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Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Scientifico del Servizio Sanitario di Concepción. Tessuto osseo umano è stato prelevato da teste femorali donate da pazienti sottoposti a interventi di protesi dell'anca presso l'Ospedale di Traumatologia di Concepción, Cile, dopo consenso scritto e informato. I campioni venivano conservati a −80 °C fino all'uso. Tutte le procedure rispettavano le linee guida istituzionali per l'uso etico dei tessuti umani nella ricerca. Tutto il tessuto osseo umano è stato ottenuto da teste femorali donate dai pazienti dell'Ospedale di Traumatologia di Concepción, Cile, con il consenso informato e con l'approvazione del Comitato Etico Scientifico del Servizio Sanitario di Concepción. Tutte le procedure rispettano le linee guida istituzionali per l'uso dei tessuti umani.
1. Sintesi GelMA
- Sciogliere 10 g di gelatina tipo A A in 100 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,5) a 60 °C sotto mescolamento costante.
- Abbassare la temperatura a 50 °C e aggiungere 5 mL di anidrido metacrilico a una dose di 0,5 mL/min, mescolare delicatamente per 1–3 ore.
- Diluire la miscela di reazione 5× con PBS preriscaldato a 40 °C per fermare la reazione.
- Dialisi la soluzione utilizzando una membrana da 12–14 kDa contro 3–5 L di acqua distillata a 40 °C per 5–7 giorni, sostituendo l'acqua ogni giorno.
NOTA: (Passo critico) Assicurarsi una sostituzione completa quotidiana dell'acqua per rimuovere l'anidride metacrilica non reattiva.
- Liofilizza la soluzione dialitica per 24 ore e conserva il GelMA liofilizzato a 4 °C fino all'uso.
2. Preparazione dell'idrogel GelMA
- Prepara lotti da 10 mL di idrogel GelMA a 5, 10 o 15 w/v%.
- Sciogliere 0,5, 1,0 o 1,5 g di GelMA liofilizzato in 9,5 mL di acqua deionizzata a 50 °C.
- Raffredda la soluzione a 37 °C.
- Aggiungere 0,5 mL di soluzione fotoiniziatrice Irgacure 2959 (0,5 w/v% di etanolo assoluto).
- Mescola delicatamente e mantieni la soluzione a 37 °C fino a una filtrazione sterile attraverso un filtro a membrana acetato di cellulosa da 0,22 μm.
3. Decellularizzazione ossea
- Scongelare gradualmente le teste femorali fino a 25 °C. Taglia ogni testa femorale a metà e poi in pezzi più piccoli.
- Immergi i pezzi in acqua distillata sterile a 60 °C e sonica per 15 minuti (40 kHz, continuo).
- Lavare i campioni in 300 mL di acqua distillata preriscaldata a 60 °C mentre si agita a 200 giri/min per 5 minuti.
- Centrifugare a 1850 × g per 15 minuti a 25 °C. Ripeti i passaggi di lavaggio e centrifuga tre volte.
- Sterilizza il tessuto tramite sonicazione (40 kHz, continuo) per 10 minuti a 60 °C in una soluzione contenente perossido di idrogeno al 3% e acido perrossiacetico allo 0,02%.
- Trasferire il tessuto a 300 mL di etanolo al 70% e sonicare (40 kHz, continuo) per 10 minuti a 21 °C.
- Lavare i campioni due volte con acqua distillata da 300 mL, agitare a 200 giri/min per 10 minuti a 60 °C e centrifugare a 1850 × g per 15 minuti a 25 °C.
- Innanzitutto, si precongela l'osso a -80 °C per 4 ore, poi si liofilizza l'osso decellularizzato per 24 ore a base larga per garantire un'asciugatura uniforme ed evitare un'altezza eccessiva del campione a 0,05 mbar tra -40 e -60 °C.
NOTA: (Passo critico) Assicurarsi che il campione non superi i 2–3 cm di altezza all'interno del contenitore per evitare una liofilizzazione incompleta.
4. Preparazione delle microparticelle ossee
- Inserire i frammenti ossei decellularizzati in fiaschette Erlenmeyer da 250 mL nella soluzione sterilizzante e omogeneizzare utilizzando un omogeneizzatore fino a ottenere una soluzione bianca uniforme (Video Supplementare 1).
- Centrifugare a 1850 × g per 15 minuti a 25 °C, eliminare il soprantantante e lavare il pellet due volte con 300 mL di acqua distillata a 25°C sotto agitazione a 200 giri/min per 10 minuti. Eseguire una centrifugazione finale a 1850 × g per 15 minuti a 25 °C.
