Capsule Sophora flavescens a cinque gusti rivestite da Endry alleviano i cambiamenti legati alla colite sperimentale e alla ferroptosi

Sommario

In un modello murino di colite ulcerosa, capsule Sophora flavescens con rivestimento enterico a cinque gusti hanno alleviato il danno colonico e migliorato lo stress ossidativo, lo squilibrio infiammatorio delle citochine, la segnalazione JAK2/STAT3 e le variazioni dei marcatori correlati alla ferroptosi.

Abstract

La colite ulcerosa rimane difficile da gestire perché le opzioni terapeutiche efficaci e mirate sono limitate, e lo stress ossidativo, la segnalazione infiammatoria e le vie regolate della morte cellulare possono contribuire a danni mucosi. Questo studio ha valutato se le capsule rivestite enteriche (FSEC) a cinque gusti di Sophora flavescens alleviano la colite sperimentale ed ha esplorato i cambiamenti associati nello stress ossidativo, nell'infiammazione e nei marcatori della ferroptosi. Un modello murino di colite ulcerosa è stato stabilito utilizzando l'esposizione ciclica al 2,5% di dextrano solfato di sodio, combinata con la sfida alfa del fattore di necrosi tumorale. I topi sono stati trattati con FSEC a bassa, media o alta dose oppure con l'antagonista TLR4 CRX-526 come intervento di controllo positivo. L'istopatologia del colon è stata valutata tramite colorazione di ematossilina ed eosina. I livelli di superossido sirico dismutasi, catalasi, glutatione, mieloperossidasi e Fe²⁺ sono stati misurati tramite saghi biochimici. Le citochine del tessuto colonico sono state quantificate tramite immunosorbente legato a enzimi, l'espressione di JAK2 e STAT3 è stata valutata tramite immunoistochimica, mentre l'espressione di GPX4, FTH1 e ACSL4 è stata analizzata tramite western blotting. Il trattamento con FSEC ridusse la lesione della mucosa colonica e l'infiltrazione delle cellule infiammatorie, aumentò gli indici antiossidanti e ridusse i livelli di mieloperossidasi. La FSEC ha inoltre ridotto i livelli di TNF-α e IL-1α, ha parzialmente ripristinato i livelli di IL-13 ed è stata associata a una debolezza della colorazione immuno-colorante di JAK2 e STAT3. Parallelamente, FSEC ha migliorato i cambiamenti dei marcatori correlati alla ferroptosi, inclusi livelli ridotti di Fe²⁺ e ACSL4 e un aumento dell'espressione di GPX4 e FTH1. Questi risultati suggeriscono che la FSEC allevia la colite ulcerosa sperimentale nei topi, almeno in parte migliorando lo stato di stress ossidativo, moderando la segnalazione infiammatoria e ripristinando i profili marcatori correlati alla ferroptosi.

Introduzione

La colite ulcerosa (UC) è un disturbo infiammatorio cronico che colpisce principalmente la mucosa colonica e rettale ed è caratterizzato da episodi ricorrenti di infiammazione mucosa, ulcerazioni e compromisso della funzione^{barriera 1,2,3}. Sebbene la suscettibilità genetica, i fattori ambientali, la disfunzione della barriera epiteliale e la disregolazione immunitaria siano stati implicati nella patogenesi della CU, i meccanismi alla base della lesione mucosa persistente rimangono incompletamente compresi. I trattamenti farmacologici attuali, tra cui aminosalicilati, corticosteroidi, immunosoppressori e agenti biologici, possono ridurre l'attività della malattia in molti pazienti; tuttavia, il loro uso clinico può essere limitato da ricadute dopo l'interruzione del trattamento, effetti avversi, elevati costi e risposte terapeutiche^{incomplete 3}.

La ferroptosi, una forma di morte cellulare regolata dipendente dal ferro caratterizzata da perossidazione lipidica e metabolismo alterato del ferro, è stata sempre più implicata nell'infiammazione intestinale e nella lesione epiteliale associata^{alla CU} 4,5,6,7,8. Parallelamente, le formulazioni di medicina tradizionale cinese hanno attirato una crescente attenzione come approcci complementari per il trattamento della colite ulcerale grazie al loro potenziale terapeutico^{multi-bersaglio 9}.

