Sintesi verde di nanoparticelle d'oro e argento utilizzando estratti vegetali, filtrati fungini e colture batteriche

Sommario

Questo protocollo descrive metodi di sintesi verde riproducibile per la fabbricazione di nanoparticelle d'oro e argento utilizzando estratti vegetali, filtrati fungini e colture batteriche, seguiti da conferma di nanoparticelle tramite spettroscopia ultravioletto-visibile e microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

La sintesi verde di nanoparticelle metalliche (NP) utilizzando sistemi biologici offre un'alternativa sostenibile ai metodi convenzionali di fabbricazione chimica. Questo protocollo presenta procedure sperimentali e analitiche riproducibili per la sintesi di NP d'oro (Au) e argento (Ag) utilizzando colture batteriche, filtrati fungini ed estratti di foglie vegetali come agenti riducenti e stabilizzanti. Gli AgNP sono stati sintetizzati utilizzando estratti da Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicifera ed Earliella sp., mostrando caratteristiche bande di assorbimento ultravioletta-visibile (UV–Vis) tra 405 e 425 nm che hanno confermato la formazione di NP. È stato implementato un approccio di progettazione di esperimenti per valutare l'influenza di fattori ambientali, tra cui condizioni di ossigeno, pH, concentrazione di Auno, concentrazione cellulare, tipo di donatore di elettroni e temperatura, sulla sintesi degli AuNP da parte di Shewanella oneidensis e Cupriavidus metallidurans. In condizioni ideali (0,2 mM Au e pH 5), S. oneidensis produceva prevalentemente AuNP sferici con una dimensione media di 43,6 ± 11,0 nm e un caratteristico picco di assorbimento a 520 nm. La formazione e la morfologia NP sono state confermate tramite spettroscopia UV–Vis e microscopia elettronica a trasmissione. Questo flusso di lavoro fornisce una piattaforma riproducibile per la sintesi di NP biogenici e supporta applicazioni nel biosensing, nella biorimediazione e nelle tecnologie antimicrobiche.

Introduzione

Le nanoparticelle metalliche (NP) possiedono proprietà fisicochimiche uniche associate alla loro elevata superficie superficiale, tra cui comportamenti elettronici, magnetici e catalitici distintivi, oltre ad un'elevata reattività. Queste caratteristiche ne hanno promosso l'applicazione in molteplici campi, tra cui medicina per la diagnosi di malattie e la somministrazione di farmaci 1,2,3,4,5,6, cosmetici per formulazioni di creme ^{solari 7}, elettronica per transistor e celle^{solari 8}, ingegneria ambientale per il trattamento delle acque ^2,9,10, e l'agricoltura per fertilizzanti e^{pesticidi 11,12}. L'espansione continua delle applicazioni NP tra discipline si riflette nell'aumento del numero di pubblicazioni correlate riportate negli ultimi^{anni 13,14}.

I metodi sintetici per le NP metalliche consentono un controllo preciso su caratteristiche importanti come dimensione delle particelle, morfologia e stabilità, rendendo il processo di sintesi un fattore determinante cruciale delle prestazioni NP. I metodi convenzionali di sintesi chimica sono stati ampiamente ottimizzati; tuttavia, spesso coinvolgono reagenti tossici, elevato consumo energetico e costi di produzione^{elevati 14,15}. Queste limitazioni hanno motivato lo sviluppo di alternative più verdi e sostenibili. Gli approcci di sintesi verde impiegano sistemi biologici come estratti ^{vegetali 16,17}, microrganismi tra cui funghi e batteri¹⁸, e^{alghe 19} come agenti naturali riducenti e stabilizzanti. Durante questi processi, i sali metallici vengono ridotti a forme zero-valenti, generando NP attraverso percorsi ecologici ed economici. Inoltre, i NP sintetizzati biologicamente sono spesso biocompatibili, facilitando il loro utilizzo in applicazioni mediche, agricole e^{ambientali 8,14}.