- Liofilizza (0,05 mbar a -40---60 °C) il materiale risultante per 48 ore e conserva a -80 °C fino all'uso.
- Molire meccanicamente l'osso corticale o midollare liofilizzato utilizzando una malta ceramica sterilizzata fino a ottenere una polvere fine (Figura 1).
- Fai passare la polvere attraverso una rete o un setaccio da 200 μm, pesa il materiale finale e conserva a -80 °C.
NOTA: (Passaggio critico) Assicurarsi che la polvere sia completamente asciutta prima del setaccio per evitare aggregazioni e una scelta imprecisa delle dimensioni delle particelle.
Video supplementare 1: Procedura di omogeneizzazione ossea. Omogeneizzazione dei frammenti ossei decellularizzati utilizzando un omogeneizzatore fino a ottenere una sospensione bianca uniforme. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura 1: Preparazione delle microparticelle ossee. (A) Frammenti ossei decellularizzati dopo l'omogeneizzazione con omogeneizzatore OV5 e la conservazione a -80 °C. (B,C) Malta ceramica sterilizzata usata per macinare ossa decellularizzate in una polvere fine. (D) Microparticelle ossee decellularizzate finali dopo il setaccio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
5. Fabbricazione del gel osseo
- Prepara 10 w/v% di GelMA sciogliendo 1 g di GelMA in 9,5 mL di acqua deionizzata a 50 °C.
- Raffreddare la soluzione a 37 °C e aggiungere la soluzione di fotoinitiatore Irgacure 2959.
- Mantieni la soluzione a 37 °C ed esegui la filtrazione sterile utilizzando un filtro da 0,22 μm.
- Aggiungi microparticelle ossee decellularizzate (DBMP) all'1% w/v.
- Mescola e pipetta su e giù con attenzione, evitando di creare bolle, a 40 °C fino a ottenere una sospensione omogenea che formi il gel osseo (BG).
- Conserva la glucosa a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
NOTA: (Passo critico) Mantieni l'idrogel sopra la temperatura di gelificazione (≥37 °C) prima dell'incorporazione cellulare per evitare una solidificazione prematura.
6. Coltura primaria degli osteociti
- Estrazione del midollo osseo e lavaggio iniziale
- Estrarre e triturare il tessuto del midollo osseo dall'interno della testa femorale utilizzando strumenti chirurgici sterili (Figura 2).
- Trasferire il tessuto tritato in una piastra di Petri sterile.
- Lavare il tessuto tre volte con mezzo di coltura α-MEM integrato con soluzione antibiotica-antimicotica (100 μg/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina, 0,25 μg/mL di anfotericina).
- Risciacqua una volta con la Soluzione Salina Bilanciata di Hank (HBSS).
NOTA: (Passo critico) Minimizzare il tempo tra il prelievo e l'elaborazione del tessuto per preservare la vitalità cellulare.
- Digestione enzimatica
- Incubare il tessuto in soluzione di collagenasi di tipo I per 25 minuti a 37 °C con una leggera agitazione.
- Lava con HBSS.
- Ripeti i passaggi 6.2.1–6.2.2 altre due volte (tre digestione totale della collagenasi).
- Incubare il tessuto in acido etilendiaminaminano tetraacetico (EDTA) di 0,5 mM per 25 minuti a 37 °C.
- Lava con HBSS e ripeti il passaggio EDTA altre due volte.
- Esegui un'ultima digestione con collagenasi di tipo I (25 minuti a 37 °C), seguita da un lavaggio HBSS.
NOTA: (Risoluzione dei problemi) Una digestione incompleta può causare una bassa resa cellulare; Estendi l'incubazione enzimatica di 5–10 minuti se necessario.
- Recupero cellulare e coltura
- Raccogli la soluzione di collagenasi e trasferisci il lavaggio finale HBSS in un tubo centrifuga da 50 mL.
- Centrifuga a 1.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare il sovrantato e risospendere il pellet in 2 mL di α-EM completo.
- Seminare la sospensione cellulare in due fiaschette di coltura T75 e incubare a 37 °C con il 5% di CO₂.
NOTA: Sostituire il mezzo di coltura ogni 2–3 giorni fino a raggiungere una confluenza adeguata (Figura 3).
