Isolamento, sintesi e caratterizzazione delle nanoparticelle CD47- e Integrina α4/β1–Modificato con membrana di macrofagi

Summary

Questo protocollo consente la preparazione e la caratterizzazione di nanoparticelle poli(acido-co-gliclicolico) rivestite a membrana CD47 e integrina α4/β1 per applicazioni mirate di somministrazione di farmaci.

Abstract

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica e un importante contributo alla morbilità e mortalità cardiovascolare. La somministrazione mirata di agenti antinfiammatori ai siti aterosclerotici rimane una sfida significativa. In questo caso, presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione e la caratterizzazione delle nanoparticelle di membrana rivestite con colchicina con colchicina (MMM/COL) rivestite con CD47 e integrina α4/β1 comodificate con membrana di CD47 e integrina. Il protocollo include la modifica dei macrofagi tramite trasfezione plasmidiale e stimolazione con endotelina-1, isolamento di membrana, fabbricazione NP e rivestimento a membrana. I NP MMM/COL risultanti vengono valutati utilizzando caratterizzazione fisicochimica, analisi dell'espressione proteica e sagaggi in vitro e in vivo . La validazione funzionale include la valutazione dell'associazione cellulare con cellule endoteliali attivate, l'assorbimento dei macrofagi, gli effetti antinfiammatori nelle cellule schiuma e la biodistribuzione in un modello murino di aterosclerosi. Inoltre, vengono evidenziati parametri sperimentali chiave e passaggi di controllo qualità per garantire riproducibilità e coerenza tra i laboratori. Questo protocollo fornisce un approccio robusto e scalabile per generare NP biomimetici per applicazioni mirate di somministrazione di farmaci nella ricerca sull'aterosclerosi.

Introduction

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica che porta a eventi cardiovascolari fatali e ictus attraverso la stenosi del lumen arterioso e la rottura instabile della placca, responsabile di un significativo onere globale ^{per la salute 1,2,3}. La riduzione della regolazione delle risposte infiammatorie nel sito aterosclerotico è un obiettivo terapeutico^{principale 4,5}. La colchicina, un potente farmaco antinfiammatorio, ha mostrato potenziali risultati nel ridurre gli eventi cardiovascolari^{avversi 6,7}. Tuttavia, la sua utilità clinica è limitata da una finestra terapeutica ristretta e da effetti collaterali sistemici, che richiedono sistemi di somministrazione mirati per aumentare l'accumulo nel sito della placca minimizzando la^{tossicità 8}.

Le nanoparticelle rivestite dalla membrana (NP) sono emerse come una potente piattaforma per la somministrazione mirata di farmaci, sfruttando le funzioni biologiche naturali delle cellule di origine ^9,10,11. Tra i tipi cellulari coinvolti nell'aterosclerosi, i macrofagi svolgono un ruolo fondamentale 12,13,14. L'integrina α4/β1, espressa sui macrofagi, media il reclutamento alle placche aterosclerotiche legandosi alla molecola di adesione cellulare vascolare-1 (VCAM-1) espressa sulle cellule endoteliali (EC) attivate. CD47, un segnale "non mangiarmi", consente l'evasione della fagocitosi da parte del sistema mononucleare^{di fagociti 15,16}. Ingegnerizzando le membrane dei macrofagi in modo che sovraesprimano queste proteine rispetto alle membrane macrofagiche native, si possono creare NP con un targeting potenziato tramite l'interazione integrina α4/β1–VCAM-1 e una riduzione della fagocitosi tramite segnalazione^{mediata da CD47 6}. La strategia di doppia modifica migliora i sistemi di puntamento NP rivestiti a membrana nativi e i sistemi di puntamento basati su ligando, migliorando contemporaneamente il targeting agli EC attivati e riducendo la clearance dei fagociti. A differenza delle membrane macrofagiche native che esprimono solo livelli di base di queste proteine, la nostra membrana ingegnerizzata offre funzionalità migliorata senza introdurre liganti sintetici di targeting che potrebbero innescare immunogenicità.

Questo protocollo dettaglia la preparazione e la caratterizzazione di NP poli(acido lattico-coglicolico) caricati di colchicina (NP COL) rivestiti con membrane macrofagiche co-modificate CD47- e integrina α4/β1, generando NP rivestiti da membrana macrofagica modificata (NP MMM/COL). Descriviamo metodi per la modifica genetica e farmacologica dei macrofagi RAW 264.7, l'isolamento di membrane modificate, la preparazione e il rivestimento delle PLGA NP, e saghi funzionali completi in vitro e in vivo . Questo metodo fornisce un quadro riproducibile per preparare e valutare le NP biomimetiche per applicazioni mirate di somministrazione di farmaci nella ricerca sull'aterosclerosi.

Protocol

Tutte le procedure animali descritte in questo protocollo sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali dell'Ospedale Nanchino Drum Tower e hanno seguito le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio stabilite dai National Institutes of Health.

