Generazione di strutture organoidi simili a organoidi derivate da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo a partire da tessuto pancreatico fresco

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per differenziare le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) in strutture organoidi simili a isole pancreatiche utilizzando il lisato del tessuto pancreastico suino. Strutture simili a organoidi si formano dopo 22 giorni. Questo metodo semplice ed economico produce strutture morfologicamente simili a isolotti pancreatici per studi in vitro e screening farmacologico.

Abstract

Essendo una malattia cronica diffusa a livello globale, il diabete mellito (DM) è caratterizzato da un alteramento dell'equilibrio glucosio nel corpo. Nel diabete mellito di tipo 1 (T1DM), le risposte autoimmuni distruggono completamente le cellule β pancreatiche, causando insufficienza insulinica totale. I pazienti con questa condizione necessitano di un trattamento supplementare per insulina a vita. Il presente studio intende creare una piattaforma di coltura affidabile ed economica per generare strutture simili a organoidi a isole pancreatiche a partire dalle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC). Questa piattaforma può non solo alleviare la carenza di isolotti donatori per il trapianto, ma anche fungere da modello in vitro per la ricerca sul diabete.

Ottimizzando il processo di preparazione del lisato del tessuto pancreatico suino (centrifugazione a 12.000 giri/min per 30 minuti a 4 °C, seguita da una filtrazione a 0,22 μm per la sterilizzazione), i BMSC sono stati indotti con successo a differenziarsi in strutture organoidi simili a isolotti pancreatici. La validazione morfologica ha confermato che solo i BMSC indotti formavano aggregati compatti, paffuti e altamente trasparenti simili a isolotti, mentre i BMSC non indotti mostravano una significativa vacuolizzazione e una trasparenza ridotta.

Il monitoraggio dinamico ha mostrato che gli aggregati cellulari (50–100 μm di diametro) si sono formati al giorno 16 di coltura e si sono sviluppati in strutture simili a capsule (200–300 μm di diametro) entro il giorno 22. Questo metodo è semplice da gestire, conveniente e non richiede attrezzature complesse. Gli organoidi risultanti sono morfologicamente simili agli isolotti pancreatici, fornendo uno strumento per studi in vitro e screening farmacologico correlati.

Introduzione

Come sistemi modello tridimensionale (3D) in vitro, le strutture organoidi degli isolotti pancreatici sono emerse come strumenti cruciali nella ricerca sul diabete e nella medicina rigenerativa, grazie alla loro capacità di imitare da vicino la composizione multicellulare e la struttura spaziale degli isolotti pancreatici^{nativi 1}. Tali modelli non solo offrono una piattaforma unica per comprendere la biologia dello sviluppo delle isolotte e i meccanismi patologici del^{diabete 2,3}, ma supportano anche lo sviluppo di terapie sostitutive cellulari e sistemi di screening^{farmacologico 4}. Con la prevalenza globale del diabete in continua aumento—soprattutto la carenza assoluta di insulina causata da danni irreversibili alle β cellule nel diabete di tipo 1—la terapia sostitutiva convenzionale con insulina può controllare i sintomi ma non può curare la malattia. Nel frattempo, il trapianto di isolotti affronta una grave carenza di donatori, rendendo lo sviluppo di fonti alternative scalabili per isolotti una priorità^{urgente 1,5}. Sfruttando il potenziale di differenziazione diretta delle cellule staminali pluripotenti o delle cellule staminali adulte, la tecnologia simile agli organoidi degli isoli pancreatici può aiutare a risolvere questa^{limitazione 6,7,8}.

Negli ultimi anni sono stati fatti progressi significativi nei sistemi di coltura organoidi simili a isolotti pancreatici basati su cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC^). Numerosi studi hanno confermato che, ottimizzando i protocolli di induzione e le condizioni di coltura, le cellule staminali possono differenziarsi in cellule simili a isolotti con funzioni di secrezione insulinica rispondenti al^{glucosio 10}. Scoperte nella tecnologia di riprogrammazione chimica hanno permesso la generazione di hiPSC senza manipolazione genetica, migliorando il potenziale^{traslazionale 11}. In termini di sistemi di coltura, la coltura 3D combinata con specifiche combinazioni di matrice extracellulare e fattori di crescita può favorire l'auto-organizzazione delle cellule precursori degli isolotti in strutture organoidi composte da cellule α, β e δ¹². Tuttavia, le tecnologie esistenti affrontano ancora numerose sfide, tra cui un'efficienza di differenziazione instabile, una maturità funzionale insufficiente e la mancanza di reti vascolari e microambienti immunitari—fattori limitanti^{chiave 13} che limitano un'applicazione più ampia.