Figura 2: Prelievo del tessuto midollo osseo. (A) Testa femorale ottenuta da un intervento di sostituzione dell'anca, che mostra la regione midollare utilizzata per l'isolamento cellulare. (B) Pezzi ossei midollari tritati posti in una piastra di Petri sterile prima della digestione enzimatica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Cultura primaria degli osteociti. Osteociti attaccati e proliferano in un monostrato all'interno di un T75 dopo l'isolamento dall'osso midollare umano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
7. 3D coltura cellulare
- Preriscalda la quantità di idrogel di glucosa a 37 °C.
NOTA: (Passaggio critico) Assicurarsi che l'area di lavoro sia priva di correnti d'aria; Il raffreddamento accelera la gelificazione prematura.
- Distoglie gli osteociti coltivati e centrifuga a 500 × g per 5 minuti in un tubo da 15 mL.
- Risospendere il pellet in 200 μL di mezzo di coltura e mescolare con il gel di glucosa idrogel per ottenere una densità cellulare finale di almeno 1000 cellule/μL (d'ora in poi chiamata bioink).
- Aspirare 50 μL del bioinchiostro utilizzando una pipetta da 1000 μL e mantenere a 37 °C fino alla deposizione.
- Pipetta 50 μL di bioinchiostro per costruzione in ciascun pozzo della piastra di coltura (Video Supplementare 2); lascia circa 5 minuti per la gelificazione fisica a temperatura ambiente (Figura 4).
- Esponi ogni pozzo a luce UV a 365 nm per 1 minuto per ottenere un attacco irreversibile (0,30 J/cm 2).
- Aggiungi il mezzo di coltura e incuba i costrutti a 37 °C, 5% CO2 per i punti temporali richiesti. Usa una piastra separata per ogni momento temporale.
Figura 4: Preparazione della costruzione della coltura cellulare 3D. La piastra del pozzo contenente GelMA carico di cellule si costruisce immediatamente dopo il pipettaggio e dopo il reticolamento UV (365 nm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 2: Preparazione di costrutti 3D carichi di cellule. Deposizione delle miscele idrogel-cella in una piastra a 12 pozzi utilizzando una semplice tecnica di pipettura prima del reticolamento UV. Clicca qui per scaricare questo file.
8. Test di biocompatibilità
- Macchiature vive/morte
- Coltivare gli impalcature carichi di cellule per gli intervalli di tempo desiderati.
- Lava delicatamente con PBS sterile.
- Incubare i costrutti per 30 minuti al buio con una soluzione viva/morta contenente 0,2% di omidero-1 di etidio-1 (EthD-1) e 0,05% di calceina AM in PBS.
- Immagini immediatamente usando un microscopio a fluorescenza con filtri per calcein AM (~495/515 nm) ed EthD-1 (~495/635 nm). I set standard di fluoresceina isotiocianato (FITC) e Texas Red sono compatibili rispettivamente con la rilevazione della calcina AM ed EthD-1.
- Identificare le cellule vive tramite fluorescenza citoplasmatica verde e le cellule morte tramite fluorescenza nucleare rossa.
NOTA: Le immagini planari possono essere elaborate utilizzando ImageJ (Fiji). L'obiettivo obiettivo, il tempo di esposizione, il guadagno e l'intensità dell'illuminazione sono stati mantenuti costanti per tutti i campioni confrontati e regolati solo per evitare la saturazione del segnale. Per minimizzare le errate interpretazioni causate dall'autofluorescenza, sono state mantenute le stesse impostazioni di acquisizione per tutti i campioni all'interno di ogni esperimento, e sono state utilizzate osservazioni di controllo di costrutti di impalcatura/microparticelle ossee senza cellule per riconoscere il pattern di fluorescenza di fondo associato al biomateriale. Questi controlli ci hanno permesso di distinguere il segnale derivato dalle particelle dalla vera colorazione delle celle arrotondate durante l'interpretazione dell'immagine.
- Quantificazione di Alamarblue
- Prepara una soluzione di lavoro al 5% di alamarblue in mezzo completo.
- Incubare impalcature in soluzione di alamarBlue per 2,5 ore a 37 °C e 5% di CO₂, protette dalla luce.
- Trasferire 100 μL di sovrantante su una piastra a 96 pozzi in triplice, inclusi i controlli.
- Misurare la fluorescenza a 360/40 nm di eccitazione e 460/40 nm di emissione.
- Normalizza i valori di fluorescenza ai controlli per determinare l'attività metabolica relativa.
