l'alto.

La metrica basata sulla pendenza cattura il segmento di arrampicata attiva e riduce il contributo della latenza iniziale allo start, delle fasi di plateau e degli artefatti di movimento stocastici. Pendenze positive indicano una locomozione verso l'alto netta, pendenze prossime allo zero indicano uno spostamento verticale limitato e pendenze negative indicano uno spostamento verso il basso netto. Queste traiettorie rappresentative illustrano il declino motorio progressivo nei moscerini esprimenti amiloide-β rispetto ai controlli di pari età.

In condizioni ottimali di registrazione, la pipeline FlyTrDT ha generato traiettorie continue del baricentro con una segmentazione del contorno stabile e profili coerenti di spostamento verticale (Figura 4A). Le ridotte prestazioni locomotorie nei moscerini che esprimono amiloide-β si sono riflesse in traiettorie ascendenti meno sostenute e valori di pendenza inferiori (Figura 4B–D). I video registrati con eccesso di riflessi, posizionamento instabile del tubo, illuminazione non uniforme o contrasto dello sfondo inadeguato hanno prodotto traiettorie del baricentro discontinue e artefatti intermittenti di tracciamento, ed sono stati esclusi durante la valutazione del controllo di qualità.

Associazione tra prestazione motoria precoce e risultati sulla sopravvivenza
Per esaminare le associazioni tra prestazione motoria precoce e risultati sulla sopravvivenza, i valori normalizzati della pendenza della scalata al Giorno 7 sono stati confrontati con l'AUC di sopravvivenza (area sotto la curva) tra i diversi genotipi (Figura 5). Le mosche di controllo con prestazione motoria precoce preservata (indice motorio normalizzato = 1,0) hanno mostrato valori più elevati di AUC di sopravvivenza (48,2), mentre le mosche che esprimono l'amiloide-β con prestazione motoria precoce ridotta (indice motorio normalizzato = 0,395) hanno mostrato valori più bassi di AUC di sopravvivenza (24,65). Dataset rappresentativi della locomozione sono stati ottenuti da 2 provette per condizione, ciascuna derivante da una replica biologica. Questi dataset rappresentativi suggeriscono un'associazione tra ridotta prestazione motoria precoce e sopravvivenza abbreviata nel modello di malattia da amiloide-β. Poiché sono stati analizzati solo due genotipi rappresentativi, questi risultati sono presentati in forma descrittiva piuttosto che come una correlazione predittiva statisticamente significativa.

