Costruzione di modelli efficienti di blastocisti murini derivati da cellule staminali per studi ambientali

Summary

Questo protocollo descrive la generazione e l'analisi degli iGATA4-blastoidi, un modello scalabile basato su cellule staminali che riproduce caratteristiche chiave del blastocisti del topo, inclusa l'organizzazione della linea di discendenza e la cavitazione, e consente una valutazione riproducibile e ad alto rendimento delle perturbazioni ambientali e molecolari che influenzano lo sviluppo embrionale precoce.

Abstract

I modelli embrionali basati su cellule staminali offrono una piattaforma potente per indagare lo sviluppo precoce dei mammiferi e la loro sensibilità alle perturbazioni ambientali. Qui viene presentato un protocollo robusto e accessibile per generare blastoidi di topo ad alta fedeltà utilizzando cellule staminali embrionali (ESC), cellule staminali trofoblastiche (TSC) e cellule staminali embrionali ingegnerizzate per l'espressione indutibile di GATA4 (iGATA4-ESC). Questo sistema produce blastoidi iGATA4 che riproducono con precisione la morfologia naturale dei blastocisti E4.5, le proporzioni di linea e le firme trascrizionali, fornendo un modello in vitro affidabile dei compartimenti primitivi dell'endoderma (PE), dell'epiblasto (EPI) e del trofetectoderma (TE). Questo protocollo dimostra innanzitutto come mantenere e preparare le tre popolazioni di cellule staminali necessarie alla formazione del blastoide. Viene quindi delineato l'assemblaggio passo dopo passo degli iGATA4-blastoidi in condizioni di coltura pre-impianto, evidenziando parametri sperimentali critici. Per consentire una caratterizzazione rigorosa, viene fornito un flusso di lavoro testato per la fissazione, la colorazione e l'imaging del blastoide. Infine, viene presentato un esempio che dimostra come i blastoidi iGATA4 possano essere utilizzati per saghi ad alta produttività. Esponendo ampie coorti di blastoidi a fattori ambientali definiti, i cambiamenti nella morfologia, nell'allocazione della linea e nella progressione dello sviluppo possono essere quantificati rapidamente e in modo riproducibile. Insieme, questo protocollo stabilisce una piattaforma scalabile per modellare lo sviluppo pre-impianto, analizzare le prime decisioni di linea e eseguire screening multiparametrici per valutare le influenze ambientali o molecolari sulla formazione di blastocisti.

Introduction

Comprendere come gli embrioni dei mammiferi precoci si auto-assemblano e come fattori ambientali comuni possano influenzarne negativamente la formazione richiede sistemi modello riproducibili, accessibili sperimentalmente e scalabili. Modelli integrati simili a embrioni generati combinando cellule staminali embrionali ed extraembrionali forniscono tale^{piattaforma 1,2}. Questo protocollo descrive come le cellule staminali embrionali (ESC), le cellule staminali trofoblastiche (TSC) e le ESC ingegnerizzate per l'espressione inducibile di GATA4 (iGATA4-ESC) possano essere assemblate in condizioni pre-impianto per produrre blastoidi con linee robuste e correttamente proporzionate di endoderma primitivo (PE), epiblasto (EPI) e trofetectoderma (TE). Lavori recenti hanno dimostrato che queste strutture, denominate^{iGATA4-blastoidi 3}, somigliano al blastocisto E4.5 per proporzioni di linea, firme trascrizionali ed espressione dei marcatori funzionali. Quando coltivate in vitro, il 12,5% di queste strutture passa alla morfologia post-impianto. È importante sottolineare che sono adatti a screening tossicologici e ambientali.

