Isolamento, sintesi e caratterizzazione delle nanoparticelle CD47- e Integrina α4/β1–Modificato con membrana di macrofagi

Summary

Questo protocollo consente la preparazione e la caratterizzazione di nanoparticelle poli(acido-co-gliclicolico) rivestite a membrana CD47 e integrina α4/β1 per applicazioni mirate di somministrazione di farmaci.

Abstract

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica e un importante contributo alla morbilità e mortalità cardiovascolare. La somministrazione mirata di agenti antinfiammatori ai siti aterosclerotici rimane una sfida significativa. In questo caso, presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione e la caratterizzazione delle nanoparticelle di membrana rivestite con colchicina con colchicina (MMM/COL) rivestite con CD47 e integrina α4/β1 comodificate con membrana di CD47 e integrina. Il protocollo include la modifica dei macrofagi tramite trasfezione plasmidiale e stimolazione con endotelina-1, isolamento di membrana, fabbricazione NP e rivestimento a membrana. I NP MMM/COL risultanti vengono valutati utilizzando caratterizzazione fisicochimica, analisi dell'espressione proteica e sagaggi in vitro e in vivo . La validazione funzionale include la valutazione dell'associazione cellulare con cellule endoteliali attivate, l'assorbimento dei macrofagi, gli effetti antinfiammatori nelle cellule schiuma e la biodistribuzione in un modello murino di aterosclerosi. Inoltre, vengono evidenziati parametri sperimentali chiave e passaggi di controllo qualità per garantire riproducibilità e coerenza tra i laboratori. Questo protocollo fornisce un approccio robusto e scalabile per generare NP biomimetici per applicazioni mirate di somministrazione di farmaci nella ricerca sull'aterosclerosi.

Introduction

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica che porta a eventi cardiovascolari fatali e ictus attraverso la stenosi del lumen arterioso e la rottura instabile della placca, responsabile di un significativo onere globale ^{per la salute 1,2,3}. La riduzione della regolazione delle risposte infiammatorie nel sito aterosclerotico è un obiettivo terapeutico^{principale 4,5}. La colchicina, un potente farmaco antinfiammatorio, ha mostrato potenziali risultati nel ridurre gli eventi card....

Protocol

Tutte le procedure animali descritte in questo protocollo sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali dell'Ospedale Nanchino Drum Tower e hanno seguito le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio stabilite dai National Institutes of Health.

1. Modifica dei macrofagi RAW 264.7

1. Preparare le cellule RAW 264,7, completare il Mezzo Eagle Modificato di Dulbecco integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina–estreptomicina, plasmide di sovraespressione CD47, reagente di transfezione Lipofectamina 3000, endote....

Results

Le misurazioni DLS sono state effettuate utilizzando un sistema Zetasizer Nano ZS a 25°C con un angolo di retrodiffusione di 173°. I campioni sono stati diluiti 20 volte in acqua deionizzata (concentrazione finale di circa 0,1 mg/mL) e equilibrati per 2 minuti prima della misurazione. Ogni campione è stato misurato in triplice e i risultati sono presentati come media ± SD. DLS e TEM rivelano un aumento della dimensione NP dopo il rivestimento della membrana e confermano la formazione di .......

