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Articolo di ricerca
Questo studio retrospettivo presenta un flusso di lavoro riproducibile per la prelievo precoce di sangue post-ammissione, la misurazione di citochine sieriche e recettori Toll-like, la genotipizzazione dei polimorfismi genici infiammatori e la valutazione del rischio di infezione in pazienti con emorragia intracerebrale spontanea.
L'infezione polmonare nosocomiale è una complicanza frequente dopo un'emorragia intracerebrale spontanea e può peggiorare il recupero neurologico, prolungare il ricovero e aumentare il carico clinico. Questo studio clinico-laboratorio retrospettivo presenta un flusso di lavoro riproducibile per valutare i profili immunogenetici infiammatori di biomarcatori e dell'ospite associati all'infezione polmonare nosocomiale dopo un'emorragia intracerebrale spontanea primaria. I pazienti sono classificati in base al fatto che un'infezione polmonare nosocomiale si verifichi dopo il ricovero. Il sangue venoso periferico viene raccolto nei primi periodi post-ammissione in condizioni pre-analitiche standardizzate. Il siero viene separato, allicito e conservato per la misurazione tramite immunosorbente legato agli enzimi di IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, TLR2, TLR4 e TLR9. Parallelamente, il DNA genomico viene estratto dal sangue intero anticoagulato e utilizzato per la genotipizzazione polimorfistica della lunghezza dei frammenti di reazione a catena della polimerasi di loci selezionati correlati ai recettori di citochine e Toll. Il flusso di lavoro include anche procedure di controllo qualità per la gestione dei campioni, misurazioni ELISA duplicate, valutazione della purezza del DNA, chiamata dei genotipi e genotipizzazione ripetuta. L'analisi statistica include il confronto tra gruppi di caratteristiche cliniche e livelli di biomarcatori, test di equilibrio di Hardy-Weinberg, analisi di regressione logistica per associazioni tra genotipo e alle, aggiustamento per covariazioni cliniche rilevanti e correzione del tasso di falsa scoperta per confronti genetici multipli. Questo flusso di lavoro combinato clinico, infiammatorio e immuno-genetico può aiutare a caratterizzare i profili di rischio infettivo dopo un'emorragia intracerebrale spontanea, anche se è ancora richiesta una validazione multicentrica prospettica prima dell'applicazione clinica di routine.
L'emorragia intracerebrale spontanea (ICH) è un sottotipo grave di ictus causato dalla rottura non traumatica dei vasi cerebrali e rimane una fonte importante di morte e disabilità neurologica. Clinicamente, l'ICH è comunemente classificata come primaria o secondaria. La ICH primaria rappresenta la maggior parte dei casi ed è principalmente collegata ad arteriopatia ipertensiva o angiopatia amiloidecerebrale 1. Al contrario, l'ICH secondaria è associata a cause strutturali o ematologiche, tra cui aneurismi, malformazioni arteriovenose, malattia di Moyamoya e disturbi della coagulazione. Sebbene l'ICO rappresenti una proporzione minore di tutti gli eventi ictus rispetto all'ictus ischemico, comporta una mortalità a breve termine e un carico funzionale a lungo termine sproporzionatamenteelevati 2,3,4,5.
Tra le principali complicazioni ospedaliere dopo la PCI, l'infezione polmonare nosocomiale è particolarmente frequente e con conseguenze cliniche. Studi precedenti hanno dimostrato che un'infezione polmonare può verificarsi in una percentuale significativa di pazienti ricoverati dopo ictus o emorragia intracerebrale ed è associata a ricovero più lungo, maggiore carico medico, peggiore recupero neurologico e aumentodella mortalità 6,7,8. L'importanza clinica di questa complicanza va oltre la sola gestione respiratoria. Ridotta coscienza, ridotti di deglutizione e riflessi di tosse, immobilizzazione, supporto meccanico delle vie aeree e procedure di drenaggio invasive possono tutti aumentare il rischio di infezione durante la fase acuta dopo l'IC. Allo stesso tempo, un'infezione polmonare può peggiorare ulteriormente l'infiammazione sistemica, compromettere l'erogazione di ossigeno e complicare le cure neurocritiche, amplificando così i processi di lesione secondaria.
