Articolo metodologico

Perfusione microvascolare monitorata tramite imaging laser a contrasto speckle durante lesioni da ischemia-reperfusione renale nei topi

DOI:

10.3791/70762

⸱

27 febbraio 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, First Affiliated Hospital & Cardiovascular Research Center, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Un sistema laser di contrasto speckle è stato utilizzato per monitorare le variazioni del flusso sanguigno microvascolare renale durante la ischemia-reperfusione unilaterale renale dopo la resezione del rene destro nei topi.

Abstract

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L'imaging laser a contrasto di speckle (LSCI) è una tecnica non invasiva per misurare la perfusione sanguigna superficiale su vaste aree. Grazie alla sua elevata risoluzione spaziotemporale, la LSCI semi-quantifica i cambiamenti eterogenei del flusso sanguigno tra diverse regioni all'interno dell'area fotografica. Qui dimostriamo la tecnica della LSCI per registrare il flusso sanguigno durante una lesione unilaterale di ischemia-reperfusione renale (IRI) nei topi. Dopo la nefrectomia destra, la posizione del topo e il punto focale dell'obiettivo del sistema LSCI sono stati regolati per garantire che il rene sinistro fosse nel campo visivo. Le scansioni LSCI venivano eseguite prima, durante e dopo l'ischemia del rene. Inoltre, selezionando le regioni di interesse (ROI), il flusso sanguigno nelle regioni veniva monitorato simultaneamente. Il metodo LSCI visualizza la perfusione microvascolare del rene e consente una mappatura in tempo reale del flusso sanguigno. Può essere utilizzato per monitorare il flusso sanguigno microvascolare e valutare l'effetto di un intervento sulla cinetica della reperfusione e sull'omogeneità spaziale durante l'IRI renale del topo o altri modelli animali simili.

Introduzione

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La lesione ischemia-reperfusione (IRI) è tra le principali cause di lesione renale acuta (AKI), associata ad alta morbilità e alta mortalità neipazienti 1,2. Il cambiamento dell'emodinamica renale è uno dei fattori criticidell'AKI 1 indotta da IR. La disfunzione microcircolatoria evocata da RI è una delle principali cause dello sviluppo di lesioni, che porta alla privazione di ossigeno e alla disfunzione mitocondrialedelle cellule 3,4. Pertanto, monitorare in tempo reale i cambiamenti del flusso sanguigno è un metodo efficace per garantire un'ischemia o reperfusione efficace del rene e per valutare il grado di IRI nei modelli animali per il disturbo.

Esistono molteplici tecniche per misurare la perfusione microvascolare dei tessuti, tra cui la fluormetria Doppler laser (LDF)5, l'autofluorescenza (NADH) con autofluorescenza 6,7,8 con adenina dinucleotide (NADH), l'imaging ainfrarossi 9 e l'angiografia indocyanina verde (ICG) 10. Tra queste, l'imaging a infrarossi e l'imaging autofluorescenza NADH misurano indirettamente la perfusione microvascolare. LDF, utilizzando una sonda ottica, monitora solo il flusso sanguignoregionale 5, e la scansione LDF non è abbastanza rapida da monitorare i cambiamenti in tempo reale della perfusione microvascolare tissutale nelle condizioni I/R 11. L'angiografia ICG può anche identificare i vasi ostruitirenali 10 ma richiede la somministrazione di un agente di contrasto, che ne limita l'uso a un numero limitato dimisurazioni 12. L'imaging laser a contrasto di speckle (LSCI) è un metodo efficiente e non invasivo per monitorare la microperfusione renale in temporeale 13. È stato utilizzato per generare informazioni spazialmente risolte relative alla dinamica del flusso sanguigno. Quando un fascio coerente viene proiettato su una superficie ruvida, le onde di luce riflesse o diffuse interferiscono tra loro a causa di minuscole differenze di percorso, formando una distribuzione casuale di motivi di macchie chiare e scure noti come "speckle". La LSCI mappa la velocità del flusso sanguigno nei tessuti superficiali analizzando il grado di sfocatura della "macchia dinamica" prodotta quando la luce laser irradia il tessuto 12,14,15. In questo studio, il sistema LSCI operava a una lunghezza d'onda laser di 785 nm con una risoluzione spaziale di 3 μm, un campo visivo regolabile tra 6,3 mm × 4,7 mm e 42 mm × 31 mm, e una velocità di imaging fino a 120 fotogrammi al secondo, permettendo una mappatura ad alta risoluzione e in tempo reale della perfusione microvascolare corticale. Alla luce di questi vantaggi, l'LSCI è stata applicata in diversi contesti sperimentali e clinici per il monitoraggio del flusso sanguigno, tra cui ustioni16, perfusioneretinica 17, flusso sanguignocerebrale 18,esofago 19 eintestino 20.

