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Articolo di ricerca

P. gingivalis/F. nucleatum nella parodontite apicale cronica sono associati all'accorciamento gestazionale tramite la via TLR4/MyD88/NF-κB

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DOI:

10.3791/70793

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15 maggio 2026

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1Department of Cariology and Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, The Affiliated Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, 2Development and Related Diseases of Women and Children Key Laboratory of Sichuan Province, 3Stomatology Disease Institute of Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Xinjiang Medical University, 4Department of Endodontics, Urumqi Stomatological Hospital, 5Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University

In questo articolo

Sommario

I patogeni orali associati alla parodontite apicale cronica (P. gingivalis, F. nucleatum) vengono valutati utilizzando modelli murini di CAP e saghi di infezione da trofoblasti umani. Si osserva un accorciamento gestazionale insieme all'attivazione infiammatoria placentare, compatibile con la segnalazione TLR4/MyD88/NF-κB. Il DNA batterico è rilevabile nei tessuti placentari/vascolari, supportando un legame ematogeno e potenziali bersagli di intervento.

Abstract

Il parto prematuro spontaneo (sPTB; parto prima delle 37 settimane) rimane una delle principali cause di mortalità neonatale, e l'infezione intrauterina è implicata in una proporzione significativa dei casi. Le evidenze emergenti collegano patogeni orali come Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum a esiti gestazionali avversi; tuttavia, le vie meccanicistiche che collegano la parodontite apicale cronica (CAP) al rischio gestazionale rimangono incompletamente definite. Nei topi C57BL/6J femmine, la CAP è stata stabilita tramite inoculazione canalare e integrata da un modello di sfida vena caudale utilizzando sospensioni batteriche (1 × 108 CFU/mL). Sono stati valutati tramite qPCR la lunghezza gestazionale, l'istopatologia placentare, i marcatori infiammatori e i segnali del DNA batterico. Parallelamente, trofoblasti umani sono stati esposti a P. gingivalis o F. nucleatum (MOI = 50, 24 h) per esaminare la segnalazione infiammatoria coerente con l'attivazione dell'asse TLR4/MyD88/NF-κB. Rispetto ai controlli, i gruppi associati al CAP hanno mostrato accorciamento gestazionale (mediano 19,5 vs 20,5 giorni), accompagnato da un aumento delle letture infiammatorie placentarie (inclusi elevati IL-1β e TNF-α) e caratteristiche istopatologiche compatibili con lesioni infiammatorie. qPCR ha inoltre indicato la presenza di segnali di DNA batterico nei tessuti placentari e vascolari. Nei saggi trofoblastici, F. nucleatum ha suscitato risposte proinfiammatorie più forti rispetto a P. gingivalis, in associazione con un aumento della fosforilazione di NF-κB. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che i patogeni orali associati alla CAP potrebbero contribuire all'accorciamento gestazionale stimolando l'infiammazione placentaria tramite la segnalazione TLR4/MyD88/NF-κB, supportando un asse microbico orale-placentario come potenziale bersaglio per mitigare il rischio gestazionale correlato all'infezione.

Introduzione

Il parto prematuro spontaneo (sPTB) è definito come il parto che avviene tra le 20 e le 37 settimane di gestazione senza interventomedico 1. Come preoccupazione critica per la salute pubblica globale, l'incidenza di sPTB varia da circa il 5%–9% nei paesi sviluppati al 12%–18% nelle regioni con risorselimitate 2,3. Il parto pretermine e le sue complicazioni rimangono una delle principali cause di mortalità nei bambini sotto i 5 anni, rappresentando circa un milione di morti neonatali ognianno. I sopravvissuti spesso sperimentano sia complicazioni immediate, come la sindrome da difficoltà respiratoria, sia conseguenze a lungo termine, tra cui paralisi cerebrale e ritardi nellosviluppo 5,6, imponendo così oneri economici sostanziali alle famiglie e allasocietà 7,8.

L'eziologia dello sPTB è multifattoriale, riflettendo le interazioni tra fattori materni, fetali e ambientali, tra cui disfunzione contrattile uterina, insufficienza cervicale, disturbi endocrini, disturbi placentari e infezioneintrauterina 9. L'infezione intrauterina è riconosciuta come un contributo principale e si stima rappresenti circa il 30%–40% dei casi di partopretermine 10,11. I patogeni possono accedere alla cavità amniotica tramite vie ascendenti (ad esempio cervicovaginali) o ematogeni, attivando le risposte immunitarie dell'ospite e favorendo il rilascio di citochine proinfiammatorie (ad esempio, IL-6, TNF-α) e prostaglandine che possono precipitare la parto12. I trofoblasti, come componenti cellulari chiave dell'interfaccia madre-fetale, contribuiscono alla tolleranza immunitaria così come alla difesaantimicrobica 13.