La scelta di una via biologica appropriata per la sintesi NP dipende dall'applicazione prevista, nonché dalle infrastrutture e dai requisiti operativi disponibili. La sintesi a base vegetale è generalmente preferita per una produzione rapida e a basso costo di NP perché richiede una gestione sterile minima; tuttavia, la variabilità nella composizione dell'estratto può influenzare la riproducibilità^20,21. La sintesi mediata dai funghi può fornire elevate rese NP e enzimi extracellulari che migliorano la stabilizzazione NP e il processo a valle, anche se questo approccio richiede periodi di coltivazione più lunghi e condizioni di crescita^{controllate 22}. Al contrario, i sistemi batterici permettono la sintesi sintonizzabile in condizioni metaboliche definite e la rapida produzione di biomassa, rendendoli adatti a studi meccanicistici e applicazioni associate^{alla NP 22}. Tuttavia, la sintesi batterica spesso richiede una gestione asettica rigorosa, condizioni controllate del bioreattore e ulteriori processi a valle quando vengono recuperati NP^{intracellulari 21,22}.

Nonostante i vantaggi menzionati, i metodi di sintesi verde continuano ad affrontare sfide associate alla riproducibilità e alla standardizzazione. Inoltre, protocolli visivi dettagliati passo dopo passo per la sintesi verde dei NP metallici restano^{limitati a 23}, limitando la capacità dei ricercatori di riprodurre e implementare con successo le metodologie esistenti. L'obiettivo di questo lavoro è presentare protocolli di sintesi verde riproducibile per NP d'oro (Au) e argento (Ag) utilizzando estratti vegetali, filtrati fungini e colture batteriche. In particolare, per la sintesi NP sono stati impiegati estratti acquosi da Psidium guayaquilensis e Acanthophora spicefera, filtrati fungini extracellulari da Earliella sp. e sistemi batterici che coinvolgono Shewanella oneidensis e Cupriavidus metallidurans . I protocolli presentati sottolineano i passaggi critici nella preparazione dell'estratto biologico, nella sintesi NP e nella caratterizzazione preliminare degli NP. Inoltre, il flusso di lavoro integra la progettazione degli esperimenti, procedure di preparazione standardizzate e caratterizzazione in linea per supportare la sintesi riproducibile e ottimizzabile di NP biogenici.

Protocollo

La ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida istituzionali della Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL, Ecuador). La biomassa vegetale, algale e fungina utilizzata in questo studio è stata raccolta da ambienti accessibili e non ha coinvolto specie protette o aree restritte. Secondo le normative istituzionali e nazionali, non erano richiesti permessi specifici per la raccolta della biomassa liberamente disponibile in queste condizioni. Consulta la Figura 1 per il flusso di lavoro sperimentale integrato utilizzato per la sintesi verde di AgNP e AuNP utilizzando sistemi biologici vegetali, algali, fungini e batterici.

Figura 1: Flusso di lavoro integrato per la sintesi verde di nanoparticelle (NP) d'argento (Ag) e oro (Au) utilizzando sistemi biologici. Schema del flusso di lavoro sperimentale per la sintesi verde di AgNP e AuNP utilizzando sistemi vegetali, algali, fungini e batterici. Il flusso di lavoro illustra la selezione delle sorgenti biologiche, la preparazione di estratti o biomassa, la reazione con precursori metallici (_{AgNO 3} o HAuCl₄), le condizioni di reazione e la formazione di NP. I sistemi biologici includono estratto di foglia di Psidium guayaquilensis , estratto di alga Acanthophora spicifera , filtrato extracellulare di Earliella sp. e colture batteriche MR-1 di Shewanella oneidensis . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: Segui tutte le linee guida di sicurezza dei laboratori istituzionali quando manipolano sostanze chimiche e materiali biologici. Consultare le schede dati di sicurezza di tutti i reagenti prima dell'uso.