Le capsule Sophora flavescens enterica-coated (FSEC) a cinque gusti sono utilizzate clinicamente per il trattamento della colite ulcerosa attiva lieve a moderata nella medicina tradizionale cinese. Studi precedenti suggeriscono che la FSEC possa migliorare i sintomi della colite ulcerosa attraverso meccanismi multi-componente e^{multi-bersaglio 10}. Tuttavia, gli effetti della FSEC sullo stress ossidativo, sulla segnalazione infiammatoria, sull'attività JAK2/STAT3 e sui cambiamenti correlati alla ferroptosi nella UC sperimentale rimangono insufficientemente caratterizzati.

Lo stress ossidativo e la segnalazione infiammatoria sono importanti contributi al danno della mucosa intestinale nella CU. Una produzione eccessiva di specie reattive di ossigeno può compromettere l'integrità epiteliale, favorire l'infiltrazione delle cellule infiammatorie e compromettere i sistemi di difesa antiossidanti. Le vie mediate dalle citochine come la segnalazione JAK2/STAT3 contribuiscono all'amplificazione infiammatoria e al danno^tissutale 11,12,13,14,15. Inoltre, lo stress ossidativo e la ferroptosi sono strettamente collegati attraverso alterazioni nelle difese antiossidanti, nel metabolismo del ferro e nella perossidazione^lipidica 16,17,18,19,20. Pertanto, la valutazione simultanea degli indici di stress ossidativo, delle citochine infiammatorie, della segnalazione JAK2/STAT3 e dei marcatori correlati alla ferroptosi può fornire una comprensione più completa del danno mucoso e delle risposte terapeutiche nella UC sperimentale.

Nel presente studio, è stato utilizzato un modello murino ciclo-sfidato di dextrano solfato di sodio e fattore di necrosi tumorale alpha-challenged per valutare gli effetti delle FSET a dosi basse, medie e elevate. Un punto di forza metodologico chiave di questo disegno è l'integrazione della valutazione istopatologica con le misurazioni degli indici di stress ossidativo sierico, citochine del tessuto del colon, immunoistochimica JAK2/STAT3 e analisi western blot delle proteine correlate alla ferroptosi all'interno di un unico quadro sperimentale. Questo approccio è stato utilizzato per determinare se la FSEC allevia la cucurete ulcerosa sperimentale e per caratterizzare i cambiamenti associati nello stress ossidativo, nella segnalazione infiammatoria e nei profili marcatori correlati alla ferroptosi. Il disegno sperimentale complessivo e il flusso di lavoro analitico sono riassunti nella Figura 1.

Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale del modello del mouse e analisi a valle. La colite ulcerosa sperimentale cronica è stata indotta dall'esposizione ciclica al 2,5% di dextrano solfato di sodio (DSS) combinata con la sfida del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) durante l'ultima settimana del protocollo sperimentale. I topi sono stati assegnati ai gruppi di controllo normale, modello, FSET a bassa dose, FSET a dose media, FSAC ad alta dose e CRX-526 controlli positivi. La FSEC è stata somministrata tramite gavage intragastrico a dosi di 108, 216 o 432 mg/kg di peso corporeo. CRX-526 è stato utilizzato come intervento di controllo positivo. Dopo il trattamento finale, sono stati raccolti campioni per la valutazione istopatologica, saghi biochimici correlati allo stress ossidativo, analisi delle citochine tramite ELISA, immunoistochimica e analisi western blot. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Tutte le procedure animali sono state esaminate e approvate dal Comitato per il Benessere Animale e l'Etica del Nanchang Medical College (n. di approvazione. NY2SC 20250407). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Le sostanze chimiche, i reagenti e le attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Animali e trattamento

In questo studio sono stati utilizzati maschi di topi C57BL/6J (di tipo selvatico, 8 settimane). Gli animali venivano alloggiati in condizioni standard di laboratorio con temperatura e umidità controllate e avevano libero accesso a cibo e acqua. Dopo l'acclimatazione, la colite cronica è stata indotta somministrando tre cicli di destrono solfato di sodio (DSS) al 2,5% nell'acqua potabile. Ogni ciclo durava 1 settimana ed era separato da un periodo di recupero di 2 settimane con acqua potabile regolare. Durante l'ultima settimana del protocollo sperimentale, i topi dei gruppi modello e di trattamento hanno ricevuto il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α; 10 μg/100 g di peso corporeo, due volte al giorno) tramite gavage intragastrico per aggravare ulteriormente la lesione colonica. I topi di controllo normali hanno ricevuto solo il veicolo e non sono stati esposti a DSS o TNF-α.

