Un metodo per adattare Euglena gracilis a substrati a base di manioca per la coltivazione eterotrofa

Sommario

Questo protocollo descrive il metodo a passo per adattare Euglena gracilis a substrati a base di manioca e la successiva valutazione della crescita, della vitalità e della produzione di biomassa su molteplici prodotti di manioca in condizioni di coltivazione eterotrofe.

Abstract

La lavorazione della manioca genera sottoprodotti ricchi di nutrienti che rimangono sottoutilizzati a causa della composizione variabile, dei composti cianogeni e delle comunità microbiche attive. Questo protocollo presenta una strategia di adattamento a più stadi per stabilire una linea tollerante alla manioca di Euglena gracilis adatta alla coltivazione eterotrofa su substrati derivati dalla manioca. Il metodo inizia con l'esposizione simultanea delle colture di Euglena a mezzi di manioca autoclaviati e non autoclavati e a un gradiente di concentrazione garri di 10–30 g/L per valutare la tolleranza alla complessità microbica e al carico del substrato. Le colture vengono quindi sottoposte a un gradiente di concentrazione più elevato di 30–50 g/L per valutare le prestazioni con substrati più densi. La linea risultante viene confrontata con una varietà selvatica non adattata su cinque prodotti di manioca; garri, polpa escura, pellet, bucce e mangime per animali per valutare la consistenza della crescita nei materiali rilevanti per il campo. Il protocollo include la misurazione delle variazioni del pH, dei livelli di cianuro tramite strisce colorimetriche e la preparazione di biomassa essiccata per l'analisi proteica basata sulla quantificazione totale dell'azoto. Insieme, queste procedure forniscono un quadro riproducibile per adattare Euglena gracilis a substrati derivati dalla manioca e per valutare le prestazioni della varietà tra diversi prodotti di manioca manioca. Questo metodo consente lo sviluppo di linee algali robuste per l'uso in applicazioni di bioprocessazione e valorizzazione dei rifiuti focalizzate sulla manioca.

Introduzione

La manioca (Manihot esculenta) è una delle principali colture alimentari e industriali in tutta l'Africa occidentale, che genera sottoprodotti lavorati come garri, polpa escura, bucce e pellet^1.

I substrati derivati dalla manioca sono principalmente composti da carboidrati fermentabili e nutrienti residui, oltre a un contenuto minore di proteine e fibre, anche se la composizione può variare a seconda delle condizioni di lavorazione e della materia di^{partenza 2,3}. Rimangono sottoutilizzati a causa della loro composizione eterogenea, della presenza di glicosidi cianogeni e delle diverse comunità microbiche che si formano durante la lavorazione e la fermentazione^{tradizionali 4}. Queste caratteristiche rappresentano sfide per la coltivazione microbica diretta e limitano l'integrazione dei sottoprodotti della manioca nei flussi di lavoro standardizzati di bioprocessazione. Nonostante l'abbondanza di sottoprodotti derivati dalla manioca, attualmente manca metodi riproducibili e biosostenibili per coltivare sistemi microbici su questi substrati chimicamente complessi e microbiologicamente attivi. Un sistema di coltivazione in grado di arricchire o disintossicare una fonte alimentare così popolare, operando in modo affidabile in queste condizioni, supporterebbe flussi di lavoro più sostenibili per la lavorazione della manioca e un utilizzo circolare delle risorse.

Euglena gracilis è un flagellato unicellulare all'interno degli Euglenozoa⁵ , riconosciuto per la sua pellicola flessibile, la morfologia dinamica e le capacità reversibili di incisamento in risposta a notevoli fluttuazioni nella disponibilità di nutrienti, nella pressione osmotica e nella composizione^{chimica 6}. La sua adattabilità metabolica gli permette anche di sintetizzare il polisaccaride di stoccaggio^{paramylon 6} e di regolare il pH cellulare tramite il metabolismo degli acidi organici. Queste caratteristiche metaboliche, in particolare l'accumulo di paramylon, possono aumentare l'accumulo energetico e la tolleranza allo stress, supportando la sopravvivenza e l'adattamento nelle condizioni variabili di nutrienti e sostanze chimiche tipiche dei substrati derivati dalla manioca. Questi tratti permettono a E. gracilis di persistere in condizioni di acqua dolce chimicamente variabili, rendendolo un candidato promettente per la coltivazione su substrati eterogeni e non^{raffinati 7}.

Quando esposte a substrati chimicamente complessi o attivi a livello microbico, le colture di E. gracilis non adattate spesso mostrano risposte allo stress come aumento dell'incismino e ridotta motilità, mentre le popolazioni adattate possono mantenere una morfologia e un'attività metabolica più^{stabili 8}. Le interazioni con le comunità microbiche associate possono influenzare ulteriormente le prestazioni fisiologiche durante esposizioni prolungate a substrati complessi. Queste caratteristiche evidenziano la rilevanza degli approcci basati sull'adattamento nell'allevamento di E. gracilis su materiali derivati dalla^{manioca 9}.

Per affrontare queste sfide, questo metodo impiega una strategia di adattamento a stadi progettata per acclimatare gradualmente E. gracilis a substrati derivati dalla manioca. L'approccio incorpora un'esposizione controllata a una crescente complessità del substrato e attività microbica, permettendo la selezione di popolazioni in grado di mantenere la vitalità e la crescita in condizioni di coltivazione eterogenee. Questo design permette a E. gracilis di interagire con il microbiota associato e potenzialmente trarne vantaggi, adattandosi all'aumento delle concentrazioni di substrati.

Dopo l'adattamento, il protocollo conduce una valutazione comparativa delle linee di E. gracilis adattate e non adattate tra molteplici prodotti derivati dalla manioca. Questo quadro comparativo consente di valutare la consistenza della crescita, la stabilità morfologica e le risposte fisiologiche in condizioni di substrato rilevanti per il campo, poiché il processo di adattamento prepara gradualmente E. gracilis a navigare nella variabilità dei nutrienti, negli stress chimici e nell'attività microbica tipica dei sottoprodotti della manioca.

Il metodo incorpora il monitoraggio standardizzato dei livelli di pH e^{cianuro 10} durante la coltivazione, oltre alla preparazione della biomassa raccolta per l'analisi proteica a valle tramite quantificazione totale di azoto¹¹, permettendo il confronto del potenziale nutrizionale tra substrati e ceppi. Insieme, queste misurazioni supportano la valutazione della stabilità metabolica, delle interazioni con il substrato e delle caratteristiche della biomassa durante la coltivazione e l'adattamento basata sulla manioca, dimostrando che la linea adattata di E. gracilis può crescere in modo robusto e costante attraverso molteplici sottoprodotti della manioca.

Questo metodo è più adatto per contesti di laboratorio o ricerca applicata con accesso a infrastrutture microbiologiche di base e substrati derivati dalla manioca disponibili localmente. Le considerazioni pratiche includono la necessità di una gestione coerente di mezzi eterogenei, l'accesso alla microscopia per monitorare la salute della coltura e un controllo attento della miscelazione per evitare stress di taglio durante la coltivazione.

Protocollo

Questo protocollo utilizza protisti non patogeni e substrati vegetali derivati dalla manioca. Eseguire tutte le procedure secondo i requisiti istituzionali di biosicurezza e sicurezza chimica per i materiali vegetali cianogenici.