Va notato che l'LSCI valuta principalmente la perfusione nei tessuti superficiali, fornisce valori di flusso relativi piuttosto che assoluti e può essere influenzato dalle proprietà ottiche dei tessuti e dagli artefatti del movimento. Queste caratteristiche intrinseche vengono considerate nell'interpretazione dei dati di imaging.

Questo lavoro, utilizzando un modello che coinvolgeva la nefrectomia destra per facilitare l'esposizione e l'imaging del rene controlaterale, ha monitorato i cambiamenti nella perfusione microvascolare prima, durante e dopo l'ischemia in un modello murino unilaterale renale I/R utilizzando LSCI e ha dimostrato l'eterogeneità spaziale del flusso sanguigno sulla superficie del rene.

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Protocollo

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Tutte le procedure animali rispettavano la Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio e la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio, e furono approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Shantou University Medical College. Per eliminare differenze basate sul genere e sul ceppo negli effetti IRI, nello studio sono stati utilizzati solo topi maschi C57BL/6N. Tutti i topi sono stati abbinati per età e peso per ottenere risultati comparabili. È stato utilizzato un campione di n = 5, coerente con studi metodologici precedenti che utilizzavano LSCI per la validazionetecnica 21. Gli animali ricevettero cure umane e furono soppressi dopo gli esperimenti tramite inalazione di CO2 . I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Prima di iniziare l'intervento, attiva il sistema laser di contrasto con macchie. Il sistema utilizzato in questo studio funziona con un laser a 785 nm. Imposta la distanza di lavoro a circa 15-20 cm sopra il campo chirurgico. Il sistema calcola il flusso sanguigno nelle Laser Speckle Perfusion Units (LSPU) basandosi sull'algoritmo di contrasto spaziale. Assicurati che lo strumento sia riscaldato e stabile prima di procedere.

1. Preparazione e laparotomia degli animali

  1. Sterilizza il tavolo chirurgico prima di ogni intervento. Prepara e posiziona tutti i materiali necessari (strumenti sterilizzati e cotton fioc, garze, anestetici pre-diluiti, borsa riscaldante, pinza vascolare, soluzione salina, crema depilatoria, batuffoli di cotone, punti, antisettici cutanei e sutura) sul tavolo operatorio.
  2. Somministrare meloxicam (0,2 mg/kg di peso corporeo; iniezione sottocutanea) al topo 30 minuti prima per alleviare il dolore.
  3. Versa una certa quantità di soluzione salina sterilizzata in un contenitore pulito. Poi prendi un pezzo di garza e taglia un'apertura adatta al centro.
  4. Anestetizzare un topo con iniezione intraperitoneale di Tribromoetanolo al 2,5% (400 mg/kg di peso corporeo; precedentemente diluito in soluzione salina sterile).
    NOTA: Il tribromoetanolo è stato usato come anestetico durante il processo di nefrectomia destra. E l'isoflurano all'1% è stato utilizzato per l'anestesia durante procedure prolungate di monitoraggio del flusso sanguigno.
  5. Posiziona il mouse sul cuscinetto riscaldante con del nastro adesivo e usa la crema depilatoria per rimuovere i peli dall'addome del topo. Durante l'intervento, usa la borsa riscaldante per mantenere la temperatura rettale tra 37 °C ± 0,5 °C.
  6. Disinfetta prima la pelle nell'area chirurgica con alcol al 75% e poi con iodoforo usando un cotton fioc.
  7. Usa le pinze per pizzicare il dito del topo. Quando il topo non mostra risposta al dolore, fai un'incisione verticale lungo la linea mediana dell'addome usando delle forbici. Separare delicatamente la pelle dal peritoneo, poi aprire il peritoneo ed entrare nella cavità addominale.
  8. Applica un retrattore al topo per ottimizzare la visibilità e copri il campo operatorio con una garza, allineando lo spazio sulla garza con la cavità addominale e inumidendolo con soluzione salina.