Saggio di arrampicata in Drosophila transgenica; diagramma a scatola e curva di Kaplan-Meier per lo studio della malattia di Alzheimer.
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro della pipeline FlyTrDT semi-automatica, che integra metriche sulla longevità locomotoria con l'analisi della sopravvivenza. Il flusso di lavoro comprende l'allevamento standardizzato delle mosche e l'analisi della durata della vita, la valutazione manuale e semi-automatica della geotassi negativa, l'estrazione frame per frame del baricentro dai video di arrampicata, il calcolo della pendenza di arrampicata (pixel/s), l'analisi dell'area sotto la curva (AUC) relativa alla sopravvivenza e l'integrazione delle prestazioni motorie con gli esiti di sopravvivenza. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico di analisi della sopravvivenza che confronta i gruppi controllo CS e Aβ; probabilità nel tempo in giorni.
Figura 2: Analisi della sopravvivenza di Kaplan-Meier di moscerini Canton S controllo e moscerini esprimenti l'amiloide-β. Le curve di sopravvivenza illustrano l'andamento della longevità in condizioni ambientali e dietetiche standardizzate. I moscerini Canton S controllo hanno mostrato una sopravvivenza prolungata rispetto ai moscerini esprimenti l'amiloide-β in maniera pan-neuronale, i quali hanno evidenziato una ridotta longevità durante i diversi punti temporali dell'invecchiamento. I dati rappresentano traiettorie di sopravvivenza rappresentative ottenute da 2 provette per condizione, ciascuna con replica biologica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati del test di arrampicata in Drosophila; i grafici a scatola confrontano CS rispetto a elav-Gal4/UAS-Aβ42 ai giorni 7 e 28.
Figura 3: Prestazione manuale nel test di geotassi negativa in moscerini controllo e in moscerini che esprimono l'amiloide-β ai giorni 7 e 28. I grafici a scatola mostrano misurazioni rappresentative dell'attività di arrampicata espresse come percentuale di moscerini che superano la soglia di 10 cm entro 10 s. I moscerini controllo Canton S (CS) hanno mantenuto un'attività di arrampicata relativamente stabile durante l'invecchiamento, mentre i moscerini che esprimono l'amiloide-β hanno mostrato una ridotta capacità di arrampicata già al giorno 28. Ogni punto rappresenta la misurazione di una provetta singola. I dati rappresentativi sono stati ottenuti da 2 provette replicate biologicamente per ogni condizione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Analisi dell'altezza di arrampicata; i grafici A-D mostrano le pendenze in pixel/sec; grafici altezza vs tempo; tendenze dei dati.
Figura 4: Estrazione semi-automatica delle traiettorie di arrampicata e della pendenza durante l'arrampicata attiva in moscerini controllo ed esprimenti amiloide-β. Le traiettorie medie rappresentative della posizione verticale sono state estratte da video di geotassi negativa utilizzando la pipeline di tracciamento FlyTrDT. Le tracce blu rappresentano la posizione media frame per frame del baricentro verticale delle mosche rilevate nel tempo, mentre i segmenti rossi indicano un segmento rappresentativo di arrampicata attiva identificato mediante una finestra mobile di regressione lineare. I valori di pendenza sono espressi in pixel/s. (A) Moscerini controllo Canton S al giorno 7. (B) Moscerini esprimenti amiloide-β al giorno 7. (C) Moscerini controllo Canton S al giorno 28. (D) Moscerini esprimenti amiloide-β al giorno 28. Le traiettorie rappresentative sono state generate da 2 provette per condizione, ciascuna costituente un replicato biologico. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico di correlazione tra salute motoria precoce e sopravvivenza; gli assi mostrano la salute motoria normalizzata al giorno 7 e l'area sotto la curva (AUC) di sopravvivenza.
Figura 5: Associazione tra prestazione motoria precoce e esiti di sopravvivenza in un modello di Drosophila di tossicità da amiloide-β. I valori normalizzati della pendenza della scalata al giorno 7 sono stati riportati in grafico rispetto all'area sotto la curva (AUC) di sopravvivenza per le mosche di controllo Canton S (CS) e per le mosche che esprimono l'amiloide-β (AD) (n = 2). Le mosche di controllo hanno mostrato una prestazione motoria precoce più elevata e valori maggiori di AUC di sopravvivenza rispetto alle mosche che esprimono l'amiloide-β. Questi set di dati rappresentativi illustrano un'associazione tra la prestazione locomotoria precoce e gli esiti di sopravvivenza. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: Script Python basato su FlyTrDT utilizzato per la quantificazione semi-automatica della locomozione da video di geotassi negativa. Lo script esegue l'elaborazione delle immagini fotogramma per fotogramma, la rilevazione del baricentro, l'estrazione delle traiettorie e il calcolo di parametri di arrampicata, tra cui pendenza di arrampicata, velocità, lunghezza della traiettoria, area della traiettoria, numero di arresti e numero di cambi di direzione.Cliccare qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Script Python per l'integrazione dei dati relativi all'arco di salute motoria e alla longevità. Lo script esegue il calcolo della frazione di sopravvivenza, l'analisi dell'area sotto la curva (AUC) con il metodo trapezoidale, la normalizzazione dei valori della pendenza di arrampicata al giorno 7, la fusione dei set di dati e la visualizzazione grafica delle prestazioni motorie e degli esiti di sopravvivenza.Cliccare qui per scaricare questo file.