1. Preparazione e fermentazione di mezzi a base di manioca

ATTENZIONE: I materiali derivati dalla manioca possono contenere glicosidi cianogeni e possono rilasciare cianuro di idrogeno in determinate condizioni. Esegui tutte le fasi di pesata, idratazione, miscelazione e campionamento in una cappa chimica. Indossa un camice da laboratorio, guanti in nitrilo e occhiali di sicurezza. Decontaminare le superfici di lavoro dopo aver maneggiato substrati di manioca e smaltire i rifiuti solidi e liquidi come rifiuti chimici pericolosi secondo le linee guida istituzionali.

1. Preparare le sospensioni garri
   Nota: Il tipo selvatico Euglena gracilis è stato coltivato in condizioni di oscurità costante a 28°C con oscillazioni orbitali di 120 x g. La composizione del mezzo nutritivo eterotrofo è stata preparata come una formulazione definita composta dall'1,5% di glucosio, 0,5% estratto di lievito, 0,1% di KH2PO4, 0,1% di MgSO4, 0,2% (NH4)2SO4, 0,01% di CaCL2.2H2O più 0,4 mL/L di soluzione vitaminica stock (Vitamina B1: 2,50g/L; Vitamina B12: 12,5 mg/L; Vitamina B6: 0,5mg/L; Vitamina B7: 0,025 mg/L) e 2,0 mL/L di soluzione di macchio in tracce (Na2EDTA.2H2O: 25,00 g/L; FeCl3.6H2O: 21,00 g/L; ZnSO4.7H2O: 11,0 g/L; MnCl2.4H2O: 4,0 g/L; CuSO4.5H2O: 0,39 g/L; H3BO3: 0,285 g/L; Na2MoO4.2H2O: 0,9 g/L).
   1. Etichettare ogni fiaschetta sterile da 500 mL con il tipo di substrato (garri), la concentrazione target (10, 20, 30, 40 o 50 g ^L-1), l'ID replicato e la condizione di sterilizzazione programmata (autoclaviata o non autoclavata).
   2. Posiziona una barca di pesatura sulla bilancia analitica e premi TARE/Zero per impostare il display a 0,000 g.
   3. Pesare il garri per corrispondere al volume di lavoro finale (ad esempio, per 300 mL, pesa 3,0 g per 10 g ^L-1, 6,0 g per 20 g ^L-1, 9,0 g per 30 g ^L-1, 12,0 g per 40 g ^L-1 o 15,0 g per 50 g ^L-1).
      NOTA: L'intervallo di concentrazione selezionato (10–50 g ^L-1) è stato progettato per coprire condizioni che vanno dalla crescita di base all'elevato carico sul substrato, consentendo la valutazione dell'adattamento attraverso la crescente complessità fisicochimica.
   4. Aggiungi asepticamente il garri pesato in ogni fiaschetta sterile da 500 mL contenente acqua deionizzata o distillata da 300 mL e riapplica il tappo ventilato.
   5. Mescola ogni sospensione per 3 minuti, finché la miscela non si omogeneizza utilizzando uno dei seguenti approcci.
      NOTA: E. gracilis è sensibile alla tagliatura meccanica; Pertanto, sono state selezionate condizioni di miscelazione per minimizzare lo stress indotto dall'agitazione mantenendo un adeguato contatto tra cellule e substrato.
      1. Per la miscelazione manuale, stringi il tappo ventilato e fai roteare la fiaschetta a mano in un movimento circolare per 3 minuti finché i solidi non sono distribuiti uniformemente.
      2. Per la mescolare magnetica, aggiungi asepticamente una barra di agitazione sterile alla fiaschetta, posiziona la fiaschetta su una piastra di mescolamento e imposta la velocità a 200 x g per formare un vortice poco profondo senza schizzi.
   6. Lascia idratare la sospensione senza disturbo per 10 minuti a temperatura ambiente (25 °C).
   7. Immediatamente prima della fermentazione, omogeneizzare delicatamente la miscela stringendo prima il tappo di sfiato e facendo roteare le fiaschette a mano per 5 volte per sospendere il materiale sedimentato.
      NOTA: Il garri utilizzato in questo studio era un prodotto commerciale derivato dalla manioca. Sulla base delle informazioni nutrizionali fornite dal produttore, era principalmente composto da carboidrati, con quantità minori di proteine e un contenuto di grassi trascurabile. Questa composizione riflette i tipici substrati lavorati di manioca utilizzati in contesti alimentari e industriali.
2. Prepara ulteriori supporti a base di manioca
   1. Etichettare ogni fiaschetta sterile da 500 mL con il tipo di substrato (polpa essiccata, pellet, bucce o mangime per animali), concentrazione (30 g ^L-1), identificazione replicata e condizione di sterilizzazione (autoclaviata o non autoclavata).
   2. Posiziona una barca di pesatura sulla bilancia analitica e premi TARE/Zero per impostare il display a 0,000 g.
   3. Pesa il substrato per ottenere 30 g ^L-1 in base al volume di lavoro (ad esempio, per 300 mL, pesa 9,0 g).
   4. Aggiungi asepticamente il substrato pesato in ogni fiaschetta sterile contenente 300 mL di acqua deionizzata o distillata e riapplica il tappo ventilato.
   5. Idrata e mescola ogni sospensione utilizzando uno dei seguenti approcci.
      1. Per la miscelazione manuale, stringi il tappo dello sfiato e fai girare delicatamente la fiaschetta 10 volte ogni 3 minuti durante il periodo di idratazione.
      2. Per la mescolare magnetica, aggiungi asepticamente una barra sterile e mescola a 200 x g finché il materiale non è visibilmente idratato e distribuito uniformemente.
   6. Ispeziona visivamente ogni sospensione e conferma che i solidi siano idratati e che non rimangano grandi grumi secchi.
      NOTA: Non filtrare il substrato manioca a meno che non sia necessario per una misurazione analitica a valle.
3. Fermentazione aerobica di substrati a base di manioca
   1. Conferma che ogni fiaschetta sia dotata di un tappo sterile permeabile al gas ventilato per permettere lo scambio di gas minimizzando la contaminazione ambientale.
   2. Posizionare le fiaschette verticali a temperatura ambiente (25 °C) in un'area designata, lontana dalla luce diretta del sole e dal flusso d'aria ad alto traffico.
   3. Incubare senza agitazione per un minimo di 72 ore.
   4. Annota la data e l'orario di inizio della fermentazione per ogni fiaschetta e condizione.
4. Prepara i mezzi autoclavati
   1. Dopo la fermentazione, assicurati che ogni fiaschetta da 500 mL contenga ≤300 mL di liquido (≤ due terzi del volume totale) per evitare il ribollimento durante la sterilizzazione.
   2. Allenta il tappo ventilato in una posizione "stretta alle dita" adatta all'autoclaving e applica il nastro indicatore autoclave sulla fiaschetta.
   3. Carica le fiaschette nell'autoclave in un vassoio sicuro per autoclave e seleziona il ciclo liquido P13.
   4. Assicurati che i parametri di sterilizzazione siano a 121 °C per 30 minuti (sterilizzazione liquida) e inizia il ciclo.
   5. Dopo il ciclo, lascia che la pressione della camera dell'autoclave torni alla pressione atmosferica prima di aprire la porta. Rimuovi le fiaschette usando guanti resistenti al calore e lasciale raffreddare a temperatura ambiente.
   6. Conserva le fiaschette raffreddate durante la notte a temperatura ambiente prima dell'inoculazione.
      ATTENZIONE: Liquidi caldi e vapore possono causare ustioni. Apri lentamente lo sportello dell'autoclave e rimuovi le fiaschette solo dopo che la pressione si è equilibrata e i liquidi si sono raffreddati.
5. Prepara supporti non autoclavati
   1. Utilizzare direttamente il substrato fermentato della manioca senza autoclaving per preservare le comunità microbiche autoctone.
   2. Inoculare i mezzi non autoclavati immediatamente dopo il periodo di fermentazione di 72 ore per minimizzare la contaminazione ambientale non intenzionale.
   3. Mantenere una manipolazione costante tra le repliche utilizzando lo stesso tipo di recipiente (fiaschette sterili da 500 mL con tappo ventilato), lo stesso volume di lavoro (300 mL) e la stessa durata di fermentazione (≥72h) per tutte le condizioni del substrato.

