Un protocollo standardizzato di metabolomica per l'analisi dei cambiamenti metabolici indotti dall'esercizio fisico nei pugili d'élite tramite cromatografia liquida-spettrometria di massa

Summary

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro standardizzato di metabolomica sirica basato sulla cromatografia liquida abbinata alla spettrometria di massa quadrupolare a tempo di volo (LC-QTOF-MS/MS) e all'analisi multivariata dei dati per la profilazione di cambiamenti metabolici acuti e a breve termine legati al recupero nei pugili maschi d'élite.

Abstract

La boxe d'élite induce cambiamenti metabolici rapidi che non sono completamente catturati dalle misurazioni fisiologiche convenzionali. Un flusso di lavoro standardizzato di metabolomica sirica non mirata, basato sulla cromatografia liquida-spettrometria di massa a tempo di volo quadrupolo (LC-QTOF-MS/MS), è stato applicato a campioni raccolti prima dello sparring, immediatamente dopo lo sparring e 24 ore dopo lo sparring in sette pugili maschi d'élite. Il flusso di lavoro includeva la raccolta standardizzata dei campioni, il monitoraggio del controllo qualità aggregato, la profilazione dei metaboliti, l'analisi statistica multivariata e l'interpretazione dei percorsi. Lo sparring acuto era associato a cambiamenti nei metaboliti legati alla glicolisi e alla gluconeogenesi, mentre il punto temporale di 24 ore era associato al metabolismo dello zolfo.

Il fosfatidilinositolo PI(16:0/18:2(9Z,12Z)) ha mostrato una forte discriminazione dello stato immediatamente post-sparring, e il tiosolfato è stato associato allo stato di recupero di 24 ore. Questi risultati supportano l'uso di questo flusso di lavoro per la profilazione riproducibile dei cambiamenti metabolici legati all'esercizio in questa coorte di sette pugili maschi d'élite. Il protocollo è pensato per studi controllati a piccoli gruppi di esercizio acuto e recupero a breve termine e pone l'accento sulla gestione riproducibile dei campioni, il monitoraggio di controllo qualità aggregato e l'analisi a valle interpretabile.

Introduction

La boxe d'élite, caratterizzata da tre round da 2 minuti di allenamento ad alta intensità, si basa su una combinazione di metabolismo anaerobico e aerobico e provoca rapidi spostamenti nei substrati energetici, nei mediatori di stress ossidativo e nei metaboliti legati alla riparazione tissutale. Le valutazioni tradizionali (lattato nel sangue e frequenza cardiaca) catturano solo endpoint fisiologici isolati, fallendo nel risolvere i cambiamenti metabolici sistemici e interconnessi che spaziano dal "basamento pre-sparring → stress acuto post-sparring → recupero di 24 ore."

La metabolomica non mirata, resa possibile dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa a tempo di volo quadrupolare, affronta questa limitazione profilando in modo completo i metaboliti di piccole molecole nei campioni biologici. Tipicamente rileva migliaia di picchi metabolici e annota centinaia o migliaia di metaboliti tramite l'integrazione con database^{curati 1,2,3}. Questo approccio può rivelare dinamiche metaboliche sfumate che i metodi tradizionali trascurano, ma gli studi metabolomici esistenti focalizzati sulla boxe mancano di standardizzazione: spesso omettono protocolli di sparring controllati, rigorosi passaggi di controllo qualità (QC) o tempi di recupero a lungo termine, portando a risultati irriproducibili e a una traduzione limitata in strategie di allenamento o^{recupero 4,5}.