I microrganismi orali, tra cui Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum, sono stati implicati nei processi infiammatori correlati allo sPTB, potenzialmente attraverso la batteriemia e/o la diffusione di mediatori infiammatori14. Queste specie sono patogeni parodontali consolidati, e associazioni tra parodontite e sPTB sono state segnalate in studi epidemiologici eclinici 15,16,17. In particolare, P. gingivalis e F. nucleatum sono frequentemente rilevati anche nella parodontite apicale cronica (CAP)18,19, tuttavia la relazione tra PAC e esiti gestazionali avversi rimane relativamente poco studiata, e le vie biologiche rilevanti non sono completamentedefinite 20. Harjunmaa et al. hanno riportato per primi un'associazione tra parodontite apicale e riduzione della durata gestazionale e basso peso alla nascita nel 201521. Uno studio di follow-up sulla stessa coorte non ha supportato il trasferimento batterico diretto alla placenta, suggerendo che l'infiammazione sistemica possa rappresentare un legame plausibile tra parodontite apicale e esiti dellagravidanza 22. In linea con questa interpretazione, la parodontite apicale radiograficamente confermata è stata associata a un rischio elevato di parto prematuro a basso pesoalla nascita 23. In quanto infezione occulta persistente, la CAP può contribuire al rischio gestazionale attraverso un'infiammazione sistemica cronica di basso grado e/o l'esposizione a componenti microbiciematogeni. È quindi necessaria una maggiore chiarificazione della relazione CAP–gestazione per affinare la comprensione delle vie infiammatorie orale-placentaria e per informare strategie di prevenzione per il rischio gestazionale correlato all'infezione.

Studi recenti hanno evidenziato la rilevanza dell'asse di segnalazione TLR4/MyD88/NF-κB nel parto pretermine associato all'infiammazione. Robertson et al. hanno identificato TLR4 come potenziale bersaglio terapeutico nel travaglio prematuro indotto da infiammazione e hanno riportato effetti preventivi nei modellianimali 26. Peng et al. hanno inoltre dimostrato che miR-199a-3p attenua l'infiammazione epiteliale cervicale attraverso la soppressione della via HMGB1/TLR4/NF-κB 27. Inoltre, Shen et al. hanno descritto effetti antiossidanti e antinfiammatori della siringa nei ratti gravidi diabetici, con la modulazione della via TLR4/MyD88/NF-κB implicata nei miglioramentiosservati 28. Insieme, questi risultati supportano un quadro meccanicistico in cui la segnalazione infiammatoria legata a TLR4/MyD88/NF-κB contribuisce alle vie associate all'infezione che influenzano il parto, riconoscendo al contempo che molteplici recettori immunitari innati possono agire in parallelo a seconda del contesto patogeno.

Il presente studio valuta gli effetti gestazionali associati alla CAP utilizzando sagaggi complementari in vitro per trofoblasti e modelli murini in vivo . Il modello trofoblastico consente l'interrogazione controllata della segnalazione infiammatoria indotta dal patogeno, mentre il modello CAP murino in gravidanza collega le risposte cellulari ai fenotipi di gravidanza a livello di organismo in condizioni fisiologiche gestazionali. È incluso un modello di sfida vena caudale per fornire una via di esposizione ematogenica complementare e per valutare se i modelli di attivazione infiammatoria osservati nel contesto di infezione orale si riproducono quando i componenti batterici accedono alla circolazione materna. In particolare, l'esposizione a Trofoblasti a P. gingivalis e F. nucleatum viene utilizzata per profilare le risposte delle citochine e l'attivazione dell'asse TLR4/MyD88/NF-κB, mentre esperimenti su animali valutano la lunghezza gestazionale, l'infiammazione placentare e la rilevazione tramite qPCR dei segnali del DNA batterico nella biforcazione carotide e nei tessuti placentari. Poiché la qPCR indica la presenza di DNA batterico piuttosto che la vitalità o la localizzazione cellulare, le interpretazioni riguardanti la presenza microbica all'interfaccia madre-feto rimangono caute. Inoltre, le differenze tra specie e l'esposizione sperimentale controllata possono limitare la traduzione clinica diretta, sottolineando la necessità di una successiva validazione in contesti di rilevanza umana.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in rigorosa conformità con le linee guida etiche stabilite dal Comitato Etico della Ricerca Animale del Primo Ospedale Affiliato dell'Università Medica dello Xinjiang (Approvazione n.: IACUC-20231121-13) e in conformità con la guida dei National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (edizione 2011). Inoltre, questo studio è stato condotto in conformità con le linee guida ARRIVE. Tutte le forniture (reagenti, consumabili, apparecchiature e software) e le relative informazioni di produttore e numeri di catalogo sono fornite nella Tabella dei Materiali per facilitarne la riproducibilità.