2. Fondazione delle culture di inizio di E. gracilis

1. Mantenimento delle colture di razzi di E. gracilis
   1. Inoculare E. gracilis in un mezzo nutritivo eterotrofo fresco e incubare le colture in completa oscurità a 28 °C con scuotere orbitali continue a 120 x g fino a raggiungere una crescita logaritmica media.
   2. Esaminare le colture utilizzando un microscopio luminoso composto (campo chiaro) con ingrandimento totale 100×–400× (10× oculare con obiettivi 10×–40×) per confermare la motilità attiva, la tipica morfologia cellulare allungata e bassi livelli di incismatizzazione.
      NOTA: La vitalità è stata valutata sulla base della presenza di cellule intatte con confini cellulari definiti e detriti minimi. La motilità attiva è stata definita come il movimento direzionale osservabile delle cellule all'interno del campo visivo. La stabilità morfologica è stata valutata sulla base della predominanza delle forme cellulari caratteristiche e della bassa frequenza delle forme collassate o altamente irregolari.
   3. Escludere colture che presentino eccessive detriti cellulari, morfologia anomala o eccellenza elevata prima dell'uso negli esperimenti di adattamento.
2. Preparare l'inoculo per l'adattamento
   1. Omogeneizzare delicatamente le colture starter stringendo il tappo di sfiato e facendo roteare le fiaschette a mano per 15 secondi per garantire una distribuzione uniforme delle celle senza indurre stress di taglio.
   2. Determina la densità cellulare utilizzando un emocitometro di Neubauer.
      1. Mescola delicatamente la coltura facendo roteare a mano per 15 secondi.
      2. Pipetta 1,0 mL di coltura in un tubo sterile da 1,5 mL per microcentrifuga.
      3. Pulire l'emocitometro e il slip con etanolo al 70% e lasciarli asciugare all'aria.
      4. Pipetta 10 μL di coltura sulle due griglie dell'emocitometro e posiziona il copertura sul campione umido.
      5. Utilizzando la microscopia a campo chiaro (obiettivo 10×), concentrarsi sulla griglia e contare le celle in un insieme definito di quadrati (ad esempio, i 4 quadrati angolari della griglia grande).
      6. Applicare le regole standard dei confini (contare le celle che toccano i bordi in alto e sinistra; escludere le celle che toccano i bordi inferiore e destro).
      7. Ripeti i conteggi sulla seconda camera (e/o ricarica) e calcola la media delle celle/mL.
      8. Calcola la densità cellulare usando la seguente equazione: celle/mL= (media delle celle per quadrato × 10⁴× fattore di diluizione)/1
         Nota: Per migliorare la visualizzazione delle cellule, diluire il campione con acqua deionizzata secondo necessità (ad esempio, prendere un'aliquota di 100 μL del campione e diluire in 600 μL di acqua deionizzata, e ripetere la valutazione della densità cellulare)
   3. Regolare i volumi di inoculazione per ottenere un inoculo finale del 5% (v/v) su tutti i mezzi sperimentali.
      NOTA: I rapporti di inoculo selezionati sono scelti per garantire una sufficiente densità cellulare iniziale e il mantenimento delle colture.
   4. Prepara inocula separata per ogni condizione di trattamento per mantenere densità cellulari iniziali costanti tra i gruppi sperimentali.

3. Adattamento iniziale nei media di manioca autoclaviata e non autoclaviata

1. Mezzi di adattamento inoculati
   NOTA: I volumi dell'inoculo sono stati selezionati per bilanciare una densità cellulare iniziale sufficiente con la sensibilità agli effetti di adattamento, con volumi più bassi usati durante l'adattamento precoce e volumi più alti per mantenere colture stabili durante il passaggio di routine.
   1. Aggiungere l'inoculo preparato di E. gracilis su substrati di manioca autoclavi e non autoclavi preparati a concentrazioni finali di garri di 10 ^gL-1, 20 ^gL-1 e 30 ^gL-1.
   2. Utilizzare volumi di inoculazione uguali in tutte le condizioni di trattamento per standardizzare la densità cellulare iniziale.
   3. Per mescolare le colture, stringi il tappo ventilato e fai roteare delicatamente la fiaschetta in un movimento circolare per 15 secondi per distribuire le celle.
   4. Incubare le colture in completa oscurità a 25 °C per avviare la crescita eterotrofa.
2. Mantenere le condizioni culturali
   1. Per i mezzi non autoclavati, minimizzare l'agitazione per preservare la struttura della comunità microbica nativa e la stratificazione del substrato.
   2. Mescola tutte le colture una volta al giorno usando un delicato vortice manuale per 15 secondi per mantenere il contatto tra le cellule di E. gracilis e il materiale sospeso di maniocca.
      ATTENZIONE: Evitare scuote vigorose o agitazioni continue per prevenire stress di taglio e interruzioni involontarie delle interazioni microbio-substrato.
3. Monitorare l'adattamento precoce
   1. Ogni 48 ore, raccogli asepticamente 1 mL di campioni da ciascuna coltura usando punte di pipetta sterili.
      1. Stringi il tappo ventilato e fai girare delicatamente la fiaschetta di coltura per 15 secondi prima del campionamento per garantire una distribuzione uniforme delle cellule e del materiale sospeso.
      2. Trasferire un'aliquota di coltura in un tubo sterile per microcentrifuga da 1,5 mL.
      3. Diluire il campione con acqua deionizzata secondo necessità per migliorare la visualizzazione delle singole cellule. (ad esempio 100 μL di campione diluito in 600 μL di acqua deionizzata).
      4. Prepara il vetrino microscopico a montaggio umido pipettando 10 μL del campione diluito su un vetrino pulito e coprendo con un vetrino di copertura.
   2. Valutare le colture tramite microscopia chimica
      1. Esaminare i campioni utilizzando un microscopio a luce composta (campo chiaro) con un ingrandimento totale del 100× al 400× (10× oculare con obiettivi del 10× al 40×).
      2. Valutare la motilità cellulare, la morfologia e la frequenza dell'incisazione come indicatori dello stato di adattamento.
         NOTA: La vitalità è stata valutata sulla base della presenza di cellule intatte con confini cellulari definiti e detriti minimi. La motilità attiva è stata definita come il movimento direzionale osservabile delle cellule all'interno del campo visivo. La stabilità morfologica è stata valutata sulla base della predominanza delle forme cellulari caratteristiche e della bassa frequenza delle forme collassate o altamente irregolari.
4. Eseguire passaggi seriali durante l'adattamento
   NOTA: Gli intervalli di campionamento e trasferimento sono forniti come intervalli definiti per consentire la variabilità nella dinamica di crescita mantenendo al contempo un tempo sperimentale coerente tra le repliche.
   1. Ogni 7 giorni, trasferire asepticamente il 20% (v/v) di ogni coltura in substrati di manioca appena preparati con la stessa concentrazione di garri e condizione di sterilizzazione.
   2. Mantenere volumi di trasferimento costanti tra i passaggi per preservare la pressione di selección.
   3. Ripetere il passaggio seriale fino a quando le colture non mostrano crescita costante, motilità sostenuta e bassa frequenza di incisazioni in mezzo manioca ^L-1 a 30 g.
      Punto di pausa: Le colture possono rimanere indisturbate fino a 24 ore tra i passaggi di miscelazione e campionamento di routine.