1. Sintesi degli AgNP utilizzando foglie di P. guayaquilensis

1. Collezione di foglie
   1. Raccogliere foglie fresche di P. guayaquilensis durante la stagione secca a Guayaquil, provincia di Guayas, Ecuador (2°10′S, 80°0′W).
      NOTA: Esemplari voucher di questa specie endemica sono stati depositati presso l'Erbario GUAY della Facoltà di Scienze Naturali dell'Università di Guayaquil, Ecuador, e presso l'erbario Steere del New York Botanical Garden (NYBG), New York, USA. Ulteriori informazioni sono disponibili su: http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. Preparazione dell'estratto di foglia
   1. Lava accuratamente il materiale vegetale fresco con acqua distillata.
      NOTA: Assicurarsi la completa rimozione delle impurità superficiali.
   2. Asciuga le foglie in un asciugatore a vassoio con flusso d'aria forzato a 40°C.
      NOTA: Temperature di essiccazione basse minimizzano la degradazione dei composti organici termolabili coinvolti nella riduzione dell'Ag⁺ .
   3. Macina il materiale secco con una mulina manuale per ottenere una polvere fine.
   4. Sospendere 10 g di materiale in polvere in 200 mL di acqua distillata.
   5. Riscalda la sospensione a 70°C sotto una mescolata continua per 1 ora.
   6. Lascia raffreddare l'estratto a temperatura ambiente (RT, ~28°C).
   7. Filtrare l'estratto sotto vuoto attraverso carta filtrante di qualità (Grado 1, poro dimensione 11 μm, diametro 110 mm).
      NOTA: Rimuovere tutti i residui solidi dal materiale vegetale.
   8. Conserva l'estratto filtrato a 4°C in bottiglie ambrate fino a un nuovo utilizzo.
3. Fabbricazione di AgNP fitogenici utilizzando estratti di foglie
   NOTA: Durante gli esperimenti di ottimizzazione, variare un parametro per ogni analisi mantenendo costanti i parametri rimanenti. Valutare la concentrazione di nitrato d'argento (_{AgNO 3}) (1–5 mM), la frazione di estrazione (10%–50% v/v), il tempo di reazione (0,5–1 h) e la temperatura (25°C–80°C). Ottimizzare i parametri di sintesi utilizzando la metodologia della superficie di risposta basata su un DoE composito centrale. Studia ogni fattore a cinque livelli (-α, -1, 0, +1 e +α). Usa la lunghezza d'onda del picco di risonanza plasmonica superficiale (SPR) (λ_SPR), che corrisponde alla dimensione NP, come variabile di risposta²⁴. Il disegno sperimentale consiste in 16 punti fattoriali, 8 punti assiali e 5 repliche a punto centrale, per un totale di 29 esperimenti.
   1. Preparare soluzioni di_{AgNO 3} dissolvendo la massa appropriata di_{AgNO 3} in acqua distillata per ottenere concentrazioni comprese tra 1 e 5 mM.
      ATTENZIONE:_{AgNO 3} è corrosivo e un forte agente ossidante che può causare irritazione alla pelle e agli occhi. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti e protezione per gli occhi. Evitare l'esposizione alla luce e smaltire i rifiuti contenenti Ag secondo le linee guida istituzionali di sicurezza.
   2. Mescola la soluzione di_{AgNO 3} con l'estratto vegetale per ottenere frazioni di estratto comprese tra il 10% e il 50% (v/v).
   3. Riscaldare e mescolare la miscela di reazione alla temperatura selezionata (25°C–80°C) per il tempo di reazione desiderato (0,5–1 ora).
   4. Lascia che la miscela di reazione rimanga a RT per 24 ore.
   5. Centrifuga la miscela marrone a reazione a 1660 × g per 15 minuti a RT. Scartare il soprantantante e raccogliere la frazione solida.
   6. Asciuga le NP recuperate in forno a 60°C.

2. Sintesi degli AgNP utilizzando estratti di alghe di A. spicifera

1. Collezione di alghe
   1. Raccogliere l'alga A. spicifera a Valdivia, provincia di Santa Elena, Ecuador (1°57′23.91′S, 80°43′51.33′′W).
2. Preparazione dell'estratto algale
   1. Preparare l'estratto algale seguendo la procedura descritta nel Passo 1.2. Sostituire le foglie della pianta con biomassa algale di A. spicifera .
3. Fabbricazione di AgNP Ficogenici utilizzando estratti di alghe
   NOTA: Eseguire una serie di 12 esperimenti variando un parametro alla volta mantenendo costanti i parametri rimanenti. Valutare la concentrazione di_{AgNO 3} (1–5 mM), la frazione di estrazione (5%–25% v/v), il tempo di reazione (1–4 h) e la temperatura (25°C–70°C).
   1. Preparare le soluzioni_{AgNO 3} e l'estratto delle alghe come descritto nei passaggi 1.3.1 e 2.2.
   2. Mescola la soluzione di_{AgNO 3} con l'estratto di alga per ottenere una frazione estratta dal 5%–25% (v/v). Riscaldare e mescolare la miscela di reazione alla temperatura selezionata (25°C–70°C) per il tempo di reazione desiderato (1–4 ore).
   3. Lascia raffreddare la soluzione per RT per 24 ore. Raccogli la frazione solida dopo la centrifugazione e asciugala in forno come descritto nei passaggi 1.3.5 e 1.3.6.