1. Coltura batterica

I ceppi di riferimento di Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum (identificatori di ceppo forniti nella Tabella dei Materiali) sono stati gestiti in condizioni anaerobiche. Le colture primarie sono state stabilite su piastre agar di sangue Columbia pre-ridotte e incubate anaerobicamente (85% N₂, 10% H₂ e 5% CO₂) a 37 °C per 48 ore. Per le preparazioni sperimentali, una singola colonia ben isolata è stata inoculata in un brodo di infusione cerebrale da 40 mL e incubata in condizioni anaerobiche identiche fino alla crescita della fase centrale logaritmica (OD660 = 0,6–0,8). Per minimizzare l'esposizione all'ossigeno, sono stati eseguiti passaggi di inoculazione e trasferimento all'interno di una postazione di lavoro anaerobica utilizzando mezzi e strumenti pre-ridotti. Le concentrazioni batteriche sono state standardizzate a 1 × 108 CFU/mL per l'esposizione animale utilizzando una quantificazione basata su OD660 con una curva standard OD–CFU specifica per ceppo, generata nelle stesse condizioni di coltura; La curva di calibrazione è stata stabilita tramite diluizione seriale e conteggio delle colonie su piastre di agar anaerobico con almeno tre calibrazioni indipendenti. Per gli studi da infezione da trofoblasti, le sospensioni batteriche sono state quantificate utilizzando un metodo di enumerazione validato e diluite in un mezzo di coltura completa senza antibiotici per ottenere la molteplicità specificata di infezione (MOI) immediatamente prima della co-coltura.

2. Abitazione e raggruppamento degli animali

I topi specifici senza patogeno C57BL/6J (n = 90; 60 femmine, 30 maschi) di età compresa tra 6 e 7 settimane sono stati ospitati in condizioni controllate (22 °C ± 2 °C, 60% ± 10% di umidità, ciclo di luce di 12 ore) con accesso ad libitum a cibo e acqua. Dopo una settimana di acclimatazione, i topi sono stati distribuiti casualmente in sei gruppi sperimentali (n = 15/gruppo): controllo normale (NC), CAP con P. gingivalis (AP), CAP con F. nucleatum (AF), iniezione fisiologica normale nella vena caudale (VN), iniezione della vena caudale di P. gingivalis (VP) e iniezione della vena caudale di F. nucleatum (VF). Sono state registrate randomizzazioni e allocazioni della gabbia per minimizzare il bias di allocazione e i potenziali effetti della gabbia.

3. Istituzione del modello CAP

Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in condizioni asettiche. L'anestesia è stata indotta tramite somministrazione intraperitoneale di pentobarbital sodio (1,62 mg/30 g di peso corporeo) combinata con solfato di atropina (12,5 μg/30 g di peso corporeo), e una profondità anestetica adeguata è stata confermata dall'assenza del riflesso di ritiro del pedale. I topi sono stati posizionati supino su un tappeto riscaldante per mantenere la temperatura corporea, e la bocca è stata delicatamente aperta per consentire una visualizzazione stabile dei primi molari mascellari bilaterali. Sotto ingrandimento, le camere pulpari dei primi molari mascellari bilaterali sono state aperte utilizzando una bura rotonda sterile, seguita dalla rimozione del tessuto polpale coronale con micro-strumenti sterili. Gli orifizi canalari sono stati identificati utilizzando una piccola lima endodontica (dimensioni 06–10), e i canali sono stati negoziati delicatamente per ottenere una patenza evitando una forza eccessiva e minimizzare il rischio di perforazione. La camera veniva risciacquata con soluzione salina sterile (o PBS sterile) e asciugata con punte di carta sterili prima dell'inoculazione.

L'inoculazione batterica è stata eseguita utilizzando una sospensione standardizzata a 1 × 108 CFU/mL. Per rendere il dosaggio riproducibile, il volume somministrato era fissato operativamente a 2 μL per dente (circa 2 × 105 CFU per dente), somministrato utilizzando una punta calibrata per micropipetta posizionata all'ingresso della camera. Una punta di carta sterile assorbente, pre-ammollata con la stessa sospensione, veniva poi inserita nella camera della polpa per mantenere un'esposizione localizzata. Il parto riuscito è stato confermato da una visibile bagnazione della punta della carta e dall'assenza di perdite nella cavità orale. Dopo l'inoculazione, la camera veniva asciugata all'aria finché non rimaneva più liquido visibile, quindi sigillata con un adesivo dentale a cura leggera (20 s), seguita da un restauro utilizzando un composito in resina fluida e lucida (20 s). L'integrità della guarnizione è stata confermata tramite ispezione visiva e lievi sonde; i restauri che mostravano lacune o perdite precoce venivano immediatamente risigillati. Sono state fornite analgesia post-procedurale e monitoraggio secondo le linee guida istituzionali per la cura degli animali.

Due settimane dopo, furono ottenute radiografie periapicali per confermare l'istituzione della CAP. L'insediamento riuscito è stato definito da una chiara radiolucenza periapicale con cambiamenti ossei circostanti compatibili con infiammazione periapicale cronica e distruzione ossea. L'accoppiamento è iniziato due settimane dopo l'infezione/l'istituzione del modello.

4. Stabilimento del modello di iniezione delle vene caudali

Le sospensioni batteriche sono state preparate a una concentrazione di 1 × 108 CFU/mL in soluzione salina sterile. I topi sono stati trattenuti e la coda è stata riscaldata per 1–2 minuti per dilatare le vene laterali della coda. Le iniezioni venivano eseguite utilizzando un ago di calibro fine (tipicamente 29–30 G) inserito con la musatura nella vena laterale della coda con un angolo ridotto (circa 10–15°). La corretta posizione endovenosa è stata confermata da un lampo di sangue nel mozzo e un'infusione fluida con bassa resistenza; Un posizionamento non riuscito è stato indicato da una maggiore resistenza e/o formazione di una fiamma sottocutanea, nel qual caso l'infusione è stata interrotta e ripetuta in un sito più prossimale dopo un breve riscaldamento. I topi ricevevano iniezioni giornaliere per tre giorni consecutivi (100 μL per topo ogni volta). Dopo tre giorni, le femmine furono ospitate insieme agli uomini e i tappi vaginali furono controllati la mattina seguente. Dopo la conferma dei tappi vaginali (GD 0,5), le iniezioni sono state somministrate ogni tre giorni (100 μL per topo ogni volta) fino al giorno gestazionale 15.

