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Articolo metodologico

Trapianto cardiaco eterotopico cervicale usando la tecnica dell'anastomosi end-to-side per studiare l'immunologia del trapianto

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DOI:

10.3791/70704

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3 luglio 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education; NHC Key Laboratory of Organ Transplantation; Key Laboratory of Organ Transplantation, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Division of Hepato-Pancreato-Biliary Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, 4Department of Clinical Medicine, Bengbu Medical College

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta una tecnica semplificata di anastomosi per suture end-to-side per il trapianto di cuore cervicale murino, fornendo un modello robusto e riproducibile per lo studio dell'immunologia dei trapianti.

Abstract

Il trapianto di cuore eterotopico murino è un modello preclinico fondamentale nella ricerca sui trapianti. Il trapianto di cuore eterotopico cervicale nei topi offre vantaggi distinti, tra cui un monitoraggio visivo e palpabile diretto della vitalità del trapianto, una riduzione del trauma chirurgico e un recupero post-operatorio più rapido. È quindi diventata una piattaforma sempre più preziosa per lo studio dell'immunologia del trapianto, particolarmente preziosa per animali con condizioni fisiologiche precarie dovute a modifiche genetiche o induzione di farmaci, e per esperimenti che richiedono trapianto secondario o combinato di organi, la regione cervicale spesso diventa l'unico sito fattibile. Le tecniche convenzionali di trapianto cervicale, sia che utilizzino suture end-to-end sia metodi basati su cuffia, richiedono una legatura permanente dell'arteria carotide comune e della vena giugulare esterna del ricevente, il che può compromettere la perfusione cerebrale e introdurre materiali estranei o disturbi emodinamici. Per affrontare questi limiti, questo articolo descrive una tecnica raffinata di trapianto di cuore cervicale che utilizza un'anastomosi vascolare laterale. Il metodo preserva l'arteria carotide comune e la vena giugulare esterna del ricevente, mantenendo una perfusione cerebrale normale ed evitando complicazioni associate alla legatura permanente dei vasi. Questo protocollo dettaglia i passaggi dal prelievo del cuore con donatore all'anastomosi ricevente e alle cure post-operatorie. I risultati rappresentativi dimostrano un alto tasso di successo chirurgico (96,7%) e l'efficacia del modello nello studio del rigetto di allotrapi. Questa tecnica offre un modello fisiologicamente rilevante e tecnicamente accessibile per i ricercatori dell'immunologia del trapianto.

Introduzione

Negli ultimi cinquant'anni, l'immunologia dei trapianti è rimasta un punto centrale per immunologi e specialisti in trapianti. Oggi, il trapianto di organi solidi è ampiamente eseguito e rappresenta il trattamento più efficace per le malattie terminali degli organi. Tuttavia, il rigetto del trapianto non è stato risolto fondamentalmente e rappresenta ancora uno dei principali ostacoli nel trapianto e una delle principali cause di perdita deltrapianto 1. Di conseguenza, superare o mitigare il rifiuto riducendo o evitando l'immunosoppressione sistemica rimane una sfida significativa e un obiettivo chiave di ricerca nel settore.

I modelli di trapianto di organi animali vascolarizati, in particolare quelli murini, hanno svolto un ruolo cruciale nell'avanzamento dell'immunologia del trapianto e hanno fornito una base scientifica essenziale per la traduzioneclinica 2. Ad esempio, molti agenti immunosoppressivi usati clinicamente oggi — come ciclosporina, tacrolimus e rapamicina — sono stati validati con successo per la prima volta in modelli di trapiantotopino 3,4.

Il modello di trapianto di cuore eterotopico (HT) per murini è uno dei modelli preclinici più utilizzati, favorito per l'abbondanza di ceppi genetici disponibili e reagenti per la ricerca, oltre che per la sua procedura relativamente semplice e il semplice monitoraggio post-operatorio. In quanto tale, rappresenta una piattaforma chiave per studiare i meccanismi di rigetto acuto, inducere la tolleranza immunitaria e valutare nuovi immunosoppressori in vivo 5,6.