1. Modifica dei macrofagi RAW 264.7

1. Preparare le cellule RAW 264,7, completare il Mezzo Eagle Modificato di Dulbecco integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina–estreptomicina, plasmide di sovraespressione CD47, reagente di transfezione Lipofectamina 3000, endotelina-1 (ET-1), soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e forniture di coltura tissutale sterile.
2. Coltivare 264,7 cellule RAW in un incubatore umidificato a 37°C con il 5% di CO₂ e mantenere le cellule fino a raggiungere circa 4–5 × 10⁵ cellule per pozzo in una piastra a 6 pozzi.
3. Eseguire la modifica CD47
   1. Prepara la soluzione di DNA plasmidico mescolando 2,5 μg di DNA plasmidico con 5 μL di reagente P3000 in un mezzo siero Opti-MEM da 125 μL.
   2. Prepara la soluzione del reagente per la trasfezione diluendo 3,75 μL di reagente per la trasfezione in 125 μL di mezzo senza siero.
   3. Usa questi volumi per un formato a 6 pozzi a piastra (6 pozzi). Scalare tutti i componenti proporzionalmente per altri formati mantenendo un rapporto DNA:P3000 di 1:2 (μg:μL) e un rapporto DNA:reagente di trasfezione di 1:1,5 (μg:μL).
      NOTA: Ad esempio, usa 10 μg di DNA, 20 μL di P3000 e 15 μL di reagente di trasfezione per piatti da 10 cm.
   4. Combinare la soluzione di DNA con la soluzione del reagente per la transfezione e incubare per 15 minuti a 25°C.
   5. Aggiungere i complessi di trasfezione alle cellule in DMEM senza antibiotici integrato con FBS al 10% a circa 2–2,5 × 10⁶ cellule per piatto da 10 cm.
   6. Sostituisci il substrato con un mezzo fresco completo contenente antibiotici 6 ore dopo la trasfezione.
4. Eseguire modifiche con integrina α4/β1
   1. Stimolare cellule trasfettate o non trasfezzate con 100 nM ET-1 in un mezzo siero per 24 ore al fine di regolare l'espressione dell'integrina α4/β1.
      NOTA: Verificare l'efficienza della modifica tramite reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) e analisi Western blot per CD47, integrina α4 e integrina β1.

2. Isolamento della membrana macrofagica modificata (MMM)

1. Raccogli le celle modificate RAW 264.7 usando un raschietto a celle.
2. Centrifuga le celle a 900 × g per 5 minuti a 4°C.
3. Lava il pellet cellulare tre volte con PBS freddo a 1×.
4. Risospendere la pellet cellulare in 2 mL di tampone di lisi ipotonica pre-raffreddata (10 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM di KCl, 1,5 mM di_MgCl2 e 1 mM di fluoruro di fenilmetilsulfonil) e incubare la sospensione sul ghiaccio per 15 minuti.
5. Congela la sospensione in azoto liquido per 2 minuti, poi scongelala in un bagno d'acqua a 37°C per 5 minuti. Ripeti il ciclo congelamento-discongelamento cinque volte per lisare completamente le cellule.
   ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare gravi ustioni criogeniche. Maneggiare usando guanti isolati appropriati e protezione facciale.
6. Centrifugare il lisato a 850 × g per 10 minuti a 4°C per rimuovere nuclei e cellule non rotte.
7. Centrifugare il soprantantante raccolto a 15.000 × g per 30 minuti a 4°C. Per ottenere una maggiore purezza della membrana, si trasferisce il surnatante ottenuto dopo 15.000 × g di centrifugazione in tubi ultracentrifughe e si centrifuga a 100.000 × g per 1 ora a 4°C utilizzando un'ultracentrifuga.
   ATTENZIONE: Assicurarsi che i tubi delle ultracentrifughe siano correttamente bilanciati e certificati per centrifugazione ad alta velocità per prevenire squilibri o guasti del rotore.
   NOTA: L'ultracentrifugazione produce membrane plasmatiche purificate con una riduzione della contaminazione intracellulare degli organi.
8. Raccogliere il pellet contenente frammenti di MMM e risospenderlo in 300 μL di 1× PBS o tampone di lisi per ottenere una concentrazione proteica di circa 1–2 mg/mL.
9. Determinare la concentrazione di proteine di membrana utilizzando un kit di quantificazione delle proteine BCA.
   NOTA: Le membrane isolate possono essere conservate a −80°C per un uso successivo.