Viene presentato un flusso di lavoro metabolomico standardizzato basato sulla cromatografia liquida-spettrometria di massa a tempo di volo quadrupolare, ottimizzato per i pugili d'élite, per catturare sia le risposte acute all'esercizio sia il recupero ritardato. Il protocollo include tre momenti chiave (pre-sparring [T0], subito post-sparring [T1], 24 ore post-sparring [T2]) per distinguere lo stress transitorio dall'adattamento^{sostenuto 6,7,8}. Le caratteristiche tecniche critiche includono: (1) sparring controllato (frequenza cardiaca massima 80–85%) per garantire un'intensità costante^{dell'esercizio 7,9}; (2) LC-QTOF ad alta risoluzione per la rilevazione sensibile di metaboliti sierici a bassa^{abbondanza 2,3,10}; (3) analisi multivariate e univariate, inclusa analisi a componenti principali (PCA), analisi parziale ortogonale per discriminazione dei minimi quadrati (OPLS-DA) e test statistici a coppie, per identificare i metaboliti reattivi^{all'esercizio 6,8,11}; e (4) un singolo campione di QC siero aggregato (miscelazione a volume uguale di campioni di studio) con più iniezioni per valutare la stabilità dello strumento contro la derivazione del^{segnale 12}.

Questo protocollo può essere adattabile ad altri sport ad alta intensità e breve durata (ad esempio, sprint e lotta), ma tale trasferibilità richiede convalida in coorti specifiche per sport. Nel presente studio, il flusso di lavoro fornisce un quadro preliminare per identificare i marcatori metabolici di stress e recupero nei pugili maschi d'élite. Questo flusso di lavoro è più adatto per studi controllati sull'esercizio acuto e il recupero a breve termine in piccoli coorti atletici ben caratterizzati, utilizzando metabolomiche non mirate basate su siero. Potrebbe essere meno adatto per l'estrapolazione diretta ad altri sport, atlete donne, popolazioni più grandi e eterogenee o studi di adattamento a lungo termine senza ulteriore validazione.

Lo studio mirava a caratterizzare i cambiamenti metabolici sierici indotti dallo sparring d'élite e a distinguere le risposte acute post-sparring dai cambiamenti legati al recupero di 24 ore. Si ipotizzava che lo sparring acuto influenzasse prevalentemente il metabolismo energetico, mentre il recupero in 24 ore sarebbe associato a metaboliti legati all'equilibrio redox e alla riparazione tissutale. Il flusso di lavoro complessivo è mostrato nella Figura 1.

Protocol

Eseguire tutte le procedure in conformità con l'approvazione del Comitato Etico Istituzionale per la Ricerca Umana dell'Università di Educazione Fisica e Sport del Capital (approvazione n. 2025A005).

ATTENZIONE: Trattate tutti i campioni di sangue umano come potenzialmente infettivi. Indossa guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi. Effettuare la raccolta venosa del sangue, la gestione del siero e lo smaltimento dei rifiuti in conformità con le procedure di biosicurezza istituzionale. Decontaminare le superfici di lavoro dopo la gestione del campione.

ATTENZIONE: Metanolo, acetonitrile e acido formico sono sostanze chimiche pericolose. Gestisci le fasi di preparazione, estrazione e ricostituzione del solvente in una cappa chimica certificata. Evita il contatto con la pelle e l'inalazione. Raccogli i rifiuti di solvente in contenitori approvati.

1. Reclutamento e preparazione dei partecipanti allo studio

1. Reclutare sette pugili maschi d'élite di età compresa tra i 20 e i 28 anni e competono nelle categorie di peso 60–75 kg.
2. Conferma che ogni partecipante abbia almeno 5 anni di esperienza professionale e nessuna storia di malattie metaboliche.
3. Escludere i partecipanti con lesioni muscoloscheletriche nei 6 mesi precedenti.
4. Istruire i partecipanti a seguire una dieta standardizzata contenente 55% di carboidrati, 25% di proteine e 20% di grassi per 3 giorni prima del test.
5. Istruire i partecipanti a evitare esercizi fisici intensi al 60% o superiore alla frequenza cardiaca massima per 48 ore prima del test.
6. Istruire i partecipanti a digiunare per 12 ore prima del prelievo del sangue. Consentire l'assunzione d'acqua durante il periodo di digiuno.
7. Determina la frequenza cardiaca massima tramite test di esercizio graduato una settimana prima dello sparring.
8. Aumenta la velocità del tapis roulant di 1 km/h ogni 3 minuti fino all'esaurimento. Usa la frequenza cardiaca massima misurata per definire l'intensità target dello sparring.