Capsule di Sophora flavescens con rivestimento enterico (FSEC) a cinque gusti venivano utilizzate come medicinale brevettato cinese commercialmente disponibile e approvato. La formulazione conteneva Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f. e Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. I contenuti delle capsule dello stesso lotto di produzione venivano pesati e sospesi in acqua distillata sterile per preparare sospensioni di dosaggio fresche prima dell'amministrazione. Le sospensioni venivano miscelate accuratamente prima di ogni gavaga per garantire una dispersione uniforme. Fonte del prodotto, numero di approvazione, specifiche farmaceutiche e informazioni sul controllo qualità sono fornite nella Tabella dei Materiali. La qualità del prodotto è stata descritta in conformità con la specifica farmaceutica approvata e le informazioni fornite dal produttore, inclusi specifiche della capsula, aspetto, requisiti di rilascio e disintegrazione enterici, requisiti di limite microbico e standard di controllo qualità.

I topi trattati con FSAC hanno ricevuto FSEC a bassa dose (108 mg/kg di peso corporeo), FSEC a dose media (216 mg/kg di peso corporeo) o FSEC ad alta dose (432 mg/kg di peso corporeo) tramite gavage intragastrico due volte al giorno durante l'ultima settimana di modellazione. I livelli di dose sono stati selezionati in base alla dose clinica approvata, alla conversione dell'area superficiale corporea e alle considerazioni preliminari di dosaggio. I topi trattati con veicoli hanno ricevuto lo stesso volume di acqua distillata sterile tramite gavage intragastrica.

Il gruppo di controllo positivo ha ricevuto l'antagonista TLR4 CRX-526 a 1 mg/kg tramite iniezione nella vena caudal durante l'ultima settimana di modellazione. CRX-526 è stato utilizzato come intervento antinfiammatorio di riferimento. Lo studio ha incluso sei gruppi (n = 6 per gruppo): gruppo controllo normale, modello, FSET a bassa dose, FSET a dose media, FSET ad alta dose e CRX-526 gruppo di controllo positivo. I topi sono stati sacrificati 24 ore dopo l'ultimo trattamento dello studio. L'eutanasia è stata eseguita tramite lussazione cervicale sotto anestesia isoflurana, in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

2. Valutazione istologica tramite colorazione di ematossilina ed eosina

I tessuti del colon sono stati raccolti dalla regione macroscopicamente più colpita tra l'ano e l'area ileocecale. Per ogni topo, un segmento rappresentativo del colon di questa regione era fissato in formalina tamponata al 10% di neutro, incorporata nella paraffina, sezionata e colorata con ematossilina ed eosina. Per la valutazione istologica, sono state preparate almeno tre sezioni per ogni animale e sono stati esaminati cinque campi ad alta potenza non sovrapposti per ogni sezione. I campi venivano selezionati sistematicamente a caso scansionando la sezione da un bordo all'altro, evitando aree strappate, piegate o poco colorate. Le modifiche istopatologiche, tra cui ulcerazione mucosa, distruzione ghiandolare, congestione e infiltrazione delle cellule infiammatorie, sono state valutate tramite microscopia ottica.

3. Misurazione di indicatori biochimici legati allo stress ossidativo

I campioni di sangue (0,5 mL) sono stati raccolti in tubi contenenti anticoagulanti e centrifugati a circa 1160 × g per 10 minuti a 4 °C. Il soprantantante è stato raccolto e utilizzato per misurare i livelli di ferro sierico, dismutasi superossida (SOD), glutatione (GSH), catalasi (CAT) e mieloperossidasi (MPO) utilizzando i corrispondenti kit di analisi elencati nella Tabella dei Materiali secondo le istruzioni del produttore.