Il primo modello HT eterotopico murino fu stabilito da Corry et al.7 nel 1973. In questo modello, il cuore donatore viene posizionato nella cavità addominale del ricevente, con l'aorta del trapianto e l'arteria polmonare (PA) anastomizzate da un lato all'aorta addominale e alla vena cava inferiore (IVC) del ricevente, rispettivamente. Questo metodo rimase la tecnica standard per l'HT addominale per decenni. Spinto dalla necessità di accogliere allografti di terze parti negli studi sulle tolleranza, è stato esplorato un secondo sito per HT. Ciò ha portato allo sviluppo di modelli di HT cervicale nei topi, che offrono altri vantaggi come la valutazione visiva diretta della vitalità dell'innesto, minore trauma chirurgico e minore rischio di infezione postoperatoria 5,8,9. Nel 1991, Chen et al.8 descrissero per la prima volta un modello di HT eterotopico cervicale nei topi, che prevedeva l'anastomosi di sutura manuale end-to-end dell'aorta donatrice e PA rispettivamente all'arteria carotide comune (CCA) e alla vena giugulare esterna (EJV) del ricevente. Tuttavia, questo modello non ha ottenuto un'ampia adozione a causa della significativa sfida tecnica posta dalla grave discrepanza tra l'aorta donatrice e la CCA ricevente, che ha reso estremamente difficile l'anastomosi vascolare.

Sempre nel 1991, Matsuura et al.9 introdussero una tecnica senza cuffia per l'anastomosi vascolare nel modello HT cervicale. Questo metodo semplifica la procedura eliminando la sutura manuale tecnicamente impegnativa, rendendola più facile da padroneggiare. Successivamente, sono stati segnalati numerosi miglioramenti tecnici alla tecnicadel bracciale 10,11. Attualmente, il metodo del manciale è ampiamente utilizzato nell'HT cervicale, in particolare da ricercatori senza esperienza pregressa nella sutura microvascolare. Tuttavia, la tecnica del bracciale introduce materiali artificiali, che possono indurre infiammazione locale e interferire con le valutazioni immunologiche, ponendo anche sfide tecniche nei vasi di piccolocalibro 5,6. Recentemente, Liao et al.12 hanno proposto una tecnica a manica senza polsetti nella TH cervicale, in cui i vasi donatori e riceventi vengono anastomizzati direttamente con il metodo della manica. Evitando materiali artificiali e accogliendo piccoli vasi, questo approccio offre una piattaforma fisiologica e riproducibile per il trapianto secondario di cuore.

Tuttavia, sia le tecniche di sutura end-to-end che quelle senza cuffia richiedono una legatura permanente del CCA e EJV unilaterali del destinatario. Questo compromette l'apporto unilaterale di sangue cerebrale al sistema nervoso centrale, il che può portare a complicazioni neurologiche, come il disturbo direzionale e l'emiplegia 13,14,15. Inoltre, questi approcci end-to-end possono portare a alterazioni dell'emodinamica, come i getti arteriosi ad alta velocità, e comportano un rischio maggiore di trombosi e stenosi, che sono dannose per la sopravvivenza a lungo termine dell'innesto. Inoltre, la tecnica del manciale comporta anche un rischio intrinseco di trombosi dovuto alla presenza del braccino.

Per affrontare queste limitazioni, abbiamo adottato una tecnica di sutura manuale avanzata e raffinata in cui l'aorta ascendente e la PA del donatore vengono anastomizzate rispettivamente alla CCA e all'EJV del ricevente. Questo metodo preserva l'integrità e la continuità dei principali vasi cervicali del ricevente, mantenendo così una normale perfusione cerebrale e aderendo al principio delle 3R (Sostituzione, Riduzione e Raffinamento) della ricerca sugli animali. Utilizzando questa tecnica, abbiamo raggiunto un tasso di successo chirurgico di circa il 96,7% (29/30, con una sola mortalità dovuta a emorragia). Non sono state osservate complicazioni cerebrali correlate all'ischemia in nessun topo ricevente dopo l'intervento. Questo metodo assomiglia molto ai modelli addominali standard ed è particolarmente adatto ai chirurghi con esperienza nella sutura vascolare per stabilire modelli di HT cervicali.

