Farmacologia di rete e verifica sperimentale per esplorare la corteccia cinnamomi contro l'osteonecrosi indotta da steroidi della testa femorale

Sommario

Questo studio mira a esplorare i potenziali meccanismi della corteccia di Cinnamomi nel trattamento dell'osteonecrosi della testa femorale integrando farmacologia di rete, simulazioni di dinamica molecolare ed esperimenti sugli animali.

Abstract

L'osteonecrosi della testa femorale indotta da steroidi (SONFH) provoca dolore intenso e mobilità limitata, compromettendo significativamente la qualità della vita dei pazienti. La corteccia cinnamomica (CC) ha dimostrato di alleviare efficacemente questa condizione, tuttavia il suo meccanismo d'azione rimane poco chiaro. Questo studio mira a identificare i composti attivi della CC ed esplorare i loro meccanismi nella SONFH. I costituenti attivi sono stati selezionati utilizzando i database HERB 2.0, PubCem e SwissADME, e i loro obiettivi corrispondenti sono stati previsti utilizzando il database svizzero Target Prediction. I target per SONFH sono stati identificati intersecando target provenienti dai database GEO, DisGeNET, GeneCards e OMIM con i target correlati al composto. È stata costruita una rete di interazione proteina-proteina (PPI) utilizzando il database STRING, e analisi di arricchimento GO e KEGG sono state condotte tramite il database DAVID. Le interazioni composto-bersaglio più promettenti sono state validate tramite docking molecolare (MD) e simulazioni di dinamica molecolare. I ricercatori hanno identificato 563 potenziali bersagli, inclusi 61 bersagli correlati a SONFH, con AKT1, HIF-1α e STAT3 che fungono da nodi centrali. L'analisi di arricchimento KEGG ha evidenziato il percorso di segnalazione HIF-1α come meccanismo chiave. Inoltre, esperimenti su animali hanno dimostrato che la frazione attiva di CC mitigava efficacemente il danno strutturale della testa femorale in un modello murino con SONFH. I risultati suggeriscono che la CC potrebbe migliorare la SONFH coordinando l'adattamento all'ipossia e regolando l'angiogenesi e l'osteogenesi.

Introduzione

L'osteonecrosi della testa femorale indotta da steroidi (SONFH) è una grave patologia osteoarticolare, causata dalla disordinazione o riduzione dell'apporto sanguigno alla testa femorale da diversi¹. La morte delle cellule ossee e dei componenti del midollo osseo porta a danni strutturali all'interno della testa femorale e a un compromisso funzionale dell'articolazione^{dell'anca 2}. Clinicamente, i pazienti si manifestano tipicamente con dolore all'anca e mobilità^{limitata 3}. Senza un trattamento efficace, l'80% dei pazienti con SONFH progredirà verso il collasso della testa femorale, richiedendo una sostituzione totale^{dell'anca 4}. Impone una forte pressione psicologica e un pesante onere economico sui^{pazienti 5}. La pratica clinica raccomanda l'uso di una combinazione di anticoagulanti, farmaci fibrinolitici, vasodilatatori e farmaci abbassanti i lipidi per trattare la SONFH, che hanno dimostrato un certo potenziale clinico ma generalmente un'efficacia terapeutica^{limitata 6}.

La medicina tradizionale cinese (MTC) ha dimostrato sempre più il suo impatto positivo nel trattamento della^{SONFH 7}. La MTC mostra potenziale per il sollievo dei sintomi, il controllo della malattia e un miglioramento della mobilità articolare e della qualità della vita dei^{pazienti 8}. Clinicamente, la CC e i suoi componenti sono stati ampiamente utilizzati per migliorare la SONFH, mostrando un'efficacia^{notevole 9}. Numerose sostanze bioattive presenti nella CC hanno una varietà di azioni biologiche, tra cui proprietà antinfiammatorie, antiossidanti, promotori dell'angiogenesi e miglioranti la^{microcircolazione.} Ricerche precedenti nell'ingegneria tissutale ossea e nel metabolismo hanno stabilito che la cinnamaldeide, un componente attivo principale della CC, può modulare le vie di segnalazione legate al rimodellamento^{osseo 11}. Lo studio iniziale ha indicato che le pillole di Yougui (YGP) hanno potenziale terapeutico per la SONFH favorendo l'angiogenesi e potenziando le risposte^{infiammatorie 12}. Come farmaco sovrano negli YGP, il CC può riscaldare lo yang, beneficiare il qi e sbloccare i meridiani, producendo effetti terapeutici benefici su^{SONFH 13}. Tuttavia, i meccanismi precisi alla base della sua efficacia restano poco chiari. Chiarire la rete regolatoria multi-bersaglio che il CC utilizza per migliorare la SONFH non solo aiuterebbe a comprenderne la natura farmacologica, ma ne favorirebbe anche un uso clinico sensato e la creazione di miglioramenti correlati. Integrare la bioinformatica con la farmacologia delle reti fornisce un approccio efficace per chiarire i meccanismi d'azione¹⁴.

La farmacologia di rete può identificare componenti bioattivi nelle erbe e prevedere le associazioni tra questi componenti del farmaco e i bersagli^{genici 15}. La MD viene utilizzata per convalidare le interazioni di legame tra i composti attivi candidati e i principali bersagli terapeutici. La dinamica molecolare utilizza la meccanica newtoniana per valutare la stabilità e la flessibilità del legame al ligando-recettore attraverso la simulazione del movimento¹⁶. Gli autori hanno studiato in modo approfondito i potenziali effetti della CC sulla SONFH utilizzando la farmacologia di rete, la medicina medica e simulazioni di dinamica molecolare. I risultati forniscono un riferimento per future ricerche approfondite sulla base farmacodinamica dei materiali e sul meccanismo della CC nel miglioramento della SONFH. Il diagramma di flusso dello studio è mostrato nella Figura 1.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Etico Sperimentale Animale dell'Università di Medicina Cinese dello Zhejiang (IACUC-20240708-22) e conformi alla Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio emessa dagli Istituti Nazionali di Salute. In questo esperimento sono state utilizzate venti femmine di topi C57BL/6J di 10 settimane, dal peso di 20 a 22 g. Questi topi sono stati ottenuti dal centro per animali dell'Università Medica Cinese dello Zhejiang. Vedi la Tabella dei Materiali per un elenco di tutti i reagenti, le attrezzature e i software utilizzati in questo protocollo.

Screening di composti attivi e bersagli di CC
I composti chimici di CC sono stati identificati utilizzando l'erba 2.0¹⁷ con la parola chiave "CC." Le sostanze chimiche senza un ID PubChem o con lo stesso ID sono state filtrate. Poi unisci e rimuovi i duplicati per ottenere i siti target corrispondenti a CC. Esegui uno screening iniziale utilizzando il database^{PubChem 18} basato sulla regola dei cinque di Lipinski (Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹. Gli autori utilizzano il database PubChem per determinare la rappresentazione SMILES per ogni composto chimico. Utilizzando il database SwissADME, gli autori selezionano composti con restrizione di assorbimento "alto" di GI e valori di ≥2 "Sì" in Drug^{likeness 20}. Utilizzare il database Swiss-Target^{Prediction 21} per estrarre proteine target con probabilità superiore a zero. Poi unisci e rimuovi i duplicati per ottenere i siti target corrispondenti al CC.