4. Analisi immunoistochimica di JAK2 e STAT3

Sezioni di tessuto del colon incorporate in paraffina (5 μm) sono state deparaffinate in xilene, reidratate tramite una serie di etanolo gradato e risciacquate con soluzione salina tamponata con fosfato. Il recupero dell'antigene è stato effettuato in tampone di citrato (pH 6,0) tramite riscaldamento a microonde. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, l'attività endogena della perossidasi è stata bloccata con il 3% di H₂O₂ per 10 minuti. Le sezioni sono state bloccate con siero di capra normale al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente e incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro JAK2 e STAT3 a diluizioni rispettivamente di 1:50 e 1:80. Dopo lavaggi salini tamponati con fosfato, le sezioni sono state incubate con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano secondo le istruzioni del produttore. I segnali immunoreattivi sono stati visualizzati utilizzando la 3,3′-diaminobenzidina, e i nuclei sono stati controcolorati con ematossilina. Le sezioni venivano disidratate, montate ed esaminate al microscopio ottico.

5. Quantificazione delle citochine tramite saggio immunoenzimatico legato agli enzimi

I tessuti colonici venivano tagliati in pezzi da 2–^{3 mm,} omogeneizzati su ghiaccio in soluzione salina tamponata con fosfato e centrifugati a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Il soprantantante è stato raccolto e le concentrazioni di TNF-α, IL-1α e IL-13 sono state misurate utilizzando i corrispondenti kit ELISA secondo le istruzioni del produttore. I valori di assorbanza sono stati misurati utilizzando un lettore di microplacche e le concentrazioni di citochine sono state calcolate a partire da curve standard generate per ogni saggio.

6. Analisi del western blot delle proteine correlate alla ferroptosi

Le proteine totali sono state estratte dai tessuti del colon e le concentrazioni proteiche sono state determinate tramite un saggio sull'acido bicinconinico. Quantità uguali di proteine da ciascun campione sono state separate da SDS-PAGE e trasferite sulle membrane. Dopo il blocco con latte scremato al 5% o un tampone di blocco equivalente per 2 ore a temperatura ambiente, le membrane sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro GPX4, FTH1, ACSL4 e la proteina di controllo del carico β-actina, come elencato nella Tabella dei Materiali. Il giorno seguente, le membrane sono state lavate e incubate con l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano corrispondente per 2 ore a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un substrato chemiluminescente e fotografate tramite un sistema di imaging chemiluminescenze. Le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando software di densitometria. I livelli di espressione di GPX4, FTH1 e ACSL4 sono stati normalizzati a β-actina, e l'espressione relativa delle proteine è stata calcolata per analisi statistica.

7. Analisi statistica

I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). I confronti tra più gruppi sono stati effettuati utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza, seguiti dal test post hoc di Bonferroni, quando sono state soddisfatte le assunzioni di normalità e omogeneità della varianza. Un valore di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

FSEC allevia il danno istopatologico e migliora gli indici correlati allo stress ossidativo nei topi con colite ulcerosa
Come mostrato nella Figura 2, il gruppo di controllo normale ha mostrato un'architettura mucosa del colon intatta, con ghiandole ben organizzate e minima infiltrazione di cellule infiammatorie. Al contrario, il gruppo modello ha mostrato gravi lesioni mucose caratterizzate da disturbo epiteliale, ulcerazione mucosa, dis...