3. Sintesi degli AgNP utilizzando Earliella sp.

1. Raccolta e Manutenzione della Cultura
   1. Trasferire frammenti miceliali in crescita attiva di Earliella sp. sulle piastre di agar di patata con destrosio.
      NOTA: Il ceppo fungino utilizzato in questo studio è stato isolato da campioni ambientali raccolti nel campus dell'ESPOL, Ecuador. L'isolato è stato identificato tassonomicamente sulla base delle caratteristiche morfologiche e conservato nella collezione di colture del Biotechnology Research Center of Ecuador (CIBE, ESPOL) con il codice interno E2. Poiché questa varietà è mantenuta in una collezione istituzionale e non è stata depositata in un archivio internazionale, non è disponibile alcun numero RRID o di accessione esterna.
   2. Incubare le placche a 28°C per 48 ore.
   3. Trasferire un frammento miceliale nel brodo di patate destrosio e incubare la coltura sotto agitazione costante a 150 giri al minuto per 5 giorni.
      NOTA: Questo passaggio promuove la produzione di biomassa e la secrezione di metaboliti extracellulari.
   4. Filtrare la coltura fungina attraverso carta filtrante sterile per separare la biomassa miceliale dal brodo extracellulare. Raccogli il filtrato per la successiva sintesi NP.
      NOTA: Il brodo extracellulare contiene biomolecole che funzionano come agenti riducenti e stabilizzanti durante la sintesi dell'AgNP.
2. Fabbricazione degli AgNP micogenici
   NOTA: Generare 14 condizioni sperimentali variando un parametro per saggio mantenendo rapporti di volume costanti tra il brodo fungino e la soluzione di_{AgNO 3} . Valutare la concentrazione di_{AgNO 3} (1–10 mM), il pH (4–10 regolato usando HCl o NaOH), il tempo di reazione (1–4 h) e la temperatura (25°C–70°C).
   ATTENZIONE: L'acido cloridrico (HCl) e l'idrossido di sodio (NaOH) sono altamente corrosivi. Indossa l'attrezzatura di protezione personale adeguata ed effettua regolazioni di pH lentamente sotto una mescolata continua per evitare schizzi e surriscaldamenti localizzati. Usa 1 M di soluzioni acido o basico durante la regolazione del pH.
   1. Mescola il brodo extracellulare fungino con una soluzione di_{AgNO 3} alla concentrazione desiderata (1–10 mM) utilizzando un rapporto di volume tra il 2,5% e il 10% (v/v) per ottenere un volume finale di reazione di 50 mL. Regolare il volume finale di reazione in base alla condizione sperimentale testata.
   2. Mescolare la miscela di reazione alla temperatura selezionata (25°C–70°C) per il tempo di reazione desiderato (1–4 ore). Lascia raffreddare la soluzione per RT per 24 ore. Raccogli la frazione solida dopo la centrifugazione e asciugala in forno come descritto nei passaggi 1.3.5 e 1.3.6.

