Valutazione della crescita non rilevabile basata sulla coltura e profilazione antiossidante dell'estratto fresco di gel di aloe vera

Sommario

Questo protocollo descrive la preparazione asettica di estratto fresco di gel interno di Aloe vera , la misurazione potenziometrica del pH, la valutazione della capacità antiossidante totale tramite un saggio colorimetrico automatizzato basato su ABTS, la valutazione della crescita non rilevabile basata su coltura in condizioni di incubazione definite e lo screening antimicrobico preliminare di una Aloe vera 70:30 (v/v).Miscela di prova /N-acetil-L-cisteina tramite diffusione su disco e diluizione qualitativa a doppio tubo in testa.

Abstract

L'aloe vera (Aloe barbadensis Miller) è ampiamente utilizzata nei prodotti di medicina topica e complementare. Tuttavia, i flussi di lavoro standardizzati di laboratorio per la valutazione simultanea della capacità antiossidante totale (TAC), del comportamento del pH, dello stato di crescita non rilevabile basato sulla coltura in condizioni definite e dello screening antimicrobico preliminare rimangono limitati. Estratto fresco di Aloe vera in gel interno è stato preparato asetticamente e formulato al 5%, 10%, 15% e 20% (a spesso). Il pH è stato misurato potenziometricamente e il TAC è stato determinato tramite un saggio colorimetrico automatizzato basato su cationi radicali ABTS. La valutazione di crescita non rilevabile basata sulla coltura è stata effettuata inoculando l'estratto su agar di sangue, agar blu di metilene eosina e agar destrosio Sabouraud, seguita da incubazione aerobica e ispezione visiva alle 24 ore, 48 e 72 ore. Lo screening antimicrobico di una miscela di prova 70:30 (v/v) Aloe vera/N-acetil-L-cisteina è stato eseguito contro ceppi di riferimento standard tramite diffusione su disco e saggi qualitativi di diluizione a doppio tubo. La TAC differiva significativamente tra i gruppi (Kruskal-Wallis, p = 0,014), con i valori più alti osservati nella formulazione al 20%. Non è stata osservata alcuna crescita batterica o fungina visibile nelle condizioni di coltura testata durante il periodo di osservazione di 72 ore. La miscela di prova Aloe vera/N-acetil-L-cisteina ha prodotto zone inibitorie che variano da 11 mm a 17 mm, con la zona più ampia osservata contro Pseudomonas aeruginosa. Questo flusso di lavoro offre un approccio pratico da laboratorio per la preparazione e la caratterizzazione preliminare dell'Aloe vera fresca.formulazioni basate su -per la ricerca in medicina complementare nelle prime fasi iniziali.

Introduzione

L'aloe vera ha continuato ad attirare notevole attenzione scientifica grazie al suo uso di lunga data nella medicina tradizionale e alla sua crescente rilevanza nella ricerca farmaceutica, biomedica, cosmetica e^{alimentare 1,2,3}. Questa pianta medicinale contiene una vasta gamma di costituenti biologicamente attivi, tra cui polisaccaridi, composti fenolici, antracinoni, vitamine, minerali, enzimi e altri metaboliti a basso peso molecolare che possono contribuire alle sue proprietà terapeutiche ^{e funzionali 1,2,3}. Tra questi componenti, l'acemannan è stato enfatizzato per il suo potenziale biomateriale e per i ruoli riportati nella riparazione dei tessuti, nell'immunomodulazione e nelle applicazioni^{rigenerative 4,5}. Parallelamente, i composti fenolici e altri composti attivi per antiossidanti sono stati associati agli effetti di recupero dei radicali liberi, protettivi e biologicamente supportivi dell'Aloe vera. Preparati ^2,3.