4. Selezione ad alta concentrazione (30–50 g/L)

1. Preparare substrati ad alto carico
   1. Preparare mezzi di manioca a base di garri a concentrazioni finali di 30 ^gL-1, 40 ^gL-1 e 50 ^gL-1 seguendo le procedure descritte nel Metodo 1.
   2. Lasciare che i substrati si idratino completamente durante il periodo di fermentazione per garantire un'esposizione uniforme delle cellule ai componenti disciolti e particellati.
   3. Sospezione delicata delle particelle depositate facendo roteare delicatamente le fiaschette a mano per 10–15 secondi immediatamente prima dell'inoculazione.
2. Inoculare colture ad alto carico
   1. Inoculare ogni medium di manioca ad alta concentrazione con il 5% (v/v) della linea di E. gracilis precedentemente adattata a 30 ^gL-1 garri.
   2. Standardizzare i volumi di inoculazione su tutte le concentrazioni per mantenere densità cellulari iniziali comparabili.
   3. Incubare le colture in completa oscurità a 25 °C con scuotere orbitali continue a 120 x g per mantenere condizioni di crescita eterotrofe.
   4. Mescola le colture una volta al giorno con una leggera voluta manuale per 15 secondi per mantenere il contatto tra cellule e substrato sospeso senza indurre stress di taglio
3. Monitoraggio delle prestazioni sotto elevato carico di substrato
   1. Ispezionare le colture ogni 48 ore per rilevare cambiamenti visibili di torbidità, pigmentazione e interazione tra cellule di E. gracilis e materiale sedimentato di manioca di manioca.
   2. Raccogliere asepticamente piccole aliquote ed esaminare cellule utilizzando un microscopio luminoso composto a ingrandimento totale 100×–400× (10× oculare con obiettivi 10×–40×).
   3. Valutare la motilità, la morfologia cellulare e la frequenza dell'incisminamento come indicatori della tolleranza fisiologica all'aumento della concentrazione del substrato (Consulta il Metodo 2).
4. Confermare l'adattamento ad alte concentrazioni di substrato
   1. Identificare colture che mantengono motilità sostenuta, morfologia coerente e bassa frequenza di incisazioni a concentrazioni di manioca di ≥40 g ^L-1.
   2. Designare le colture che soddisfano questi criteri come la linea di gracili adattata alla manioca per una successiva valutazione sperimentale.

5. Test comparativi di crescita nei media a prodotto manioca

1. Preparare condizioni di test a coppie
   1. Per ogni prodotto di manioca, inclusi garri, polpa essiccata, pellet, bucce e mangimi per animali, prepara due recipienti identici contenenti la stessa concentrazione e volume nel substrato.
   2. Inoculare un vaso con la linea adattata alla manioca di E. gracilis e il vaso accoppiato con il ceppo di tipo selvatico non adattato.
   3. Utilizzare volumi di inoculazione uguali per ogni condizione accoppiata per garantire densità cellulari iniziali comparabili tra le linee
2. Mantenere culture accoppiate
   1. Incubare tutte le colture accoppiate in completa oscurità a 25 °C con scuotere orbitali continue a 120 x g per mantenere condizioni di crescita eterotrofe.
   2. Mescola colture una volta al giorno tramite inversione manuale delicata per mantenere il contatto tra cellule e substrato sospeso.
   3. Registra cambiamenti visibili, inclusi torbidità, pigmentazione e schemi di assestato, durante tutto il periodo di incubazione.
3. Registro delle differenze morfologiche osservate
   1. A intervalli di campionamento definiti, raccogliere asepticamente aliquote da ciascuna coltura per analisi microscopiche (vedere il Metodo 2.2 per la raccolta delle aliquote e l'analisi al microscopio)
   2. Esaminare i campioni utilizzando un microscopio a luce composta (campo chiaro) con un ingrandimento totale del 100× al 400× (10× oculare con obiettivi del 10× al 40×).
   3. Documentare le differenze tra colture adattate e di tipo selvatico per quanto riguarda la motilità, la frequenza degli incismi e la morfologia cellulare complessiva.

6. Monitoraggio del pH

1. Raccogliere campioni di pH
   1. Ai giorni 0, 3, 6, 9 e 12, preleva asepticamente 1 mL di coltura da ogni condizione sperimentale utilizzando punte sterili di pipetta.
   2. Lascia i campioni indisturbati per 2 minuti per permettere la sedimentazione dei solidi sospesi.
   3. Trasferire con attenzione il sovrantato chiarificato in un tubo microcentrifuga pulito senza disturbare il materiale sedimentato.
2. Misura il pH
   1. Calibrare il misuratore di pH secondo le istruzioni del produttore utilizzando i buffer standard appropriati prima della misurazione.
   2. Inserire la sonda calibrata di pH nel sovrandanante chiarificato senza disturbare alcun residuo di materiale sedimentato.
   3. Registra i valori del pH immediatamente dopo che la lettura del pH si è stabilizzata.
   4. Risciacqua accuratamente la sonda con acqua deionizzata tra i campioni e l'altro per evitare contaminazioni incrociate.

7. Test con cianuro utilizzando strisce colorimetriche

ATTENZIONE: I soprantativi contenenti cianuro sono pericolosi. Esegui tutte le fasi di campionamento e test in una cappa chimica o in un'area ben ventilata. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti e protezione per gli occhi. Evitare il contatto diretto della pelle con campioni e strisce reattive e smaltire le strisce usate e i rifiuti liquidi secondo le linee guida istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici pericolosi.

1. Raccogliere campioni di cianuro
   1. Ai giorni 0, 4, 8 e 12, preleva asepticamente 1 mL di soprantantante di coltura da ogni condizione sperimentale utilizzando punte sterili di pipetta.
   2. Lascia i campioni indisturbati per 2 minuti per permettere la sedimentazione dei solidi sospesi.
   3. Raccogli con cura il soprandanante chiarificato senza disturbare il materiale particolato.
2. Esegui un saggio al cianuro colorimetrico.
   1. Immergi un test con la striscia reattiva al cianuro colorimetrico nel sovrantantante chiarificato per la durata specificata dal produttore.
   2. Rimuovi la striscia e lascia sviluppare completamente il colore per il tempo consigliato in condizioni ambientali.
   3. Confrontare la striscia sviluppata con la scala di riferimento fornita dal produttore per determinare la concentrazione di cianuro.
3. Livelli record di cianuro
   1. Registra le concentrazioni di cianuro per ogni campione in tutti i momenti secondo la scala di riferimento.
   2. Fotografare ciascuna striscia testare sviluppata insieme alla scala di riferimento oppure conservare la striscia secondo le raccomandazioni del produttore per una futura verifica.