3. Preparazione di NP PLGA caricati con colchicina (NP COL)

1. Sciogliere 10 mg di PLGA (50:50, MW 90.000) e 1 mg di colchicina in 1 mL di dimetilsolfosidro (DMSO).
   ATTENZIONE: Il DMSO può penetrare nella pelle e migliorare l'assorbimento di altre sostanze. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata (guanti in nitrilo, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza) durante la manovrazione. Raccogliere soluzioni contenenti DMSO come rifiuti di solventi organici e smaltirlo tramite servizi autorizzati di smaltimento di rifiuti pericolosi. La colchicina è tossica e potenzialmente teratogena. Raccogliere tutti i materiali contaminati dalla colchicina (soluzioni, guanti e tubi) come rifiuti farmaceutici pericolosi e smaltire tramite servizi autorizzati di smaltimento dei rifiuti pericolosi secondo le normative istituzionali e locali.
2. Mescolare la soluzione a 500 giri/min utilizzando un agitatore magnetico con una barra di mescolazione rivestita in Teflon da 10 mm a 25°C.
3. Aggiungi 4 mL di acqua ultrapura goccia a goccia a circa 1 mL/min usando una pompa a siringa dotata di una siringa da 5 mL e un ago da 26G a 25°C.
4. Continuare a mescolare la miscela per 3 ore per permettere la formazione del NP.
5. Trasferire la sospensione NP in una sacca per dialisi (MWCO 3.500 Da).
6. Dialisi contro 2 L di acqua distillata a 4°C sotto una lieve mescolata a 200 giri/min.
7. Continuare la dialisi per 24 ore e sostituire completamente il buffer per la dialisi a 6, 12 e 24 ore per rimuovere colchicina libera e DMSO.
   ATTENZIONE: Raccogli tutti i solventi e reagenti organici, inclusi quelli provenienti dalla dialisi, come rifiuti chimici organici. Non gettarla nello scarico. Segui i protocolli istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
8. Raccogli la sospensione COL NP dializzata e conserva a 4°C.
   NOTA: I NP COL possono essere conservati a 4°C per un uso a breve termine (fino a 3 giorni). Per la marcatura fluorescente, incorporare lo 0,1% (p/w) di 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianerina perclorato (DiI) nella soluzione PLGA durante lo Passo 3.1.
9. Verifica la rimozione del DMSO e della colchicina gratuita
   1. Raccogliere il dialisato finale (il buffer dopo l'ultimo cambiamento a 24 ore) e analizzarlo utilizzando spettrofotometria ultravioletto-visibile (UV-vis).
   2. Scansiona il dialisato da 200 a 400 nm e confrontalo con un campione di controllo (buffer di dialisi fresco).
   3. Confermare che non sia presente alcun picco di assorbanza intorno a 210 nm (caratteristico del DMSO) o a 345 nm (caratteristico della colchicina), indicando la rimozione riuscita del solvente residuo e del farmaco libero.
   4. In alternativa, si determina la concentrazione residua di DMSO utilizzando un kit di analisi DMSO secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che il DMSO residuo sia inferiore allo 0,1% (v/v) per evitare citotossicità negli saggi a valle.

4. Fabbricazione di NP rivestiti a membrana (NP MMM/COL)

1. Sonicare la sospensione MMM isolata (dal passo 2.7) per 20 minuti usando un sonicatore a bagno maria a 40 kHz e 110 W. Mantieni il volume del campione a 1 mL in un tubo da 1,5 mL e la temperatura sotto i 25°C usando il bagno di ghiaccio secondo necessità.
2. Estludere la sospensione a membrana sonicata attraverso un filtro a membrana in policarbonato con una dimensione dei pori di 400 nm utilizzando un mini estrusore per formare vescicole a membrana.
3. Mescola le NP del COL (dal passo 3.5) con le vescicole MMM a un rapporto di massa proteina-PLGA della membrana di 1:1.
   1. Utilizzare una sospensione a membrana contenente 10 mg di proteine per 10 mg di PLGA come determinato dal test di quantificazione proteica.
   2. Con delicatezza mescola delicatamente le NP COL con le vescicole MMM su e giù 15 volte usando una pipetta da 1 mL.
4. Co-estrusca la miscela attraverso un filtro a membrana in policarbonato con poro di 200 nm e ripeti l'estrusione per 15 passate.
5. Raccogli la sospensione risultante contenente NP MMM/COL e conservala a 4°C per un uso immediato.