4. Sintesi degli AuNP utilizzando C. metallidurans e S. oneidensis

1. Raccolta e Manutenzione della Cultura
   1. Inoculare stock cellulari congelate conservate al 20% di glicerolo a −80°C di C. metallidurans CH34 o S. oneidensis MR-1 su piastre di agar di soia triptiche in condizioni aerobiche. Incubare le placche a 28°C per 24 ore.
   2. Seleziona una singola colonia da ogni piastra e inoculala in 250 mL di brodo di soia triptico in condizioni aerobiche. Incubare la coltura a 28°C in uno shaker rotante che funziona a 120 giri/min.
   3. Prelevare le cellule nella fase stazionaria dopo 72 ore di incubazione, quando la densità ottica a 610 nm (OD₆₁₀) raggiunge circa 1. Centrifugare le colture a 10000 × g per 10 minuti a ~20°C.
   4. Lava i pellet raccolti due volte con una soluzione sterile di NaCl allo 0,9% (p/v). Concentrare le celle lavate a un valore OD₆₁₀ di circa 7.
   5. Generare stock di celle concentrate anossiche degassando le sospensioni e riempiendo lo spazio di testa con gas_N2 .
2. Fabbricazione di AuNP batteriogeni
   NOTA: Utilizzare una matrice fattoriale frazionaria per valutare l'influenza dei fattori ambientali sulla sintesi dell'AuNP²⁵. Costruire la matrice utilizzando 7 fattori a 2 livelli selezionati secondo studi precedenti^26,27. Organizzare gli esperimenti in una matrice ortogonale e randomizzare l'ordine sperimentale per minimizzare il bias tentativo-combinazione. L'ordine sperimentale risultante è presentato in Tabella 1.
   1. Sciogliere il cloruro d'oro triidrato (HAuCl₄) in acqua deionizzata per preparare una soluzione di riserva a 5 g L⁻¹.
      ATTENZIONE: HAuCl₄ è tossico e un forte agente ossidante. Maneggiare tutte le soluzioni all'interno di una cappa chimica certificata indossando l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Evitare il contatto con materiali organici e smaltire i rifiuti secondo i protocolli istituzionali per i rifiuti pericolosi.
   2. Preparare i reattori sperimentali diluendo la soluzione standard alla concentrazione target in soluzione NaCl allo 0,9% (p/v) e regolando il pH secondo le condizioni sperimentali elencate nella Tabella 1.
   3. Distribuire 50 mL della soluzione metallica preparata in flaconi puliti di siero da 120 mL. Sigilla immediatamente ogni bottiglia usando un tappo in gomma butilica.
   4. Fissa il tappo usando una guarnizione in alluminio a crimpare e un crimper portatile. Sterilizza le bottiglie di siero sigillate autoclavandole a 121°C per 21 minuti.
   5. Lascia raffreddare le bottiglie in RT e ispeziona visivamente ogni bottiglia per eventuali precipitazioni.
      NOTA: Scartare le bottiglie che mostrano precipitazioni visibili e preparare i reattori sostitutivi.
   6. Istituzione delle condizioni anossiche
      1. Collega ogni bottiglia di siero sterilizzato a un sistema di collettori a gas dotato di una fonte di azoto ad alta purezza (N₂) e di una pompa a vuoto.
      2. Genera uno spazio di testa anosico eseguendo 21 cicli di purga consecutivi per ogni reattore che richiedono condizioni anossiche secondo la Tabella 1. Durante ogni ciclo, applicare il vuoto seguito da un riempimento dell'azoto per circa 30 secondi fino a quando la pressione interna non ritorna approssimativamente alla pressione atmosferica (~1 atm).
         NOTA: Non è richiesta la verifica diretta delle condizioni anossiche; tuttavia, l'analisi dei gas nello spazio di testa, come la cromatografia dei gas, può essere utilizzata per confermare la rimozione dell'ossigeno quando necessario.
         ATTENZIONE: Il gas azoto può spostare l'ossigeno e creare un rischio di asfissia in spazi chiusi. Assicurarsi una ventilazione adeguata in laboratorio e verificare le connessioni sicure delle tubature del gas prima dell'uso.
      3. Mantieni i reattori sotto una leggera pressione positiva di_{N 2} dopo il ciclo finale di purga.
      4. Etichetta i reattori da 1 a 8 secondo l'ordine sperimentale. Ad esempio, etichettare la quinta condizione sperimentale come R5.
   7. Aggiunta di donatori di elettroni e inoculazione
      1. Iniettare il volume richiesto di soluzione sterile di donatore di elettroni liquidi anosici, come il lattato di sodio, nella fase liquida dei reattori designati secondo la Tabella 1 utilizzando una siringa e un ago sterili.
      2. Iniettare il volume richiesto di donatore di elettroni gassosi, come H₂, nello spazio di testa designato del reattore utilizzando una siringa a tenuta gas.
      3. Inoculare tutti i reattori biotici iniettando asetticamente il volume richiesto di coltura microbica anossica concentrata nella fase liquida.
         NOTA: Conservare colture di stock concentrate a 4°C prima dell'inoculazione per mantenere la vitalità cellulare.
   8. Impostazione degli esperimenti di controllo
      1. Preparare un controllo abiotico seguendo tutti i passaggi descritti nello Passo 4.2, sostituendo l'inoculo microbico con un volume equivalente di mezzo di coltura anossica sterile o tampon.
      2. Prepara un controllo delle cellule morte seguendo tutti i passaggi descritti nel Passo 4.2 utilizzando un inoculo sterilizzato tramite autoclaving.
         NOTA: Utilizzare i controlli per tenere conto della riduzione e biossorbizione dei metalli abiotici. Preparare il controllo delle cellule uccise autoclavando le cellule vitali a 121°C per 21 minuti per valutare il contributo dei meccanismi microbici attivi.
   9. Incubazione e tempo di reazione
      1. Metti tutte le bottiglie di sero in incubatori a temperatura controllata.
      2. Regolare la temperatura di incubazione secondo le condizioni sperimentali specificate nella Tabella 1.
      3. Posizionare gli incubatori su piattaforme rotative e incubare i reattori a 120 giri/min.
      4. Lascia che le reazioni procedano per 72 ore.
         NOTA: Mettere in pausa l'esperimento dopo l'incubazione e conservare le bottiglie di sero a 4°C fino alla lavorazione del campione.
         NOTA: Opzionalmente quantificare il metallo disciolto residuo dopo la biosintesi NP utilizzando spettroscopia di emissione ottica a plasma accoppiato induttivamente per valutare l'efficienza di rimozione del metallo e distinguere la formazione di NP dalle specie disciolte residue.
3. Replicazione delle condizioni ottimali
   1. Identificare la condizione del reattore associata alla massima rimozione del metallo dopo lo screening primario e l'analisi dei dati.
   2. Replicare la condizione ottimale selezionata in tre bombole di reattore indipendenti per confermare la riproducibilità.
   3. Eseguire la preparazione, l'installazione del reattore e le procedure di incubazione per gli esperimenti di verifica triplicata secondo i Passaggi 4.1 e 4.2.
      NOTA: Dopo il completamento degli esperimenti, conservare e etichettare temporaneamente tutte le soluzioni disciolte come rifiuti acquosi fino allo smaltimento da parte di aziende certificate di gestione dei rifiuti secondo il Codice Organico Nazionale dell'Ambiente e le linee guida tecniche istituzionali.