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Protocollo

La cura degli animali ha rispettato le linee guida internazionali e tutte le procedure sono state condotte presso l'Istituto di Trapianto d'Organi, Ospedale Tongji, Facoltà Medica Tongji, Università di Scienza e Tecnologia Huazhong, Cina. L'approvazione etica per lo studio è stata ottenuta dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale Tongji (Numero di approvazione: TJH-202310010). Gli strumenti appropriati utilizzati per lo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione preoperatoria

  1. Sterilizza la sala operatoria con una lampada ultravioletta per 30 minuti. Disinfetta il tavolo operatorio con etanolo al 70% e autoclave di tutti gli strumenti chirurgici (121 °C per 20 minuti).
  2. Utilizzare maschi adulti C57BL/6 e topi BALB/c (dal peso 20–25 g; 8–10 settimane). Per il trapianto sintegeno, si utilizzano topi C57BL/6 sia come donatori che come riceventi. Per il trapianto allogenico, si utilizzano topi BALB/c come donatori e topi C57BL/6 come riceventi.
  3. Somministrare analgesia preoperatoria al topo ricevente tramite iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg/kg) 1 ora prima dell'intervento.
    NOTA: L'analgesia preoperatoria non viene eseguita sul topo donatore, poiché il donatore viene soppresso immediatamente dopo la procedura di prelievo cardiaco.
  4. Prepara la soluzione anestetica contenente ketamina (20 mg/mL) e xilazina (2 mg/mL). Anestetizzare il topo con anestesia ketamina preparata tramite iniezione intraperitoneale con un volume dosale di 5 μL/g. Confermare l'efficacia dell'anestesia osservando la respirazione lenta e regolare, la perdita del riflesso di raddrizzamento e l'assenza del riflesso del piede.
  5. Rasi il pelo dalle zone toracica e addominale. Fissa il mouse in posizione supina su una borsa riscaldante per mantenere la temperatura corporea. Disinfettare il sito chirurgico alternando povidone-iodio ed etanolo al 70% per tre cicli. Allunga il collo del destinatario ritraendo gli incisivi superiori verso l'alto con un filo di seta 6-0 per ottimizzare l'esposizione.
  6. Indossa guanti chirurgici sterili. Realizzare un'apertura ovale leggermente più grande del sito dell'incisione su un drappo sterile. Poi usalo per coprire il topo destinatario.

2. Prelievo di cuore da donatore

  1. Effettuare un'incisione addominale nella linea mediana seguita da un'incisione trasversa (crociforme) per esporre completamente la cavità peritoneale.
  2. Ritrai delicatamente l'intestino tenue verso sinistra usando un cotton fioc sterile umido con soluzione salina per esporre l'aorta addominale e la VCI.
  3. Iniettare 0,3 mL di soluzione fisiologica eparinizzata (300 IU/mL) nella VCI e attendere 1 minuto per l'eparinizzazione sistemica. Trasetta l'aorta addominale e la IVC per dissanguinare il donatore.
  4. Incisci il diaframma insieme alla parete toracica anteriore per realizzare un'incisione a forma di U attraverso la gabbia toracica usando forbici per esporre la cavità toracica.
  5. Iniettare 2 mL di soluzione salina fredda (4 °C) nel cuore attraverso la IVC intratoracica per eliminare il sangue residuo.
    NOTA: Lo scopo principale di questo passaggio è indurre l'ipotermia e far smettere rapidamente il battito cardiaco. Il secondo scopo è eliminare completamente il sangue dal cuore, specialmente dalle arterie coronarie.
  6. Copri il cuore con un pezzo di garza sterile immerso in soluzione salina fredda (4 °C). Una lieve trazione verso il basso su questa garza facilita l'esposizione ottimale dell'aorta e della PA. Inoltre, la garza imbevuta di soluzione salina fredda serve a mantenere l'ipotermia dell'innesto durante la successiva dissezione.
  7. Identificare e isolare la VCI intratoracica. Legalo usando una sutura di seta 6-0 e trasetta distale alla legatura con microforbici.
  8. Identifica e rimuovi il timo per esporre l'arco aortico e la PA. Identificare e isolare la vena cava superiore. Legalo usando una sutura di seta 6-0. Trancettalo distalmente rispetto alla legatura.
  9. Identificare e isolare l'aorta ascendente. Trasetta l'aorta prossimale all'arteria innominata per massimizzare la lunghezza del vaso.
  10. Identifica e isola il PA. Trancettalo appena prossimale alla sua biforcazione. Legare tutti i vasi posteriori al cuore (le vene polmonari) con una seta 6-0. Taglia con cura il cuore con delle microforbici.
  11. Muovi delicatamente il cuore e immergilo in soluzione salina fredda (4 °C) posta sul ghiaccio per la conservazione fino al trapianto.