5. Creazione del modello del topo incinta

Femmina e maschio di topo sono stati ospitati insieme con un rapporto 2:1 (femmina:maschio) durante la notte a partire dalle 20:00 di ogni giorno. La presenza di un tappo vaginale o di un test vaginale spermatozoi-positivo alle 08:00 del mattino successivo era designata come giorno gestazionale (DG) 0,5. Per ogni topo sono stati registrati il peso corporeo iniziale, il peso del prepartum, il peso post-partum, la durata gestazionale, il peso alla nascita neonatale, la dimensione della cucciolata e il numero di nati morti. Sulla base di studiprecedenti 29,30, il parto avvenuto prima del giorno 18,5 è stato definito operativamente come parto pretermine nei topi. Poiché l'accorciamento gestazionale può verificarsi entro l'intervallo di termine, gli esiti della gravidanza sono stati interpretati con attenzione alla distinzione tra il vero parto pretermine e il fenotipo di accorciamento gestazionale.

6. Raccolta e trattamento dei campioni

Al 15° giorno gestazionale, tre topi gravidi per gruppo sono stati selezionati casualmente per il prelievo placentare e vascolare (NC/AP/AF e VN/VP/VF). Dopo l'anestesia indotta da iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio (1,62 mg per 30 g di peso corporeo) e solfato di atropina (12,5 μg per 30 g di peso corporeo), sono stati prelevati campioni di sangue tramite sanguinamento retro-orbitale. I topi venivano soppressi in una camera di anidride carbonica fino a quando la morte non veniva confermata per assenza di respirazione, battito cardiaco e riflesso corneale; La somministrazione di anidride carbonica ha seguito un approccio graduale di riempimento coerente con le linee guida istituzionali per il benessere animale. La biforcazione dell'arteria carotide e i tessuti placentari sono stati raccolti prontamente utilizzando strumenti sterili per ridurre la contaminazione da campioni incrociati. Il tessuto placentare è stato suddiviso in due porzioni: una porzione è stata conservata a −80 °C, mentre l'altra è stata fissata in formalina tamponata neutra al 10% per 24 ore, seguita da disidratazione graduale con etanolo e incorporazione della paraffina. I topi rimanenti sono stati monitorati per il peso corporeo giornaliero, la durata gestazionale, la dimensione della cucciolata e il peso alla nascita neonatale.

7. Coltura cellulare e trattamento

La linea cellulare della trofoblasta umana HTR-8/SVneo è stata coltivata in mezzo RPMI 1640 integrato con siero fetale bovino inattivato al 10% a 37 °C con il 5% di CO₂. Per gli esperimenti di infezione, le cellule HTR-8/SVneo (1 × 106 cellule) in fase di crescita logaritmica sono state seminate in piastre a 6 pozzi e lasciate aderire durante la notte. Prima della sfida batterica, il mezzo veniva sostituito con un mezzo completo senza antibiotici per evitare effetti antibatterici di riportazione durante la co-coltura. Sono state aggiunte sospensioni batteriche di P. gingivalis o F. nucleatum a MOI = 50, e ogni pozzo è stato regolato a un volume finale di 2,5 mL utilizzando un mezzo di coltura completo. Le placche venivano incubate per 24 ore. I supernatanti sono stati raccolti a 24 ore e chiariti con una breve centrifugazione per rimuovere i detriti prima della misurazione delle citochine. Le cellule aderenti sono state lavate due volte con PBS sterile per rimuovere batteri non aderenti e poi processate immediatamente per l'estrazione di RNA o proteine secondo i flussi di lavoro descritti di seguito.

8. Analisi istologica della placenta del topo

I tessuti placentari sono stati fissati in formalina tamponata al 10% di neutro per 24 ore, incorporati in paraffina e sezionati a uno spessore di 4,5 μm. È stata eseguita una colorazione di routine di ematossilina ed eosina (H&E) per esaminare la morfologia placentare. Per la colorazione immunoistochimica, la localizzazione dell'antigene è stata visualizzata utilizzando un substrato perossidasi cromogenico che produce depositi marroni nei siti positivi, seguita da controcolorazione con ematossilina. I controlli negativi sono stati eseguiti sostituendo gli anticorpi primari con siero non immunitario.