8. Mantenimento e consolidamento delle colture adattate di E. gracilis

1. Combina culture adattate
   1. Dopo un adattamento riuscito a concentrazioni di manioca di ≥40 ^gL-1 garri, confermare visivamente la presenza di cellule vitali di E. gracilis in ciascuna coltura replicata.
   2. Combinare delicatamente tutte le fiaschette replicate della linea adattata in un unico recipiente sterile utilizzando la tecnica asettica per generare una cultura maestra omogenea.
2. Prepara il materiale di manutenzione
   1. Preparare mezzi freschi a base di manioca alla concentrazione di mantenimento selezionata seguendo le procedure descritte nel Metodo 1.
   2. Seleziona mezzi autoclavi o non autoclavati in base ai requisiti sperimentali a valle.
   3. Mantieni la stessa condizione di sterilizzazione in tutti i passaggi successivi per garantire la coerenza nell'esposizione ai microbi.
3. Colture di mantenimento inoculate
   1. Inoculare un mezzo di mantenimento fresco con il 20% (v/v) della coltura principale consolidata.
   2. Mescola delicatamente le colture ruotando manualmente per distribuire uniformemente le cellule senza indurre sollecitazioni di taglio.
   3. Incubare le colture in completa oscurità a 25 °C con scuotere orbitali continue a 120 x g per mantenere condizioni di crescita eterotrofe.
4. Eseguire manutenzione e passaggi di routine
   1. Mantenere le colture con una delicata inversione manuale una volta al giorno per evitare la sedimentazione prolungata di cellule e materiale del substrato.
   2. Ogni 30 giorni, consolida le colture di mantenimento combinando fiaschette replicate usando la tecnica asettica.
   3. Riinocula il substrato di mantenimento fresco utilizzando la coltura consolidata come descritto nella Sezione 8.3.
5. Monitoraggio della stabilità della cultura
   1. Ad ogni passaggio, si valuta la morfologia e la motilità cellulare utilizzando un microscopio a luce composta (campo chiaro) con un ingrandimento totale del 100× al 400× (10× oculare con obiettivi del 10× al 40×).
   2. Record di spostamenti verso un aumento dell'encistimento, accumulo di detriti cellulari o riduzione della motilità come indicatori di calo della stabilità della coltura.

9 Raccolta della biomassa per analisi proteica a valle

1. Raccolta di campioni di coltura
   1. Al punto desiderato, trasferire i volumi di coltura in tubi centrifughe sterili.
   2. Assicurati che i campioni rappresentino l'intera coltura mescolando delicatamente facendo roteare le fiaschette prima del trasferimento.
2. Raccolta della biomassa tramite centrifugazione
   1. Centrifugare campioni a ≥3.500 × g per 10 minuti per pelletare la biomassa. Ripeti questo passaggio se i sedimenti non si sono completamente assestati.
   2. Confermare la formazione di una pellet a cellule compatte sul fondo del tubo.
3. Rimuovere il soprantantante
   1. Con cura decantare o pipettare il surnatante senza disturbare il pellet.
   2. Smaltire il soprandatante secondo i protocolli sui rifiuti di laboratorio.
4. Preparare la biomassa per l'analisi a valle
   1. Conservare il pellet cellulare per ulteriori lavorazioni (ad esempio, essiccazione, conservazione o analisi delle proteine).
   2. Se non processati immediatamente, conservare i pellet a 4 °C per un uso a breve termine oppure congelarli se opportuno per la conservazione a lungo termine.

10. Gestione e archiviazione dei dati

1. Organizza il dataset
   1. Inserisci tutte le misurazioni quantitative, inclusi pH, concentrazione di cianuri, valutazioni di vitalità, conteggio cellulare e valori della biomassa, in un foglio elettronico etichettato.
   2. Salva le immagini microscopiche e le note osservazionali associate utilizzando nomi di file standardizzati che indicano il tipo di substrato, la concentrazione, l'identità della deformazione, il numero di replica e la data di campionamento (ad esempio, 25-01-NAG40G_WT1_05).
2. Preparare i dataset per l'analisi
   1. Verifica che tutte le repliche sperimentali e i momenti temporali programmati siano rappresentati e completi all'interno del dataset.
   2. Digitalizza gli appunti di laboratorio scritti a mano e salva tutti i file elettronici per archiviarli in sicurezza, prevenendo la perdita di dati. L'analisi dei dati e la generazione di figure venivano effettuate utilizzando software di fogli di calcolo (Microsoft Excel) e, dove applicabile, R (R Foundation for Statistical Computing). Tutte le analisi core possono essere riprodotte utilizzando calcoli basati su fogli di calcolo, con R usata solo per la visualizzazione supplementare.

Risultati

I seguenti risultati rappresentativi illustrano gli esiti attesi quando il protocollo descritto viene applicato con successo, così come la gamma di risultati osservati in condizioni subottimali. I dati rappresentativi corrispondenti a questi esiti sono mostrati nella Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7. Insieme, questi risultati forniscono indicazioni pratiche per interpretare la dinamica della crescita, la vitalità, la morfologia e gli esiti proteici nell'adattamento di E. gracilis a substrati a base di manioca in condizioni di coltivazione eterotrofe e completamente buie. Inoltre, questi risultati convalidano i principali esiti biologici del protocollo, tra cui adattamento di successo, crescita sostenuta, alta vitalità, morfologia stabile, prestazioni costanti tra i substrati e produzione di proteine misurabile.

Durante gli esperimenti, sono state utilizzate tre repliche per trattamento (tutti i tipi di substrati di manioca). Riconosciamo che il numero di repliche dipende dalla discrezione e dai limiti logistici di qualsiasi gruppo che segua i protocolli sopra indicati. L'applicazione con successo di questo protocollo porta a una crescita eterotrofa sostenuta di E. gracilis in mezzi a base di garri in condizioni completamente buie. Gli esiti positivi sono caratterizzati da traiettorie di crescita sigmoide, differenze limitate tra repliche e densità cellulari stabili nella fase tardiva. I tratti morfologici che indicavano risultati positivi e che sono stati osservati in modo costante nelle popolazioni adattate includevano la rotondità cellulare e le membrane cellulari spesse. Al contrario, le cellule collassate malsane appaiono tipicamente irregolari, frammentate o strutturalmente compromesse e sono associate a una vitalità ridotta, distinguendole dalle forme intatte, arrotondate o semi-incisate osservate in colture adattate. Per riferimento, sono incluse immagini rappresentative di E. gracilis di tipo selvatico che mostra una morfologia allungata caratteristica (Figura 8) per distinguere la struttura cellulare di base dalle forme adattate o alterate. Le colture coltivate a 30 g di ^L-1 garri hanno mostrato una crescita integrata più elevata, misurata per area sotto la curva di crescita (AUC), rispetto a concentrazioni più basse, suggerendo un utilizzo più efficiente del substrato della manioca e un adattamento fisiologico di successo (Figura 1).