Compilazione dei bersagli genici associati alla SONFH
I target correlati a SONFH sono stati ottenuti da database: database^{DisGeNET 22}; Database^{GeneCards 23}; Il database^{OMIM 24} e il database^{GEO 25}. Gli autori hanno scaricato e deduplicato i geni SONFH dai database OMIM e DisGeNET. Un totale di 233 target correlati alla malattia sono stati ottenuti dal database GeneCards dopo la rimozione dei duplicati. Tutti i bersagli recuperati avevano punteggi di rilevanza superiori a 0 e sono stati inclusi per analisi successive. Il punteggio minimo di rilevanza tra i geni recuperati è stato 6,48. I geni differenzialmente espressi (DEG) correlati a SONFH sono stati ottenuti dalla serie GSE123568 sulla piattaforma GPL15207 nel database GEO. Gli effetti batch sono stati corretti usando il pacchetto limma in R, e i geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati identificati con criteri di |logFC| > 1 e P < 0,05²⁶. Il pacchetto ggplot2 è stato utilizzato per creare un grafico vulcanico per visualizzare la distribuzione dei DEG, e è stata prodotta una mappa termica per presentare i risultati. La libreria target per malattie SONFH è stata stabilita rimuovendo bersagli duplicati utilizzando il pacchetto Venn in R.

Istituzione della rete PPI
Basandosi sui target previsti dei componenti attivi dei bersagli CC e correlati a SONFH, un diagramma di Venn è stato creato da Venny 2.1.0²⁷. Con l'obiettivo di acquisire dati PPI, gli autori importarono i target nel database^{STRING 28}. Il limite del criterio di screening dell'organismo era "Homo sapiens" con indice di confidenza ≥0,4. Gli autori hanno utilizzato Cytoscape 3.7.2 per stabilire i target chiave della rete PPI. La centralità del grado (DC) veniva utilizzata per esaminare i target chiave della rete PPI. Il filtro dei parametri è più del doppio del valore mediano. Con lo scopo di specificare ulteriormente i target chiave, è stato utilizzato l'add-on di Cytoscape.

Le analisi di arricchimento sono state condotte utilizzando i database dell'ontologia genica (GO) e della Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)
I target comuni di CC e SONFH sono stati analizzati per analisi di arricchimento GO e KEGG tramite il database^{DAVID 29}. Per visualizzare i primi 10 termini GO e i primi 20 percorsi KEGG, è stato utilizzato Wei Sheng^{Xin 30} per disegnare il grafico a bolle di arricchimento.

Costruzione della rete
I meccanismi molecolari della CC nell'alleviare la SONFH sono stati chiariti attraverso le reti erba-composto-bersaglio (H-C-T) e la via composto-bersaglio (C-T-P). Il software Cytoscape 3.10.3 illustrava le reti. La rete H-C-T è stata sviluppata utilizzando i composti attivi provenienti da CC e i loro bersagli condivisi. Poi usa lo strumento Analizza la Rete. Per migliorare la comprensione delle relazioni tra percorsi, composti e bersagli, i primi 20 percorsi di ricerca, insieme ai loro target e composti correlati, sono stati organizzati in una rete C-T-P da Network Tools.

Verifica MD
I target principali: HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3 ed EGFR sono stati ottenuti dall'analisi PPI. Il bersaglio è stato cercato dal database^{Uniport 31} con la limitazione di Human e revisionato dal database RCSB^{PDB 32}. Sono state selezionate strutture proteiche umane con risoluzione relativamente alta. I principi attivi sono stati identificati dalla rete C-T-P. Le loro corrispondenti strutture 3D sono state scaricate in formato mol2 dal database PubChem. Ogni file veniva aperto in Chem3D e riduceva l'energia. Successivamente gli autori hanno utilizzato il software^{AutoDockTools 33} per eseguire la disidratazione, l'idrogenazione e il calcolo delle cariche di Gasteiger della proteina recettrice. Sia i ligandi che i recettori sono stati mantenuti nel formato PDBQT. Basandosi sulla posizione spaziale e sulla capacità di attacco, gli autori valutano la fattibilità e la stabilità dell'attracco. Attraverso l'AutoDock Vina, sono state previste la scatola della griglia di docking e la macromolecola. In questa ricerca, tutti i legami rotabili del ligando sono stati lasciati ruotare liberamente, mentre i recettori sono stati impostati come rigidi. Il punteggio di attracco indica l'affinità di legame tra il recettore e il ligando; più basso è il punteggio, maggiore è l'affinità di legaggio. In accordo con questo principio, gli autori selezionano le conformazioni con l'energia di legame più favorevole per studiare le interazioni di legame dei liganti con le proteine. I risultati visivi sono stati mostrati da PyMOL.

Simulazione della dinamica molecolare
Le simulazioni di dinamica molecolare sono state eseguite utilizzando GROMACS³⁴ con il campo di forza CHARMM36. Il complesso proteina-ligando era centrato in una scatola di simulazione periodica cubica con una distanza minima tra scatola di soluto di 1,0 nm, e il sistema è stato solvato utilizzando il modello dell'acqua SPC216. Il sistema fu neutralizzato aggiungendo i contraioni Na⁺ e Cl⁻ appropriati. La minimizzazione dell'energia è stata eseguita in sequenza utilizzando l'algoritmo di discesa più ripida, seguita dal metodo del gradiente coniugato per rimuovere contatti atomici sfavorevoli. Le interazioni elettrostatiche a lungo raggio sono state calcolate utilizzando il metodo della rete di particelle Ewald (PME) con una distanza di taglio di 10 Å. Tutti i legami covalenti che coinvolgono atomi di idrogeno erano vincolati tramite l'algoritmo LINCS. La temperatura veniva mantenuta a 300 K usando il termostato V-rescale, e la pressione veniva controllata a 1 bar tramite il barotto Berendsen con accoppiamento isotropo. Durante la fase di equilibrio sono stati applicati vincoli di posizione, con una costante di forza di 1000 kJ·mol^⁻1·nm⁻² . Dopo la minimizzazione dell'energia, il sistema è stato bilanciato con simulazioni di 2 ns NVT e 2 ns NPT, seguite da una simulazione di dinamica molecolare di produzione di 100 ns con un passo temporale di 2 fs. Le coordinate atomiche venivano registrate ogni 10 ps per l'analisi successiva delle traiettorie.

Validazione sperimentale in un modello murino SONFH
Animali e l'establishment modello SONFH
Venti femmine di topi C57BL/6J, di età compresa tra 10 e un peso compreso tra 20 e 22 g, sono state prelevate dal centro veterinario dell'Università Medica Cinese dello Zhejiang. I topi hanno affrontato un periodo di acclimatazione di 7 giorni in un ambiente controllato e hanno avuto accesso illimitato a cibo e acqua. Tutti i topi sono stati assegnati casualmente ai gruppi (n = 5 per gruppo): il gruppo di controllo, il gruppo SONFH, il gruppo a bassa dose SONFH + CC (CC-Low, 7,5 g/kg/g) e il gruppo ad alta dose SONFH + CC (CC-High, 15 g/kg/g). Il modello SONFH è stato stabilito come descritto in precedenza. In breve, i topi dei gruppi SONFH, SONFH + CC-Low e SONFH + CC-High hanno ricevuto due iniezioni endovenose di lipopolisaccaridi (LPS; 20 μg/kg) al giorno 0. Successivamente, sono state somministrate tre iniezioni intramuscolari di metilprednisolone (MPS; 40 mg/kg) a intervalli di 24 ore, a partire da 24 ore dopo le iniezioni di LPS. I topi nei gruppi trattati sono stati somministrati estratto di CC tramite gavage orale quotidianamente per 6 settimane, a partire dal giorno dell'ultima iniezione di MPS. I topi del gruppo di controllo ricevevano volumi equivalenti di soluzione salina nei corrispondenti momenti temporali.