Nonostante i progressi nella ricerca sulla struttura organoide simile agli isolotti pancreatici, restano da affrontare diverse questioni scientifiche critiche in questo^campo14. Primo, la mancanza di definizioni standardizzate degli organoidi e procedure di costruzione rende difficile confrontare direttamente i risultati tra diversi laboratori¹⁵. In secondo luogo, i sistemi di coltura attuali non possono replicare completamente la complessa composizione cellulare e la precisa disposizione spaziale degli isolotti pancreatici^{nativi 16}. In terzo luogo, questioni fondamentali come la stabilità funzionale durante la coltura a lungo termine degli organoidi e la sopravvivenza post-trapianto rimangono insufficientemente^{caratterizzate 17}. Inoltre, la maggior parte dei protocolli esistenti si basa ancora su materiali matriciali derivati dagli animali, che soffrono di composizioni indefinite e di grandi variazioni da batch a lotto, ostacolando il controllo qualità per applicazioni^{cliniche 18}. Queste lacune di conoscenza e tecniche ostacolano seriamente la trasposizione delle strutture organoidi simili a isolotti pancreatici dalla ricerca di base alla pratica clinica.

Questo protocollo è progettato per costruire un approccio stabile, accessibile e ripetibile per generare costrutti simili a organoidi di isole pancreatiche utilizzando cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC). Il metodo consolidato è destinato alla ricerca sperimentale di laboratorio e alle applicazioni di screening preclinico dei farmaci. Le strategie attuali per la differenziazione degli isolotti indotte dalla BMSC soffrono di molteplici limitazioni, tra cui costi eccessivanti, standard operativi incoerenti e applicabilità limitata. La maggior parte dei sistemi di induzione esistenti si basa su costose citochine ricombinanti, matrici di coltura professionali e dispositivi di coltura ad alta precisione, che ne limitano notevolmente l'uso diffuso. Per risolvere questi svantaggi, l'attuale protocollo adotta il lisato del tessuto pancreasico suino come fattore di induzione centrale. Questa strategia di coltura ottimizzata e semplificata consente la differenziazione efficiente dei BMSC in strutture simili a isolotti con solo attrezzature e condizioni di laboratorio di routine.

Rispetto ai metodi convenzionali basati su hESC, iPSC o cocktail ad alto fattore di crescita di costo, la strategia attuale offre diversi vantaggi pratici distinti. Elimina la necessità di reagenti costosi e configurazioni di coltura complesse, riduce i costi sperimentali e consente risultati coerenti con una variabilità inter-batch minima 10,11,12,13. A differenza dei sistemi basati su matrici xenogeniche, questo protocollo utilizza un lisato tissutale semplificato, migliorando la controllabilità sperimentale e la riproducibilità nei laboratori^{15, 16, 17, 18}. Inoltre, i BMSC sono facilmente accessibili, stabili in coltura e privi di vincoli etici associati alle cellule staminali pluripotenti, rendendo questo approccio particolarmente adatto all'uso di laboratorio di routine.

Gli approcci di ricerca esistenti sono polarizzati nel campo della modellizzazione organoide pancreatica: le piattaforme organoidi avanzate per la trasformazione clinica sono costose e tecnicamente complesse, mentre modelli alternativi semplificati non supportano un'analisi funzionale approfondita. Il protocollo proposto in questo lavoro colma questo divario di ricerca offrendo uno schema tecnico standardizzato e intermedio. Questo approccio preserva le proprietà fisiologiche fondamentali degli isolotti pancreatici ed è pienamente compatibile con i convenzionali ambienti di laboratorio di base. Serve come strumento pratico per i ricercatori che si concentrano sui meccanismi di sviluppo delle isole, sulla modellazione delle malattie diabetiche e sulla valutazione preliminare dei candidati farmaci, in particolare per i team dotati di infrastrutture di coltura cellulare di routine ma privi di piattaforme professionali di coltura di cellule staminali. Sebbene questo metodo non possa generare organoidi completamente vascolarizzati o immunologicamente competenti per ricerche avanzate specifiche, è particolarmente adatto per lo screening sperimentale preliminare, l'esplorazione meccanicistica e la formazione accademica nella ricerca biologica sugli isolini.