Lo sviluppo di questa tecnica fu motivato dalle limitazioni dei sistemi blastoidali^{preesistenti 2,4,5}. Sebbene molti protocolli 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 generano strutture cavitate simili a blastocisti primitivi, la maggior parte lo fa con efficienza relativamente bassa o produce strutture con formazione incompleta di PE, identità cellulari indefinite o proporzioni di linea errate. Queste incongruenze ne riducono l'idoneità per studi meccanicistici e schermate di perturbazione ad alta produttività. Poiché la specifica PE in vivo segue l'attivazione di GATA6, SOX17, GATA4 e^SOX72, e difetti sia nel PE che nel suo derivato, l'endoderma viscerale (VE), compromettono lo sviluppo peri-impianto 23,24,25,26,27, rafforzando questo programma trascrizionale in vitro Migliora la fedeltà del blastoide. Gli ESC che portano un transgene GATA4 condizionato si trasdifferenziano in modo robusto in VE e, quando combinati con ESC e TSC in condizioni post-impianto, generano modelli embrionali integrati che gastrulano e avviano l'organogenesi 28,29,30,31. Qui, questo principio è adattato alle condizioni pre-impianto, dimostrando che gli iGATA4-ESC generano in modo affidabile PE e producono blastoidi che somigliano molto ai blastocisti^{naturali 3}.

Questo metodo supera le limitazioni precedenti nella modellazione dei blastocisti utilizzando cellule staminali e offre un'elevata efficienza nella formazione di blastoidi (l'80% delle strutture formate sono blastoidi, il 75% delle quali dimostra una corretta organizzazione e proporzioni della linea) e un'elevata somiglianza embrionale. Inoltre, l'assemblaggio modulare di iGATA4-blastoidi, in cui ogni linea di blastocisti deriva da una popolazione di cellule staminali coltivate indipendentemente, fornisce accesso sperimentale diretto a ciascun compartimento embrionale. Queste proprietà rendono il sistema particolarmente adatto per applicazioni di screening multiparametrico. Poiché produce grandi coorti di strutture morfologicamente coerenti con linee TE, EPI ed PE proporzionate con precisione, consente perturbazioni parallele e quantificazione di risposte specifiche per linea con una potenza statistica irraggiungibile utilizzando embrioni naturali.

Come prova di principio, sono stati misurati gli effetti di fattori ambientali comuni presentati a intervalli^{fisiologici 32,33,34,35,36,37,38} sullo sviluppo del blastoide. L'impatto delle modifiche di caffeina, nicotina, etanolo e amminoacidi sul tasso di cavitazione, morfologia, fitness e proporzioni di linea di sangue è stato valutato su una gamma di concentrazioni e finestre di trattamento temporale. La maggior parte delle condizioni (caffeina, etanolo, nicotina e quelle che imitano diete a basso contenuto proteico) ha portato a formazione aberrante di blastoidi e a una qualità strutturale compromessa. Al contrario, aumentare la concentrazione di amminoacidi a catena ramificata (simile alle diete ad alto contenuto proteico) migliorò l'efficienza e la qualità della formazione dei blastoidi. Questi risultati rispecchiano gli effetti osservati in vitro-colture di blastocisti naturali^{di topo 3}, dimostrando che questo sistema cattura fenotipi sottili e dipendenti dalla dose e supporta canali di screening scalabili e multidimensionali, non fattibili con embrioni naturali.

Nel contesto più ampio della modellazione embrionale, questa tecnica dimostra che le stesse cellule utilizzate per modellare lo sviluppo integrato post-impianto possono essere impiegate anche come modelli pre-impianto. Questo metodo è particolarmente adatto per applicazioni che richiedono modellazione scalabile di strutture simili a blastocisti con formazione accurata di PE e integrazione robusta delle linee. Tuttavia, come in altri modelli basati su cellule staminali di blastocisti di topo, i blastoidi iGATA4 non si impiantano e si sviluppano ulteriormente dopo il trasferimento su un topo ospite e quindi non sono adatti per studi sulle interazioni embrione–madre. Nel complesso, questo protocollo fornisce un approccio affidabile e accessibile per generare blastoidi ad alta fedeltà che modellano le decisioni precoce sui tipi cellulari nell'embrione dei mammiferi.

Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo coinvolgono linee cellulari consolidate e sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali di biosicurezza del California Institute of Technology. Non fu condotto alcun lavoro su animali vivi o soggetti umani.

Sono state testate più linee ESC e TSC che supportano la formazione iGATA4-blastoide. ESC, iGATA4-ESC e TSC di studi^{precedenti 28} sono stati utilizzati con successo per completare tutti i passaggi descritti in questo protocollo. Gli stessi autori descrivono la generazione di iGATA4-ESC da una linea ESC di mouse CD1 (ICR) già esistita.