Raccolta e preparazione dei campioni
Al termine del periodo di trattamento di 6 settimane, i topi sono stati soppressi. Le teste femorali bilaterali venivano accuratamente dissezionate e prelevate. Per ogni animale, la testa femorale sinistra era fissata per 48 ore a 4 °C per una successiva decalcificazione e incastramento della paraffina. La testa del femore destro è stata fissata e poi utilizzata direttamente per la micro-TC senza decalcificazione.

Analisi istologica (Colorazione ABH)
Dopo la decalcificazione e l'inserimento della paraffina, le sezioni della testa femorale sono state colorate utilizzando un protocollo Alcian Blue/Hematoxylin (ABH) per valutare i cambiamenti nell'osteonecrosi. Per un breve tratto, le sezioni sono state colorate con alcian blue all'1% (pH 2,5) per 30 minuti, risciacquate e poi controcolorate con ematossilina Harris. Dopo la disidratazione e il montaggio, le vetrine venivano fotografate al microscopio ottico. La quantificazione dell'osteonecrosi è stata effettuata da due osservatori accecati utilizzando il software ImageJ. Il rapporto tra lacune vuote è stato calcolato come (numero di lacune vuote/numero totale di lacune) × 100% in tre campi ad alta potenza selezionati casualmente per campione nella regione sottocondrale. Il rapporto tra i nuclei picnotici è stato determinato in modo simile.

Analisi della tomografia microcomputerizzata (Micro-CT)
La microstruttura ossea tridimensionale della testa femorale è stata analizzata utilizzando uno scanner micro-TC ad alta risoluzione. I campioni fissi venivano scansionati a una risoluzione di 10 μm (70 kV, 114 μA). Un volume sferico di interesse (VOI) standardizzato che comprendeva la regione primaria di carico è stato ricostruito e analizzato utilizzando il software CTAn. Sono stati quantificati i seguenti parametri morfometrici: Volume Osseo/Volume Totale (BV/TV), Spessore Trabecolare (Tb.Th) e Separazione Trabecolare (Tb.Sp).

Colorazione da immunofluorescenza (IF)
Per valutare il microambiente osseo, è stata eseguita una colorazione immunofluorescenza su sezioni di paraffina. Dopo il prelievo e la bloccatura dell'antigene, le sezioni sono state incubate durante la notte a 4 °C con i seguenti anticorpi primari: anti-HIF-1α (1:200), anti-ALP per coniglio (1:300) e anti-VEGF per coniglio (1:150). Dopo il lavaggio, le sezioni sono state incubate con una miscela di anticorpi secondari coniugati con fluorofori: IgG anti-coniglio marcato con Alexa Fluor 488, IgG anti-coniglio marcato con Alexa Fluor 555. I nuclei sono stati contrastati con DAPI. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza con impostazioni di esposizione costanti. L'intensità relativa di fluorescenza per ciascun marcatore è stata quantificata utilizzando il software ImageJ su tre campi per campione.

Analisi statistica
Tutti i dati quantitativi sono presentati come media ± deviazione standard (SD). L'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey è stata effettuata utilizzando il software GraphPad Prism (versione 9.0) per determinare la significatività statistica tra i gruppi. Un valore P inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Identificazione dei componenti attivi e degli obiettivi previsti del CC e sviluppo della rete "H-C-T".
Per esplorare i meccanismi dei componenti chiave e dei target della CC nell'amelioramento del SONFH, gli autori hanno utilizzato il database HERB 2.0 per identificare tutti i componenti CC selezionati. Sono stati trovati 85 composti bioattivi probabili su 209 candidati costituenti attivi di CC (Tabella Supplementare 1). Utilizzando la piattaforma svizzera di previsione dei bersagli ed eliminando voci duplicate e invalide, sono stati ottenuti 563 target presunti corrispondenti a questi componenti CC (Tabella Supplementare 2). Gli autori hanno identificato i componenti attivi e gli obiettivi della CC.

Indagare i meccanismi molecolari coinvolti nell'insorgenza e nella progressione della SONFH e identificare potenziali bersagli biomarcatori. L'analisi del dataset GSE123568 nel database GEO ha identificato i DEG associati alla SONFH, inclusi 207 geni aumentati e 216 sottoregolati. Il grafico vulcanico dei 425 DEG è mostrato nella Figura 2A, mentre i modelli di espressione dei primi 60 DEG classificati per livello di espressione sono presentati come una heatmap nella Figura 2B, con l'intensità del colore che riflette i valori di espressione trasformati in log. I database DisGeNET, OMIM e GeneCards fornivano 711 target collegati a SONFH. Combinando i 425 DEG del database GEO, un totale di 1136 target sono collegati a SONFH. Dopo l'eliminazione dei duplicati, sono stati confermati 1115 bersagli correlati al SONFH, come illustrato nella Figura 2C. Gli autori hanno preliminarmente stabilito una libreria di bersagli per malattie per SONFH.

Per identificare bersagli e componenti primari, un'analisi di intersezione tra i 563 target di CC e i 1115 target correlati a SONFH ha identificato 61 target comuni (Figura 3A e Tabella Supplementare 3), che sono stati inseriti in Cytoscape 3.10.3 per costruire la rete "H-C-T" (Figura 3B). Questa rete comprendeva 147 nodi e 413 archi. L'analisi topologica ha indicato che (s)-4-nonanolide (grado:16), isoomogenolo (grado:15), acetato di neril (grado:14), Melilotocarpano A (grado:14), 3-metossicinnamaldeide (grado:13) hanno mostrato la maggiore connettività con i bersagli proteici.

Sviluppo e valutazione topologica della rete PPI.
Per approfondire gli obiettivi del CC nel migliorare SONFH. Cytoscape 3.10.3 è stato utilizzato per visualizzare la rete PPI dopo che 61 target identici sono stati inseriti nel database STRING. C'erano 463 spigoli e 60 nodi nella rete. Nella Figura 4A, i nodi passano in colore e dimensione da più chiari e più piccoli a più scuri e più grandi, indicando un aumento di grado da basso a alto. Il plug-in MCODE ha facilitato il clustering di questi target in due moduli funzionali (Figura 4A), tra cui il cluster 1 conteneva 23 nodi e 216 archi, con un punteggio di 19,636. Per caratterizzare ulteriormente l'architettura della rete, DC, BC e CC sono stati utilizzati come metriche topologiche. Con i valori mediani di questi parametri fissati come punti di soglimento, gli autori hanno identificato 8 obiettivi attivi (Figura 4B). Il plugin CytoHubba utilizzava l'algoritmo MCC per classificare i nodi, identificando i primi 10 geni. (Figura 4C).

Analisi di arricchimento GO
Per approfondire i meccanismi della CC nell'ammiglioramento dell'ONFH, è stata condotta un'analisi di arricchimento GO su 61 potenziali bersagli, utilizzando BP, CC e MF. Sono stati arricchiti in totale 435 mandati GO, inclusi 293 termini BP, 41 mandati CC e 101 mandati MF. Questi risultati sono mostrati nelle Tabelle Supplementari 4, 5 e 6. La Figura 5A presenta visivamente i 10 termini migliori arricchiti di BP, CC e MF utilizzando un grafico a bolle. I risultati hanno indicato che i termini BP erano principalmente associati alla trasduzione del segnale, alla regolazione positiva della trascrizione tramite RNA polimerasi II, alla regolazione negativa del processo apoptotico, alla regolazione positiva della trascrizione a DNA e alla regolazione negativa della trascrizione tramite RNA polimerasi II. L'analisi ha rivelato che i termini MF erano principalmente coinvolti nel legame proteico, nel legame degli ioni metallici e nel legame identico alle proteine. I risultati della CC hanno dimostrato che la maggior parte dei bersagli si trovava principalmente nel citoplasma, nella membrana e nella membrana plasmatica.