Questo lavoro si concentra sulla costruzione di un sistema di coltura economico e standardizzato per strutture organoidi simili a isolotti pancreatici, con l'obiettivo di offrire un modello di ricerca tridimensionale credibile per studi correlati al diabete. Analizzando sistematicamente come i diversi regimi di induzione e ambienti di coltura influenzino l'efficienza della formazione degli organoidi e le caratteristiche morfologiche, questa ricerca cerca di superare i principali ostacoli tecnici che limitano il progresso in questo campo. Gli obiettivi principali della ricerca coprono tre aspetti chiave: stabilire un protocollo universale di coltura applicabile a laboratori di base ordinari senza strumenti sofisticati, formulare standard di valutazione quantitativa per la valutazione della qualità degli organoidi e ottimizzare le strategie di coltura per sostenere la stabilità morfologica e funzionale degli organoidi durante l'incubazione a lungo termine. I risultati di questo studio possono fornire un solido supporto tecnico per l'esplorazione sperimentale in vitro, costruendo al contempo un modello pratico e affidabile per la ricerca sui meccanismi di sviluppo delle isole e sullo screening di farmaci ipoglicemici.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali rispettavano le linee guida per il benessere degli animali da laboratorio approvate dal Comitato Etico dell'Università Medica del Guangxi (Approvazione n.: SYXK 2014-0003) e rispettavano i codici etici per la cura e l'uso degli animali specificati nei Principi Guida Internazionali per la Ricerca Biomedica che Coinvolge gli Animali, formulati dal Consiglio per le Organizzazioni Internazionali delle Scienze Mediche (CIOMS).

Tutte le operazioni che coinvolgono la lavorazione dei tessuti e la preparazione dei reagenti devono essere eseguite in un armadietto di biosicurezza di Classe II per prevenire la contaminazione. Lascia almeno 8 ore per completare la lavorazione dei tessuti freschi e la preparazione dell'induttore strutturale simile a un organoide delle isole pancreatiche. Tieni tutti i campioni e i reagenti sul ghiaccio durante tutto l'esperimento.

1. Preparazione sperimentale

1. Eutanasiate ratti allattanti Sprague Dawley (SD) di 7 giorni tramite lussazione cervicale. Anestetizzare i maiali domestici tramite iniezione endovenosa di pentobarbital sodio a una dose di 20 mg/kg e confermare un'adeguata anestesia tramite la scomparsa del riflesso di astinenza del pedale e la frequenza respiratoria stabile.
2. Processare tessuto pancreasico suino in un armadio di biosicurezza di Classe II in condizioni sterili. Processare il tessuto pancreastico fresco di maiale entro 24 ore dalla raccolta. Conservare i campioni di tessuto raccolti a 4 °C in un mezzo DMEM completo (come mostrato nella Tabella 1) fino alla lavorazione.
3. Preimposta la centrifuga refrigerata a 4 °C e seleziona la modalità centrifugazione a bassa velocità per evitare di danneggiare le preparazioni a celle di colore. Conservare punte da 1000 μL per pipette, da 200 μL e tubi centrifughe da 50 mL in un congelatore a −20 °C fino all'uso durante l'esperimento. Prepara un numero sufficiente di filtri sterili da 0,22 μm e siringhe sterili usa e getta da 20 mL. Sterilizza forbici oftalmiche, pinze curve, piastre di Petri di vetro e fiale tramite autoclaving ad alta temperatura (121 °C, 20 min).
4. Prima dell'uso sperimentale, si espone aliquota del tessuto pancreatico completamente preparato. Per una consistenza sperimentale ottimale, si pipettare 100 μL dell'omogeneato in singoli tubi microcentrifuga da 1,5 mL per la conservazione separata e il successivo utilizzo.

2. Elaborazione di tessuto pancreatico fresco per preparare un induttore di struttura organoide simile a isole pancreatiche