Esiti subottimali sono comunemente osservati a concentrazioni di garri più basse (10–20 g ^L-1), dove la crescita è rilevabile ma ridotta in intensità e più variabile tra le repliche. A concentrazioni più elevate (40–50 g ^L-1), le colture possono raggiungere densità cellulari di picco elevate; tuttavia, queste condizioni mostrano frequentemente stabilizzazione ritardata o aumento della variabilità temporale (Figura 2).

Negli esperimenti riusciti, la vitalità cellulare rimane elevata per tutto il periodo di coltura, con solo lievi fluttuazioni a metà esperimento. I test di esclusione Trypan Blue indicano che le colture mantenute a 30 g di ^L-1 garri mantengono un'alta proporzione di cellule vitali (non colorate) rispetto a quelle non vitali (colorate di blu) nei momenti temporali campionati (Figura 3). Le deviazioni da questo schema, tra cui una maggiore proporzione di cellule colorate, una motilità ridotta o spostamenti verso morfologie arrotondate o collassate, possono indicare condizioni subottimali e fungere da precoci innescatori per la risoluzione dei problemi. Le valutazioni di vitalità e morfologia si sono basate su criteri osservativi coerenti, tra cui l'integrità cellulare, la motilità direzionale e la prevalenza relativa delle forme allungate rispetto a quelle arrotondate o collassate.

Gli esiti subottimali sono caratterizzati da riduzioni transitorie della vitalità, più comunemente osservate a concentrazioni garri più elevate. Un recupero parziale può essere osservato in momenti successivi; tuttavia, queste condizioni mostrano una maggiore variabilità di vitalità durante il periodo di coltura (Figura 4). Questi modelli di crescita mostrano che concentrazioni intermedie di substrato (ad esempio, 30 g ^L-1) forniscono un equilibrio tra disponibilità di nutrienti e stress, risultando in una crescita più stabile. Queste tendenze riflettono l'impatto delle condizioni di pre-elaborazione e dell'adattamento a stadi sulle prestazioni della coltura, poiché l'esposizione graduale alla crescente complessità del substrato supporta una maggiore stabilità fisiologica e un comportamento di crescita riproducibile. Concentrazioni più basse limitano la produzione di biomassa, mentre concentrazioni più elevate portano a una maggiore variabilità e a una stabilizzazione ritardata.

La valutazione morfologica fornisce un indicatore qualitativo dello stato di adattamento. Gli esiti positivi includono l'emergere e la persistenza di cellule arrotondate o semi-incisate con motilità ridotta che rimangono intatte attraverso ripetute sottocolture (Figura 5).

Al contrario, le colture subottimali, per lo più associate a ceppi selvatici o adattamento in fase iniziale, mostrano transizioni brusche da cellule allungate e mobili a morfologie irregolari o collassate che coincidono con una riduzione della stabilità della crescita.

Quando il protocollo viene applicato a substrati aggiuntivi derivati dalla manioca, inclusi polpa, pellet e bucce, le colture adattate di E. gracilis mostrano una crescita riproducibile su più tipi di substrato. Gli esiti positivi sono caratterizzati da una stabilizzazione anticipata delle curve di crescita e da una riduzione del declino nelle fasi finali rispetto alle colture di tipo selvatico (Figura 6).

Gli esiti subottimali includono un ritardo nell'inizio della crescita o un aumento della variabilità replicativa, in particolare nei substrati con maggiore eterogeneità fisica.

L'implementazione riuscita del protocollo produce biomassa di E. gracilis con contenuto misurabile di proteine grezze, come quantificato da analisi di laboratorio esterno utilizzando il metodo della Combustione (Dumas). Le percentuali di proteine osservate nelle colture adattate sono comparabili a quelle misurate nelle colture di tipo selvatico, con una maggiore produzione proteica totale corrispondente a un aumento dell'accumulo di biomassa (Figura 7).

Il monitoraggio della chimica dei media ha supportato le interazioni coltura-substrato durante l'adattamento e ha convalidato l'inclusione di misurazioni di pH e cianuro all'interno del protocollo. I valori del pH hanno mostrato cambiamenti graduali nel tempo, indicando attività metabolica e utilizzo del substrato, con tendenze più stabili nelle colture adattate. Le misurazioni del cianuro hanno ulteriormente confermato questa affermazione, poiché le colture adattate hanno mostrato riduzioni nei livelli rilevabili, mentre le colture di tipo selvatico sono rimaste più variabili. Insieme, questi risultati dimostrano che questi passaggi di monitoraggio catturano efficacemente i cambiamenti nella chimica dei media associati all'adattamento e supportano l'interpretazione della performance culturale. Sebbene i meccanismi sottostanti non siano stati studiati, questo rappresenta un'area importante per future ricerche, in particolare per applicazioni su scala industriale.

Il flusso di lavoro di mantenimento e consolidamento a lungo termine ha supportato la continuazione della linea adattata di Euglena gracilis per periodi di coltura prolungati. Le colture mantenute tramite passaggi ripetuti hanno costantemente mantenuto motilità, morfologia caratteristica e comportamento di crescita stabile attraverso i cicli di mantenimento. Sebbene la performance a lungo termine non sia stata evaluata quantitativamente, queste osservazioni forniscono prove rappresentative che la linea adattata può essere mantenuta in modo affidabile nelle condizioni specificate.

Insieme, questi risultati confermano che il protocollo di adattamento supporta una crescita robusta, la vitalità e la produzione di biomassa di E. gracilis su substrati a base di manioca, con prestazioni costanti e livelli ridotti di cianuro nel tempo.

Tutte le figure e le tabelle sono fornite come file separati e non sono incorporate nel documento manoscritto. Le preferenze di posizionamento di figure e tavoli sono indicate all'interno del testo del manoscritto tramite note tra parentesi (ad esempio, (Figura 1)). Salvo diversa specificazione, tutte le figure e le tabelle devono apparire sotto la sezione Risultati Rappresentativi nella pubblicazione finale.

Tutte le figure vengono inviate come file individuali, con figure multipannello fornite come un'unica immagine combinata. Le immagini microscopiche includono barre di scala in ogni pannello. Le figure di dati includono assi etichettati con unità di misura definite, e le barre di errore sono specificate nelle corrispondenti legende delle figure.

Tutte le tabelle sono inviate come singoli file .xls o .xlsx e contengono dati numerici grezzi o riassunti senza formattazione decorativa.