Per migliorare la riproducibilità e la trasparenza, la valutazione immunoistochimica utilizzava un approccio di punteggio semi-quantitativo predefinito. L'intensità della colorazione è stata valutata come 0 (nessuna), 1 (debole), 2 (moderata) o 3 (forte), e la percentuale di cellule positive è stata valutata come 0 (<5%), 1 (5–25%), 2 (26–50%), 3 (51–75%) o 4 (>75%). Un punteggio di immunoreattività è stato calcolato moltiplicando i punteggi di intensità e percentuale per ciascun campo. Per ogni placenta, sono stati valutati almeno cinque campi ad alta potenza non sovrapposti provenienti da regioni anatomiche comparabili. La valutazione è stata condotta indipendentemente da due osservatori ciechi sull'assegnazione dei gruppi, e i disaccordi sono stati risolti tramite revisione congiunta.

9. Rilevamento quantitativo in tempo reale per PCR dei segnali del DNA batterico nella biforcazione carotide del topo e nella placenta

Il DNA tissutale è stato estratto utilizzando un flusso di lavoro di estrazione del DNA tissutale basato su colonna di silice. I lisati tissutali sono stati chiariti tramite centrifugazione a 12.000 × g per 5 minuti a 20–25 °C, e i soprannatanti sono stati applicati su colonne di silice per il legame al DNA tramite centrifugazione a 12.000 × g per 1 minuto a 20–25 °C. I passaggi di lavaggio venivano eseguiti secondo il flusso di lavoro, con ogni lavaggio seguito dalla centrifugazione a 12.000 × g per 1 minuto a 20–25 °C. Una centrifuga finale a secco è stata eseguita a 12.000 × g per 2 minuti a 20–25 °C per rimuovere l'etanolo residuo. Il DNA veniva eluzionato in un tampone di eluzione da 50 μL dopo un'incubazione di 2 minuti a 20–25 °C e raccolto tramite centrifugazione a 12.000 × g per 1 minuto a 20–25 °C. Il DNA genomico batterico è stato estratto utilizzando un flusso di lavoro di estrazione del DNA batterico a colonna di silice utilizzando gli stessi parametri di centrifugazione di legaggio/lavaggio/centrifugazione/eluzione, salvo diversa richiesta dal flusso di lavoro.

La concentrazione e la purezza del DNA sono state misurate utilizzando un quantificatore di acidi nucleici a microvolume, e l'integrità è stata verificata tramite elettroforesi su gel di agarosio. I campioni di DNA qualificati sono stati conservati a –20 °C per analisi successive. I geni batterici bersaglio sono stati amplificati e clonati utilizzando primer elencati nella Tabella Supplementare 1, con le condizioni PCR dettagliate nella Tabella Supplementare 2 e nella Tabella Supplementare 3. Le bande bersaglio amplificate sono state purificate, clonate secondo le specifiche della Tabella Supplementare 4 e trasformate in cellule competenti di Escherichia coli DH5α. I ceppi contenenti plasmidi ricombinanti sono stati verificati per garantire sequenze di inserto corrette e il DNA plasmidico è stato estratto per la preparazione standard. Le curve standard sono state generate eseguendo qPCR su standard plasmidi serialmente diluiti contenenti frammenti genici batterici bersaglio. I segnali batterici di P . gingivalis 16S 16S e P . gingivalis 16S nei campioni di biforcazione carotide e placentare sono stati rilevati quantitativamente tramite PCR in tempo reale, con numeri di copie del DNA calcolati dai valori di Ct utilizzando la curva standard. I sistemi e i programmi di reazione sono dettagliati rispettivamente nella Tabella Supplementare 5 e nella Tabella Supplementare 6. Poiché la qPCR indica segnali di DNA batterico piuttosto che vitalità o localizzazione cellulare, le interpretazioni riguardanti la presenza microbica all'interfaccia madre-fetale rimangono caute.

10. Rilevamento ELISA di fattori infiammatori nei campioni di siero dei topi e in supernatori in coltura cellulare

Tutti i reagenti e i campioni sono stati bilanciati a temperatura ambiente prima del test. I livelli sierici di TNF-α e IL-1β sono stati misurati utilizzando i flussi di lavoro ELISA dei topini, mentre i livelli di TNF-α e IL-1β nei supernattivi in coltura cellulare sono stati determinati utilizzando flussi di lavoro ELISA umani, seguendo le procedure del kit. Standard e campioni venivano misurati in pozzi duplicati e venivano generate curve standard per ogni placca. I duplicati tecnici sono stati mediati per ottenere un valore per ogni replica biologica.

11. Altre analisi di biologia molecolare

Per la qRT-PCR, l'RNA totale è stato estratto da cellule coltivate utilizzando un flusso di lavoro di estrazione di RNA a base di fenolo-cloroformio. Dopo la separazione delle fasi, la fase acquosa veniva chiarita tramite centrifugazione a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C, e l'RNA veniva precipitato, lavato e risospeso secondo il flusso di lavoro. La concentrazione di RNA è stata misurata utilizzando un analizzatore di acidi nucleici, e l'integrità dell'RNA è stata valutata tramite elettroforesi su gel di agarosio. È stata eseguita la trascrizione inversa per generare cDNA, e è stata utilizzata una PCR quantitativa in tempo reale per quantificare i livelli di TNF-α e IL-1β di mRNA. Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella Supplementare 7, le miscele di reazione nella Tabella Supplementare 8 e i programmi di reazione nella Tabella Supplementare 9.