Negli ultimi anni si è registrato un crescente interesse per l'incorporazione dell'Aloe vera in sistemi di formulazione avanzati e materiali bioattivi. Idrogel a base di aloe vera, inchiostri biomateriali, nanocompositi e impalcature stampate tridimensionalmente sono stati studiati per applicazioni di guarigione e supporto tissutale grazie alla loro elevata capacità idratante, biocompatibilità e proprietà biologiche^{multifunzionali} 4,6,8,9,10,11. Studi sperimentali hanno dimostrato che materiali contenenti Aloe vera possono supportare la gestione della ferita contribuendo a un ambiente umido, migliorando le proprietà fisicochimiche della formulazione e fornendo supporto antiossidante o antimicrobico in condizioni selezionate in vitro, in vivo e dipendenti dalla^formulazione 4,7,8,9,10,11. Inoltre, l'Aloe vera è stata esplorata nelle applicazioni di conservazione e formulazione degli alimenti, dove i rivestimenti a base di gel e i sistemi correlati sono stati associati a una maggiore stabilità ossidativa, una migliore qualità sensoriale e una maggiore performance^{microbiologica 12,13}. Questi sviluppi indicano che l'Aloe vera è sempre più considerata non solo come un prodotto tradizionale a base di erbe, ma anche come un materiale naturale multifunzionale con ampio potenziale orientato alla^formulazione 2,3,12,13.

La rilevanza biologica dell'Aloe vera si estende anche ad applicazioni di orientamento antimicrobico e microbiologico. Studi recenti hanno descritto effetti inibitori di Aloe vera o preparati contenenti Aloe vera contro microrganismi clinicamente importanti, tra cui Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis, specie di Candida e isolati clinici isolati da infezioni delle^{ferite 14,15,16,17}. Precedenti evidenze in vitro hanno anche mostrato l'attività dell'Aloe vera in gel interno contro ceppi di riferimento e isolati clinici di Helicobacter ^{pylori 18}. Inoltre, sono stati segnalati sistemi ibridi contenenti Aloe vera come una combinazione di capacità antimicrobiche, antiossidanti e di guarigione, supportando ulteriormente la natura multifunzionale di questo materiale di origine^{vegetale 19}. Tuttavia, le prestazioni biologiche dell'Aloe vera sono influenzate da diverse variabili metodologiche, tra cui la frazione della pianta utilizzata, la procedura di estrazione, la concentrazione, le condizioni di manipolazione, la freschezza del gel e se la preparazione testata contiene solo gel interno o componenti associati al^{lattice 2,20}. Questi fattori sono particolarmente importanti perché le frazioni interne del gel e delle foglie esterne differiscono sia nella composizione che nel profilo^{tossicologico 20}.

Nonostante il crescente corpus di letteratura, persistono importanti lacune metodologiche. In molti studi pubblicati, il comportamento antiossidante, le proprietà fisicochimiche, la valutazione microbiologica e le prestazioni antimicrobiche sono spesso valutate separatamente piuttosto che all'interno di un unico flusso di lavoro integrato. Per la ricerca focalizzata sulla formulazione, tuttavia, questi parametri sono strettamente interrelazionati. Una preparazione può mostrare un'attività antiossidante favorevole ma richiedere comunque un'attenta valutazione microbiologica e caratterizzazione fisicochimica prima di poter essere considerata adatta a ulteriori sviluppi sperimentali. Pertanto, flussi di lavoro di laboratorio che combinano la valutazione correlata al redox, la valutazione del pH, i test di crescita no-detectable basati su colture in condizioni definite e lo screening antimicrobico preliminare possono fornire una base più pratica e informativa per la caratterizzazione in fase iniziale delle formulazioni fresche di Aloe vera .

Di conseguenza, questo studio ha mirato a valutare formulazioni fresche di estratti di Aloe vera in gel interno preparate a diverse concentrazioni in termini di caratteristiche del pH, capacità antiossidante totale, status di crescita non rilevabile basata su coltura in condizioni di laboratorio definite e screening antimicrobico preliminare tramite diffusione su disco e diluizione qualitativa a doppio tubo. Integrando queste valutazioni in un unico flusso di lavoro sperimentale, lo studio è stato progettato per fornire un approccio pratico di base per la caratterizzazione preliminare dell'Aloe vera.formulazioni basate su -destinate alla ricerca in medicina complementare.