Discussione

Presentiamo qui un protocollo che integra l'analisi della durata della vita con la quantificazione semi-automatica dell'arco di salute motoria in Drosophila melanogaster. L'integrazione affidabile tra misurazioni della longevità e della capacità locomotoria dipende fortemente dalla costanza ambientale, dalla qualità del cibo e dalle procedure standardizzate di manipolazione tra i replicati biologici.⁷. La variabilità nella secchezza del cibo, i trasferimenti ritardati o un conteggio della mortalità non uniforme possono introdurre picchi precoci di mortalità e una maggiore variabilità tra i provette, compromettendo così la ricostruzione delle curve di sopravvivenza e l'interpretazione successiva dei fenotipi legati all'invecchiamento.

Durante il saggio di geotassi negativa, sono necessarie condizioni di illuminazione costanti, un posizionamento della videocamera e un allineamento dei tubi uniformi per garantire un'affidabile rilevazione del baricentro durante l'elaborazione video. L'esposizione eccessiva a CO₂ durante il raggruppamento deve essere ridotta al minimo, poiché l'anestesia può influenzare sia la durata della vita sia le prestazioni locomotorie. Quando si effettuano misurazioni comportamentali ripetute sullo stesso gruppo, i saggi devono essere eseguiti alla stessa ora della giornata per ridurre la variabilità circadiana. Un contrasto di fondo inadeguato o un'illuminazione non uniforme possono compromettere la sogliatura e il rilevamento dei contorni durante l'analisi automatizzata. Se durante l'elaborazione video si osservano frammentazione dei contorni o traiettorie instabili del baricentro, migliorare il contrasto di fondo, ridurre i riflessi, stabilizzare il posizionamento della videocamera e mantenere un'illuminazione uniforme tra le registrazioni. Gli artefatti persistenti di sogliatura possono essere ridotti regolando l'angolo di ripresa, minimizzando le ombre o assicurando che l'intero tubo di arrampicata rimanga continuamente visibile all'interno del campo inquadrato. Un eccessivo raggruppamento delle mosche all'interno del tubo può compromettere una stima accurata del baricentro e deve essere ridotto al minimo mantenendo dimensioni di gruppo costanti tra gli esperimenti.

I saggi tradizionali di geotassi negativa misurano solitamente la proporzione di moscerini che raggiungono un'altezza predeterminata entro un intervallo di tempo fisso e sono ampiamente utilizzati per valutare il declino locomotorio durante l'invecchiamento e la neurodegenerazione⁵^,⁶. Al contrario, il presente flusso di lavoro semiautomatico estrae una fase attiva di arrampicata verso l'alto e calcola la pendenza dell'arrampicata attiva (pixel/s) a partire dalle traiettorie centroidali frame per frame. Poiché le posizioni centroidali vengono mediate su tutte le mosche rilevate all'interno di ciascun frame, non è possibile risolvere le singole traiettorie locomotorie né l'eterogeneità comportamentale tra mosca e mosca. Questo approccio riduce l'influenza di fattori come la latenza allo spostamento improvviso, le pause transitorie e il comportamento di aggregazione, che possono influenzare le valutazioni manuali basate su endpoint. A differenza delle tradizionali valutazioni basate su endpoint, il presente flusso di lavoro fornisce inoltre misurazioni continue della pendenza crescente (pixel/s), che consentono un confronto quantitativo del declino motorio in funzione dell'età e del genotipo. Approcci simili di tracciamento computazionale sono stati applicati con crescente frequenza per migliorare l'oggettività e la coerenza nell'analisi comportamentale di Drosophila mediante piattaforme automatizzate di quantificazione della locomozione.⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹².