Questa relazione è biologicamente plausibile perché l'ICH non è solo un evento cerebrovascolare focale, ma anche un fattore scatenante di una disregolazione sistemica del sistema immunitario. L'emorragia cerebrale acuta può attivare cascate infiammatorie, alterare la segnalazione immunitaria innata e alterare l'equilibrio tra neuroinfiammazione e difesa periferica dell'ospite. In questo contesto, alcuni pazienti possono diventare più suscettibili alle infezioni ospedaliere acquisite anche con una gestione clinica simile. Pertanto, l'infezione polmonare dopo l'ICH non dovrebbe essere vista esclusivamente come conseguenza di un'esposizione al letto del letto o di cure di supporto; Può anche riflettere differenze nell'attivazione infiammatoria dell'ospite e nella reattività immunitaria.
Nonostante la rilevanza clinica di questa complicanza, gli approcci pratici per la stratificazione precoce del rischio rimangonolimitati 9. Gli approcci clinici esistenti per la stratificazione del rischio per l'infezione polmonare post-ICH generalmente si basano su variabili al letto del paziente e relative al ricovero, come gravità neurologica, età, compromissione della deglutizione, comorbidità, procedure invasive e durata dell'esposizione del dispositivo. Questi strumenti sono utili clinicamente perché possono essere applicati rapidamente in contesti di emergenza, terapia intensiva o neurocritica. Tuttavia, le sole variabili cliniche potrebbero non spiegare completamente perché pazienti con gravità neurologica comparabile e esposizione a cure simili presentino diversi esiti di infezione. Biomarcatori infiammatori e fattori immunogenetici dell'ospite possono quindi fornire ulteriori informazioni sulla suscettibilità biologica, specialmente durante il primo periodo post-ammissione, quando vengono prese decisioni di sorveglianza preventiva e gestione respiratoria.
Le citochine sono mediatori centrali delle risposte immunitarie e infiammatorie, e le vie dei recettori Toll-like (TLR) svolgono ruoli chiave nel riconoscimento dei patogeni e nell'attivazione immunitaria innata. Le misurazioni di citochine sieriche e proteine TLR possono fornire un'istantanea dell'attivazione infiammatoria sistemica precoce, mentre alcuni polimorfismi immunitari possono riflettere differenze più stabili nell'ospite nella produzione di citochine, nella segnalazione dei recettori o nella regolazione infiammatoria. Rispetto alla sola valutazione clinica, un flusso di lavoro combinato di biomarcatori e polimorfismi può catturare sia lo stato infiammatorio attuale sia la risposta immunitaria sottostante di ciascun paziente. Questo approccio non è inteso a sostituire la valutazione clinica al paziente, ma a integrarla aggiungendo informazioni di laboratorio e genetiche dell'ospite che possano aiutare a identificare i pazienti che richiedono una sorveglianza più stretta delle infezioni dopo una IC spontanea.
Su questa base, abbiamo ipotizzato che i pazienti con ICH spontanea che sviluppano infezione polmonare nosocomiale avrebbero mostrato un profilo infiammatorio distinto insieme a una distribuzione diversa di polimorfismi genetici immunologici selezionati rispetto ai pazienti che rimangono privi di infezione. Per testare questa ipotesi, il presente studio clinico-laboratorio retrospettivo ha analizzato citochine sieriche post-ammissione precoce, livelli di proteine sieriche di TLR2, TLR4 e TLR9, e selezionato polimorfismi genici infiammatori in pazienti con ICH spontanea primaria. Il flusso di lavoro utilizza sangue periferico raccolto durante il ricovero acuto, quantificazione proteica basata su ELISA, genotipizzazione basata su PCR-RFLP e confronti statistici tra pazienti con e senza infezione polmonare nosocomiale. L'obiettivo era fornire un quadro riproducibile per caratterizzare i profili infiammatori e genetici ospite associati al rischio di infezione, supportando così un riconoscimento più precoce dei pazienti ad alto rischio nell'ambiente ospedaliero acuto.