3. Operazione destinataria

  1. Isolamento del recipiente destinatario
    1. Effettuare un'incisione longitudinale di 1 cm sul lato destro del collo, che si estende dal bordo superiore del punto medio della clavicola destra al bordo inferiore della mandibola.
    2. Estrazione del lobo destro della ghiandola submandibolare. Trancetto il muscolo esternocleidomastoideo destro per creare una tasca sufficiente per l'impianto di cuore da donatore.
    3. Identifica e isola l'EJV giusto e il CCA giusto. Mobilita l'EJV cauterizzando i suoi rami. Poi, isola il CCA dai tessuti circostanti. Evitare di danneggiare il nervo vago accompagnato durante la dissezione della CCA.
  2. Anastomosi arteriola
    1. Simultaneamente occluse EJV e CCA usando due pinze microvascolari, con una pinza applicata alle estremità craniche di entrambi i vasi e l'altra alle estremità caudali. Applica prima la pinza cranica, seguita dalla pinza caudale.
      NOTA: Le pinze microvascolari sono preferibilmente introdotte dal lato destro del mouse verso sinistra, con le manette delle pinze posizionate sul lato destro. Questa orientazione facilita la successiva anastomosi vascolare e aiuta a ridurre la compressione della trachea.
    2. Ruota il mouse di 90° in senso orario. Effettua un'incisione longitudinale sulla CCA, assicurandoti che la lunghezza corrisponda al diametro dell'aorta ascendente del donatore. Risciacqua il lumen con soluzione salina eparinizzata per rimuovere completamente eventuali coaguli residui.
    3. Per creare la finestra anastomotica, si utilizza una sutura 11-0. Fai passare l'ago attraverso la parete del vaso a una distanza approssimativamente pari al diametro del vaso donatore, solleva delicatamente la parete del vaso con la sutura e poi estrai una piccola porzione con microforbici.
    4. Posiziona il cuore donatore nella tasca cervicale. Ancorare l'aorta ascendente del donatore al CCA ricevente posizionando due suture 11-0 con aghi alle estremità prossimale e distale. Posiziona il cuore donatore sul lato destro del ricevente e coprilo con una garza sterile umida.
    5. Utilizzando la sutura distale, esegui una sutura continua sulle pareti posteriori in direzione distale-prossimale con 6–8 punti.
    6. Dopo aver completato la sutura della parete posteriore, ruota il topo di 180°. Rifletti il cuore donatore verso sinistra del ricevente e coprilo con garza sterile umida. Completare l'anastomosi suturando le pareti dei vasi anteriori in direzione prossimale-distale con 6–8 punti. Risciacqua il lumen con soluzione salina prima di fare il nodo finale per rimuovere le bolle d'aria.
  3. Anastomosi venosa
    1. Fai un'incisione longitudinale sull'EJV, corrispondendo al diametro del PA donatore. Risciacqua il lumen con soluzione salina eparinizzata per rimuovere completamente eventuali coaguli residui.
    2. Ancorare il PA del donatore all'EJV ricevente posizionando due suture 11-0 con aghi alle estremità prossimale e distale.
    3. Utilizzando la sutura prossimale, sutura continuamente le pareti posteriori in direzione prossimale-distale con 5–7 punti.
    4. Continuare con la stessa sutura per chiudere le pareti anteriori dall'esterno in direzione distal-prossimale con 5–7 punti. Lega la sutura all'apice prossimale. Risciacqua il lumen con soluzione salina prima di fare il nodo finale per rimuovere le bolle d'aria.
  4. Reperfusion
    1. Rilascia prima la pinza distale, seguita dalla pinza prossimale, per iniziare la riperfusione. Al momento della reperfusione, l'innesto cardiaco dovrebbe immediatamente diventare rosso. Il ritmo normale e la contrazione di solito si riprendono entro 1–2 minuti.
    2. Una volta confermata l'emostasi, posizionare con cura l'innesto cardiaco all'interno della tasca sottocutanea, assicurandosi che non vi sia torsione dei vasi. Chiudi l'incisione cutanea con punti 5-0.
  5. Assistenza postoperatoria
    1. Metti il topo in una gabbia pulita e mettilo in un incubatore per neonati impostato a 34 °C per facilitare il recupero. Monitorare il topo ogni 1–2 ore finché non si risveglia spontaneamente, poi riportarlo nella gabbia di alloggio.
      NOTA: Il riscaldamento è necessario per prevenire la depressione respiratoria indotta dall'ipotermia e per facilitare il recupero dall'anestesia.
    2. Somministrare analgesia post-operatoria tramite iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg/kg) ogni 12 ore per le prime 48 ore dopo l'intervento.
    3. Monitorare quotidianamente le pulsazioni dell'innesto cardiaco e registrare lo stato di sopravvivenza dell'innesto.