Vanno considerate diverse ulteriori limitazioni. Le misurazioni basate sui pixel della pendenza di arrampicata (pixel/s) dipendono da una calibrazione della telecamera e da una geometria di ripresa costanti tra un esperimento e l'altro. Differenze nella distanza o nella risoluzione della telecamera potrebbero influenzare i valori assoluti della pendenza, rendendo necessaria una normalizzazione rispetto a controlli interni. Inoltre, sebbene un declino motorio precoce sia stato qualitativamente associato a una ridotta sopravvivenza nel modello di amiloide-β presentato qui, una validazione più ampia su ulteriori genotipi, interventi o trattamenti farmacologici rafforzerebbe l'interpretazione della relazione tra prestazione motoria e risultati di sopravvivenza. I set di dati rappresentativi qui presentati hanno lo scopo di illustrare l'implementazione e l'interpretazione del flusso di lavoro, piuttosto che stabilire un modello predittivo generalizzato in diversi contesti patologici.

Nonostante questi limiti, questo protocollo fornisce un quadro riproducibile ed economico per collegare parametri funzionali di salute a esiti di sopravvivenza negli studi sull'invecchiamento. Il metodo è facilmente adattabile a manipolazioni genetiche, schemi di screening farmacologico e modelli di neurodegenerazione in cui il declino funzionale precede la mortalità. Integrando una quantificazione oggettiva della pendenza di arrampicata (pixel/s) con un'analisi standardizzata della sopravvivenza, questo approccio consente un fenotipaggio completo delle traiettorie di invecchiamento in Drosophila. Studi futuri che includano ulteriori genotipi neurodegenerativi, interventi farmacologici e set di dati comportamentali longitudinali potrebbero ulteriormente migliorare l'utilità del flusso di lavoro per l'analisi integrata del healthspan¹³^,¹⁴.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto con fondi della Scuola di Biotecnologie Amrita, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amritapuri.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	Himedia	GRM666	Agente solidificante
Acido benzoico	Himedia	GRM488	Conservante antimicrobico
Canton-S	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC #1	Strain di riferimento selvatico
Tubo per arrampicata	Prodotto su misura	N/D	Tubo cilindrico trasparente, altezza 12 cm × diametro 2 cm, in plastica trasparente o vetro
Farina di mais	Fornitore locale	N/D	Preparazione del cibo per Drosophila
Computer desktop/portatile	Qualsiasi produttore	Definito dall'utente	Sistema operativo con processore dual-core minimo, ≥8 GB di RAM, compatibile con Python 3.x
D-glucosio	Himedia	MB037	Componente del cibo per Drosophila
elav-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC #458	Promotore GAL4 pan-neuronale
Matplotlib	Libreria open source	Versione 3.5.2	Creazione di grafici e visualizzazione
NumPy	Libreria open source	Versione 1.26.4	Calcoli numerici
OpenCV	Libreria open source	Versione 4.9.0	Elaborazione video
Pandas	Libreria open source	Versione 2.2.0	Gestione dei dati
Acido propionico	Himedia	GRM3658	Conservante antifungino
Python	Python Software Foundation	Versione 3.12.1	Ambiente di analisi
Scikit-learn	Libreria open source	Versione 1.4.2	Analisi di regressione lineare
Telecamera dello smartphone / Fotocamera digitale	Qualsiasi produttore	Definito dall'utente	Registrazione minima a 30 fotogrammi/s, messa a fuoco stabile, posizionamento perpendicolare, risoluzione minima di 1280 × 720
Saccarosio	Himedia	GRM601	Componente del cibo per Drosophila
UAS-APP.Aβ.E693G	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC #33774	Modello della mutazione artica umana dell'APP
Lievito	Himedia	RM027	Integratore nutrizionale

Riferimenti

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Caligiore D, Giocondo F, Silvetti M. The Neurodegenerative Elderly Syndrome (NES) hypothesis: Alzheimer and Parkinson are two faces of the same disease. IBRO Neurosci Rep. 2022;13:330-43.
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