Discussion

Questo protocollo fornisce un metodo completo per costruire e applicare NP co-modificati da membrana di macrofagi CD47 e integrina α4/β1 per la terapia mirata dell'aterosclerosi. I principali vantaggi di questo sistema includono il targeting attivo tramite l'interazione integrina α4/β1–VCAM-1 e una riduzione dell'assorbimento dei macrofagi associata alla segnalazione mediata da CD47, come supportato dai test di captazione in vitro (Figura 3) e dai risultati .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomicina D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (USA)	A1310	Colorante di vitalità per la discriminazione live/dead della citometria a flusso
Alexa Fluor 488-coniugata per capre anti-coniglio IgG	Thermo Fisher Scientific (USA)	A-11008	Anticorpo secondario per la colorazione immunofluorescenza CD68
Anticorpo anti-topo CD47	Abcam (USA)	ab214453	Utilizzato per l'analisi Western blot per verificare l'espressione del CD47
Integrina anti-mouse e alfa; 4 anticorpi (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (USA)	SC-376334	Utilizzato per l'analisi del Western blot per verificare integrina e alfa; 4 Espressione
Integrina anti-topo e beta; 1 anticorpo (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (USA)	SC-374429	Utilizzato per l'analisi del Western blot per verificare integrina e beta; 1 Espressione
ApoE-/- topi	Il Laboratorio Jackson (USA)	N/A	Utilizzato per il modello aterosclerosi in vivo
Kit per il test BCA	Thermo Fisher Scientific (USA)	23225	Utilizzato per determinare la concentrazione proteica
Piastra in silicone nero	N/A	N/A	Usato per montare l'aorta per immagini ex vivo
Plasmide CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (Cina)	G0177361-1	Contiene il gene Cd47 del topo per la sovraespressione
Colchicina	Sigma-Aldrich (USA)	C9754	Carico utile terapeutico nelle nanoparticelle
Microscopio laser confocale a scansione	Leica Microsystems	TCS SP8	Utilizzato per l'imaging di fluorescenza e l'analisi di co-localizzazione
Tampone citrato (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (USA)	N/A	Utilizzato per il recupero di antigeni nella colorazione a immunofluorescenza
Tubi per dialisi (MWCO 3.500 Da)	Sigma-Aldrich (USA)	PURD35030	Utilizzato per la purificazione di nanoparticelle
Dimetilsolossido (DMSO)	Sigma-Aldrich (USA)	D2447	Solvente per la preparazione delle nanoparticelle
DiI (1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianino perclorato)	Beyotime (Cina)	C1036	Marcatura fluorescente del nucleo di nanoparticelle
DiO (3,3′-dicottadaceloxacarbocianico, perclorato)	Beyotime (Cina)	C1038	Marcatura fluorescente della membrana dei macrofagi
DiR	Beyotime (Cina)	Y239280	Utilizzato per l'imaging fluorescente in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (USA)	D3571	Controcolorazione nucleare per l'imaging a fluorescenza
Dulbecco' s Eagle Medium Modificato (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (USA)	11965092	Mezzo di coltura cellulare
Analizzatore dinamico di diffusione della luce (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Regno Unito)	N/A	Utilizzato per misurazioni di scattering dinamico della luce (DLS) della dimensione delle nanoparticelle, PDI e potenziale zeta
Kit ELISA	R& D Systems (USA)	Dipende dalla citochina target	Usata per quantificare le citochine infiammatorie
Endotelina-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (USA)	E7764	Usata per stimolare integrina e alfa; 4/& beta; 1 Espressione
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, USA)	10091148	Integratore per il mezzo di coltura cellulare
Citometro a flusso	BD in Bioscienze (USA)	FACSCalibur	Utilizzato per l'acquisizione di segnali di fluorescenza
Software per l'analisi della citometria a flusso (FlowJo v10.8.1)	BD in Bioscienze (USA)	N/A	Utilizzato per l'analisi dei dati di citometria a flusso
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)	FuHeng Biotechnologies (Cina)	FH1122	Utilizzato per i saggi di targeting in vitro
Software di analisi delle immagini (ImageJ)	Istituti Nazionali di Salute (USA)	N/A	Utilizzato per l'analisi quantitativa delle immagini
Sistema di imaging in vivo	PerkinElmer (USA)	IVIS Lumina III	Utilizzato per l'imaging a fluorescenza corporea intera
Isopropanolo (60%)	Sigma-Aldrich (USA)	34863	Utilizzato per la differenziazione durante la colorazione con Oil Red O
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientific (USA)	L3000001	Reagente di trasfezione
Agitatore magnetico e barra di agitazione	N/A	N/A	Utilizzato per la preparazione delle nanoparticelle
Masson' s Kit per la tinta tricroma	Abcam (USA)	ab150686	Utilizzato per la colorazione al collagene
Mini estrusore	Avanti Polar Lipids (USA)	610000	Utilizzato per l'estrusione a membrana
Linea cellulare Murine RAW 264.7	FuHeng Biotechnologies (Cina)	FH0328	Origine dei macrofagi
Linea cellulare muscolare liscia murina	FuHeng Biotechnologies (Cina)	FH-Y063	Utilizzato per la valutazione della sicurezza
Oil Red O	Sigma-Aldrich (USA)	O0625	Usato per la colorazione lipidica
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (USA)	31985062	Mezzo sirico ridotto per la trasfezione
Lipoproteina ossidata a bassa densità (Ox-LDL)	Yiyuan Biotecnologie (Cina)	YB-002	Utilizzato per indurre la formazione di celle di schiuma
Penicillina e dash; Streptomicina	Thermo Fisher Scientific (USA)	15140122	Integratore antibiotico per coltura cellulare
Fenilmetilsolsolfinilfluoro (PMSF)	Sigma-Aldrich (USA)	78830	Inibitore della proteasi
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific (USA)	10010023	Lavaggio e tampone di diluizione
Poli(acido lattico-coglicolico) (PLGA, 50:50; MW 90.000)	Dalian Meilun Biotechnology (Cina)	MB5649-1	Polimero per la fabbricazione di nanoparticelle
Filtri a membrana in policarbonato (200 nm, 400 nm)	Whatman (Regno Unito)	800282	Utilizzato per l'estrusione
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich (USA)	P9333	Componente del buffer di lisi
Reagente P3000	Thermo Fisher Scientific (USA)	L3000001	Potenziatore di trasfezione
Microtomo rotatorio	Leica Biosystems (Germania)	RM2235	Utilizzato per la sezionazione a paraffina
Pompa a siringa	Apparato Harvard (USA)	70-3007	Utilizzato per la formazione controllata di nanoparticelle
Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)	Thermo Fisher Scientific (USA)	Talos F200S	Utilizzato per l'imaging delle nanoparticelle
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (USA)	T2663	Componente buffer
Fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-&alfa)	R& D Systems (USA)	410-MT	Usata per attivare le cellule endoteliali
Acqua ultrapura	Milli-Q (Merck, USA)	ZMQSV0T01	Utilizzato per la preparazione e la dialisi delle nanoparticelle