Discussione

Questo studio ha indagato gli effetti delle capsule enteriche (FSEC) di Sophora flavescens a cinque gusti in un modello murino di colite ulcerosa sperimentale (UC) e ha valutato i cambiamenti associati negli indici legati allo stress ossidativo, nelle citochine infiammatorie, nella segnalazione JAK2/STAT3 e nei marcatori correlati alla ferroptosi. I principali risultati sono stati che il trattamento con FSEC alleviava la lesione istopatologica del colon, migliorava gli indici bi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018	Sostanza cromogena per immunoistochimica basata su HRP.
ACSL4 antibody (F-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	Anticorpo primario monoclonale per western blot; utilizzato a 1:500; RRID: AB_10842002.
Antigen retrieval solution, citrate buffer, pH 6.0	Beyotime Biotechnology	P0081	Buffer per recupero dell'epitopo indotto dal calore per immunoistochimica su sezioni in paraffina.
BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0012	Quantificazione delle proteine prima del western blotting.
C57BL/6J mice	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Topi SPF maschi, 8 settimane; fonte animale coerente con i materiali di approvazione etica presentati.
Catalase (CAT) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	Kit colorimetrico per la misurazione dell'attività CAT nel siero.
ChemiDoc XRS+ imaging system	Bio-Rad Laboratories	1708265	Sistema di imaging a chemiluminescenza per il rilevamento del western blot.
CRX-526	TargetMol	T27090	Antagonista del TLR4 utilizzato come intervento di controllo positivo; CAS n. 245515-64-4.
Dextran sulfate sodium salt (DSS), colitis grade	MP Biomedicals	160110	DSS, grado di colite, peso molecolare 36.000–50.000 Da; utilizzato al 2,5% in acqua potabile.
ECL chemiluminescent substrate	Bio-Rad Laboratories	1705061	Sostanza ECL chemiluminescente Clarity Western per il rilevamento del segnale del western blot basato su HRP.
ELISA kit, mouse IL-13	Abcam	ab219634	Kit ELISA sandwich colorimetrico per la quantificazione di IL-13 del topo; lettura a 450 nm.
ELISA kit, mouse IL-1α	Abcam	ab199076	Kit ELISA sandwich colorimetrico per la quantificazione di IL-1α del topo; lettura a 450 nm.
ELISA kit, mouse TNF-α	Abcam	ab208348	Kit ELISA sandwich colorimetrico per la quantificazione di TNF-α del topo; lettura a 450 nm.
Ethanol, absolute	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Utilizzato per la lavorazione dei tessuti, disidratazione e preparazione dei reagenti.
Ferrous iron (Fe2+) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	Kit colorimetrico per la misurazione di Fe2+ in campioni di siero o tessuto.
Five-flavor Sophora flavescens enteric-coated capsules	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	NMPA approval no. Z20150002	Medicina brevettata cinese; 0,4 g/capsula; formulazione include Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f. e Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC.; specifiche farmaceutiche YBZ00152015
Glutathione (GSH) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	Kit per la misurazione del GSH ridotto nel siero.
GPX4 antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	Anticorpo primario monoclonale per western blot; utilizzato a 1:500; RRID: non elencato nel foglio dati del fornitore.
Hematoxylin and eosin staining kit	Solarbio	G1120	Colorazione H&E di sezioni di tessuto del colon in paraffina.
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	Anticorpo secondario per western blot; utilizzato a 1:50.000; RRID: AB_631736.
ImageJ software	National Institutes of Health	Version 1.54	Software di analisi delle immagini e densitometria utilizzato per la quantificazione delle bande del western blot.
Immunohistochemistry detection kit	ZSGB-BIO	PV-9000	Kit di rilevamento HRP basato su polimeri per immunoistochimica su sezioni in paraffina.
JAK2 antibody (D2E12)	Cell Signaling Technology	3230	Anticorpo primario monoclonale per immunoistochimica di JAK2 su sezioni in paraffina; RRID: AB_2128522.
Microplate reader	BioTek Instruments	Synergy H1	Lettore di piastre per la misurazione dell'assorbanza ELISA a 450 nm.
Myeloperoxidase (MPO) activity assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A044-1-1	Kit colorimetrico per la misurazione dell'attività MPO nel siero.
Neutral buffered formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Fissazione del tessuto del colon prima dell'incorporamento in paraffina.
Normal goat serum	Solarbio	SL038	Reagente di blocco per immunoistochimica.
Paraffin	Leica Biosystems	39601006	Medium di incorporazione per la lavorazione del tessuto del colon.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio	P1020	Buffer per omogenizzazione dei tessuti, lavaggio e procedure di immunocolorazione.
PVDF membrane	MilliporeSigma	IPVH00010	Membran per il trasferimento delle proteine per il western blotting.
Recombinant mouse TNF-α protein	R&D Systems	410-MT	TNF-α ricombinante del topo utilizzato per la sfida infiammatoria dell'ultima settimana.
SDS-PAGE and transfer system	Bio-Rad Laboratories	1658004	Sistema Mini-PROTEAN Tetra per SDS-PAGE e trasferimento per western blot.
SPSS Statistics software	IBM	Version 24.0	Software di analisi statistica per ANOVA a una via e test post-hoc di Bonferroni.
STAT3 antibody (124H6)	Cell Signaling Technology	9139	Anticorpo primario monoclonale per immunoistochimica di STAT3; RRID: AB_331757.
Superoxide dismutase (SOD) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-3-2	Kit metodo WST-1 per la misurazione dell'attività SOD nel siero.
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418	Reagente per la rimozione della cera per il trattamento delle sezioni in paraffina.
β-actin antibody (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Anticorpo di controllo del caricamento monoclonale per western blot; utilizzato a 1:1.000;