Figura 1: Dinamiche di crescita di E. gracilis coltivate a 10, 20 e 30 ^gL-1 garri in condizioni completamente buie. Le densità medie delle cellule vengono mostrate nel tempo per ciascuna concentrazione di substrato. Le barre di errore rappresentano il SEM tra repliche biologiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Prestazioni di crescita di E. gracilis a concentrazioni elevate del garri (30–50 g ^L-1). Le traiettorie della densità cellulare illustrano differenze nella densità di picco, nel tempismo di stabilizzazione e nella variabilità tra concentrazioni più elevate nel substrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Tendenze di vitalità cellulare di E. gracilis coltivata a 30 ^gL-1 garri misurate con esclusione di Trypan Blue. La proporzione di cellule vitali è mostrata nei punti temporali campionati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Fluttuazioni di vitalità di E. gracilis coltivate a concentrazioni garri più elevate. Cambiamenti transitori nella vitalità cellulare sono mostrati durante il periodo sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Morfologia rappresentativa delle popolazioni adattate di E. gracilis . Immagini rappresentative della microscopia a luce invertita mostrano cellule arrotondate e semi-incisate osservate dopo l'adattamento. Barra della scala = XX μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Prestazioni di crescita di E. gracilis adattato e di tipo selvatico su substrati derivati dalla manioca. Le traiettorie di crescita sono mostrate per colture adattate e di tipo selvatico coltivate su più prodotti di manioca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Contenuto di proteine grezza e output totale di proteine della biomassa di E. gracilis coltivata nella manioca. Il contenuto proteico è stato quantificato tramite analisi esterne utilizzando il metodo SGS Combustion (Dumas). La produzione totale di proteine è rappresentata insieme all'accumulo di biomassa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Morfologia rappresentativa di E. gracilis di tipo selvatico in condizioni standard (ingrandimento 40X). Immagine rappresentativa di Euglena gracilis sana e non adattata che mostra una morfologia allungata caratteristica sotto microscopia luminosa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Un determinante centrale del successo di questo protocollo è l'equilibrio tra la concentrazione nel substrato di manioca e la stabilità fisiologica durante la coltivazione eterotrofa di E. gracilis. I materiali derivati dalla manioca introducono eterogeneità fisica, particelle residue e cinetica variabile di rilascio dei nutrienti che influenzano direttamente il comportamento di crescita e la stabilità della^{coltura 2,3}. Tra i passaggi del protocollo, la preparazione del substrato e la selezione della concentrazione rappresentano quindi i punti di controllo più sensibili. Come dimostrato dai Risultati Rappresentativi, le concentrazioni intermedie nei substrati supportano in modo affidabile una crescita sostenuta con una divergenza replicata limitata, mentre concentrazioni più basse limitano l'accumulo di biomassa e concentrazioni più elevate aumentano la variabilità temporale e le risposte a stress transitorie. Questi risultati sottolineano che il carico massimo del substrato non garantisce necessariamente prestazioni ottimali o stabili di coltivazione quando si lavora con materiali agroindustriali eterogenei. I passaggi di preprocessing selezionati e gli intervalli di concentrazione del substrato sono stati progettati per sfidare progressivamente E. gracilis sotto una complessità chimica e microbica crescente. Le differenze osservate nella stabilità della crescita e nella vitalità in queste condizioni supportano la validità di questo approccio a stadi e confermano che le concentrazioni intermedie nei substrati forniscono un equilibrio tra disponibilità di nutrienti e stress fisiologico.

La gestione delle colture durante la crescita eterotrofa influenza ulteriormente gli esiti di adattamento. Una miscelazione costante ma delicata in condizioni completamente buie era fondamentale per mantenere il contatto tra le cellule di E. gracilis e il materiale del substrato sospeso, evitando al contempo uno stress di taglio eccessivo. Una miscelazione insufficiente ha promosso la sedimentazione e gradienti di nutrienti localizzati, confondendo sia le misurazioni di crescita che di vitalità, in particolare nei mezzi non^{autoclavati 12}. Queste osservazioni sono in linea con rapporti precedenti che mostrano che l'eterogeneità spaziale e l'esposizione disomogenea del substrato possono oscurare le risposte fisiologiche nei sistemi di coltivazione microbica. Il protocollo quindi enfatizza l'inversione di routine piuttosto che l'agitazione continua come compromesso pratico tra omogeneità e integrità della cultura.

Per adattarsi alla variabilità insita ai substrati basati sulla manioca, il protocollo incorpora molteplici punti di risoluzione dei problemi e flessibilità. L'autoclavaggio dei mezzi fermentati di manioca ha migliorato la consistenza a breve termine riducendo il carico microbico e modificando la struttura del substrato, in particolare durante le prime fasi di adattamento. Al contrario, i mezzi non autoclavati possono essere utilizzati efficacemente dopo un adattamento riuscito, a condizione che la densità e la miscelazione dell'inoculo siano sufficienti a mantenere una crescita stabile. Questo approccio a stadi è coerente con studi precedenti che dimostrano che la pressione selettiva graduale consente alle popolazioni microbiche di tollerare una complessità ambientale crescente^{nel tempo 13,14}. Il monitoraggio longitudinale è stato essenziale in questo contesto, poiché le riduzioni transitorie di crescita o vitalità si sono spesso riprese durante i passaggi successivi senza compromettere il successo complessivo dell'adattamento.

I saggi di vitalità e il monitoraggio morfologico hanno servito come strumenti diagnostici rapidi durante tutto il processo di adattamento. L'esclusione del Trippan Blue forniva un indicatore quantitativo della robustezza fisiologica, mentre la valutazione basata sulla microscopia della motilità e dell'encistamento forniva un allarme precoce di condizioni subottimali come carico eccessivo del substrato o acclimatazione^{ritardata 15}. È importante sottolineare che il protocollo enfatizza le tendenze nel tempo piuttosto che le misurazioni a singolo punto, poiché le fluttuazioni a breve termine di vitalità o morfologia non erano sempre predittive di fallimento della cultura a lungo termine. Questa prospettiva longitudinale si è rivelata fondamentale per distinguere le risposte a stress transitorie dal declino fisiologico sostenuto. Le riduzioni nei livelli rilevabili di cianuro osservate durante la coltivazione suggeriscono una parziale disintossicazione dei substrati derivati dalla manioca nelle condizioni descritte. Queste riduzioni possono derivare da una combinazione di degradazione, volatilizzazione e attività microbica associata alla fermentazione. Sebbene i meccanismi biochimici specifici e la cinetica della rimozione del cianuro non siano stati direttamente indagati in questo studio, queste osservazioni supportano l'inclusione del monitoraggio del cianuro come indicatore pratico della trasformazione del substrato e della fattibilità della coltura durante l'adattamento.

Va riconosciuto diversi limiti del metodo. Primo, la percentuale di proteine greggio da sola non cattura completamente il valore nutrizionale o la qualità funzionale delle proteine, e l'interpretazione deve considerare l'output totale di biomassa insieme alle metriche^{composizionali 16}. In secondo luogo, l'uso di substrati eterogenei e minimamente lavorati introduce una variabilità che non può essere eliminata, nemmeno con una preparazione standardizzata. Questa sfida è ben riconosciuta nella bioprocessazione^{agroindustriale 17} e riflette vincoli reali piuttosto che carenze sperimentali. Terzo, sebbene il protocollo sia ottimizzato per la coltivazione su scala di laboratorio e su scala pilota, l'espansione oltre i volumi su scala da laboratorio richiederà un controllo aggiuntivo della dinamica di miscelazione, del trasferimento di ossigeno e della gestione dei solidi, oltre alla considerazione della configurazione del reattore e delle condizioni idrodinamiche, come è stato dimostrato per altri sistemi microalgali e^{protisti 18}.

Rispetto ai metodi di coltivazione di E. gracilis esistenti che si basano su zuccheri raffinati o sistemi fototrofi strettamente controllati, questo protocollo offre un vantaggio metodologico distinto consentendo la crescita su substrati derivati dalla manioca a basso costo in condizioni completamente eterotrofe. L'approccio evita la dipendenza da fonti di carbonio^{purificato 19,20} e non richiede infrastrutture di illuminazione specializzate, ampliando così la flessibilità operativa della coltivazione di E. gracilis. Questo è particolarmente rilevante per applicazioni focalizzate sull'efficienza delle risorse, la valorizzazione dei rifiuti e la produzione decentralizzata nelle regioni produttrici di manioca.