5. Caratterizzazione dei NP

1. Misurare il diametro idrodinamico, l'indice di polidispersione (PDI) e il potenziale zeta usando la diffusione dinamica della luce (DLS) nelle seguenti condizioni: temperatura, 25°C; angolo di retrodiffusione, 173°; tempo di equilibrio, 2 minuti; e tre misurazioni replicate per campione.
2. Diluire i campioni 20 volte in acqua deionizzata (concentrazione finale, circa 0,1 mg/mL).
   NOTA: La diluizione minimizza gli effetti di diffusione multipla.
3. Visualizza la struttura nucleo-guscio delle MMM/COL NP utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
   1. Posizionare 5 μL di sospensione NP (circa 0,1 mg/mL) su una griglia di rame rivestita di carbonio scaricata in glow (mesh 300).
   2. Lascia adsorbire il campione per 2 minuti a 25°C.
   3. Rimuovere il liquido in eccesso toccando delicatamente il bordo della griglia con carta filtrante.
   4. Applicare 5 μL di soluzione di acetato di uranyle all'1% sulla griglia e incubare per 1 minuto a 25°C.
   5. Rimuovere la macchia in eccesso con carta filtrante.
   6. Lascia asciugare completamente la griglia all'aria per almeno 10 minuti prima dell'immagini.
      ATTENZIONE: L'acetato di uranile è tossico e radioattivo. Maneggiare con l'attrezzatura personale adeguata (guanti, camice da laboratorio e protezione oculare) e smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali sui materiali pericolosi.
4. Marcare la membrana con il colorante perclorato di 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO) durante il secondo passaggio oppure marcando le cellule intatte prima dell'isolamento della membrana, e marcare il nucleo PLGA con DiI.
5. Analizzare la co-localizzazione dei segnali DiO (verde) e DiI (rosso) utilizzando microscopia a scansione laser confocale (CLSM).
   1. Impostare i parametri eccitazione/emissione come segue: DiO (verde), eccitazione 488 nm, emissione 550 nm; DiI (rosso), eccitazione 561 nm, emissione 620 nm.
   2. Usa un obiettivo a immersione in olio al 60× (apertura numerica, 1,4).
   3. Imposta il foro estenopeico su 1 unità Airy.
   4. Regola il guadagno del rilevatore per evitare la saturazione dei pixel.
   5. Acquisire immagini a risoluzione di 1024 × 1024 pixel con media di linea di 2×.
   6. Mantieni la potenza del laser sotto il 5% per minimizzare lo sbiancamento fotografico.
6. Analizzare la presenza di CD47, integrina α4 e integrina β1 sulla superficie NP del MMM/COL utilizzando l'analisi Western blot.
7. Determina il carico e il rilascio del farmaco
   1. Lisare un volume di NP di 100 μL in DMSO e misurare l'assorbenza della colchicina a 345 nm per determinare il carico del farmaco e l'efficienza dell'incapsulamento.
   2. Inserire 1 mL di sospensione NP MMM/COL (contenente circa 100 μg di colchicina) in una sacca per dialisi (MWCO, 3.500 Da).
   3. Sigilla la busta e immergila in 50 mL di PBS (pH 7,4) contenente il 20% di FBS in un becher di vetro da 100 mL.
   4. Mantieni il mezzo di rilascio a 37°C sotto una mescolata costante a 100 giri al minuto utilizzando un agitatore magnetico con una barra di agitazione da 20 mm rivestita in Teflon.
   5. Mantieni le condizioni di sink per tutto l'esperimento.
      NOTA: La solubilità della colchicina nella PBS con FBS del 20% è >1 mg/mL; La concentrazione massima di colchicina nel mezzo di rilascio è <10% della saturazione.
   6. Nei momenti temporali predeterminati (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 e 62 h), prelevare 500 μL di mezzo di rilascio.
   7. Sostituire il volume ritirato con un volume uguale di PBS fresco preriscaldato (37°C) contenente il 20% di FBS.
   8. Misurare la concentrazione di colchicina nei campioni prelevati utilizzando spettrofotometria UV–Vis a 345 nm.
   9. Esegui tutte le misurazioni in triplice.