Per il Western blotting, i lisati proteici provenienti da tessuti placentari di topo o cellule trofoblastiche sono stati chiariti tramite centrifugazione a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C, quantificati e sottoposti a SDS-PAGE, seguiti da trasferimento di membrana e rilevamento basato su anticorpi tramite un flusso di lavoro di imaging a fluorescenza. Il carico proteico uguale è stato fissato a 30 μg per corsia. Le immagini originali a membrana non ritagliate, inclusi i marcatori del peso molecolare, sono state conservate per tutte le macchie presentate nelle figure e sono disponibili DOI: 10.57760/sciencedb.28254. Salvo diversa specificazione, "n" si riferisce a repliche biologiche (animali individuali o colture cellulari indipendenti), mentre le ripetizioni tecniche sono utilizzate per il controllo della qualità e non sostituiscono la replicazione biologica.

12. Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando software di analisi statistica e le figure sono state generate tramite software di grafica (elencati nella Tabella dei Materiali). I dati continui normalmente distribuiti sono stati presentati come deviazione media ± standard e analizzati tramite ANOVA unidirezionale con test post hoc appropriati, mentre i dati normalmente distribuiti sono stati espressi come mediana (intervallo interquartile) e analizzati utilizzando il test di Kruskal–Wallis con appropriati confronti a coppie. Le soglie di significatività statistica sono state fissate a P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001. Salvo diversa specificazione, "n" indica repliche biologiche, e repliche tecniche (ad esempio, pozzi ELISA duplicati) venivano mediate per produrre un singolo valore per ogni replica biologica.

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Risultati

L'infezione da P. gingivalis o F. nucleatum è associata a accorciamento gestazionale e a un aumento delle citochine infiammatorie sieriche nei topi
Le statistiche di base per le variazioni di peso materno, gli esiti neonatali e la durata gestazionale sono riassunte nella Tabella 1 e nella Figura 1. Le traiettorie del peso materno e le condizioni neonatali non differivano significativamente tra i gruppi (...

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Discussione

Negli ultimi anni, l'accumulo di evidenze ha suggerito legami stretti tra la salute orale e gli esiti della gravidanza, portando a una crescente attenzione alle possibili associazioni tra parodontite apicale cronica (CAP) e esiti avversi della gravidanza, inclusi i fenotipi preterminicorrelati al parto 31 . Una revisione sistematica indica che la base di evidenze cliniche attuali rimane limitata ed eterogenea, ma nel complesso supporta un'associazione positiva tra...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per lo Sviluppo e le Malattie Correlate di Donne e Bambini del Laboratorio Chiave della Provincia del Sichuan (Grant No. FYYFEJB2025002).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Chromogenic Peroxidase SubstrateAgilent DakoK3468Sostrato cromogenico per perossidasi per IHC
Defibrinated sheep blood, sterileThermo Fisher (Remel)R54012Additivo per agar al sangue (5%)
Dental X-ray unit / radiography systemPlanmecaIntra (modello)Radiografie periapicali per conferma CAP
DNeasy Blood & Tissue KitQIAGEN69504Estrattore di DNA da tessuti/batteri su colonna di silice
E. coli DH5α Competent CellsTaKaRa9057Trasformazione per costruzione standard del plasmide
Eosin Y solution, alcoholicSigma-Aldrich (Merck)HT110132Colorazione H&E
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, AustraliaGibco (Thermo Fisher Scientific)10099-141Supplemento per mezzo completo
Flowable resin composite3MFiltek Supreme Flowable 6010Ricostruzione dopo sigillatura; fotopolimerizzazione
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum reference strainATCC25586Coltura anaerobica; esposizione CAP e vena caudale
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 9 (versione)Analisi statistica e generazione di figure
Hematoxylin solutionSigma-Aldrich (Merck)HHS32Controstaino H&E
HTR-8/SVneo human trophoblast cell lineATCCCRL-3271Assaggi di infezione in vitro
Human IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DLB50Misura IL-1β nel surnatante cellulare
Human TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DTA00DMisura TNF-α nel surnatante cellulare
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µmMillipore (Merck)IPFL00010Trasferimento per Western blot fluorescente
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR925-68071Anticorpo secondario fluorescente
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR926-32211Anticorpo secondario fluorescente
IκBα (44D4) Rabbit mAbCell Signaling Technology4812Anticorpo primario (WB)
K-File (endodontic file)Dentsply Sirona (Maillefer)A012D015Strumentazione del canale (es. dimensione 15)
LED dental curing light3MElipar DeepCure-S (modello)Fotopolimerizzazione 20 s (secondo il protocollo)
Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MLB00CMisura IL-1β nel siero
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MTA00BMisura TNF-α nel siero
MyD88 (D80F5) Rabbit mAbCell Signaling Technology4283Anticorpo primario (WB)
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WQuantificazione DNA/RNA
Near-infrared imaging systemLI-COROdyssey CLx (modello)Imaging per Western blot fluorescente
NF-κB p65 (D14E12) Rabbit mAbCell Signaling Technology8242Anticorpo primario (WB)
PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+Gibco (Thermo Fisher Scientific)10010-023Lavaggio cellulare e preparazione dei reagenti
Penicillin-Streptomycin Gibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Antibiotici
Pentobarbital sodium saltSigma-Aldrich (Merck)P3761Induzione dell'anestesia (dose secondo il protocollo)
Peroxidase blocking solutionAgilent DakoS2023Blocco della perossidasi endogena per IHC
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAbCell Signaling Technology3033Anticorpo primario (WB)
Porphyromonas gingivalis reference strainATCC33277Coltura anaerobica; esposizione CAP e vena caudale
PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real Time)TaKaRaRR037ASintesi di cDNA
Real-time PCR systemApplied BiosystemsQuantStudio 5 (modello)Quantificazione qPCR di target 16S
Round bur (sterile)Dentsply SironaH1-010Apertura di accesso per la camera pulpare del primo molare mascellare
RPMI 1640 MediumGibco (Thermo Fisher Scientific)11875-093Mezzo di coltura base per HTR-8/SVneo
SYBR-safe DNA gel stainInvitrogenS33102Visualizzazione del DNA
TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0TaKaRa9760Miniprep del plasmide per gli standard
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820AMix master per qPCR (basato su coloranti)
TLR4 (D8L5W) Rabbit mAbCell Signaling Technology14358Anticorpo primario (WB)
TRIzol ReagentInvitrogen15596-026Estrazione di RNA con fenolo-cloroformio
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco (Thermo Fisher Scientific)25200-056Staccamento cellulare
T-Vector pMD19 (Simple)TaKaRa3271Clonazione del prodotto PCR per le curve standard
Universal dental adhesive3MScotchbond Universal Adhesive 26200Sigillare la camera pulpare dopo l'inoculazione