Il significato più ampio di questo metodo risiede nella sua applicabilità ad aree di ricerca focalizzate sull'adattamento microbico, la bioprocessazione sostenibile e la valorizzazione della biomassa. Accoppiando l'esposizione incrementale dei substrati con strumenti di monitoraggio semplici e a basso costo, il protocollo fornisce un quadro riproducibile per integrare substrati non tradizionali nei flussi di lavoro di coltivazione microbica. Sebbene sviluppati per E. gracilis, i principi fondamentali dell'adattamento a stadi, della valutazione longitudinale delle prestazioni e del processo decisionale informato dalla morfologia sono ampiamente trasferibili ad altri sistemi microalgali e protisti esplorati per applicazioni di bioeconomia^{circolare 21,22}. In quanto tale, questo protocollo funge non solo da metodo di coltivazione, ma anche da quadro generalizzabile per l'adattamento microbico applicato sotto vincoli reali del substrato. Questo metodo è stato progettato con l'accessibilità come obiettivo principale ed è quindi più adatto a laboratori o contesti di ricerca applicata con infrastrutture microbiologiche di base e accesso a risorse biologiche chiave, in particolare colture di Euglena gracilis e substrati derivati dalla manioca. Inoltre, il sistema offre flessibilità temporale, poiché i mezzi a base di manioca possono essere preparati e fermentati tutto l'anno senza vincoli stagionali. Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato e validato su scala di laboratorio, l'uso di substrati derivati dalla manioca a basso costo e i requisiti minimi di lavorazione supportano la scalabilità potenziale verso sistemi di coltivazione più grandi.

Sebbene questo protocollo stabilisca un quadro riproducibile per l'adattamento e la coltivazione, ulteriori analisi quantitative della cinetica della crescita, della produttività della biomassa e dell'efficienza nella conversione dei substrati saranno importanti per ottimizzare le prestazioni in applicazioni su larga scala o industriali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Autoclave - 533LS Steam Sterilizzatore	Getinge	533LS	Sterilizzazione a vapore dei media di manioca. Sterilizzare i media utilizzando il ciclo liquido.
Bright-Line™ Emacitometri sostituzione vetrino di copertura	Millipore Sigma	BR723015- 100EA	Vetrini di spessore speciali progettati per l'uso con l'ematocrito.
Polpa essiccata di manioca	Psaltry International	N/A	Sottostrato di manioca fornito
Pellet di manioca	Psaltry International	N/A	Sottostrato di manioca fornito
Pellicine di manioca	Psaltry International	N/A	Sottostrato di manioca fornito
Sottostrato di manioca (garri)	Fornitore locale	N/A	Garri derivato dalla manioca utilizzato come fonte di carbonio preparato con acqua deionizzata.
Centrifughe Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifuga	Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifuga	75004241	Capace di ≥3.500 × g, utilizzata per il raccolto della biomassa.
Tubetti per centrifuga Ad es. Axygen (A Marchio Corning)	Corning	MCT-150-C-S	Sterili, volume minimo di 1,5 mL
Acqua pulita Ad es. UltraPure™ Acqua distillata senza DNase/RNase Libera	ThermoFisher Scientific	10977035	Deionizze o distillata. Utilizzata per la preparazione dei media
Microscopio a luce composta	Olympus	N/A	Microscopio composto standard adatto per l'osservazione e il conteggio delle cellule di routine.
Striscia di test del cianuro Strisce, colorimetriche. CN- 10-30 mg/L	MQuant	110044	Rilevamento semi-quantitativo del cianuro. Elimina come rifiuto pericoloso
Piattellino di pesatura standard sterile	Fisher Scientific	01-549-750	Utilizzato per pesare i substrati di manioca e la biomassa secca.
Euglena gracilis (linea adattata )	N/A	N/A	Stamma adattata alla manioca generata in questo studio
Euglena gracilis (Tipo selvatico)	N/A	N/A	Stamma di riferimento non adattata. Mantenere le stesse condizioni standard.
Componenti del mezzo di crescita Euglena	Vari	N/A	Mezzo Euglena basale preparato secondo le formulazioni standard del laboratorio.
Consolle 6 litri FreeZone Freeze Essiccatore	Labconco	70061xxxx	Utilizzato per la disidratazione della biomassa
Emacitometri con linee standard	Weber Scientific	NC1587539	Utilizzato per il conteggio manuale delle cellule.
Agitatore magnetico con piastra riscaldante	IKA	N/A	Opzionale; migliora la consistenza durante la preparazione del mezzo e la sospensione del substrato.
Micropipette (P20, P200, P1000)	Eppendorf	N/A	Pipette con volume regolabile utilizzate per i trasferimenti liquidi asettici.
Mini centrifuga	Eppendorf	N/A	Opzionale; facilita il rapido sedimento durante la raccolta della biomassa.
Parafilm	Bemis	PM996	Utilizzato per la sigillatura temporanea di flaconi o piastre quando non sono disponibili tappi ventilati.
Strisce indicatore pH	Fisher Scientific	13-640-520	Alternativa al pHmetro per una rapida valutazione qualitativa dei mezzi di coltura.
pHmetro con sonda Thermo Scientific Orion Star A211 pHmetro da banco	Thermo Scientific Orion Star A211 pHmetro da banco	13-645-519	Calibrato prima dell'uso. Per misurare il pH del surnatante della coltura
Conservazione refrigerata (4°C)	Frigidaire	FRT18S6JW7	Conservazione a breve termine dei mezzi
Incubatore oscillante (scuro)	Thermolyne	M49235	Incubatore oscillante orbitale capace di 100-150 RPM, intervallo di temperatura 24-28 °C; utilizzato in condizioni di oscurità per supportare la crescita eterotrofica di Euglena.
Flacone spray (32oz)	Boardwalk	BWK03010	Utilizzato per la sterilizzazione del piano di lavoro e la manipolazione asettica di routine (soluzione di etanolo al 70%)
Software per fogli di calcolo	Microsoft Excel	N/A	Raccolta, organizzazione e analisi dei dati
Suggerimenti per pipette sterili	Eppendorf	N/A	Suggerimenti sterili e monouso compatibili con le pipette P20, P200 e P1000.
Pipette serologiche sterili (5, 10, 25 mL)	Corning	N/A	Pipette sterili avvolte singolarmente utilizzate per i trasferimenti e il campionamento dei coltivi.
Soluzione di blu di tripano 0,4%, liquida, sterile-filtrata, adatta per la coltura cellulare	Sigma-Aldrich	T8154	Dye vitale utilizzato per la valutazione della vitalità cellulare mediante il test di esclusione del blu di tripano.
Tubetti per il prelievo di campioni (50 mL)	Falcon	14-432-22	Per campionamento pH e cianuro
Flaconi Erlenmeyer con tappo di ventilazione (250-500 mL)	Flacone Erlenmeyer in policarbonato da 250 mL Corning® con tappo di ventilazione	431144	Flaconi Erlenmeyer in policarbonato con tappi ventilati; autoclavabili; utilizzati sia per colture liquide sterili che non sterili.
Contenitori per rifiuti	Vari - in conformità con gli standard di laboratorio stabiliti	N/A	Sacche per autoclave e contenitori per rifiuti acuti o in vetro per lo smaltimento conforme alla biosicurezza.