Analisi KEGG
Per fornire informazioni sui potenziali meccanismi biochimici con cui la CC potrebbe migliorare la SONFH, è stata condotta un'analisi dell'arricchimento delle vie KEGG per chiarire i meccanismi biochimici attraverso cui la CC può migliorare la SONFH. Utilizzando un criterio di screening di P < 0,05 e FDR < 0,05, sono state identificate 48 voci di arricchimento KEGG (Tabella Supplementare 7). I primi 20 percorsi significativamente arricchiti, determinati da arricchimento e conteggio di pieghe, sono stati visualizzati utilizzando grafici a bolle e barre (Tabella 1, Figura 5B e 5C). Utilizzando Cytoscape 3.10.3, è stata costruita una rete C-T-P con 167 nodi e 589 spigoli (Figura 5D). Gli effetti della CC su SONFH sono principalmente collegati all'infezione da herpesvirus associata al sarcoma di Kaposi, alla via di segnalazione HIF-1 e a lipidi e aterosclerosi, come indicato dalle analisi funzionali GO e di arricchimento della via KEGG.

Verifica MD
Per valutare le potenziali interazioni tra composti attivi e bersagli chiave, i 10 composti della rete C-T-P, inclusi aneto, melilotocarpano A, acetato di neril, acido caprilico, isoomogenolo, 3-metossicinamalaldeide, (s)-4-nonanolide, miristicina, borneolo e acetato di cinnamilo, sono stati agganciati ai bersagli chiave AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC ed EGFR. I risultati completi dell'attracco per tutte le coppie composto–bersaglio sono riassunti nella Tabella Supplementare 8, e informazioni dettagliate sui composti, bersagli e parametri di attracco sono fornite nella Tabella Supplementare 9. La Figura 6 presenta una mappa termica della distribuzione dell'energia di legame.

Nel complesso, diverse coppie composto-bersaglio hanno mostrato affinità di legame relativamente favorevoli, con valori di energia di legame più bassi che indicano interazioni previste più stabili. In particolare, i risultati dell'aggancio hanno mostrato una chiara eterogeneità nelle affinità di legame sia tra composti che bersagli. Alcuni composti, come il melilotocarpano A, hanno costantemente mostrato affinità di legame relativamente forti su più bersagli, mentre altri hanno mostrato interazioni più moderate o deboli, suggerendo che diversi composti possano contribuire in modo diseguale agli effetti farmacologici previsti.

Inoltre, è stata osservata variabilità tra i bersagli. Ad esempio, alcuni bersagli come STAT3 ed EGFR hanno mostrato affinità di legame relativamente moderate o deboli con molteplici composti, con alcuni valori che si avvicinano a -5,0 kcal/mol, rispetto a bersagli come AKT1 o SRC. Questo schema indica che non tutti i bersagli principali funzionano necessariamente come partner diretti di legame ad alta affinità dei composti identificati e possono invece svolgere ruoli regolatori indiretti all'interno della rete di interazione. Tali differenze possono essere legate a variazioni nella compatibilità strutturale tra liganti e siti di legame proteico, nonché alle caratteristiche intrinseche dei bersagli.

Tra le coppie valutate, AKT1 ha mostrato l'energia di legame più bassa con melilotocarpano A (-9,6 kcal/mol), suggerendo un'interazione potenzialmente favorevole. La Figura 7 illustra la modalità di legame prevista di questo complesso. In particolare, SER205 di AKT1 forma legami a idrogeno con melilotocarpiano A, anethole e miristicina. Inoltre, si prevedeva che il melilotocarpano A formerà legami a idrogeno con GLY309 di HIF-1α, LEU438 e THR440 di STAT3, SER433 e ARG412 di ESR1, e ARG500 e GLU510 di SRC.

Per identificare i composti candidati rappresentativi, è stata utilizzata la più bassa energia di legame per ciascun bersaglio e è stata impostata una soglia di energia di legame di ≤ -5,0 kcal/mol per indicare interazioni relativamente stabili. Sulla base di questi criteri, sono stati identificati come potenziali composti chiave di melilotocarpano, anetocarpino e miristicina. Nel complesso, la maggior parte dei componenti attivi della CC ha mostrato potenziali interazioni con i target terapeutici selezionati, con alcuni composti che hanno mostrato tendenze di legame relativamente più forti tra più bersagli. Tuttavia, va notato che la MD è un approccio computazionale semplificato che fornisce previsioni preliminari di potenziali interazioni e potrebbe non tenere pienamente conto della flessibilità proteica e degli ambienti biologici complessi. Pertanto, questi risultati devono essere interpretati con cautela e le interazioni osservate non costituiscono prove definitive di un legame diretto.

Simulazione della dinamica molecolare
Per valutare ulteriormente la stabilità dei complessi, gli autori hanno selezionato i complessi AKT1-melilotocarpano A, HIF-1α-melilotocarpano A e STAT3-melilotocarpano A per simulazioni di dinamica molecolare. Tra i bersagli previsti, STAT3 e HIF-1α sono stati selezionati per simulazioni MD in base al loro ruolo centrale nella rete PPI e alla loro rilevanza biologica per la patologia di SONFH. STAT3 ha mostrato uno dei più alti gradi di connettività nella rete PPI, indicando un potenziale ruolo regolatorio in più vie di segnalazione. HIF-1α è stato selezionato perché l'analisi di arricchimento KEGG ha identificato la via di segnalazione HIF-1 come una delle vie più rilevanti associate all'angiogenesi e all'adattamento all'ipossia nell'osteonecrosi.

Allo stesso tempo, gli autori si sono concentrati su AKT1 come bersaglio rappresentativo grazie ai loro forti punteggi di docking e alla loro rilevanza diretta per le caratteristiche patologiche di SONFH, in particolare l'angiogenesi indotta da ipossia e la rigenerazione ossea. A causa di limitazioni di risorse computazionali, sono stati selezionati tre complessi rappresentativi per simulazioni MD dettagliate, una strategia comunemente adottata negli studi di simulazione molecolare basati su farmacologia di rete. La deviazione quadratica media radicale (RMSD) valuta efficacemente la stabilità conformazionale dei complessi proteina-ligando, dove valori più bassi indicano una maggiore stabilità strutturale. Come mostrato nella Figura 8A, il complesso AKT1-melilotocarpano A completò il rilassamento entro i primi 12 ns e successivamente raggiunse un altopiano stabile, osservando solo una fluttuazione transitoria intorno ai 50-55 ns prima di tornare rapidamente all'equilibrio. L'RMSD complessivo durante tutta la simulazione è stato di circa 0,369 nm. La Figura 8B illustra che il complesso HIF1A-melilotocarpan A ha subito un rilassamento nei primi 16 ns, seguito dal mantenimento di un altopiano stabile. Si verificò una breve fluttuazione tra 38 e 42 ns, dopo la quale si osservò una rapida ristabilizzazione. La RMSD complessiva per questo complesso era di 0,25 nm. Nella Figura 8C, il complesso STAT3-melilotocarpan A ha subito un rilassamento entro 0,3 ns, per poi raggiungere un altopiano stabile. La breve fluttuazione si è verificata tra 5 ns e 80 ns. La simulazione complessiva era di circa 0,21 nm. Come dimostrato nei complessi AKT1-melilotocarpan A, HIF-1α-melilotocarpan A e STAT3-melilotocarpan hanno mantenuto stabilità senza alterazioni significative, indicando una combinazione relativamente stabile.