2. Protocollo di sparring e raccolta di campioni di siero

1. Prepara un ring da boxe standard da 6 × 6 m, guanti da 16 oz e un cardiofrequenzimetro con fascia toracica.
2. Effettua un riscaldamento standardizzato di 10 minuti composto da 5 minuti di corsa a 8 km/h, 3 minuti di stretching dinamico e 2 minuti di shadowboxing.
3. Esegui il protocollo di sparring come segue.
   1. Esegui tre round di allenamento da 2 minuti ciascuno.
   2. Affronta gli avversari per categoria di peso e livello tecnico.
   3. Prevedi un intervallo di riposo di 1 minuto tra un round e l'altro.
   4. Monitora la frequenza cardiaca ogni 30 secondi durante la sessione.
   5. Regolare l'intensità dello sparring per mantenere la frequenza cardiaca all'80%–85% della MHR.
   6. Pausa lo sparring se la frequenza cardiaca supera il 90% della MHR. Riprendere lo sparring solo dopo che la frequenza cardiaca è tornata al raggio bersaglio.
4. Raccogli campioni di sero in tre momenti temporali come segue.
   1. Raccogli 5 mL di sangue venoso dalla vena antecubitale 30 minuti dopo il riscaldamento per T0 utilizzando un tubo di separazione sirica (SST) da 8 mL.
   2. Raccogli 5 mL di sangue venoso entro 5 minuti dopo l'ultimo ciclo per il T1 usando un nuovo SST.
   3. Raccogli 5 mL di sangue venoso alla stessa ora della giornata come T0 per il T2 usando un nuovo SST. Assicurati che i partecipanti rispettino le stesse restrizioni di digiuno e attività utilizzate per il T0.
5. Processare i campioni di sangue come segue.
   1. Centrifugare ogni SST a 11000 × g per 15 minuti a 4 °C entro 1 ora dalla raccolta.
   2. Trasferire 2–3 mL dello strato siero superiore in 1,5 mL di crioviali.
   3. Conserva subito i cryovials a -80 °C.
   4. Limitare ogni campione a non più di due cicli di congelamento-discongelamento.
6. Prepara un campione QC in pool.
   1. Scongelare tutti i 21 campioni di siero dello studio (T0, T1 e T2 di sette partecipanti) sul ghiaccio prima della preparazione QC in pool.
   2. Trasferire un'aliquota uguale da ciascun campione di studio in un tubo da 1,5 mL.
   3. Trasferire 20 μL da ciascun campione per ottenere un volume QC finale aggregato di 420 μL.
   4. Vortice il campione QC aggregato per 10 secondi.
   5. Utilizzare il campione QC aggregato per iniezioni ripetute durante l'analisi LC-QTOF-MS per monitorare la stabilità strumentale e la deriva del segnale.

3. Estrazione di metaboliti da campioni di siero

1. Rimuovere i campioni di siero congelato (T0, T1, T2 e QC) da -80 °C. Scongelare i campioni sul ghiaccio per 30 minuti e far fermentare ogni campione per 10 secondi.
2. Pipetta 100 μL di siero in un tubo microcentrifuga a basso legame proteico da 1,5 mL. Aggiungi 500 μL di solvente di estrazione gelato costituito da metanolo:acetonitrile (1:1, v/v). Vortice per 30 secondi.
   1. Non aggiungere uno standard interno durante l'estrazione. Non applicare correzioni di estrazione basate su standard interni o normalizzazione a valle nel flusso di lavoro finalizzato.
3. Sonica il tubo in un bagno d'acqua ghiacciata a 4 °C per 10 minuti a 300 W e 40 kHz. Incubare il tubo a -20 °C per 1 ora per precipitare proteine.
4. Centrifuga il tubo a 13200 × g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire circa 450 μL di sovrantante in un nuovo tubo microcentrifuga e scartare il pellet come rifiuto biologico pericoloso.
5. Asciugare il soprantantante in un concentratore a vuoto a 37 °C e -0,09 MPa per 45 minuti o fino a raggiungere la completa secchezza.
6. Ricostituire l'estratto essiccato in 100 μL di acetonitrile:acqua (1:1, v/v). Vortice per 30 secondi.
   Nota: Acetonitrile:acqua (1:1, v/v) è stato utilizzato perché compatibile con la colonna di cromatografia a fase inversa utilizzata in questo flusso di lavoro e non ha prodotto precipitazioni visibili nei test preliminari.
7. Centrifugare la soluzione ricostituita a 13200 × g . per 15 minuti a 4 °C. Trasferire circa 90 μL di soprantantante in una fiala di vetro LC-MS dotata di un inserto da 200 μL e sigillare la fiala.