Reattore / Batteri	Temperatura (°C)	Atmosfera	Donatore di elettroni	Densità ottica (OD610)	pH	[Gold] (mM)
1 / CMC	37	N2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	N2	C3H 5O3−	1	1	0.2
3 / SOM	37	O2	C3H 5O3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / SOM	37	N2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H 5O3−	1	5	2
7 / SOM	28	N2	C3H 5O3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

Tabella 1: Disegno sperimentale fattoriale frazionario utilizzato per la sintesi batteriogenica di AuNP. Questa tabella riassume le condizioni sperimentali valutate per la sintesi di AuNP utilizzando S. oneidensis MR-1 (SOM) o C. metallidurans CH34 (CMC). Le variabili includevano temperatura di incubazione, atmosfera di headspace, donatore di elettroni, densità ottica dell'inoculo (OD₆₁₀), pH della soluzione e concentrazione iniziale di Au³⁺ .

5. Caratterizzazione degli AgNP e degli AuNP

NOTA: Utilizzare la spettroscopia ultravioletto-visibile (UV–Vis) come metodo accessibile per confermare la formazione NP tramite risonanza plasmonica superficiale. Utilizzare la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per valutare direttamente la morfologia e la dimensione del NP. Ulteriori caratterizzazioni fisicochimiche possono essere eseguite utilizzando tecniche complementari come la diffusione dinamica della luce (DLS), la diffrazione dei raggi X (XRD), la spettroscopia a trasformata di Fourier nell'infrarosso (FTIR) e la spettroscopia a dispersione energetica (EDS) per valutare la distribuzione delle dimensioni, la cristallinità, la chimica superficiale e la composizione elementare quando è richiesta una caratterizzazione più^{completa 28,29}.