Protocollo

1. Preparazione di Aloe vera. Serie di estratti e diluizioni

1. Raccogli le foglie mature di una pianta di aloe vera coltivata a temperatura ambiente e risciacquale accuratamente sotto acqua corrente per rimuovere eventuali residui.
2. In un armadietto di biosicurezza livello 2 (BSL-2), disinfettare la superficie delle foglie con etanolo al 70% usando guanti sterili. Dopo aver applicato il 70% di etanolo, lasciare asciugare completamente la superficie fogliare all'aria per almeno 2 minuti prima dell'incisione asettica.
3. Utilizzando un bisturi sterile, rimuovere la punta distale e i margini della foglia, lasciare che l'essudato giallo in lattice dreni completamente per circa 30 minuti, poi sfiletta la foglia longitudinalmente. Separare con cura e raccogliere solo il gel interno trasparente, evitando la crosta esterna e lo strato residuo di lattice.
4. Trasferire con attenzione il gel interno di Aloe vera in un contenitore sterile e omogeneizzare tramite vortice intermittente per circa 5-10 minuti a circa 2.500 giri/ min (o impostazione equivalente di vortice medio-alto); eseguire la procedura a temperatura ambiente a meno che non sia necessario un controllo della temperatura per lo strumento specifico.
5. In condizioni asettiche, preparare formulazioni fresche di estratti di Aloe vera in gel interno al 5%, 10%, 15% e 20% (w/v) utilizzando acqua distillata sterile; ad esempio, preparare il 5% (p/v) come gel da 5 g portato a un volume finale di 100 mL, e regolare le restanti concentrazioni in modo analogo.

2. Misurazione del pH

1. Eseguire la calibrazione a tre punti di misuratori di pH utilizzando soluzioni tampone standard pH 4.01, 7.00 e 10.01 con tracciabilità NIST prima di ogni serie di misurazioni.
2. Misurare il pH per ogni concentrazione a temperatura ambiente (20–25 °C); registra almeno tre repliche tecniche per concentrazione.

3. Misurazione della capacità totale di antiossidanti (TAC)

1. Utilizzare le formulazioni di estratto di Aloe vera preparate nello Step 1 (5%, 10%, 15% e 20%) per la misurazione del TAC.
2. Portate tutti i reagenti e i campioni alla temperatura ambiente (20–25 °C) prima dell'analisi per garantire la coerenza analitica.
3. Calibrare l'analizzatore biochimico automatizzato (Rel Assay, Turchia) secondo le procedure operative standard del produttore prima di iniziare il saggio.
4. Caricare i reagenti della capacità antiossidante totale (TAC) basati sul metodo Erel nei compartimenti dei reagenti dell'analizzatore.
5. Pipetta l'Aloe vera. Estrai i campioni nelle tazze o pozzi di reazione appropriati utilizzando micropipette calibrate. (Volume campione: 5 μL)
6. Avviare l'esecuzione del saggio TAC utilizzando il protocollo programmato dall'analizzatore per il metodo basato su cationi radicali ABTS, seguendo i volumi del reagente e le impostazioni di incubazione specificate dal produttore.
7. Lascia che la reazione proceda automaticamente, durante la quale gli antiossidanti presenti nel campione riducono il catione radicale ABTS colorato, causando una diminuzione dell'assorbenza.
8. Misurare la variazione di assorbanza spettrofotometricamente alla lunghezza d'onda specificata definita dal metodo TAC. (Lunghezza d'onda: 660 nm)
9. Calcola i valori totali della capacità antiossidante utilizzando il software dell'analizzatore confrontando le variazioni di assorbenza del campione con la curva di calibrazione equivalente a Trolox.
10. Esprime i risultati TAC come equivalenti MMOL Trolox / L per unità di volume estratto.
11. Eseguire tutte le misurazioni in duplicato per garantire l'affidabilità analitica.