La flessibilità dei residui di amminoacidi nelle proteine è stata valutata utilizzando la fluttuazione quadratica media delle radici (RMSF). Figura 9A, la fluttuazione media globale dei residui era di circa 0,17 nm, suggerendo che la stabilità fosse mantenuta principalmente dal nucleo strutturale e dalla tasca di legame. La maggiore flessibilità era in gran parte limitata a regioni intrinsecamente mobili come segmenti terminali e regioni ad anello, piuttosto che al nucleo tascabile. È noto che queste regioni sono di natura flessibile. La Figura 9B mostra che circa il 94% dei residui presentava valori RMSF inferiori a 0,20 nm, e solo circa il 6% superava 0,30 nm, indicando che la colonna dorsale proteica complessiva e i residui interni fluttuavano entro un intervallo stabile. La Figura 9C mostra che il residuo globale medio era di circa 0,17 nm. Nei dati non sono state identificate fluttuazioni superiori a 0,15 nm, indicando che la tasca di legame ha mantenuto una conformazione stabile durante tutta la simulazione. Sia i complessi AKT1-melilotocarpano A che HIF-1α-melilotocarpano A hanno dimostrato di interagire in modo forte e stabile.

I legami idrogeno sono fondamentali per promuovere le interazioni proteina-ligando. La Figura 10A mostra che i complessi AKT1-melilotocarpano A formavano tipicamente un legame a idrogeno, con il numero di legami a idrogeno che variava tra 0 e 2. Tra melilotocarpano A e HIF-1α sono separati da meno di 0,35 nm. AKT1 interagisce frequentemente in prossimità con melilotocarpano A. I complessi HIF-1α-melilotocarpano A formano da 0 a 2 legami idrogeno, principalmente un legame a idrogeno, come mostrato nella Figura 10B. Nella Figura 10 C, il numero di legami idrogeno del complesso STAT3-melilotocarpan A è da zero a quattro. La maggior parte delle volte, gli atomi di A tra melilotocarpano A e HIF-1α sono separati da meno di 0,35 nm. I complessi HIF-1α-melilotocarpano A stabiliscono 1-3 coppie di contatti stretti e talvolta anche 7-9 coppie. Ciò suggerisce interazioni efficaci di legame di idrogeno tra la piccola molecola e le proteine bersaglio. In sintesi, sia i complessi AKT1-melilotocarpan A che HIF-1α-melilotocarpan A dimostrano stabilità e resistenza.

La CC inibisce la reazione infiammatoria e l'apoptosi dei topi SONFH
L'analisi istologica con colorazione ABH ha rivelato cambiamenti osteonecrotici pronunciati nel gruppo SONFH, caratterizzati da aumento delle lacune vuote, nuclei pignotici e alterazione dell'architettura trabecolare, mentre queste caratteristiche patologiche sono state notevolmente alleviate dopo il trattamento con CC (Figura 11A). L'analisi quantitativa ha confermato che i rapporti tra lacune vuote e nuclei picnotici sono stati significativamente ridotti nei gruppi trattati con CC rispetto al gruppo SONFH (Figura 11B–C). L'analisi micro-CT ha mostrato una grave perdita ossea trabecolare nel gruppo SONFH, che è stata parzialmente invertita dalla somministrazione di CC (Figura 11D). Costantemente, il trattamento con CC ha aumentato significativamente BV/TV e TB. Diminuendo il Tb.Sp rispetto al gruppo SONFH (Figura 11E–G). La colorazione immunofluorescenza ha mostrato un'elevata espressione di HIF-1α e livelli ridotti di ALP nel gruppo SONFH, accompagnati da alterazione dell'espressione di VEGF. Il trattamento con CC ha modulato l'espressione di HIF-1α e VEGF e ha aumentato i segnali ALP, indicando un miglioramento del microambiente osseo e dell'attività osteogenica (Figura 11H).

DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I dataset utilizzati o analizzati durante lo studio attuale sono disponibili al link: https://zenodo.org/records/19730455.