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Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Affiliato dell'Università di Jiaxing, il Primo Ospedale di Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, Cina (Approvazione n. 2025-LP-599). Tutte le procedure che coinvolgevano partecipanti umani erano condotte in conformità con i requisiti istituzionali e i principi della Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato scritto per la raccolta del sangue e l'uso dei dati è stato ottenuto da tutti i partecipanti e/o dai loro rappresentanti legalmente autorizzati prima della raccolta del campione.
Tutti i kit commerciali, reagenti, consumabili, strumenti, software, produttori, numeri di catalogo e specifiche operative chiave utilizzati in questo flusso di lavoro sono elencati nella Tabella dei Materiali.
Ambito dello studio, idoneità e raggruppamento dei pazienti
Questo studio è stato condotto come un'analisi retrospettiva di coorte clinico-laboratorio monocentrica di pazienti con emorragia intracerebrale primaria spontanea (ICH) ricoverati nel Centro di Pronto Soccorso o Terapia Intensiva dell'Ospedale Affiliato dell'Università di Jiaxing, il Primo Ospedale di Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, Cina, tra maggio 2019 e settembre 2024. La diagnosi di ICH è stata confermata tramite tomografia computerizzata cranica o risonanza magnetica in conformità con le Linee guida cinesi per la diagnosi e il trattamento dell'emorragia cerebrale (2019)10.
I pazienti erano idonei se presentavano una ICH primaria spontanea confermata da immagini acquisita, venivano ammessi entro 3 giorni dall'insorgenza dei sintomi e avevano variabili cliniche chiave complete, insieme a campioni di sangue periferico disponibili per la misurazione di biomarcatori infiammatori e analisi genetiche. I pazienti sono stati esclusi se presentavano emorragia intracranica traumatica, ICH secondaria, infezione polmonare presente prima del ricovero o entro 48 ore dall'ingresso, dimissione contro parere medico o decesso entro 48 ore dall'ingresso, una storia di neoplasia o malattia autoimmune, o cartelle cliniche, di laboratorio o di genotipizzazione chiave incomplete. Dopo lo screening, 360 pazienti soddisfarono i criteri di idoneità e furono inclusi nell'analisi finale. Tra questi, 180 pazienti hanno sviluppato infezione polmonare nosocomiale durante il ricovero ospedaliero e 180 pazienti no. I pazienti sono stati assegnati al gruppo per infezioni polmonari o a quello senza infezione polmonare in base al fatto che si sia verificata un'infezione polmonare nosocomiale dopo il ricovero.
Prima del raggruppamento finale, sono state verificate la diagnosi per imaging, il momento del ricovero, il momento dell'infezione, la disponibilità di campioni di sangue e la completezza delle cartelle cliniche e di laboratorio. Questo passaggio è stato utilizzato per ridurre la classificazione errata e garantire che tutti i casi inclusi disponessero di dati completi per il confronto clinico, la misurazione dei biomarcatori infiammatori e la genotipizzazione.
Definizione di infezione polmonare nosocomiale
L'infezione polmonare nosocomiale è stata definita sulla base di evidenze radiologiche combinate con critericlinici 11. La conferma radiologica ha richiesto una nuova o progressiva lesione infiltrativa, consolidativa o vetroresina su radiografia toracica o tomografia computerizzata. Inoltre, dovevano essere presenti almeno due dei seguenti criteri: temperatura corporea > 38 °C, secrezioni respiratorie purulente o conteggio anomalo dei globuli bianchi periferici con globuli globuli < 4 × 109/L o > 10 × 109/L.
L'infezione polmonare presente prima del ricovero o diagnosticata entro le prime 48 ore dopo il ricovero non è stata classificata come infezione polmonare nosocomiale. La classificazione delle infezioni è stata verificata utilizzando rapporti radiologici, registrazioni della temperatura corporea, documentazione delle secrezioni respiratorie, risultati ematici periferici e cartelle cliniche.