1. Preleva esemplari freschi di pancreas suini e trasferili immediatamente sul ghiaccio secco per mantenere la bioattività tissutale. I tessuti acquisiti vengono prima risciacquati ripetutamente con soluzione salina normale sterile tramite pipetta. Dopo i primi passaggi di pulizia, si utilizzano 3 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per un ulteriore lavaggio accurato, eliminando completamente le macchie residue di sangue e i contaminanti tissutitori.
2. Rimuovere e scartare eventuali residui di liquido dalle piastre di coltura sterili, poi integrare le lastre con 2 mL di mezzo DMEM. I tessuti pancreatici pretrattati vengono tritati in frammenti uniformi di 1 mm³ con forbici oftalmiche sterili (Figura 1A,B). Tutti i pezzi di tessuto tritato vengono raccolti in un tubo centrifuga da 50 mL, seguiti da una leggera pipettura su e giù per 10 volte per ottenere una miscelazione omogenea.
3. L'omogeneizzazione dei tessuti viene effettuata con un pestello di vetro sterile (Figura 1C). Durante il processo di macinazione, i frammenti di tessuto pancreatico vengono miscelati uniformemente con il mezzo DMEM a un rapporto volume di 1:1. La sospensione tissutale completamente omogenea viene trasferita in un tubo centrifugo da 50 mL e sottoposta a centrifugazione refrigerata ad alta velocità a 21.600 × g per 30 minuti in condizioni di 4 °C.
4. Dopo la centrifugazione, il sovrantato chiarificato viene estratto lentamente con una pipetta sterile. Il soprantantante raccolto viene poi fatto passare attraverso un filtro sterile da 0,22 μm per eliminare piccoli detriti tissutali e impurità non disciolte (Figura 1D). Il liquido purificato viene infine suddiviso in tubi microcentrifughe da 1,5 mL con un volume fisso di 100 μL per tubo per la conservazione sigillata e i successivi esperimenti (Figura 1E).
5. Conservare l'induttore della struttura organoide simile a isolotti pancreatici alcitati a −20 °C.
   NOTA: L'induttore rimane stabile per 1 anno in condizioni adeguate di conservazione. Valutare l'attività di induzione del lisato preparato tramite ispezione visiva e induzione funzionale. Identificare il lisato attivo per il suo aspetto chiaro, rosa pallido, senza precipitazioni evidenti; riconoscono la perdita di attività dovuta alla precipitazione visibile e il mancato indotto nella formazione tipica di organoidi degli isolotti.

3. Preparazione del mezzo di induzione

1. Prepara il mezzo di induzione appena prima delle operazioni di coltura cellulare. Combinare l'organoide organoide pancreatica preparato da noi con un mezzo DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS-H-DMEM) rigorosamente in conformità con la proporzione elencata nella Tabella 1.
2. Mettere i campioni di organoidi pancreati coltivati in un incubatore cellulare mantenuto a una temperatura costante di 37 °C con saturazione di CO₂ del 5% per la coltivazione continua.

4. Osservazione morfologica e monitoraggio della crescita degli organoidi

1. L'osservazione microscopica viene effettuata nei momenti programmati durante tutto il periodo di coltivazione, inclusi il giorno 1, il giorno 3, il giorno 7, il giorno 10 e il giorno 15 dopo la semina cellulare.
2. Viene adottato un microscopio luminoso per monitorare i cambiamenti morfologici, le condizioni di crescita e la vitalità cellulare delle strutture organoidi pancreatiche durante ogni sessione di rilevamento, al fine di registrare le caratteristiche dinamiche di crescita dei costrutti.

5. Passaggio e crioconservazione degli organoidi

1. Passaggio di semi 3 BMSC a una densità di 1 × 10⁵ cellule per pozzo in piastre di coltura a 6 pozzi e coltura in mezzo completo durante la notte per consentire l'attacco cellulare prima dell'induzione.
2. Aggiungi 1 mL di tripsina contenente 0,02% di EDTA al sistema di coltura. Pipetta delicatamente la superficie della tavola di coltura 5–8 volte per staccare gli organoidi pancreatici dalla piastrella.
3. Aggiungere 2 mL di mezzo al 10% di H-DMEM-F12 per interrompere la digestione della tripsina. Centrifuga la miscela a 1.500 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga refrigerata. Aspira e scarta il soprandanante dopo la centrifugazione.
4. Aggiungi il doppio del volume di mezzo fresco al 10% FBS-H-DMEM al pellet cellulare per ottenere un rapporto di passaggio 1:2.
5. Eseguire la crioconservazione delle colture organoidi come segue: Sospendere la pellet cellulare ottenuta in 1 mL di soluzione di crioconservazione senza siero. Conservare gli organoidi sospeso a −80 °C per la conservazione a breve termine (fino a 1 anno) e in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
   NOTA: Regola il volume del mezzo fresco per ottenere diversi rapporti di passato. Ad esempio, usa lo stesso volume di mezzo del volume iniziale per un passaggio 1:1, oppure aggiungi 3 volte il volume iniziale del mezzo per un passaggio 1:3.

Risultati

Registrare la dinamica di crescita delle colture organoidi simili a isolotti pancreatici nel tempo è cruciale, specialmente nelle prime settimane di coltura, poiché permette di prevedere le prestazioni del sistema di coltura in esperimenti successivi. La Figura 2 mostra un esempio di coltura di 22 giorni, in cui i BMSC sono stati efficacemente isolati dal midollo osseo di ratti allattatori di 7 giorni e utilizzati con successo per generare ...