Figura 1: Diagramma di flusso della strategia di studio farmacologico di rete per il miglioramento delle CC della SONFH. La Figura 1 mostra che lo studio identifica potenziali bersagli degli ingredienti attivi provenienti dalla CC dal database, con SONFH come malattia principale. Dopo aver intersecato questi con target correlati alla malattia, è stata costruita una rete "componente–bersaglio–percorso" e termini GO, KEGG. Vengono poi impiegati l'aggancio molecolare e la simulazione della dinamica molecolare per valutare l'affinità di legame tra componenti chiave e bersagli centrali, con la conferma finale effettuata tramite verificazione sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Screening di bersagli intersecanti associati a SONFH. (A) Grafico vulcanico che mostra la distribuzione di geni espressi differenzialmente nei campioni di malattia. I punti rossi indicano geni soprarregolati, i punti blu indicano geni ridimensionati e i punti grigi rappresentano geni privi di espressione differenziale significativa. (B) Mappa di calore che mostra i modelli di espressione dei 60 geni espressi differenzialmente, con colonne corrispondenti ai campioni e righe corrispondenti ai geni. (C) Diagramma di Venn che mostra la sovrapposizione di target correlati alla malattia ottenuti da diversi database. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Screening di bersagli intersecanti tra CC e SONFH. (A) Diagramma di Venn che illustra la distribuzione di 61 bersagli comuni condivisi tra i bersagli previsti di composti attivi in CC (giallo) e bersagli di malattie correlate a SONFH (viola). (B) La rete Herb-Compound-Target (H-C-T) illustra le interazioni tra i composti e i loro corrispondenti bersagli. Il nodo quadrato blu rappresenta la malattia, i nodi quadrati verdi indicano composti attivi, e i nodi quadrati arancioni indicano bersagli comuni. I bordi indicano le interazioni tra i composti e i loro bersagli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Identificazione dei bersagli candidati tramite analisi PPI. (A) Rete PPI clusterizzata con il plugin MCODE. (B) Flusso di lavoro schematico dello screening topologico all'interno della rete PPI. (C) Geni chiave estratti dalla rete PPI dal plugin CytoHubba. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: risultati dell'analisi di arricchimento GO e analisi dell'arricchimento delle vie KEGG per i 61 target comuni. (A) Tabella a bolle che mostra i 10 termini principali per l'analisi di arricchimento GO per BP, CC e MF. (B) Grafico a bolle che rappresenta i primi 20 percorsi KEGG significativamente arricchiti. (C) Distribuzione dei primi 20 percorsi arricchiti basata sulla classificazione funzionale KEGG. (D) Rete illustrativa C-T-P che rappresenta i potenziali meccanismi con cui la CC può migliorare l'osteonecrosi della testa femorale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Mappa del calore dell'energia di legame delle interazioni tra i composti attivi di CC e i principali bersagli (kcal/mol). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Modalità di legame di bersagli chiave con composti attivi specifici. AKT1-melilotocarpano A (A1), HIF-1α-melilotocarpano A (B1), STAT3-melilotocarpano A (C1), ESR1-melilotocarpano A (D1), CASP3-melilotocarpano A (E1), SRC-melilotocarpano A (F1), EGFR-melilotocarpano A (G1), AKT1-anetolo (H1), AKT1-miristicina (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) e (H2) illustrano rispettivamente le loro modalità di legatura 2D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: RMSD dei valori RMSD MD. (A) per complessi AKT1-Melilotocarpan A. (B) I valori RMSD dei complessi HIF-1α-Melilotocarpan A. (C) I valori RMSD dei complessi STAT3-Melilotocarpan A. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: RMSF di MD. (A) I valori RMSF dei complessi AKT1-Melilotocarpan A. (B) I valori RMSF dei complessi HIF-1α-Melilotocarpan A. (C) I valori RMSF dei complessi STAT3-Melilotocarpano A. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Legami H di MD. (A) I valori dei legami H dei complessi AKT1-Melilotocarpan A. (B) I valori del legame H dei complessi HIF1A-Melilotocarpan A. (C) I valori del legame H dei complessi AKT1-Melilotocarpano A. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: La CC inibisce la risposta infiammatoria e l'apoptosi nella testa femorale, migliorando così la SONFH. (A) Sezioni rappresentative della testa femorale colorate con ABH. Le lacune vuote sono indicate da punte di freccia nere, mentre i nuclei picnotici sono indicati da frecce. (B–C) Analisi quantitativa del rapporto tra lacune vuote (B) e numero di nuclei picnotici (C). n = 5. (D) Ricostruzioni micro-TC tridimensionali rappresentative delle teste femorali. (E–G) Quantificazione dei parametri micro-CT, inclusi la frazione volumetrica ossea (BV/TV), la separazione trabecolare (Tb.Sp) e lo spessore trabecolare (Tb.Th). (H) Colorazione immunofluorescenza rappresentativa di HIF-1α, VEGF e ALP nelle sezioni della testa femorale; i nuclei sono stati contrastati con DAPI. I dati sono presentati come media ± SD (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Termine		Arricchimento delle pieghe	P-Valore	Conte	ID utente
Cancro alla vescica		28.44	1.23E-07	7	CREBBP, CXCL8, NOS2, MMP2, STAT3, F2, PTGS2, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, EP300, PPARG, NFE2L2, BCL2L1
Via di segnalazione HIF-1		16.66	6.56E-10	11	SRC, MMP2, STAT3, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, KDR, PDCD4, PTPN6
Resistenza agli inibitori della tirosina chinasi dell'EGFR		16.66	3.84E-07	8	CCR1, CREBBP, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3 ,EP300, TYK2, PTGS2, HIF1A, MTOR, VEGFA
Giunzione di Adherens		12.54	1.64E-05	7	CREBBP, ABCB1, CASP3, ERBB2, STAT3, PDCD4, EP300, PTGS2, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA
Resistenza endocrina		11.78	2.35E-05	7	CREBBP, NUMERO 2, NUMERO 3, ERBB2, STAT3, SERPINE1, EP300, HIF1A, EGFR, MTOR, VEGFA
Via di segnalazione AGE-RAGE nelle complicazioni diabetiche		11.55	2.63E-05	7	CCR1, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3, CXCR2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
Proteoglicani nel cancro		11.43	1.19E-10	14	CXCL8, SRC, NOS3, CASP3, STAT3, PPARG, MMP9, BCL2L1, NFE2L2
Via di segnalazione della Relaxina		10.25	1.02E-05	8	OXTR, NOS2, NOS3, ERBB2, PTAFR, KDR, NOS1, EGFR, VEGFA
Infezione da herpesvirus associata al sarcoma di Kaposi		10.20	1.45E-08	12	SRC, ERBB2, STAT3, KDR, EGFR, MTOR, BCL2L1, VEGFA
Via di segnalazione dell'ormone tiroideo		9.56	7.64E-05	7	NOS2, SRC, NOS3, MMP2, NOS1, MMP9, EGFR, VEGFA
Sforzo di taglio fluido e aterosclerosi		8.21	0.000177	7	CREBBP, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3, EP300, TYK2, MMP9
Epatite B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP, STAT3, EP300, PTPN6, TYK2, EGFR, MTOR, BCL2L1
Percorso di segnalazione JAK-STAT		7.93	5.35E-05	8	SRC, VDR, STAT3, CYP3A4, ESR1, EGFR, MTOR, VEGFA
Infezione da citomegalovirus umano		7.34	6.2E-06	10	CREBBP, CASP3, EP300, TYK2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
Lipidi e aterosclerosi		6.94	0.000035	9	CXCL8, SRC, MMP2, ERBB2, MMP9, EGFR, VEGFA
MicroRNA nel cancro		6.25	2.06E-06	12	CREBBP, SRC, ERBB2, EP300, PTPN6, PTPRF, EGFR
Carcinogenesi chimica - attivazione dei recettori		6.14	0.000265	8	SRC, MMP2, ERBB2, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR
Vie nel cancro		5.94	6.64E-10	19	CXCL8, NOS3, CASP3, MMP2, STAT3, SERPINE1, VEGFA
Via di segnalazione del calcio		5.90	0.00011	9	KAT2B, CREBBP, SRC, EP300, HIF1A, ESR1, MTOR
Infezione da papillomavirus umano		4.00	0.00324	8	SRC, NOS3, MMP2, KDR, MMP9, NFE2L2, VEGFA

Tabella 1: I risultati dell'arricchimento KEGG dei primi 20 percorsi arricchiti.

Tabella supplementare 1: Informazioni di base sui composti attivi in CC.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Gli obiettivi di 85 componenti attivi in CC.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Informazioni su 61 bersagli comuni CC-SONFH.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 4: Risultati dei termini della categoria dei processi biologici dall'analisi di arricchimento GO.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 5: Risultati dei termini di categorizzazione delle componenti cellulari dall'analisi di arricchimento GO.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 6: Risultati dei termini della categoria di funzione molecolare dall'analisi di arricchimento GO.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 7: Risultati delle vie dall'analisi di arricchimento KEGG.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 8: Energie di legame di aggancio molecolare (kcal/mol) delle coppie composto-bersaglio.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 9: Dettagli di bersagli e componenti per l'aggancio molecolare.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

In questo studio, gli autori hanno ottenuto 85 composti bioattivi dalla CC tramite diversi database e hanno effettuato screening, tra cui i principali componenti chimici includono aneto, melilotocarpano A e miristicina. Per identificare i bersagli, gli autori hanno intersecato 563 bersagli di CC di farmaci con 1116 bersagli correlati al SONFH, ottenendo infine 61 bersagli. Gli autori hanno importato 61 target comuni nei database STRING e DAVID per costruire una rete PPI e indagare possibili vie farmacologiche. I risultati hanno rivelato 10 obiettivi chiave nella rete PPI, inclusi HIF-1α e STAT3. Ischemia e ipossia sono due delle principali caratteristiche patogeniche della SONFH, secondo ricerche^{precedenti 35}. La CC può esercitare effetti positivi nella SONFH attraverso molteplici processi biologici, inclusa l'angiogenesi e la regolazione trascrizionale. Questo potrebbe essere realizzato tramite la via di segnalazione HIF-1α, lo stress di taglio fluido e l'aterosclerosi, lipidi e aterosclerosi, la via di segnalazione AGE-RAGE nelle complicazioni diabetiche e altre vie di segnalazione, secondo l'analisi di arricchimento KEGG. Ciò suggerisce che la CC potrebbe agire su SONFH attraverso questi obiettivi chiave e i percorsi associati. Per chiarire ulteriormente se i componenti della CC siano strettamente accoppiati con i bersagli, basandosi sui risultati della ricerca farmacologica di rete sopra indicati, ovvero i risultati di screening degli ingredienti attivi della prescrizione del composto e dei risultati di screening dei bersagli nella rete PPI, gli autori hanno condotto simulazioni di dinamica molecolare del melilotocarpano A-AKT1, melilotocarpano A-HIF-1α, e complessi STAT3-melilotocarpiano. Questo mostra che il melilotocarpano A si lega costantemente ad AKT1, HIF-1α e STAT3, quindi il CC potrebbe effettivamente esercitare effetti positivi agendo su questi bersagli chiave. In definitiva, attraverso un meccanismo multi-componente, multi-bersaglio e multi-percorso, la CC può esercitare effetti protettivi sulla qualità della vita nei pazienti con SONFH.