6. Saghi funzionali in vitro

1. Seme delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Stimolare le cellule con 10 ng/mL fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) per 24 ore per aumentare il VCAM-1.
2. Associazione cellulare di NP MMM/DiI con HUVEC
   1. Incubare le cellule con MMM/COL NPs (MMM/DiI NPs) marcati con DiI a una concentrazione di 50 μg/mL (basata sulla massa centrale del PLGA) per 4 ore a 37°C in un'atmosfera al 5% di CO₂.
   2. Lava le cellule tre volte con PBS pre-raffreddato. Centrifuga le celle a 300 × g per 5 minuti a 4 °C dopo ogni lavaggio.
   3. Risospendere le cellule lavate in PBS contenenti albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5%. Regola la concentrazione cellulare finale a 1 × 10⁶ cellule/mL.
   4. Imposta i parametri dello strumento per la citometria di flusso o CLSM. Rilevare la fluorescenza DiI usando eccitazione a 549 nm ed emissione a 565 nm (canale PE).
   5. Acquisire dati dai campioni. Acquisire almeno 10.000 eventi per campione per la citometria di flusso o catturare campi rappresentativi per CLSM.
   6. Seleziona cinque campi rappresentativi per campione provenienti da regioni distinte, escludendo i bordi, utilizzando una lente a immersione in olio al 60×. Assicurati che le cellule siano intatte e non sovrappongano.
   7. Cieca i campioni prima dell'acquisizione dell'immagine. Seleziona i campi spostando casualmente il livello invece di scegliere manualmente aree specifiche.
   8. Applicare parametri identici di soglia e analisi a tutti i campioni in condizioni di cieco.
   9. Escludere i detriti cellulari usando il gating FSC-A/SSC-A. Seleziona celle singole usando il gating FSC-A/FSC-H.
   10. Seleziona le cellule vive usando colorazione con colorante di viabilidad. Aggiungi 7-aminoactinomicina D (7-AAD) a 1 μg/mL, incuba per 5 minuti a 4°C al buio e usa per il gating delle cellule vive.
   11. Analizzare l'intensità della fluorescenza per quantificare l'associazione cellulare. Usa l'intensità media della fluorescenza come metrica di quantificazione. Esegui l'analisi dei dati utilizzando il software di analisi della citometria a flusso FlowJo (v10.8.1).
3. Assorbimento cellulare di MMM/DiI NP da parte di RAW 264,7 macrofagi
   1. Incubare NP MMM/COL marcati con DiI (MMM/DiI NPs) con macrofagi RAW 264,7 non modificati a una concentrazione di 50 μg/mL (basata sulla massa del nucleo PLGA) per 4 ore a 37°C in un'atmosfera al 5% di CO₂.
   2. Preparare le cellule per l'analisi come descritto nei Passaggi 6.2.2–6.2.3.
   3. Impostare i parametri dello strumento per il rilevamento DiI utilizzando eccitazione a 549 nm ed emissione a 565 nm (canale PE).
   4. Acquisire dati dai campioni. Acquisire almeno 10.000 eventi per campione.
   5. Escludere i detriti cellulari usando il gating FSC-A/SSC-A. Seleziona celle singole usando il gating FSC-A/FSC-H.
   6. Seleziona le cellule vive usando colorazione con colorante di viabilidad. Aggiungi 7-AAD a 1 μg/mL, incuba per 5 minuti a 4 °C al buio e usa per il gating delle cellule vive.
   7. Analizzare l'intensità della fluorescenza per quantificare l'assorbimento cellulare. Usa l'intensità media della fluorescenza come metrica di quantificazione. Eseguire analisi dei dati utilizzando software di analisi di citometria a flusso.
4. Saggio a celle di schiuma
   1. Differenziare le cellule RAW 264,7 in cellule schiuma incubandole con lipoproteine ossidate a bassa densità (oxLDL) a 50 μg/mL per 48 ore. Confermare la formazione delle cellule di schiuma tramite colorazione con Oil Red O, indicata dall'accumulo intracellulare di lipidi.
   2. Trattare le cellule di schiuma con colchicina libera, NP COL o NP MMM/COL a una concentrazione equivalente di colchicina di 1 μM. Incubare le cellule per 24 ore a 37°C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂.
      NOTA: Seleziona questa concentrazione basandosi su esperimenti preliminari dose-risposta che valutano la vitalità cellulare e l'efficacia antinfiammatoria.
   3. Misurare i livelli di citochine infiammatorie utilizzando un saggio immunosorbente legato a enzimi (ELISA).
      1. Raccogliere i soprantativi in coltura cellulare immediatamente dopo il trattamento (24 ore dopo il trattamento).
      2. Centrifugare le piastre a 300 × g per 5 minuti a 4°C per rimuovere i detriti cellulari.
      3. Trasferire i soprannatanti chiarificati in tubi puliti e conservarli a −80°C fino all'analisi.
      4. Misurare i livelli di TNF-α e interleucina-6 utilizzando kit ELISA secondo le istruzioni del produttore.
      5. Esegui tutte le misurazioni in pozzi triplicati e ripeti l'esperimento tre volte in modo indipendente.
      6. Riportare le concentrazioni di citochine come valori assoluti (pg/mL) senza ulteriori normalizzazioni, poiché la densità di semina cellulare e le condizioni di trattamento sono coerenti in tutti i gruppi.

7. Applicazione terapeutica in vivo in un modello di aterosclerosi

NOTA: Tutte le procedure animali devono essere approvate dal competente Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali.