4. Valutazione basata sulla coltura e senza crescita rilevabile di Aloe vera. Gel interno

1. Inoculare 10 μL di ogni estratto su agar di sangue, agar blu di metilene eosina e agar di destrosio Sabouraud utilizzando un anello calibrato (10 μL) (metodo di conteggio delle colonie).
2. Per una valutazione della crescita non rilevabile basata su coltura, si somministra asepticamente un'aliquota standardizzata di 50 μL utilizzando una micropipetta calibrata su lagar nel sangue, agaro blu di metilene eosina e destrosio Sabouraud e sparpagla delicatamente utilizzando un anello sterile usa e getta (10 μL) (valutazione della riproduzione basata su coltura con il metodo della goccia diretta).
3. Incubare le placche di agar sanguigno e di azar blu di metilene eosina aerobicamente a 37 °C e placche di destrosio di Sabouraud aerobicamente a 25–28 °C, poi ispezionare visivamente le placche per la crescita a 24, 48 e 72 ore. Incubare una piastra non inoculata di ciascun mezzo in parallelo come controllo negativo.

5. Valutazione dell'attività antimicrobica della miscela di test di Aloe vera

1. In condizioni sterili, preparare una soluzione omogenea mescolando estratto di gel interno di Aloe vera sterile al 70% con soluzione al 30% di N-acetil-L-cisteina (10% w/v in acqua sterile).
   NOTA: Questa miscela riduce l'alta viscosità del gel raschiato dalla foglia e ottiene una consistenza più fluida. Considera questa formulazione composita come miscela preliminare per lo screening preliminare. Pertanto, interpreta i risultati antimicrobici in modo che riflettano l'attività combinata di entrambi i componenti.
2. Vortice la miscela omogeneizzata a fondo fino a ottenere una soluzione uniforme.
3. Subcoltura le scorte batteriche standard precedentemente criopreservate di Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ed Escherichia coli. ATCC 25922, conservato a -80 °C, su agar ematico standard (per batteri Gram-positivi) e agar standard di eosina metilene blu (per batteri Gram-negativi), e incubato a 37 °C per 18-24 ore.
4. Al termine dell'incubazione, preparare sospensioni batteriche regolate a 0,5 di torbidità McFarland utilizzando soluzione salina sterile proveniente dalle colonie coltivate, seguendo le raccomandazioni standard di preparazione dell'inoculo per il test di suscettibilità agli^{antimicrobici 38}.
5. Inoculare uniformmente le placche di agar Mueller-Hinton con ogni sospensione batterica standardizzata utilizzando un tampone sterile.
6. Applicare un volume standardizzato di 15 μL della miscela sterile di Aloe vera/NAC su ciascun disco antimicrobico sterile da 6 mm utilizzando una micropipetta calibrata. Lo stesso volume di caricamento, tempo di assorbimento (almeno 2 min) e tempo di asciugatura all'aria (circa 5 min) sono stati applicati a tutti i dischi tra repliche per garantire la coerenza procedurale. Questo volume è stato scelto come quantità pratica di carico per dischi da 6 mm nello screening a diffusione a base di estratto vegetale ed è stato mantenuto costante per tutti gli esperimenti.
7. Posizionare i dischi impregnati con estratto sulla superficie delle piastre agar inoculate usando una pinza sterile.
8. Incubare le placche a 37 °C per 18–24 ore in condizioni aerobiche.
9. Dopo l'incubazione, si misura manualmente il diametro di ogni zona inibitoria, incluso il diametro del disco, fino al millimetro più vicino usando un righello. Eseguire l'esperimento come una singola misura descrittiva, riportando i diametri delle zone registrati come valori osservati individualmente. Effettuare misurazioni ispezionando visivamente le lastre secondo le raccomandazioni standard di lettura per la diffusione del^{disco 38}.
10. Prepara diluizioni seriali doppie (1/2, 1/4, 1/8 e 1/16) della miscela di prova 70:30 (v/v) Aloe vera/NAC nel brodo Mueller-Hinton.
11. Inoculare ogni tubo con 500 μL della corrispondente sospensione batterica standardizzata McFarland da 0,5 preparata in soluzione salina sterile. Prepara una serie di diluizione separata per ogni ceppo di riferimento e incuba i tubi inoculati nelle condizioni specificate di seguito.
12. Incubare i tubi inoculati a 37 °C per 18–24 ore.
13. Valutare visivamente la crescita microbica in base alla torbidità rispetto al brodo controllato; interpretare il saggio in modo qualitativo piuttosto che come una determinazione formale della MIC.
14. Usa un disco di ciprofloxacina (5 μg) come controllo positivo in parallelo con dischi impregnati di aloe vera/NAC. Applicare lo stesso disco di controllo positivo per Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Escherichia coli ATCC 25922 per confermare la suscettibilità in condizioni di diffusione del disco.
    NOTA: Eseguire tutte le procedure microbiologiche in condizioni BSL-2 e registrare immediatamente dopo l'incubazione tutte le osservazioni del diametro delle zone e della torbidità per l'analisi descrittiva successiva. Questo protocollo combina la preparazione asetttica di A. vera.estratto con saghi biochimici e microbiologici complementari per supportare lo sviluppo di formulazioni di origine vegetale per uso in medicina topica e complementare. Il flusso di lavoro è progettato per essere pratico nei laboratori di routine: lo screening pH e redox (TAC) può essere eseguito insieme alla coltura di sterilità e a due saggi antimicrobici comunemente utilizzati (diffusione su disco e diluizione a tubetto).