Biosicurezza e smaltimento dei rifiuti
Sangue umano, siero e DNA derivato dal sangue sono stati gestiti secondo le precauzioni standard di biosicurezza di livello 2. Il personale di laboratorio indossava guanti, camici da laboratorio, maschere e occhiali protettivi durante la manipolazione del sangue, l'aliquotazione del siero, i test ELISA, l'estrazione del DNA, la preparazione PCR, l'elettroforesi su gel, la digestione restrizionale e la visualizzazione UV. I tubi del sangue venivano controllati per eventuali perdite o rotturezze prima della lavorazione. La centrifugazione veniva eseguita utilizzando tubi con tappi o, quando disponibili, secchi centrifughe sigillati.
Gli oggetti taglienti venivano immediatamente scartati nei contenitori approvati per quelli taglienti. Tubi, punte di pipetta, guanti, piastre ELISA e altri consumabili contaminati dal sangue venivano scartati come rifiuti biologici di laboratorio. I rifiuti biologici liquidi venivano disinfettati secondo le procedure istituzionali prima dello smaltimento. I gel di agarosio, i gel di poliacrilammide, i reagenti di colorazione e i materiali correlati all'elettroforesi sono stati scartati in conformità con i requisiti istituzionali di prodotti chimici e di rifiuti da laboratorio.
La preparazione del reagente PCR, l'aggiunta di template di DNA, la gestione amplificata del prodotto, la digestione di restrizione e l'elettroforesi su gel sono state separate il più possibile per ridurre la contaminazione. Punte di pipetta resistenti agli aerosol venivano utilizzate per la PCR e la gestione del DNA. La visualizzazione UV veniva effettuata solo con uno scudo protettivo o un sistema di documentazione in gel, evitando l'esposizione diretta di occhi o pelle alla luce UV.
Raccolta del sangue periferico e elaborazione dei campioni
Per ridurre la variazione pre-analitica, sono stati raccolti 10 mL di sangue venoso periferico alle 08:00 del mattino dopo l'ammissione, dopo un digiuno notturno di almeno 12 ore. 5 mL di sangue sono stati prelevati in un tubo a vuoto semplice per la preparazione del siero, mentre i restanti 5 mL sono stati prelevati in un tubo eparinizzato per l'estrazione del DNA genomico.
Prima della lavorazione, ogni tubo è stato controllato per identificare il paziente, il tempo di prelievo, il tipo di tubo, il volume sanguigno, le perdite, la coagulazione visibile e l'emolisi grossolanda. I campioni con etichettatura errata (scorretto), volume sanguigno insufficiente, perdite di tubo o coagulazione visibile nel tubo anticoagulato sono stati esclusi dall'analisi a valle. Il sangue nel tubo semplice è stato lasciato coagulare a temperatura ambiente per 60 minuti, poi centrifugato a 1.500 × g per 10 minuti a 4 °C. Il surnatant siero veniva trasferito in tubi sterili di polipropilene a basso legame proteico senza disturbare lo strato cellulare, allicitato in frazioni di 0,5 mL e conservato a −80 °C fino all'analisi.
I campioni che mostravano emolisi moderata o grave visibile sono stati esclusi dalla quantificazione basata su ELISA. Sono stati registrati campioni leggermente emolizzati e non sono stati utilizzati per l'analisi primaria delle citochine. Campioni con torbidità visibile, evidente lipemia, volume residuo insufficiente o esposizione ripetuta al gelo-disgelo sono stati segnalati prima del test. Nessuna aliquota sierica ha subito più di un ciclo di congelamento-scongelamento prima dell'analisi.
Quantificazione delle citochine tramite ELISA
Le concentrazioni seroniche di IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ e TNF-α sono state misurate utilizzando kit ELISA sandwich umani disponibili commercialmente validati per campioni siero. Le aliquote sieriche sono state scongelate, miscelate delicatamente e ispezionate per emolisi, torbidità, lipemia, volume insufficiente e storia di congelamento-disgelo prima del caricamento.
Standard, pozzi vuoti e campioni di siero venivano caricati in duplicato. Su ciascuna lastra venivano generate curve standard utilizzando diluizioni seriali delle concentrazioni standard e un controllo a vuoto, secondo le istruzioni del kit. La densità ottica è stata misurata a 450 nm, con una correzione di riferimento a 570 nm, utilizzando un lettore di micropiastre calibrato. Le concentrazioni sono state calcolate tramite adattamento della curva logistica a quattro parametri.