Il gruppo di ricerca si è concentrato sull'elucidazione dei meccanismi attraverso cui gli YGP esercitano effetti terapeutici nelle malattie ossee. Le ricerche precedenti indicavano che gli YGP migliorano la formazione ossea e migliorano la microarchitettura trabecolare nella testa femorale attivando la β-catenina per inibire l'osteoclastogenesi e promuoverla durante il coniglio SONFH³⁶. Inoltre, i ricercatori hanno scoperto che gli YGP esercitano effetti terapeutici sulla SONFH principalmente alleviando l'infiammazione e favorendo^{l'angiogenesi 12}. Le YGP possono non solo alleviare la SONFH, ma anche migliorare l'osteoporosi. Inibindo la via di segnalazione IL-17/NF-κB e diminuendo le risposte immunitarie Th17, gli YGP fermano con successo la perdita ossea indotta da^{ovaricotomia 37}. Attraverso esperimenti su animali, i ricercatori hanno confermato che Cornus officinalis, uno dei componenti degli YGP, esercita effetti su SONFH inibendo la secrezione di mediatori infiammatori e l'apoptosi delle cellule^{ossee 38}. La CC, che può riscaldare lo yang, beneficiare il qi e sbloccare i meridiani, è l'erba principale negli YGP, svolgendo un ruolo cruciale nel migliorare la SONFH e alleviare la sofferenza dei pazienti. In sintesi, questi studi riflettono l'attenzione di lunga data sull'elucidazione dei meccanismi degli YGP nell'osteonecrosi e sull'individuare la CC come una delle principali erbe da indaginare meccanicisticamente nella SONFH.

Tra gli ingredienti attivi previsti, anethole, miristicina e altri ingredienti hanno mostrato attività biologica contro malattie ossee. È stato dimostrato che l'anetolo inibisce l'elevazione dei marcatori di riassorbimento osseo. L'anetolo riduce infine la differenziazione degli osteoclasti e la funzione riassorbtiva inibendo le vie a valle e i fattori regolatori^{chiave 39}. Le ricerche indicano che l'anetole presenta proprietà antinfiammatorie e inibisce la differenziazione adipogenica nelle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo umano (hBMSC)⁴⁰. La miristicina inibisce l'infiammazione e protegge le cellule muscolari lisce vascolari sopprimendo le vie PI3K/Akt e^{NF-κB 41}. La ferroptosi è uno dei meccanismi chiave alla base della patogenesi della SONFH. La ferroptosi è un tipo di morte cellulare programmata causata dalla perossidazione lipidica dipendente dal ferro. La miristicina previene la ferroptosi, proteggendo così l'omeostasi redox delle membrane cellulari degli^{osteoblasti 42}. Un altro ingrediente del borneolo è stato dimostrato inibibile la formazione di anelli di actina, una caratteristica degli osteoclasti riassorbenti che riflette la polarizzazione cellulare, entro 30 min⁴³. Questi risultati indicano che questi componenti potrebbero essere molto importanti per l'effetto protettivo della CC nel SONFH, e meritano ulteriori approfondimenti. Tra tutti questi ingredienti, il Melilotocarpano A è stato selezionato come ligando rappresentativo perché mostrava le affinità di legame più stabili con più bersagli principali nell'analisi MD. Tra i composti più votati, Melilotocarpan A ha mostrato interazioni di legame costantemente forti con diverse proteine chiave della rete PPI, suggerendo che possa rappresentare un componente bioattivo importante della CC.

Inoltre, i risultati della rete PPI hanno rivelato che, in particolare HIF-1α e STAT3, potrebbero essere i bersagli principali. HIF-1α è il mediatore centrale della risposta cellulare all'ipossia. Negli esperimenti SONFH, l'attivazione di HIF-1α migliora l'angiogenesi e la riparazione ossea, alleviando così la necrosi femorale^{della testa 44}. Inoltre, le ricerche hanno rilevato che HIF-1α può esercitare un effetto protettivo sul tessuto cartilagineo in condizioni^{ipossiche 45}. La regolazione all'alza dell'HIF-1α sopprime la ferroptosi e attiva STAT3 per accelerare la differenziazione dei monociti del midollo osseo in^{osteoclasti 46}. STAT3 è un attivatore di trasduzione e trascrizione del segnale. Gli HBMSC promuovono la conversione di STAT3 in p-STAT3, aumentando così la proliferazione, la migrazione e gli effetti anti-apoptotici dei condrociti in condizioni^{ipossiche 47}. STAT3 potenzia la differenziazione osteogenica e gli effetti anti-apoptotici degli hBMSC aumentando al contempo la secrezione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) per promuovere la rigenerazione microvascolare^{ossea 48}. AKT1 è una proteina chinasi che agisce come mediatore chiave della segnalazione dell'angiogenesi. AKT1 è coinvolto nell'accoppiamento angiogenesi-osteogenesi ossea e nella formazione ossea^{trabecolare 49}. In definitiva, questi centri convergono su angiogenesi, adattamento all'ipossia, infiammazione e rimodellamento osseo, suggerendo che la CC possa esercitare effetti protettivi contro la SONFH modulando questi bersagli e le relative vie di segnalazione.

Per esplorare il meccanismo della CC nell'alleviamento della SONFH, i ricercatori hanno condotto analisi GO e analisi di arricchimento KEGG. I risultati GO mostrano che i geni bersaglio sono principalmente arricchiti in funzioni biologiche come la risposta all'ipossia, la risposta cellulare al lipopolisaccaride e la regolazione positiva dell'angiogenesi. L'analisi di arricchimento KEGG ha suggerito che gli effetti farmacologici della CC nella SONFH sono prevalentemente collegati alla via di segnalazione AGE-RAGE nelle complicazioni diabetiche, alla via di segnalazione HIF-1α, alla via lipidica e aterosclerosi, e ad altre vie di segnalazione. La SONFH si verifica quando il flusso sanguigno alla testa femorale viene interrotto, causando una mancanza di supporto nutrizionale per la testa femorale e scatenando l'apoptosi^{cellulare 50}. HIF-1 è composto da HIF-1α e HIF-1β, con HIF-1α che svolge un ruolo chiave nella risposta trascrizionale agli ambienti ipossici e^{ischemici 47}. Studi precedenti hanno dimostrato che, attraverso la cascata di segnalazione VEGF/AKT/mTOR, HIF-1α coordina osteogenesi e angiogenesi, potenziando così in modo critico la differenziazione osteogenica delle cellule staminali derivate dalle adipose. Dopo l'ischemia, si sviluppa l'ipossia tissutale, portando a un marcato aumento di HIF-1α all'interno delle cellule. che aumenta i livelli di espressione del VEGF e di conseguenza promuove la riparazione e la rigenerazione^{vascolare 51}. L'ipossia interrompe la produzione di energia mitocondriale e aumenta la formazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Questi cambiamenti favoriscono l'osteoclastogenesi, inibiscono l'attività degli osteoblasti e, in ultima analisi, inducono l'apoptosi degli osteociti. Un'elevata espressione di HIF-1α sposta il metabolismo energetico cellulare dalla fosforilazione ossidativa alla glicolisi, riduce la produzione di ROS e quindi attenua l'apoptosi negli osteoblasti e negli osteociti^52,53. L'osso cancelloso sostiene la funzione ematopoietica del midollo osseo e immagazzina minerali come il calcio. L'aumento dell'attività di HIF-1α può aumentare direttamente la formazione ossea^{cancellosa 54}. Inoltre, HIF-1α mantiene la sopravvivenza dei condrociti e l'omeostasi in condizioni ipossiche⁴⁵. Di conseguenza, la via di segnalazione HIF-1α è diventata un bersaglio terapeutico per l'ONFH, con una potenziale applicazione terapeutica per l'ONFH.