1. Spettroscopia UV–Vis
   1. Configurazione degli strumenti
      1. Accendi lo spettrofotometro UV–Vis e lascia riscaldare lo strumento per almeno 15 minuti per garantire la stabilità del segnale.
      2. Seleziona la modalità di scansione spettrale e configura l'intervallo di lunghezze d'onda da 300 a 800 nm utilizzando un intervallo dati di 1 nm.
2. Preparazione del campione
   1. Ritirare aliquote di sospensioni AgNP o AuNP appena sintetizzate. Diluire i campioni con acqua distillata quando necessario per mantenere i valori di assorbanza all'interno del range di rilevamento lineare.
3. Misurazione UV–Vis dei NP
   1. Esegui la correzione di base usando acqua distillata come soluzione pura.
   2. Trasferire il campione preparato in una cuvetta, posizionare la cuvetta nel portacampioni e registrare lo spettro UV–Vis nell'intervallo 300–800 nm.
   3. Identificare la banda SPR corrispondente alla formazione NP.
      NOTA: Gli AgNP tipicamente mostrano bande SPR tra 405 e 425 nm, mentre gli AuNP generalmente mostrano bande SPR tra 520 e 550 nm.
4. Microscopia elettronica a trasmissione
   NOTA: Analizza la morfologia e la dimensione NP utilizzando TEM operato a 80 kV e dotato di una fotocamera digitale ad alta risoluzione.
   1. Trasferire 1,5 mL di sospensione NP in un tubo centrifuga e centrifugare a 5000 × g per 5 minuti a RT.
   2. Scartate il soprantantante e conservate la pallina.
   3. Aggiungere 1 mL di soluzione fissante contenente il 4% di paraformaldeide e il 5% di glutaraldeide preparata in un tampone di cacodilato di 0,1 M alla pellet. Incubare il campione per 25 ore alla RT. Poi, lava il pellet tutta la notte con un tampone cacodilato di sodio a 0,1 M.
   4. Centrifugare il campione a 5000 × g per 5 minuti e scartare il soprantantante.
   5. Aggiungere 1 mL di tetrossido di osmio all'1% (p/v) (_{OsO 4}) preparato in un tampone di cacodilato di sodio 0,1 M per la fissazione per 3 ore.
      ATTENZIONE: OsO₄ è altamente tossico e volatile. Maneggiare tutte le soluzioni esclusivamente all'interno di una cappa chimica certificata, indossando l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza.
   6. Centrifugare il campione a 5000 × g per 5 minuti e scartare il soprantantante.
   7. Disidratare il campione usando una serie di etanolo gradato. Aggiungi il 50% di etanolo, incuba per 15 minuti. Ripeti la procedura in sequenza usando il 70% e il 90%. Disidratazione completa con tre incubazioni consecutive in etanolo assoluto per 30 minuti per incubazione.
   8. Immergi il pellet in resina epossidica a RT secondo le istruzioni del produttore.
   9. Preparare sezioni semisottili (~1 μm) e colorare le sezioni con blu toluidina per l'osservazione preliminare.
   10. Taglia sezioni ultrasottili (~60 nm) con un coltello diamantato e tingi le sezioni con acetato di uranile seguito da citrato di piombo.
   11. Monta le sezioni su griglie TEM e caricale nel microscopio elettronico a trasmissione.
   12. Acquisire immagini TEM per valutare la morfologia e la dimensione NP.

Risultati

Gli AgNP sono stati sintetizzati con successo tramite vie verdi e biosintetiche utilizzando diversi agenti biologici riducenti, e sono state identificate condizioni di sintesi ideali per ciascun metodo. Nella sintesi verde mediata dall'estratto fogliare di P. guayaquilensis , le condizioni ottimali consistevano in una concentrazione di_{AgNO 3} di 5 mM, un rapporto estratto-soluzione metallica del 25% (v/v), una temperatura di reazione di 80°C e un tempo di agitazione di...