I risultati del saggio sono stati accettati solo quando la curva standard mostrava un pattern concentrazione-risposta appropriato, i pozzi vuoti mostravano un basso fondo di fondo e il coefficiente di variazione del campione duplicato era ≤ 10%. I campioni con duplicato di CV > il 10% sono stati rianalizzati dall'aliquota sieroica originale quando era disponibile un volume sufficiente. I campioni al di fuori dell'intervallo affidabile della curva standard venivano diluiti o ripetuti secondo le istruzioni del kit. Le lastre che mostravano standard incoerenti, sfondo eccessivo o evidenti effetti di bordo venivano ripetute.
I limiti analitici inferiori di rilevamento utilizzati per l'accettazione dei dati erano 2,0 pg/mL per IL-1β, 1,5 pg/mL per IL-6, 2,0 pg/mL per IL-10, 3,0 pg/mL per IL-17, 4,0 pg/mL per IFN-γ e 2,5 pg/mL per TNF-α. I valori finali delle citochine sono stati confrontati con identificatori di campioni, mappe a lastre, registrazioni di lettura duplicata e note sulla qualità del campione prima dell'analisi statistica.
Quantificazione dei TLR2, TLR4 e TLR9 sierici tramite ELISA
I livelli di proteine sierici TLR2, TLR4 e TLR9 sono stati misurati utilizzando kit ELISA umani disponibili commercialmente validati per campioni siari. I campioni di siero sono stati scongelati, miscelati delicatamente e ispezionati utilizzando gli stessi criteri di qualità del campione applicati alla misurazione delle citochine.
Standard, pozzi a vuoto e campioni di siero sono stati analizzati in duplicazione. Le lastre sono state lette a 450 nm con correzione di riferimento a 570 nm, e le concentrazioni sono state calcolate utilizzando una regressione logistica a quattro parametri. I risultati sono stati accettati quando la curva standard era valida, i pozzi vuoti erano all'interno dell'intervallo di fondo atteso e il CV duplicato era ≤ 10%. I campioni che superavano questa soglia duplicata del CV venivano ritestati quando rimanevano campioni sufficienti.
I limiti analitici inferiori di rilevamento utilizzati per l'accettazione dei risultati erano 0,10 ng/mL per TLR2, 0,12 ng/mL per TLR4 e 0,15 ng/mL per TLR9. I valori finali di TLR2, TLR4 e TLR9 sono stati confrontati con identificatori di campioni, mappe a lastre, registri di lettura duplicata e note sulla qualità del campione prima dell'analisi statistica.
Estrazione del DNA genomico
Il DNA genomico è stato estratto dal sangue intero con eparina-anticoagulante utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico ematico basato su colonna di silice. Prima dell'estrazione, sono stati controllati i campioni di sangue anticoagulante per verificare la corretta etichettatura, il volume sufficiente, la coagulazione visibile, la perdita e le condizioni di conservazione.
La purezza e la concentrazione del DNA sono state valutate tramite spettrofotometria. Solo campioni con un rapporto A260/A280 tra 1,80 e 2,00 sono stati accettati per l'amplificazione PCR a valle. I campioni al di fuori di questo intervallo sono stati rimisurati dopo una miscelazione delicata. Se il rapporto di purezza anomalo persisteva, l'estrazione del DNA veniva ripetuta quando rimaneva abbastanza sangue intero.
Il DNA veniva diluito con acqua priva di nucleasi fino a una concentrazione operativa di 50 ng/μL e conservato a -20 °C fino all'amplificazione per PCR. Prima dell'installazione della PCR, ogni campione di DNA veniva controllato per concentrazione, purezza, identificatore del campione e storia di congelamento-disgelo.