Nel percorso di segnalazione AGE-RAGE, i prodotti finali di glicazione avanzata (AGE) derivano dal reticolamento covalente non enzimatico di carboidrati con proteine, grassi o altre macromolecole^{biologiche 55}. Gli AGE possono danneggiare le cellule e i tessuti tramite danni infiammatori e ossidanti. Attraverso quattro percorsi, i segnali vengono trasdotti dall'interazione AGE-RAGE. Essi sono: 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK e (4) NADPH ossidasi-ROS⁵⁶. Alla fine, il NF-κB fosforilato entra nel nucleo per trascrivere l'espressione di citochine proinfiammatorie, fattori di crescita, citochine profibrotiche e stress ossidativo. Lo studio ha dimostrato che AGE-RAGE promuove l'apoptosi degli osteoblasti tramite la via di segnalazione MAPK e l'attivazione dello stress ossidativo, e inibisce la differenziazione osteogenica sopprimendo i livelli dei sensori di stress del reticolo endoplasmatico, nonché tramite la metilazione del DNA/via^{Wnt 57}. Inoltre, studi hanno indicato che AGE e RAGE partecipano alla calcificazione^{vascolare 58}.

Nella via di segnalazione lipidica e aterosclerosica, i lipidi ossidati attivano PPARγ. È un regolatore principale dell'adipogenesi che inibisce la differenziazione^{osteogenica 59}. Inoltre, diversi studi hanno dimostrato che i lipidi influenzano la differenziazione e la maturazione di osteoclasti e osteoblasti, compromettendo così l'omeostasi^{ossea 60}. Numerosi studi fondamentali hanno dimostrato il coinvolgimento significativo dell'apoptosi nei meccanismi fisiologici e patologici della SONFH. Esperimenti in vivo su animali successivi hanno ulteriormente confermato che la frazione attiva di CC sopprime efficacemente apoptosi e infiammazione nella SONFH, mitigando così la progressione della malattia.

In linea con questi risultati, la farmacologia di rete e le analisi sperimentali suggeriscono che la CC possa migliorare la SONFH coordinando l'adattamento all'ipossia, regolando l'angiogenesi e modulando i processi metabolici. L'analisi micro-CT quantitativa ha rivelato che l'intervento CC ha ripristinato significativamente la frazione volumetrica ossea (BV/TV), ridotto la separazione trabecolare (Tb.Sp, Tb.Th) e promosso il recupero della microstruttura ossea. L'analisi di arricchimento KEGG ha ulteriormente evidenziato la via di segnalazione HIF-1α come meccanismo chiave alla base di questi effetti. Collettivamente, questi esperimenti su animali indicano che la CC può alleviare la SONFH regolando i processi biologici legati all'ipossia e all'infiammazione e promuovendo l'angiogenesi e il rimodellamento osseo, potenzialmente attraverso vie chiave come la via di segnalazione HIF-1α.

Sebbene siano stati ottenuti alcuni importanti risultati preliminari, questo studio presenta ancora alcune limitazioni. Gli autori si sono basati esclusivamente su metodi bioinformatici moderni, inclusi la farmacologia di rete e la MD, oltre ad alcuni esperimenti su animali, per esplorare il ruolo della CC nella SONFH. Pertanto, l'affidabilità e l'accuratezza delle previsioni devono essere ulteriormente verificate in vivo e in vitro . Questo studio fornisce indizi preliminari sui meccanismi con cui la CC migliora la SONFH, che richiedono ulteriori validazioni sperimentali. Integrando la farmacologia di rete con la MD, gli autori hanno mappato sistematicamente i candidati principi bioattivi, i target chiave e le vie arricchite della CC nella SONFH. In conclusione, questo studio ha indagato i potenziali effetti protettivi della CC nella SONFH attraverso la farmacologia integrativa della rete e la validazione in vivo . I risultati indicano che i meccanismi erano principalmente associati alla modulazione della via di segnalazione HIF-1 e alla promozione della rigenerazione osteogenica. Come illustrato nella figura corrispondente, l'ammiramento della CC ha modulato significativamente l'espressione di proteine chiave, tra cui HIF-1α, VEGF e ALP, in modo dipendente dalla dose, supportando ulteriormente il suo ruolo nel coordinamento dell'adattamento all'ipossia, dell'angiogenesi e dell'attività osteogenica. Questi risultati sono stati confermati dall'analisi micro-CT, che ha dimostrato che l'intervento CC ha effettivamente ristabilito la frazione di volume osseo e migliorato la microstruttura trabecolare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4% PFA	biosharp	BL539A
Etenolo assoluto	Gruppo Sinopharm Co.Ltd	10009218
Alcian Blue Stain Kit	Solarbio	G1563
ALP	ariggo	ARG57422
AutoDock Vina	Scripps Research		Versione 1.2.7
AutoDockTools	Scripps Research		Versione 1.5.7
Piattaforma online di bioinformatica			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 campo di forza			Utilizzato per la parametrizzazione MD
CTD			https://ctdbase.org
Cytoscape	Consorzio Cytoscape		Versione 3.10.3; plugin: CytoHubba, CytoNCA
Soluzione per la colorazione DAPI	Beyotime Biotech Inc	C1006-50mL
DAVID	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Visualizzatore Discovery Studio	BIOVIA		BIOVIA Discovery Studio 2020; Visualizzazione dell'attracco
DisGeNET			https://disgenet.com
Decalcificazione EDTA	Beyotime Biotech Inc	C0167-3L
Soluzione bloccante della perossidasi endogena	Beyotime Biotech Inc	P0100A
GeneCards			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Capra anti-coniglio IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
Siero di capra	Beyotime Biotech Inc	C0265
GraphPad Prism	GraphPad (Dotmatics)		Versione 10; Analisi statistica e graficazione
GROMACS	GROMACS		Versione 2022; CHARMM36 campo di forza
Herb 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1 e alfa;	Hangzhou Huaan	HA721997
Apparecchiature micro-CT ad alta risoluzione	Bruker	SkyScan
Filtro di Regola di Lipinski			Mw & Le; 500; miLogP & le; 5; HBD & le; 5; HBA & LE; 10
Lipopolisaccaride	Sigma-Aldrich	L4516
Metilprednisolone	Gruppo Sinopharm Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
Balsamo neutro	biosharp	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
Paraffina	Gruppo Sinopharm Co.Ltd	C416770020
Ewald a Mesh di Particelle (PME)			Elettrostatica a lungo raggio
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrö Segnale		Visualizzazione e preparazione delle proteine
R	CRAN		Versione 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
STRING			https://string-db.org
SwissADME	Istituto Svizzero		http://www.swissadme.ch
Previsione SwissTarget	Istituto Svizzero		http://www.swisstargetprediction.ch
Modello ad acqua TIP3P			Utilizzato per la solvazione
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	Hangzhou Huaan	ET1604-28
Weishengxin			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	Microsoft		Utilizzato per l'elaborazione dati, l'aggancio molecolare e le simulazioni MD
Xylene	Gruppo Sinopharm Co.Ltd	10023418