1. Stabilire il modello animale
   1. Stabilire un modello di placca aterosclerotica vulnerabile in topi maschi di 8 settimane di apolipoproteina E knockout (ApoE⁻/⁻) (C57BL/6 background).
   2. Nutrire i topi con una dieta ricca di grassi contenente il 15% di grassi e lo 0,25% di colesterolo ad libitum per 1 settimana prima dell'intervento e continuare per 4 settimane dopo l'intervento.
   3. Anestetizzare i topi con isoflurano (2%–3% per l'induzione e 1,5%–2% per il mantenimento) e somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg, sottocutaneo) per analgesia durante la chirurgia di costrizione dell'arteria carotide.
   4. Contrarre l'arteria carotide comune sinistra con un ago di 0,3 mm di diametro posto accanto all'arteria. Lega una legatura di seta 6-0 attorno sia all'arteria che all'ago, poi rimuovi l'ago per creare una costrizione parziale.
   5. Confermare la formazione della placca vulnerabile a 4 settimane dall'intervento tramite una valutazione istologica.
   6. Eseguire ematossilina ed eosina (H&E), olio rosso O e colorazione tricroma di Masson per valutare la morfologia della placca, la deposizione lipidica e il contenuto di collagene.
   7. Definire placche vulnerabili per area della placca > il 40% dell'area della sezione trasversale del vaso, spessore del cappuccio fibroso < 120 μm, area del nucleo lipidico > il 40% dell'area totale della placca e una consistente infiltrazione macrofagica CD68-positiva.
2. Iniettare 100 μL di NP MMM/COL marcati con DiI via endovenosa tramite la vena caudale a una dose di 2 mg/kg (basata sulla massa centrale della PLGA).
   1. Immagini dei topi al giorno successivo all'iniezione utilizzando un sistema di imaging in vivo per valutare la biodistribuzione dell'intero corpo.
      1. Anestetizzare i topi con isoflurano (3% per l'induzione e 1,5%–2% per il mantenimento, con flussi di ossigeno rispettivamente di 1 e 0,5 L/min). Monitorare la profondità dell'anestesia in base alla frequenza respiratoria e al riflesso del pizzicatore delle dita.
      2. Posizionare i topi supino su un palco riscaldato a 37°C per mantenere la temperatura corporea durante l'immagini.
      3. Acquisire immagini di fluorescenza usando impostazioni DiI (eccitazione 549 nm ed emissione 565 nm) con un set di filtri CY3 o TRITC. Utilizzare la modalità auto-esposizione (tipicamente 50–200 ms) e l'acquisizione dell'epifluorescenza.
      4. Acquisire contemporaneamente immagini corrispondenti in campo chiaro per riferimento anatomico a una risoluzione di 1024 × 1024 pixel.
   2. Prelevare organi principali e arterie carotidi per immagini di fluorescenza ex vivo.
      1. Anestetizzare i topi con isoflurano (3% per l'induzione e 2,5%–3% per il mantenimento).
      2. Perfusi i topi con 20 mL di PBS gelato (pH 7,4) tramite puntura ventricolare sinistra a una portata di 5 mL/min per rimuovere sangue residuo e NP non legati.
      3. Prelevare organi (cuore, aorta, fegato, milza, rene e polmone) immediatamente dopo la perfusione alle 24 ore dall'iniezione.
      4. Risciacquare gli organi prelevati in PBS ghiacciato per rimuovere il sangue superficiale.
      5. Apri l'aorta longitudinalmente e fissala piatta (lato endoteliale verso l'alto) su una piastra nera in silicone usando perni in acciaio inox.
      6. Tieni i tessuti in PBS gelato ed esegui immagini fluorescenti ex vivo entro 30 minuti dal raccolto. Rimuovere l'eccesso di PBS dalla superficie del tessuto immediatamente prima dell'imaging.
3. Eseguire dosaggio e trattamento
   1. Determinare la dose di colchicina dallo studio preliminare dose-risposta (0,01–0,45 mg/kg, n = 7/gruppo). Seleziona 0,05 mg/kg di colchicina come dose terapeutica.
   2. Somministrare 100 μL tramite iniezione nella vena caudale, corrispondente a una dose NP di 2 mg/kg (massa centrale di PLGA) e una dose di colchicina di 0,05 mg/kg. Iniettare una volta al giorno per 14 giorni consecutivi.
   3. Randomizza i topi in gruppi di trattamento (PBS, colchicina libera e NP MMM/COL) utilizzando un generatore di numeri casuali. Eseguire tutte le quantificazioni da parte di due osservatori accecati ai gruppi di trattamento.
   4. Applica parametri umani, tra cui >perdita di peso corporea del 20%, mobilità ridotta o segni di disagio.
4. Eseguire analisi degli endpoint