2. Nefrectomia destra

  1. Usa un cotton fioc per spingere delicatamente l'intestino verso un lato della garza, esponendo il rene destro e i tessuti circostanti. Piega la garza per coprire l'intestino e inumidilo con soluzione salina normale per evitare che l'intestino si secchi.
  2. Usa le pinze angolate per sollevare l'uretere destro. Fai passare due fili di sutura 6-0 attraverso l'uretere ed esegui la legatura in due posizioni.
  3. Tranciare l'uretere tra le due legature usando microforbici.
  4. Dopo aver inumidito i batuffoli con soluzione salina normale, usa una pinza fine per raccogliere i batuffoli di cotone, spingi delicatamente il fegato verso l'alto e fissalo con i batuffoli di cotone, esponendo i reni e i vasi sanguigni sul lato destro.
  5. Usa una pinza angolata per separare in modo attuto i cuscinetti di grasso perinefrico lungo il lato del rene destro finché l'arteria e la vena renale non sono completamente esposte.
    NOTA: Separare simultaneamente la massa di tessuto surrenalico situata sopra il rene.
  6. Fai scorrere con cura le pinze angolate sotto l'arteria renale e la vena per creare un canale. Poi, passa una sutura intrecciata in seta 6-0 intorno ai vasi per legarli insieme.
  7. Taglia l'arteria renale e la vena occluse situate vicino al rene. Rimuovi il rene insieme al tessuto aderente rimanente.
  8. Rimuovi il batuffolo usato per tenere il fegato.

3. Monitoraggio del flusso sanguigno renale con imaging laser a contrasto speckle (LSCI) durante ischemia-reperfusione

  1. Attiva il sistema LSCI e il software dedicato dello strumento.
  2. Clicca su Immagine Originale e Anteprima per visualizzare l'immagine grezza, non elaborata, del campo chirurgico.
  3. Cambia la posizione dei topi, mantiene l'anestesia usando isoflurano all'1% somministrato a 600 mL/min tramite un cono nasale, e regola l'ingrandimento della fotocamera osservando l'immagine originale per ottenere una visuale chiara del rene bersaglio.
  4. Clicca su Visualizzazione Simultanea per visualizzare l'immagine del flusso sanguigno in tempo reale. Imposta l'ingrandimento a 2,5× e seleziona Regolazione Automatica del Flusso Sanguigna per ottimizzare l'immagine. Poi, blocca i parametri del flusso sanguigno. Inoltre, impostato per registrare un fotogramma dell'immagine ogni 5000 ms.
    NOTA: Palline di cotone bagnate possono essere usate per garantire la posizione stabile del rene e tenere lontani gli organi e i tessuti circostanti, accentuando la distinzione tra l'area renale e il fondo.
  5. Imposta la dimensione dei parametri dell'area quadrata a 112 e disporti uniformemente le 5 aree quadrate in un orientamento fisso nella vista renale. Clicca su Registrazione e Registrazione Immagine in Tempo Reale per iniziare a registrare i dati del flusso sanguigno.
    NOTA: La macchina registrerà automaticamente le unità di perfusione laser speckle (LSPU), che rappresentano le unità di flusso sanguigno in tempo reale nei ROI e possono essere utilizzate per analisi. Durante il processo di rilevamento, il movimento legato alla respirazione o i cambiamenti ambientali possono causare uno spostamento del campo visivo. Se il sistema lo indica nell'area di rilevamento, la registrazione attuale dovrebbe essere interrotta. Poi clicca su Registrazione immagine in tempo reale e registra di nuovo.
  6. Dopo aver registrato una base di 30 minuti, separare il tessuto adiposo che circonda i vasi renali sinistri. Usa le pinze emostatiche per afferrare una micropinza e posizionarla sull'arteria renale sinistra e sulla vena vicino all'ilo. Continua il monitoraggio in tempo reale per altri 30 minuti.
  7. Rilascia il micro-clamp per avviare la reperfusione. Monitorare e registrare il recupero in tempo reale del flusso sanguigno microvascolare renale.
  8. Una volta che la reperfusione del flusso sanguigno è monitorata per almeno 60 minuti, smettere di monitorare e sutura l'incisione addominale con una sutura intrecciata in seta 7-0.