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Risultati

Trenta casi furono eseguiti utilizzando questo modello modificato; Il tasso di successo delle operazioni è stato del 96,7% (29/30). Si è verificata una sola mortalità dovuta a emorragia intraoperatoria. I restanti 29 casi sono stati inclusi per l'analisi dei tempi operatori e degli esiti del trapianto. Non sono state osservate complicazioni cerebrali correlate all'ischemia in nessun ricevente dopo l'intervento. Il prelievo del cuore con donatore è stato completato in 6,4 ± 0,7 min, mentr...

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Discussione

Il modello HT cervicale che utilizza la tecnica dell'anastomosi end-to-side offre diversi vantaggi. Rispetto alla sutura end-to-end o al metodo del braccino, questo approccio preserva completamente la continuità di CCA ed EJV, mantenendo così un'emodinamica cerebrale normale ed evitando efficacemente complicanze legate all'ischemia cerebrale. L'anastomosi end-to-side evita anche difficoltà tecniche causate da una discrepanza nei diametri dei vasi donatori e riceventi. Rispetto all'HT add...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81700571).

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Materiali

```html
Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1mL SyringBecton Dickinson Medical Devices Co., LtdB309628
11-0 sutures with needlesJinhuan Medical Products Co., Ltd.H1101Per l'anastomosi vascolare
3mL SyringBecton Dickinson Medical Devices Co., LtdB309657
5-0 sutures with needlesJinhuan Medical Products Co., Ltd.CR537Per chiusura cutanea
6-0 silk sutureJinhuan Medical Products Co., Ltd.2650182
Blood Stop CauteryNingbo Shunye Medical Co., Ltd.BDD-YE-DT-1
BuprenorphineTianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Co., LtdH12020275Analgesico
Cotton swabsFuqing Health & Integral Medical20230R
Curved micro forcepsRWD life Science Co.F11031-11Strumento chirurgico
Curved micro scissors66 Vision Tech Co., Ltd.54108BStrumento chirurgico
Gauze swabsYubei Medical Materials Co., LTD21080274
Heparin sodium injectionNorth China Pharmaceutical Co., LTD2101131-2
Micro needle holderWorld Precision Instruments Co., Ltd.555408NTStrumento chirurgico
Micro vessel clipRoboz Surgical Instrument CoRS-5481T
Micro Vessel clip applicatorRoboz Surgical Instrument CoRS-5480
Needle holderRWD life Science Co.F31025-13Chiusura addominale
SalineZhejiang Tianrui Pharmaceutical Co.,Ltd716092103
Straight micro forcepsRWD life Science Co.F11029-11Strumento chirurgico
Surgical microscopeLeicaM650
Surgical platformPersonalizzato, magnetico
Tissue forcepsRWD life Science Co.F12002-12Strumento chirurgico
Tissue scissorRWD life Science Co.S12003-09Strumento chirurgico
```

Riferimenti

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