Risultati

valori di pH dell'estratto di Aloe Vera a diverse concentrazioni

Il profilo pH mostrava un pattern non monotono tra le concentrazioni. I valori medi del pH erano 6,47, 6,60, 6,26 e 6,28 per le formulazioni al 5%, 10%, 15% e 20%. Le differenze complessive tra i gruppi erano significative (p = 0,024). Le formulazioni al 5% e al 10% hanno mostrato valori di pH relativamente più alti, mentre quelle al 15% e al 20% si raggruppavano a valor...

Discussione

Il presente studio offre un flusso di lavoro integrato di laboratorio per la caratterizzazione preliminare delle formulazioni fresche di estratti di Aloe vera in gel interno, combinando misurazione del pH, analisi della capacità totale di antiossidanti (TAC), valutazione della crescita non rilevabile basata su coltura e screening antimicrobico descrittivo. Concentrazioni crescenti di Aloe vera fresca in gel interno erano associate a valori TAC più elevati, mentre non è ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(-)80 C Deep Freezer	Thermofisher/USA	Conservazione campioni	TSX40086A
Vortex	Thermofisher/USA	Preparazione campioni	88882010
Blood Agar	RTA/Turkey	Inoculazione coltura	2001
Eosine Methilene Blue Agar	RTA/Turkey	Inoculazione coltura	2010
SDA Agar	RTA/Turkey	Inoculazione coltura	2036
Müller Hinton Agar	RTA/Turkey	Inoculazione coltura	2022
Müller Hinton Broth	RTA/Turkey	Diluzione coltura	1018
Pipette	Thermofisher/USA	Preparazione campioni	4642090N
Hanna pH Meters	Hitachi/JAPAN	Analisi campioni	HI2211-02
Rel Assay Plate Reader	Rel Assay(Turkey)	Analisi TAC campioni	M201 (Smart Model)
TAC Kits	Rel Assay(Turkey)	Kit	RL0017