Riferimenti

  1. American College of Obstetricians and Gynecologists’ Committee on Practice Bulletins—Obstetrics. Practice bulletin no. 171: Management of preterm labor. Obstet Gynecol. 128, e155-e164 (2016).
  2. Vogel, J. P., Chawanpaiboon, S., Moller, A. B., Watananirun, K., Bonet, M., et al. The global epidemiology of preterm birth. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 52, 3-12 (2018).
  3. Svenvik, M., et al. Early prediction of spontaneous preterm birth before 34 gestational weeks based on a combination of inflammation-associated plasma proteins. Front Immunol. 15, 1415016-1415028 (2024).
  4. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of under-5 mortality in 2000–15: An updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet. 388, 3027-3035 (2016).
  5. Saigal, S., Doyle, L. W. An overview of mortality and sequelae of preterm birth from infancy to adulthood. Lancet. 371, 261-269 (2008).
  6. Liang, S., et al. Development of a spontaneous preterm birth predictive model using a panel of serum protein biomarkers for early pregnant women: A nested case-control study. Int J Gynaecol Obstet. 168, 701-708 (2025).
  7. Bradley, E., et al. Born too soon: Global epidemiology of preterm birth and drivers for change. Reprod Health. 22, 105-119 (2025).
  8. Hodek, J. M., von der Schulenburg, J. M., Mittendorf, T. Measuring economic consequences of preterm birth: Methodological recommendations for the evaluation of personal burden on children and their caregivers. Health Econ Rev. 1 (1), 6 (2011).
  9. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: One syndrome, many causes. Science. 345, 760-765 (2014).
  10. Goldenberg, R. L., et al. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
  11. Combs, C. A., et al. Amniotic fluid infection, inflammation, and colonization in preterm labor with intact membranes. Am J Obstet Gynecol. 210, 125.e1-125.e15 (2014).
  12. Mendz, G. L., Kaakoush, N. O., Quinlivan, J. A. Bacterial aetiological agents of intra-amniotic infections and preterm birth in pregnant women. Front Cell Infect Microbiol. 3, 58-64 (2013).
  13. Semmes, E. C., Coyne, C. B. Innate immune defenses at the maternal-fetal interface. Curr Opin Immunol. 74, 60-67 (2022).
  14. Han, Y. W., Wang, X. Mobile microbiome: Oral bacteria in extra-oral infections and inflammation. J Dent Res. 92, 485-491 (2013).
  15. Ide, M., Papapanou, P. N. Epidemiology of association between maternal periodontal disease and adverse pregnancy outcomes—systematic review. J Periodontol. 84, S181-S194 (2013).
  16. Offenbacher, S., et al. Periodontal infection as a possible risk factor for preterm low birth weight. J Periodontol. 67, 1103-1113 (1996).
  17. Jeffcoat, M. K., et al. Periodontal infection and preterm birth: Results of a prospective study. J Am Dent Assoc. 132, 875-880 (2001).
  18. Siqueira, J. F., Rôcas, I. N. Microbiology and treatment of acute apical abscesses. Clin Microbiol Rev. 26, 255-273 (2013).
  19. Marchesan, J., et al. TLR4, NOD1 and NOD2 mediate immune recognition of putative newly identified periodontal pathogens. Mol Oral Microbiol. 31, 243-258 (2016).
  20. Georgiou, A. C., Crielaard, W., Armenis, I., de Vries, R., van der Waal, S. V. Apical periodontitis is associated with elevated concentrations of inflammatory mediators in peripheral blood: A systematic review and meta-analysis. J Endod. 45 (11), 1279-1295.e3 (2019).
  21. Harjunmaa, U., et al. Association between maternal dental periapical infections and pregnancy outcomes: Results from a cross-sectional study in Malawi. Trop Med Int Health. 20, 1549-1558 (2015).
  22. Harjunmaa, U., et al. Periapical infection may affect birth outcomes via systemic inflammation. Oral Dis. 24, 847-855 (2018).
  23. Leal, A. S., et al. Association between chronic apical periodontitis and low-birth-weight preterm births. J Endod. 41, 353-357 (2015).