Genotipizzazione PCR-RFLP e chiamata del genotipo
La genotipizzazione è stata eseguita utilizzando polimorfismo di lunghezza dei frammenti di reazione a catena della polimerasi (PCR-RFLP) per IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, TNF-α-308 G/A, TLR2-196 a 174 ins/del, TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile, TLR9 rs187084, IFN-γ +874 A/T e IFN-γ +2108 A/G. Sequenze di innesco specifiche per il locus, dimensioni attese degli ampliconi, enzimi di restrizione e modelli di digestione specifici per genotipo sono forniti nella Tabella Supplementare 1.
L'amplificazione PCR è stata eseguita in un volume finale di reazione di 25 μL contenente 2,5 μL di tampone da 10 ×, 2,0 μL di miscela dNTP a 2,5 mM ciascuno, 1,0 μL di primer diretto a 10 μM, 1,0 μL di primer inverso a 10 μM, 0,25 μL di DNA polimerasi Taq a 5 U/μL, 2,0 μL di DNA genomico a 50 ng/μL, e 16,25 μL di acqua priva di nucleasi. Il master mix PCR è stato preparato in un'area pre-PCR pulita, e il modello di DNA è stato aggiunto per ultimo. Un controllo negativo senza modello era incluso in ogni esecuzione PCR.
Il profilo termico consisteva in una denaturazione iniziale a 95 °C per 5 minuti, seguita da 35 cicli di denaturazione a 95 °C per 30 secondi, ricottura a 58–62 °C per 30 secondi a seconda della coppia di innesco, ed estensione a 72 °C per 30 secondi, con un'estensione finale a 72 °C per 7 minuti. I prodotti PCR sono stati confermati per la prima volta su gel di agarosio all'1,5% prima della digestione restrizionale.
L'amplificazione PCR veniva accettata solo quando la banda attesa dell'amplicon era visibile e il controllo senza template non mostrava amplificazione. Le reazioni che mostravano bande deboli, amplificazione aspecifica, interferenza primer-dimero o contaminazione nel controllo negativo venivano ripetute dal modello originale del DNA.
I prodotti PCR sono stati digeriti con la corrispondente endonucleasi di restrizione a 37 °C per 3 ore in un volume totale di digestione di 15 μL secondo le istruzioni del produttore. I frammenti digeriti sono stati risolti su gel di agarosio al 2,5% per la maggior parte dei loci. Il locus TLR2-196--174 in/del è stato risolto su gel di poliacrilammide all'8% per migliorare la discriminazione dei frammenti.
La digestione restritiva è stata accettata solo quando i modelli di frammenti corrispondevano al profilo digerente specifico del genotipo atteso. Le reazioni che mostravano digestione incompleta, bande spalmate, dimensioni inaspettate di frammenti o separazione poco chiara sono state ripetute. Le bande venivano visualizzate sotto illuminazione ultravioletta dopo la colorazione degli acidi nucleici. Le immagini gel venivano salvate con l'identificatore del campione, il nome del locus, la data di esecuzione e il numero del gel.
L'assegnazione del genotipo è stata eseguita indipendentemente da due ricercatori di laboratorio cieco. Le chiamate di genotipo discordanti o ambigue sono state esaminate utilizzando l'immagine originale del gel e ripetute tramite amplificazione PCR quando necessario. Il dieci percento dei campioni selezionati casualmente è stato ri-genotipizzato per il controllo della qualità, e il tasso di concordanza è stato del 99,2%. I dati finali sui genotipi sono stati inseriti nel dataset di analisi solo dopo aver verificato identificatori di campioni, nomi di locus, chiamate di genotipi e registrazioni di controllo qualità.
Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando un software di analisi statistica appropriato. I dataset clinici, ELISA e genotipici sono stati uniti utilizzando codici pazienti deidentificati. I codici dei pazienti sono stati controllati per duplicazioni, discorrispondenze e valori mancanti prima dell'analisi. È stata adottata una strategia a caso completo perché tutti i pazienti inclusi disponevano di dati chiave clinici, infiammatori e di genotipizzazione.