4. Cromatografia liquida-rilevamento spettrometria di massa

1. Installare una colonna di cromatografia a fase inversa adatta alla metabolomica sierica (vedi Tabella dei Materiali) nel sistema di cromatografia liquida. Imposta il forno a colonna a 40 °C.
2. Prepara la fase mobile A come acido formico allo 0,1% (v/v) in acqua ultrapura. Preparare la fase mobile B come acido formico allo 0,1% (v/v) nell'acetonitrile.
3. Filtrare entrambe le fasi mobili attraverso una membrana da 0,22 μm.
4. Imposta la portata a 400 μL/min e il volume di iniezione a 5 μL.
5. Applicare il seguente gradiente: 0,0–0,5 min, 95% A e 5% B; 0,5–5,5 min, gradiente lineare al 50% A e 50% B; 5,5–9,0 min, gradiente lineare al 5% A e 95% B; 9,0–10,5 min, 5% A e 95% B; 10,5–12,0 min, ritorno al 95% A e 5% B e riequilibra
6. Accoppiare il sistema di cromatografia liquida a uno spettrometro di massa ad alta risoluzione dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray.
7. Acquisire dati in modalità ionica positiva e negativa in run separate.
8. In modalità ionica positiva, imposta la tensione capillare a 2500 V e quella del cono a 30 V.
9. In modalità a ione negativo, imposta la tensione capillare a -2000 V e la tensione del cono a 25 V.
10. Imposta la temperatura del gas di desolvazione a 500 °C, il flusso del gas di desolvazione a 800 L/h e quello del gas conico a 50 L/h.
11. Acquisire dati oltre m/z 50–1200 con un tempo di scansione di 0,2 s.
12. Acquisire dati di spettrometria di massa tandem utilizzando bassa energia di collisione a 0 V e alta energia di collisione a 10–40 V.
13. Eseguire i campioni nel seguente ordine: un'iniezione a bianco di solvente di ricostituzione; Tre iniezioni consecutive del campione QC aggregato; Tutti i campioni dello studio con un'iniezione di blank e una di QC ogni cinque campioni dello studio; Un'ultima iniezione di QC; e un'ultima iniezione di blank
14. Valutare la qualità dei dati e la stabilità analitica in entrambe le modalità ioniche tramite analisi di correlazione QC aggregata e clustering di analisi delle componenti principali (PCA).
15. Interpretare i coefficienti di correlazione QC aggregati superiori a 0,8 come indicazione di una stabilità analitica accettabile attraverso la sequenza analitica.