4. Recupero e assistenza post-operatoria

  1. Somministrare liquidi con un'iniezione intraperitoneale di 1 mL di soluzione salina per prevenire la disidratazione dopo l'intervento.
  2. Tieni i mouse sulla borsa termica. Monitorare attentamente i topi finché non si sono ripresi conoscenza, sembrano vigili e sono in grado di raddrizzarsi.

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Risultati

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Questo articolo mirava a rilevare i cambiamenti nel flusso sanguigno renale durante l'AKI indotta da IR. Pertanto, abbiamo utilizzato un modello murino comune che prevede la nefrectomia destra (Figura 1A) seguita da una procedura IR sul rene controlaterale (Figura 1B). Poiché era necessario un monitoraggio in tempo reale del flusso sanguigno durante l'IRI, tutte le manipolazioni sui topi venivano eseguite nella regione dello str...

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Discussione

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Questo lavoro descrive l'applicazione di un sistema LSCI per la visualizzazione in tempo reale e ad alta risoluzione della dinamica del flusso sanguigno microvascolare renale durante l'IRI nei topi. Il protocollo offre un vantaggio significativo rispetto alle tradizionali misurazioni degli endpoint o ai metodi con risoluzione spaziale limitata, come LDF, fornendo una mappa di perfusione bidimensionale che cattura l'eterogeneità regionale all'interno della microcircolazione renale. L'effi...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dal Programma di Ricerca di Squadra Innovativo per le Università della Provincia del Guangdong (2022KCXTD009).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Contenitore assorbente (per anestesia)Shenzhen Laiyue Biotech Co., Ltd, Cina10-0210
Alcol, medico (75%)HENGLIYA, Xinjiang, CinaN/ADisinfettante cutaneo
Vaporizzatore anesteticoMidmarkhttps://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer
Cotton bobQingdao Hainuo Biological Engineering Co., Ltd, Cinahttps://www.hainuocn.com/index/detail/448.html
Crema depilatoriaVEEThttps://www.veet.com.cn/jingchun/whx
Benda di garzaWinner Medical Co., Ltd, Shenzhen, Cinahttps://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html
Cuscina riscaldanteRenqiu Dingsheng Heating Equipment Co., Ltd, CinaHD-1902Per mantenere la temperatura corporea
Soluzione iodoforaTaixinkang, Jinxian, Cinahttps://www.11467.com/nanchang/co/120661.htmAntisettico cutaneo
IsofluranoRWD Life Science Co., Ltd, CinaR510-22-10Anestetico inalatorio
Sistema di imaging a contrasto con specchi laser (LSCI)Hubei Xunwei Optoelectronic Technology Co., Ltd, CinaSIM BFI HR PROSistema equivalente MoorFLPI-2
MeloxicamQilu Animal Health Products Co., Ltd, Cinahttps://en.qiludb.com/companion_animal/500.html0,2 mg per kg di peso corporeo; analgesico
Micro-clampShanghai Medical Instrument(Group) Co., Ltd, CinaW40140Pinza vascolare
Soluzione fisiologica normale (0,9% cloruro di sodio)Cisen Pharmaceutical Co., Ltd, Cinahttps://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62
Sutura intrecciata in seta (6-0)Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd, Cinahttp://www.fdma.com.cn/products_detail/12.htmlPer la legazione dei vasi
Sutura intrecciata in seta (7-0)Wego Terumo (Weihai) Medical Products Co., Ltd, Cinahttps://www.weigaoholding.com/Per la chiusura della ferita, suture chirurgiche non assorbibili con ago curvo
Siringa (1 mL)Shandong Ande Healthcare Apparatus Co., Ltd, Cinahttps://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.htmlCon ago da 26 G
TribromoetanoloSigma-AldrichT48402-100Gsoluzione al 2,5%; Anestetico iniettabile

Riferimenti

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