Discussione

Il diabete mellito è un disturbo metabolico globale, principalmente classificato in diabete mellito di tipo 1 (T1DM) e diabete mellito di tipo 2 (T2DM). Il T1DM è una malattia autoimmune caratterizzata dalla distruzione selettiva delle cellule β pancreatiche, che porta a una carenza assoluta di insulina¹⁹. I pazienti necessitano di insulina esogena per tutta la vita, ma corrono comunque al rischio di gravi ipoglicemia e complicazioni^{microvascolar...}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.22 & mu; m Filtro sterile	Merck Millipore	SLGP033RB	Filtrazione sterile del lisato del tessuto pancreatico per rimuovere impurità e detriti
0,25% di tripsina (entro lo 0,02% di EDTA)	Wisent	325-043-CL	Lieve dissociazione degli organoidi degli isolotti pancreatici per l'operazione del passaggio
Tubi microcentrifughe da 1,5 mL	Assidio di Corning	AXY-20-1500	Alibazione e conservazione del lisato del tessuto pancreaico (100 & mu; L per tubo)
10 & mu; Punte per pipette L	Eppendorf	22491653	Trasferimento liquido per anticorpi e soluzioni enzimatiche di piccolo volume
1000 & mu; Punte per pipette L	Eppendorf	22491651	Trasferimento liquido per reagenti e sospensioni di celle
-20°; Freezer	Haier	HYC-326	Conservazione di reagenti (ad esempio, FBS, tripsina) e punte di pipetta
200 & mu; Punte per pipette L	Eppendorf	22491652	Trasferimento preciso di liquidi per reagenti di piccolo volume (ad esempio, aliquotazione del lisato)
10 & mu; Punte per pipette L	Haier	DW-86L626	Conservazione a lungo termine del lisato del tessuto pancreatico e organoidi criopreservati
Tubi centrifughe da 50 mL	Corning	430829	Centrifugazione ad alta velocità e bassa temperatura del lisato del tessuto pancreatico e della sospensione cellulare
Piastre di cultura a 6 pozzi	Corning	3516	Coltura di organoidi degli isolotti pancreatici e dei BMSC
Armadio di Biosicurezza di Classe II	Haier	HR40-IIA2	Lavorazione sterile del tessuto pancreastico suino e operazioni di coltura organoidi
Incubatore CO2	Thermo Fisher Scientific	3111	Incubazione di organoidi degli isolotti pancreatici a 37°C; C, 5% CO2 ambiente
Pinza curva	Shanghai Huaqi Medical Instruments Co., Ltd.	HQ-1302	Maneggiamento del tessuto pancreatico durante la lavorazione, sterilizzato ad alta temperatura
Mezzo DMEM (glucosio alto)	Wisent	318-025-CL	Utilizzato per la coltura di organoidi a isoli pancreatici
Medio DMEM (basso livello di glucosio)	Wisent	319-015-CL	Mezzo basale per la coltura BMSC e la lavorazione dei tessuti
Siero Fetale Bovino (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10099141C	Aggiunto al DMEM con un rapporto di volume del 10% per la coltura cellulare e la terminazione della digestione
H-DMEM-F12 media	Wisent	315-080-CL	Usata per interrompere la digestione della tripsina durante il passaggio dell'organoide
Autoclave ad alta temperatura	Haier	GR80DA	Sterilizzazione degli strumenti (121 e degna; C, 20 min) e vetro
Microscopio Luminoso	Olympus	CX43	Osservazione e imaging di organoidi delle isole pancreatiche a diversi ingrandimenti (e tempi; 4, & times; 10, e volte; 20)
Forbici oftalmiche	Shanghai Huaqi Medical Instruments Co., Ltd.	HQ-1201	Taglio del tessuto pancreatico suino in 1 mm e superiore; frammenti, sterilizzati tramite autoclaving ad alta temperatura
Soluzione penicillina-streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Utilizzato con un rapporto di volume dell'1% per prevenire la contaminazione batterica nel mezzo di coltura
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10010023	Lavaggio del tampone per il tessuto pancreatico suino e il risciacquo cellulare
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	5810R	Centrifugazione ad alta velocità a 4° C per la preparazione del lisato pancreatico e la raccolta dei pellet cellulari
Soluzione di crioconservazione senza siero	Suzhou Xinsaimai Biotechnology Co., Ltd.	#C40050	Utilizzato per la crioconservazione di organoidi degli isoli pancreatici, risospendendo pellet cellulari prima di -80°C; Memoria C