5. Preelaborazione dei dati e analisi statistica

1. Importare file grezzi di cromatografia liquida-spettrometria di massa in software di elaborazione dati per l'allineamento del tempo di conservazione, la deconvoluzione, l'allineamento dei picchi e l'estrazione delle caratteristiche (vedi Tabella dei Materiali).
   1. Seleziona la prima iniezione QC in pool come riferimento di allineamento.
   2. Esegui l'allineamento del tempo di ritenzione, la deconvoluzione e l'allineamento dei picchi utilizzando il flusso di lavoro predefinito del software selezionato. Usa una tolleranza di tempo di ritenzione di ± 0,1 min e una tolleranza di massa di ± 5 ppm.
   3. Eseguire il picco di picking e mantenere caratteristiche con intensità superiore a 1000 conteggi presenti in almeno l'80% dei campioni di almeno un gruppo.
   4. Non applicare ulteriori normalizzazioni post-pre-preprocessing in nessuna delle due modalità ioniche.
   5. Esporta la tabella delle caratteristiche processate contenente m/z, tempi di conservazione e valori dell'area di picco.
   6. Tutte le trasformate Log2 hanno mantenuto le intensità di picco.
   7. Imputare valori mancanti con un quinto del valore positivo minimo per ogni caratteristica.
   8. Centrare ogni caratteristica nella media e dividere per la sua deviazione standard prima dell'analisi multivariata.
   9. Utilizzare la matrice trasformata e scalata per l'analisi delle componenti principali (PCA), l'analisi discriminante parziale dei minimi quadrati (PLS-DA), l'analisi ortogonale dei minimi quadrati parziali discriminanti (OPLS-DA), il clustering e l'analisi di correlazione. Usa le intensità delle caratteristiche originali processate per i grafici di abbondanza.
2. Annota i metaboliti confrontando le caratteristiche con i database pubblici di metabolomica, inclusi il Human Metabolome Database (HMDB), la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e LIPID MAPS dove applicabile.
   1. Valuta ogni annotazione in base all'errore di massa degli ioni precursori, alla distribuzione isotopica e al matching dei frammenti della spettrometria di massa tandem. Assegnare un massimo di 20 punti a ciascun criterio.
   2. Applicare una finestra di errore di massa tra ioni precursori di 100 ppm e una finestra di errore di massa di ioni frammenti di 50 ppm. Non applicare una finestra fissa di tempo di conservazione.
   3. Conservare annotazioni con un punteggio totale di almeno 40 su 60. Escludere le annotazioni con punteggio più basso.
3. Definisci esplicitamente i gruppi di confronto come segue: A = T0 (prima dello sparring), B = T1 (subito dopo lo sparring) e C = T2 (24 ore dopo lo sparring).
4. Eseguire analisi statistiche a valle utilizzando software di calcolo statistico e pacchetti di analisi associati (vedi Tabella dei Materiali).
   1. Esegui un'analisi a componente principale (PCA) dopo la scala a varianza unitaria e visualizza i grafici dei punteggi.
   2. Costruire modelli di analisi parziale dei minimi quadrati discriminanti (PLS-DA) e analisi ortogonale parziale dei minimi quadrati discriminanti (OPLS-DA) per A contro B, B contro C e A contro C.
   3. Usare la validazione incrociata a 7 volte quando il numero di campione è almeno 7. Se il numero di campioni è inferiore a 7, si imposta il numero di pieghe uguale al numero di campioni.
   4. Eseguire 200 test di permutazione per valutare la validità del modello.
   5. Selezionare i metaboliti differenziali applicando le seguenti soglie: cambiamento di piegamento (FC) ≥ 2 o FC ≤ 0,5, importanza variabile nella proiezione (VIP) ≥ 1 e test t P. < 0,05.
   6. Genera grafici dei vulcani e grafici statistici correlati per confronti a coppie.
   7. Genera heatmap utilizzando la matrice trasformata log2 e scalata a varianza unitaria.
   8. Generare heatmap di correlazione con una soglia di significatività di P ≤ 0,05 e visualizzare fino a 20 metaboliti.
   9. Determinare il numero ottimale di cluster prima del clustering k-means. Eseguire il clustering k-means dopo la scala della varianza delle unità.
   10. Genera grafici a barre di abbondanza dalle intensità originali delle caratteristiche processate.
   11. Generare diagrammi di Venn per riassumere la sovrapposizione tra i confronti a coppie.
   12. Eseguire l'analisi delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) per metaboliti selezionati. Valutare le prestazioni diagnostiche in base all'area sotto la curva (AUC).
5. Mappare i metaboliti differenziali alle vie KEGG utilizzando una funzione di arricchimento delle vie in un pacchetto bioinformatico appropriato (vedi Tabella dei Materiali).
   1. Interpretare i percorsi con P. < 0,05. Non è stata riportata alcuna correzione con test multipli nel record finale dell'analisi.

Results

Controllo Qualità (QC) Validazione dei dati LC-QTOF-MS/MS

Per valutare la stabilità e la riproducibilità del segnale, sono state analizzate ripetute iniezioni del campione QC aggregato in entrambe le modalità ioniche. I coefficienti di correlazione di Spearman tra le iniezioni QC aggregate superavano 0,8 in entrambe le modalità ioniche, il che indicava prestazioni stabili dello strumento lungo tutta la sequenza analitica. La PCA di tutti i cam...