  24. León, R., et al. Detection of Porphyromonas gingivalis in the amniotic fluid in pregnant women with a diagnosis of threatened premature labor. J Periodontol. 78, 1249-1255 (2007).
  25. Sanz, M., et al. Periodontitis and cardiovascular diseases: Consensus report. J Clin Periodontol. 47, 268-288 (2020).
  26. Robertson, S. A., et al. Targeting Toll-like receptor-4 to tackle preterm birth and fetal inflammatory injury. Clin Transl Immunol. 9, e1121-e1139 (2020).
  27. Peng, J., et al. miR-199a-3p suppresses cervical epithelial cell inflammation by inhibiting the HMGB1/TLR4/NF-κB pathway in preterm birth. Mol Med Rep. 22, 926-938 (2020).
  28. Shen, Z., et al. Protective effects of syringin against oxidative stress and inflammation in diabetic pregnant rats via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 131, 110681-110690 (2020).
  29. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: Suggested assessment and reporting guidelines. Biol Reprod. 99, 922-937 (2018).
  30. Ao, M., et al. Dental infection of Porphyromonas gingivalis induces preterm birth in mice. PLoS One. 10 (8), e0137249-e0137265 (2015).
  31. Jakovljevic, A., et al. The association between apical periodontitis and adverse pregnancy outcomes: A systematic review. Int Endod J. 54 (9), 1527-1537 (2021).
  32. Khalighinejad, N., Aminoshariae, A., Kulild, J. C., Mickel, A. Apical periodontitis, a predictor variable for preeclampsia: A case-control study. J Endod. 43 (10), 1611-1614 (2017).
  33. Venugopal, B., Narasimman, H., Mahalingam, A., Naren Kishore, R., Jayavel, K., et al. Systemic health associations of apical periodontitis: A systematic review of observational studies. Cureus. 17 (10), e95273 (2025).
  34. Liang, S., et al. Periodontal infection with Porphyromonas gingivalis induces preterm birth and lower birth weight in rats. Mol Oral Microbiol. 33 (4), 312-321 (2018).
  35. Lin, D., et al. Porphyromonas gingivalis infection in pregnant mice is associated with placental dissemination, an increase in the placental Th1/Th2 cytokine ratio, and fetal growth restriction. Infect Immun. 71 (9), 5163-5168 (2003).
  36. Han, Y. W., et al. Fusobacterium nucleatum induces premature and term stillbirths in pregnant mice: Implication of oral bacteria in preterm birth. Infect Immun. 72 (4), 2272-2279 (2004).
  37. Liu, H., et al. Fusobacterium nucleatum induces fetal death in mice via stimulation of TLR4-mediated placental inflammatory response. J Immunol. 179 (4), 2501-2508 (2007).
  38. Chan, E., et al. Identification of Fusobacterium nucleatum in formalin-fixed, paraffin-embedded placental tissues by 16S rRNA sequencing in a case of extremely preterm birth secondary to amniotic fluid infection. Pathology. 51 (3), 320-322 (2019).
  39. Habelrih, T., Augustin, T. L., Mauffette-Whyte, F., Ferri, B., Sawaya, K., et al. Inflammatory mechanisms of preterm labor and emerging anti-inflammatory interventions. Cytokine Growth Factor Rev. 78, 50-63 (2024).
  40. Gomez-Lopez, N., Romero, R., Plazyo, O., Panaitescu, B., Furcron, A. E., et al. Intra-amniotic administration of HMGB1 induces spontaneous preterm labor and birth. Am J Reprod Immunol. 75 (1), 3-7 (2016).
  41. Wang, S., Ma, L., Ji, J., Huo, R., Dong, S., et al. Protective effect of soy isolate protein against streptozotocin induced gestational diabetes mellitus via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 168, 115688 (2023).
  42. Reyes, L., et al. Porphyromonas gingivalis and adverse pregnancy outcome. J Oral Microbiol. 10 (1), 1374153 (2017).
  43. Aagaard, K., et al. The placenta harbors a unique microbiome. Sci Transl Med. 6 (237), 237ra65 (2014).
  44. Kuperman, A. A., et al. Deep microbial analysis of multiple placentas shows no evidence for a placental microbiome. BJOG. 127 (2), 159-169 (2020).
  45. Einenkel, R., et al. Less is more! Low amount of Fusobacterium nucleatum supports macrophage-mediated trophoblast functions in vitro. Front Immunol. 15, 1447190 (2024).

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