   1. Eutanasia i topi 24 ore dopo l'iniezione finale. Prelevare arterie carotide e aorte. Valuta la carica di placca tramite macchie in rosso rosso O in faccia dell'aorta.
   2. Quantificare l'area della placca
      1. Quantificare l'area della placca come percentuale di area Oil Red O-positive dell'area totale del lumen aortico nelle sezioni trasversali (cinque sezioni per topo) utilizzando software di analisi delle immagini.
      2. Apri l'immagine nel software di analisi ImageJ.
      3. Clicca su Immagine → Digita → 8 bit per convertire l'immagine in scala di grigi.
      4. Clicca sull'immagine → regola → soglia. Seleziona il metodo Otsu e applica la soglia per identificare le regioni O-positive a Oil Red.
      5. Applicare gli stessi parametri di soglia a tutte le immagini campioni e registrare le impostazioni di soglia per la verifica.
      6. Clicca su Analizza → imposta Misurazioni e seleziona Area.
      7. Clicca su Analizza → Misura per quantificare le regioni selezionate.
      8. Esporta i dati quantificati.
   3. Valuta la stabilità della placca
      1. Valutare la stabilità della placca tramite colorazione istologica delle sezioni carotidee utilizzando H&E, Oil Red O e la colorazione tricroma di Masson. Quantificare il collagene come la percentuale di area blu tricromo-positiva di Masson nell'area della placca.
      2. Preparare sezioni immerse in paraffina a uno spessore di 5 μm e sezioni congelate a temperatura di taglio ottimale a uno spessore di 8 μm.
      3. Eseguire la colorazione H&E deparaffinizzando e reidratando le sezioni, seguita da una colorazione con ematossilina per 5 minuti e una colorazione con eosina per 2 minuti a temperatura ambiente (RT; 23°C ± 2°C).
      4. Esegui la colorazione con olio rosso ossigeno sulle sezioni congelate incubando con soluzione di lavoro olio rosso per 15 minuti a RT. Differenzia le sezioni con isopropanolo al 60% per 2 secondi e risciacqua con acqua distillata.
      5. Esegui la colorazione tricroma di Masson secondo le istruzioni del kit incubando sezioni con ematossilina di ferro di Weigert per 10 minuti, ponceau-acido fucisina per 5 minuti, acido fosfomolibdico per 5 minuti e blu di anilina per 5 minuti alla RT.
      6. Apri immagini istologiche in software di analisi delle immagini.
      7. Applica la soglia di colore per identificare le regioni positive al collagene. Esegui una soglia automatica e applica gli stessi parametri a tutte le immagini campione.
      8. Imposta la soglia di registrazione per la verifica.
      9. Definisci l'area totale della placca come la somma di tutte le aree placche all'interno dell'intima vascolare.
      10. Misura l'area della placca tracciando manualmente i confini delle placche o utilizzando la segmentazione automatica delle soglie per identificare tutte le regioni della placca.
      11. Misura l'area positiva al collagene.
      12. Calcola il contenuto di collagene come area positiva al collagene divisa per l'area totale della placca × al 100%.
   4. Valutare il contenuto dei macrofagi
      1. Eseguire la colorazione immunofluorescenza CD68 per valutare il contenuto di macrofagi. Quantificare il contenuto di macrofagi come la percentuale di area CD68 positiva dell'area della placca.
      2. Preparare le sezioni di tessuto (spessore 5 μm per le sezioni immerse in paraffina). Esegui il prelievo dell'antigene utilizzando tampone di citrato (pH 6.0) ad alta pressione per 2 minuti.
      3. Blocchi sezioni con il 5% di BSA per 30 minuti a RT.
      4. Incubare sezioni con anticorpo monoclonale anti-topo CD68 (clone D4B9C, diluizione 1:200 in 1% BSA) durante la notte a 4°C.
      5. Incubare sezioni con anticorpo secondario anti-coniglio IgG coniugato con Alexa Fluor 488 (diluizione 1:500) per 1 ora a RT.
      6. Controcolorare i nuclei con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti.
      7. Immagini a fluorescenza aperta nei software di analisi delle immagini.
      8. Identificare le regioni CD68-positive tramite la soglia di soglia (thresholding). Esegui una soglia automatica e applica gli stessi parametri a tutte le immagini campione.
      9. Imposta la soglia di registrazione per la verifica.
      10. Misura l'area CD68-positiva.
      11. Calcola il contenuto di macrofagi come area CD68-positiva divisa per l'area totale della placca × al 100%.