In un software di analisi statistica appropriato, lo stato di infezione polmonare è stato codificato come variabile di gruppamento, utilizzando il gruppo senza infezione polmonare come categoria di riferimento. Le variabili continue sono state inizialmente testate per la normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Le variabili continue normalmente distribuite sono state espresse come media ± deviazione standard e confrontate utilizzando il test t di Student a campioni indipendenti. Le variabili continue non normalmente distribuite sono state riportate come mediane con intervalli interquartili e confrontate utilizzando il test U di Mann-Whitney. Le variabili categoriche sono state espresse come conteggi e percentuali e confrontate utilizzando il test del chi-quadrato o il test esatto di Fisher, a seconda dei criteri.
Le distribuzioni dei genotipi nel gruppo senza infezione polmonare sono state valutate per l'equilibrio di Hardy-Weinberg prima dell'analisi dell'associazione. Le frequenze di genotipo e alleli sono state riassunte come n (%). I rapporti di probabilità e gli intervalli di confidenza del 95% per il rischio di infezione polmonare sono stati stimati utilizzando modelli di regressione logistica multivariabile. Lo stato di infezione polmonare è stato inserito come variabile dipendente. Le variabili genotipo, allele o biomarcatori sono state inserite come variabili indipendenti, come specificato per ogni analisi.
Età e sesso venivano inseriti nel modello principale a priori. BMI, broncopneumopatia cronica ostruttiva, malattie cardiache, perdite di liquido cerebrospinale, tempo di permanenza del drenaggio e ammissione della categoria Glasgow Coma Scale sono stati inseriti simultaneamente nel modello completamente aggiustato perché queste variabili erano clinicamente rilevanti o mostravano uno squilibrio basale tra i gruppi. La multicollinearità è stata valutata utilizzando fattori di inflazione della varianza (VIF), e i VIF <5,0 sono stati considerati accettabili.
Poiché sono stati testati polimorfismi multipli, è stata applicata la correzione del tasso di falsa scoperta di Benjamini-Hochberg alle analisi di associazionegenetica 12. I valori P dei test di associazione genetica sono stati classificati dal più piccolo al più grande, e la significanza corretta è stata determinata secondo la procedura di Benjamini-Hochberg. Tutti i test erano bilaterali e P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo, salvo diversa specificazione dopo aggiustamento multiplo per confronto.
I risultati finali sono stati confrontati con il dataset sorgente, i record di controllo qualità ELISA, i record di chiamata di genotipi e i valori delle tabelle prima della preparazione del manoscritto. I risultati sono stati interpretati come associazioni piuttosto che come effetti causali perché lo studio ha utilizzato un disegno osservazionale retrospettivo.
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Indicatori clinici
Le caratteristiche cliniche di base sono riassunte nella Tabella 1. Un totale di 360 pazienti con emorragia intracerebrale spontanea sono stati inclusi nell'analisi finale, comprendenti 180 pazienti che hanno sviluppato un'infezione polmonare nosocomiale durante il ricovero e 180 pazienti che non l'hanno fatta. Non sono state osservate differenze significative tra i gruppi in termini di età (62,4 anni ± 6,8 ...
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L'emorragia intracerebrale spontanea (ICH) rimane uno dei sottotipi di ictus più gravi e continua a imporre gravi carichi di mortalità precoce e disabilità a lungotermine 13. Nella pratica clinica, i pazienti con ICH sono particolarmente vulnerabili a complicazioni ospedaliere perché una lesione neurologica può indebolire la protezione delle vie aeree, ridurre l'efficacia della tosse, limitare la mobilità e aumentare l'esposizione a procedure di supporto invasive....
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse legati a quest'opera.