Discussion

Questo flusso di lavoro standardizzato ha caratterizzato i cambiamenti metabolitici associati allo sparring d'élite nella boxe e al recupero a breve termine in una piccola coorte controllata. Le iniezioni QC aggregate, l'analisi di correlazione basata su QC, il clustering PCA e le analisi multivariate hanno sostenuto insieme una stabilità analitica accettabile. Il successo del protocollo dipendeva principalmente da quattro fattori: mantenere l'intensità dello sparring entro l'80%–85% del...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti	Acetonitrile	Merck	Grado LC-MS, CAS 75-05-8
Reagenti	Metanolo	Merck	Grado LC-MS, CAS 67-56-1
Reagenti	Acido formico	TCI	Grado LC-MS, CAS 64-18-6
Consumabili	TUBA VACUETTE CAT Attivatore del siero coagulante	Greiner Bio-One	Tubo attivatore del coagulo sirico da 8 mL
Consumabili	Fiala criogenica di Nalgene	Thermo Fisher Scientific	1,5 mL, filettatura esterna
Consumabili	Tubo di legame proteico	Eppendorf	Cat. N. 0030108442, 1,5 mL
Vetro	Fiala di vetro con tappo a vite e inserto	Agilent	Fiala da 2 mL con 200 e mu; Inserto in vetro a L; inserisci Cat. N. 5183-2090
Consumabili	Filtro Millex-GP	Merck	Cat. No. SLGP033RS, 0,22 μ Membrana m
Strumenti	Ring da pugilato personalizzato 6x6 m	Muay Thai Sport	6 e volte; Ring di allenamento da 6 m
Consumabili	Guanti da boxe Pro Style 2	Everlast	16 oz
Strumenti	Polar H10	Polare	Sensore di frequenza cardiaca con fascia toracica
Strumenti	Quasar	h/p/cosmos	Tapis roulant motorizzato
Strumenti	Centrifuga 5425 R	Eppendorf	Microcentrifuga refrigerata
Strumenti	Bransonic CPX2800	Emerson / Branson	Bagno a ultrasuoni digitale a 40 kHz
Strumenti	Savant SpeedVac SPD1030	Thermo Fisher Scientific	Concentratore di vuoto integrato
Strumenti	Miscelatore Mini Vortice VWR	Avantor / VWR	Cat. N. 10153-688
Strumenti	TSX ULT Freezer	Thermo Fisher Scientific	Modello TSX50086A
Strumenti	ACQUITY UPLC I-Class PLUS	Acque	Sistema UHPLC
Strumenti	Xevo G2-XS QTof	Acque	Spettrometro di massa QTOF
Strumenti	Colonna T3 ACQUITY UPLC HSS	Acque	P/N 176001132, 1,8 e mu; m, 2.1 e volte; 100 mm
Software	MassLynx	Acque	Versione 4.2
Software	Progenesi QI	Acque	Versione 2.3
Software	R	R Foundation for Statistical Computing	Versione 3.6.1
Software	PRCOMP	base R	Funzione base R
Software	ROPLS	Bioconduttore	Pacchetto R
Software	Pheatmap	CRAN	Pacchetto R
Software	corrplot	CRAN	Pacchetto R
Software	kmeans	base R	Funzione base R
Software	NbClust	CRAN	Pacchetto R
Software	venn	CRAN	Pacchetto R
Software	MetaboAnalystR	CRAN / Laboratorio Xia	Versione 1.0
Software	pROC	CRAN	Versione 1.15.0
Software	clusterProfiler	Bioconduttore	Pacchetto Bioconductor
Banche dati	Database del Metaboloma Umano (HMDB)	HMDB	Database online
Banche dati	Enciclopedia di Geni e Genomi di Kyoto (KEGG)	KEGG	Database online
Banche dati	MAPPE LIPIDICHE	MAPPE LIPIDICHE	Database online