Results

Le misurazioni DLS sono state effettuate utilizzando un sistema Zetasizer Nano ZS a 25°C con un angolo di retrodiffusione di 173°. I campioni sono stati diluiti 20 volte in acqua deionizzata (concentrazione finale di circa 0,1 mg/mL) e equilibrati per 2 minuti prima della misurazione. Ogni campione è stato misurato in triplice e i risultati sono presentati come media ± SD. DLS e TEM rivelano un aumento della dimensione NP dopo il rivestimento della membrana e confermano la formazione di ...

Discussion

Questo protocollo fornisce un metodo completo per costruire e applicare NP co-modificati da membrana di macrofagi CD47 e integrina α4/β1 per la terapia mirata dell'aterosclerosi. I principali vantaggi di questo sistema includono il targeting attivo tramite l'interazione integrina α4/β1–VCAM-1 e una riduzione dell'assorbimento dei macrofagi associata alla segnalazione mediata da CD47, come supportato dai test di captazione in vitro (Figura 3) e dai risultati ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomicina D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (USA)	A1310	Colorante di vitalità per la discriminazione live/dead della citometria a flusso
Alexa Fluor 488-coniugata per capre anti-coniglio IgG	Thermo Fisher Scientific (USA)	A-11008	Anticorpo secondario per la colorazione immunofluorescenza CD68
Anticorpo anti-topo CD47	Abcam (USA)	ab214453	Utilizzato per l'analisi Western blot per verificare l'espressione del CD47
Integrina anti-mouse e alfa; 4 anticorpi (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (USA)	SC-376334	Utilizzato per l'analisi del Western blot per verificare integrina e alfa; 4 Espressione
Integrina anti-topo e beta; 1 anticorpo (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (USA)	SC-374429	Utilizzato per l'analisi del Western blot per verificare integrina e beta; 1 Espressione
ApoE-/- topi	Il Laboratorio Jackson (USA)	N/A	Utilizzato per il modello aterosclerosi in vivo
Kit per il test BCA	Thermo Fisher Scientific (USA)	23225	Utilizzato per determinare la concentrazione proteica
Piastra in silicone nero	N/A	N/A	Usato per montare l'aorta per immagini ex vivo
Plasmide CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (Cina)	G0177361-1	Contiene il gene Cd47 del topo per la sovraespressione
Colchicina	Sigma-Aldrich (USA)	C9754	Carico utile terapeutico nelle nanoparticelle
Microscopio laser confocale a scansione	Leica Microsystems	TCS SP8	Utilizzato per l'imaging di fluorescenza e l'analisi di co-localizzazione
Tampone citrato (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (USA)	N/A	Utilizzato per il recupero di antigeni nella colorazione a immunofluorescenza
Tubi per dialisi (MWCO 3.500 Da)	Sigma-Aldrich (USA)	PURD35030	Utilizzato per la purificazione di nanoparticelle
Dimetilsolossido (DMSO)	Sigma-Aldrich (USA)	D2447	Solvente per la preparazione delle nanoparticelle
DiI (1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianino perclorato)	Beyotime (Cina)	C1036	Marcatura fluorescente del nucleo di nanoparticelle
DiO (3,3′-dicottadaceloxacarbocianico, perclorato)	Beyotime (Cina)	C1038	Marcatura fluorescente della membrana dei macrofagi
DiR	Beyotime (Cina)	Y239280	Utilizzato per l'imaging fluorescente in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (USA)	D3571	Controcolorazione nucleare per l'imaging a fluorescenza
Dulbecco' s Eagle Medium Modificato (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (USA)	11965092	Mezzo di coltura cellulare
Analizzatore dinamico di diffusione della luce (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Regno Unito)	N/A	Utilizzato per misurazioni di scattering dinamico della luce (DLS) della dimensione delle nanoparticelle, PDI e potenziale zeta
Kit ELISA	R& D Systems (USA)	Dipende dalla citochina target	Usata per quantificare le citochine infiammatorie
Endotelina-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (USA)	E7764	Usata per stimolare integrina e alfa; 4/& beta; 1 Espressione
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, USA)	10091148	Integratore per il mezzo di coltura cellulare
Citometro a flusso	BD in Bioscienze (USA)	FACSCalibur	Utilizzato per l'acquisizione di segnali di fluorescenza
Software per l'analisi della citometria a flusso (FlowJo v10.8.1)	BD in Bioscienze (USA)	N/A	Utilizzato per l'analisi dei dati di citometria a flusso
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)	FuHeng Biotechnologies (Cina)	FH1122	Utilizzato per i saggi di targeting in vitro
Software di analisi delle immagini (ImageJ)	Istituti Nazionali di Salute (USA)	N/A	Utilizzato per l'analisi quantitativa delle immagini
Sistema di imaging in vivo	PerkinElmer (USA)	IVIS Lumina III	Utilizzato per l'imaging a fluorescenza corporea intera
Isopropanolo (60%)	Sigma-Aldrich (USA)	34863	Utilizzato per la differenziazione durante la colorazione con Oil Red O
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientific (USA)	L3000001	Reagente di trasfezione
Agitatore magnetico e barra di agitazione	N/A	N/A	Utilizzato per la preparazione delle nanoparticelle
Masson' s Kit per la tinta tricroma	Abcam (USA)	ab150686	Utilizzato per la colorazione al collagene
Mini estrusore	Avanti Polar Lipids (USA)	610000	Utilizzato per l'estrusione a membrana
Linea cellulare Murine RAW 264.7	FuHeng Biotechnologies (Cina)	FH0328	Origine dei macrofagi
Linea cellulare muscolare liscia murina	FuHeng Biotechnologies (Cina)	FH-Y063	Utilizzato per la valutazione della sicurezza
Oil Red O	Sigma-Aldrich (USA)	O0625	Usato per la colorazione lipidica
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (USA)	31985062	Mezzo sirico ridotto per la trasfezione
Lipoproteina ossidata a bassa densità (Ox-LDL)	Yiyuan Biotecnologie (Cina)	YB-002	Utilizzato per indurre la formazione di celle di schiuma
Penicillina e dash; Streptomicina	Thermo Fisher Scientific (USA)	15140122	Integratore antibiotico per coltura cellulare
Fenilmetilsolsolfinilfluoro (PMSF)	Sigma-Aldrich (USA)	78830	Inibitore della proteasi
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific (USA)	10010023	Lavaggio e tampone di diluizione
Poli(acido lattico-coglicolico) (PLGA, 50:50; MW 90.000)	Dalian Meilun Biotechnology (Cina)	MB5649-1	Polimero per la fabbricazione di nanoparticelle
Filtri a membrana in policarbonato (200 nm, 400 nm)	Whatman (Regno Unito)	800282	Utilizzato per l'estrusione
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich (USA)	P9333	Componente del buffer di lisi
Reagente P3000	Thermo Fisher Scientific (USA)	L3000001	Potenziatore di trasfezione
Microtomo rotatorio	Leica Biosystems (Germania)	RM2235	Utilizzato per la sezionazione a paraffina
Pompa a siringa	Apparato Harvard (USA)	70-3007	Utilizzato per la formazione controllata di nanoparticelle
Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)	Thermo Fisher Scientific (USA)	Talos F200S	Utilizzato per l'imaging delle nanoparticelle
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (USA)	T2663	Componente buffer
Fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-&alfa)	R& D Systems (USA)	410-MT	Usata per attivare le cellule endoteliali
Acqua ultrapura	Milli-Q (Merck, USA)	ZMQSV0T01	Utilizzato per la preparazione e la dialisi delle nanoparticelle