Gli autori ringraziano il personale clinico coinvolto nell'assistenza ai pazienti e le persone che hanno assistito nel recupero della letteratura e nell'organizzazione dei dati. Questo studio è stato supportato dal Progetto di Pianificazione delle Scienze e della Tecnologia della Salute della Città di Jiaxing (Grant No. JWKJ-25005).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Human TNF-α ELISA Kit | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | KHC3011 | ELISA kit per la misurazione quantitativa di TNF-α umano nel siero. |
| Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA Kit | Sigma-Aldrich / Merck | RAB0744-1KT | Kit ELISA a 96 pozzetti per la misurazione di TLR2 umano in campioni di siero o plasma. |
| Human TLR4 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP3-11807 | Kit ELISA sandwich colorimetrico per la misurazione di TLR4 umano in siero, plasma o altri fluidi biologici. |
| Human TLR9 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP2-76574 | Kit ELISA colorimetrico per la misurazione di TLR9 umano in campioni di siero. |
| Absorbance microplate reader | Agilent BioTek | 800 TS | Lettore di micropiastre per la misurazione della densità ottica ELISA a 450 nm con correzione di riferimento a 570 nm. |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | QIAGEN | 51104 | Kit basato su membrana in silice per l'estrazione di DNA genomico da sangue intero anticoagulato. |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spettrofotometro per microvolume per la valutazione della concentrazione del DNA e della purezza A260/A280. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific | A24811 | Ciclotermico utilizzato per l'amplificazione PCR endpoint nella genotipizzazione PCR-RFLP. |
| PCR Master Mix, 2X | Thermo Scientific | K0171 | Reagente PCR premiscelato contenente Taq DNA polimerasi, dNTP, MgCl2 e buffer di reazione; utilizzato per l'amplificazione PCR convenzionale. |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0401 | Fonte enzimatica alternativa per le reazioni PCR locus-specifiche quando si utilizzano componenti PCR separati anziché il master mix 2X. |
| Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | Acqua di grado molecolare utilizzata per la preparazione delle PCR, la diluizione del DNA e i controlli senza template. |
| Custom DNA primers | Sangon Biotech | Custom synthesis | Primers locus-specifici per la genotipizzazione PCR-RFLP; le sequenze dei primer sono elencate nella Tabella Supplementare S1. |
| Restriction endonucleases for PCR-RFLP | Thermo Scientific / New England Biolabs | Enzimi locus-specifici elencati nella Tabella Supplementare S1 | Enzimi di restrizione utilizzati per la digestione specifica del genotipo dei prodotti PCR. L'enzima selezionato per ciascun locus dovrebbe corrispondere al modello di digestione elencato nella Tabella Supplementare S1. |
| Agarose I, molecular biology grade | Thermo Scientific | 17850 | Agarosio per la preparazione di gel al 1,5% e 2,5% utilizzati per confermare i prodotti PCR e risolvere la maggior parte dei frammenti RFLP. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0371 | Marcatore di dimensioni del DNA per la stima delle dimensioni dei prodotti PCR e dei frammenti RFLP. |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | S33102 | Colorante per gel di acidi nucleici per la visualizzazione del DNA in gel di agarosio o acrilammide; utilizzato come alternativa a basso rischio al bromuro di etidio. |
| Horizontal agarose gel electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-Sub Cell GT system / 1704360 base | Sistema di elettroforesi per la separazione su gel di agarosio dei prodotti PCR e RFLP. |
| Vertical PAGE electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001 | Sistema di elettroforesi verticale per la separazione su gel di poliacrilammide all'8% quando è necessaria una discriminazione dei frammenti ad alta risoluzione. |
| Gel documentation system with UV or blue-light transillumination | Bio-Rad / equivalent laboratory system | Gel Doc XR+ o equivalente | Sistema di imaging per la documentazione delle bande di DNA colorate dopo l'elettroforesi su gel. Utilizzare la protezione UV o la modalità luce blu se disponibile. |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf / equivalent laboratory centrifuge | 5424 R o equivalente | Centrifugatrice refrigerata utilizzata per la separazione del siero a 1.500 × g e 4 °C. |
| −80 °C ultra-low temperature freezer | Thermo Scientific / equivalent laboratory freezer | Forma 900 Series o equivalente | Conservazione delle aliquoti di siero prima dell'analisi ELISA. |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Versione 25.0 | Software statistico utilizzato per statistiche descrittive, test di normalità, confronti tra gruppi, regressione logistica ed esportazione dei risultati del modello. |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel for Microsoft 365 | Utilizzato per il controllo dei dati, l'organizzazione della mappatura delle piastre, la revisione dei valori duplicati e la preparazione dei file di analisi fusi prima dell'analisi SPSS. |
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