Discussione

Confrontando le vie di sintesi valutate in termini di fattibilità, controllo della dimensione NP, costo operativo, riproducibilità ed efficienza complessiva del processo, la sintesi mediata da piante utilizzando estratto di foglie di P. guayaquilensis ha dimostrato il miglior equilibrio tra i metodi di sintesi di AgNP studiati. Questo protocollo ha fornito un controllo migliorato sulla dimensione del NP attraverso ottimizzazione sistematica e caratterizzazione microscopica diret...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Absolute ethanol	Merck	E7023	TEM dehydration series
Aluminum crimp seals	Dwk Wheaton	224178-01	Per flaconi di siero
Amber glass bottles	Duran	2180154	Conservazione protetta dalla luce
ATR-FTIR spectrometer	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Intervallo spettrale: 300–3600 cm-1
Autoclave	Yamato	SM300	Sterilizzazione a 121 °C
Butyl rubber stoppers	Dwk Kimble	73827-21	Sigillatura ermetica
Centrifuge	BIOBASE	BKC-TH20RL	Centrifuge da banco
Chloroauric acid trihydrate (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Precursore d'oro
Diamond knife	Aurion	Dyatom 45	Sezionamento TEM ultrasottile
Distilled or deionized water	Methrom	N/A	Preparazione della soluzione
Epoxy resin (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	Medium di incorporazione TEM
Filter paper, qualitative Grade 1	Merck Whatman	WHA1001110	Dimensione dei pori: 11 µm; diametro: 110 mm
Fourier transform infrared spectrometer (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Intervallo spettrale: 300–3600 cm-1
Gas manifold system	Custom-built	N/A	Per cicli di spurgo
Gas-tight syringe	Hamilton	1001 RN	1 mL
Glutaraldehyde	VWR	219859510	Glutaraldeide al 5%, paraformaldeide al 4% in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Preservazione allo stato 20%
Handheld crimper	Biomed	USYGQ-20Z	Sigillatura a crimpare manuale dei flaconi di siero
Hand mill/grinder	Corona	L10000	Macinazione della biomassa vegetale
Hydrochloric acid (HCl)	Merck	320331	Aggiustamento del pH
Hydrogen (H2) gas	Linde	Industrial grade	Gas donatore di elettroni
ICP-OES system	Varian	Vista-MPX	Quantificazione dei metalli
Incubator	Memmert	SM 400	Incubazione a temperatura controllata
Laboratory oven	Barnstead	M100	Asciugatura dei nanoparticelle
Lead citrate	Merck	7398	Colorazione TEM
Nitric acid (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Reagente acido
Nitrogen (N2) gas	Linde	Industrial grade	Condizioni anossiche
Osmium tetroxide (OsO4)	Merck	201030	Fissazione TEM
Paraformaldehyde	VWR	101176-014	Glutaraldeide al 5%, paraformaldeide al 4% in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M
Potato Dextrose Agar (PDA)	Merck	110130	Coltivazione fungina
Potato Dextrose Broth (PDB)	Merck	P6685	Mezzo microbiologico
Rotary shaker	JoanLab	OS-20Pro	Incubazione a agitazione controllata
Serum bottles (120 mL)	Wheaton	223748	Vetro borosilicato
Silver nitrate (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	Reagente ACS, ≥99,0%
Sodium cacodylate buffer	VWR	11650	Glutaraldeide al 5%, paraformaldeide al 4% in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	3957.1	Soluzione di lavaggio 0,9%
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Aggiustamento del pH
Sodium lactate	Sigma-Aldrich	L7022	Donatore di elettroni/fonte di carbonio
Sterile syringes and needles	BD	Various	Gestione di liquidi sterili
Stirring hot plate	Biologix	01-310X	Riscaldamento e agitazione
Toluidine blue	EMS	DcU-10	Colorazione di sezioni semi-sottili
Transmission electron microscope (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Dotato di fotocamera digitale ad alta risoluzione
Tray dryer with forced airflow	Handmade	N/A	Asciugatura della biomassa a 40 °C
Tryptic Soy Agar (TSA)	Oxoid	CM01301	Mezzo microbiologico
Tryptic Soy Broth (TSB)	Carl Roth	X938.1	Mezzo microbiologico
Uranyl acetate	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	Colorazione TEM
UV–Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 10S	Analisi spettrale UV–Vis
Vacuum pump	KNF or equivalent	N 820 G	Per condizioni anossiche
Materiali biologici
Materiale biologico	Fonte	Identificatore	Commenti/Descrizione
Acanthophora spicifera	Collezione locale	N/A	Biomassa di alghe marine
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	Stamma batterico
Earliella scabrosa	CIBE-ESPOL	E2	Collezione fungina istituzionale
Psidium guayaquilensis	Collezione locale	N/A	Biomassa di piante selvatiche
Shewanella oneidensis MR-1	BCCM/LMG	LMG 19005	Stamma di raccolta di colture