I TSC vengono coltivati sopra fibroblasti embrionali (MEF) disponibili in commercio. Tutti i prodotti chimici, reagenti, kit, apparecchiature e software utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura di cellule staminali di topo per la formazione di blastoidi

1. Preparazione delle piastre di alimentazione MEF
   1. Ricoprire una piastra di coltura cellulare a 6 pozzi con 1,5 mL di gelatina allo 0,2% (p/v) in acqua deionizzata (DI) per pozzo. Incubare a 37 °C in normoxia per almeno 45 minuti.
   2. Durante l'incubazione, preparare un tubo centrifuga da 15 mL con 4 mL di mezzo FC (Tabella 1) preriscaldato a 37 °C.
   3. Scongelare la fiala MEF in un bagno d'acqua usando un movimento a otto finché non rimane solo una piccola sfera di ghiaccio. Trasferisci il contenuto nel tubo preparato, poi pipetta su e giù per mescolare bene. Centrifuga a 500 × g per 4 minuti.
   4. Aspirare il sovrantantante e risospendere il pellet in 1 mL di mezzo FC. Regolare a un volume sufficiente per impiegare ~160.000 celle per pozzo in 1,5 mL per pozzo.
   5. Aspirare la gelatina e imporre 1,5 mL di MEF per pozzo. Incubare in normoxia durante la notte senza disturbi.
   6. Sostituisci il mezzo con un mezzo fresco di 1,5 mL per pozzo il giorno successivo. Cambia il mezzo ogni 48 ore. Usa i MEF 2–7 giorni dopo la piastratura. I MEF possono rimanere sani più a lungo, ma la loro capacità di sostenere la crescita del TSC potrebbe essere compromessa.

ATTENZIONE: Eseguire tutte le colture cellulari di topo in armadietti a flusso laminare di livello di biosicurezza (BSL) 1 utilizzando la tecnica BSL-2.

2. Scongelamento e passaggio di cellule staminali embrionali di topo (WT ESC e iGATA4-ESC)
   1. Scongelare gli ESC WT o iGATA4-ESC seguendo i passaggi 1.1.1–1.1.3. Dopo la centrifugazione, risospendere le celle in 1 mL di mezzo N2B27/2i/LIF (Tabella 1) e seminare ~50.000 celle per pozzo in una piastra a 6 pozzi rivestita di gelatina con ~1,5 mL per pozzo. Incubare a 37 °C in normoxia e cambiare terreno ogni 48 ore.
   2. Assicurati che le colonie siano ben compatte e rotonde, con sporgenze minime prima del passaggio. Passaggio ogni 2–3 giorni.
      NOTA: Le ESC WT e le iGATA4-ESC sono morfologicamente indistinguibili fino all'induzione con doxiciclina (DOX).
   3. Rivestire una piastra a 6 pozzi con 1,5 mL di gelatina allo 0,2% in acqua DI per pozzo. Incubare a 37 °C per almeno 45 minuti.
   4. Aggiungi 500 μL di reagente di dissociazione cellulare per pozzo e incuba per 3 minuti. Aggiungi 2 mL di medium FC mentre pipetti delicatamente intorno ai bordi. Conferma > distacco del 90% al microscopio. Se le cellule restano attaccate, pipetta delicatamente per facilitare la risospensione.
   5. Trasferire la sospensione a celle in un tubo centrifugo da 15 mL e centrifugare a 500 × g per 4 minuti.
   6. Aspirare il soprandanante e risospendere il pellet in 1 mL di mezzo N2B27/2i/LIF. Determinare la concentrazione cellulare usando 10 μL su un emocitometro. Regolare il volume per produrre un seed ~50.000 cellule per pozzo.
   7. Aspira la gelatina e semina le cellule. Incubare in normoxia. Cambia media il giorno successivo e ogni 48 ore da allora.
3. Scongelamento e passaggio di cellule staminali trofoblastiche (TSC) di topo
   1. Scongelare i TSC seguendo i passaggi 1.1.1–1.1.3. Dopo la centrifugazione, risospendere le celle in 1 mL di mezzo TSF4H (Tabella 1) e seminare ~20.000 celle per pozzo in una piastra a 6 pozzi rivestita con MEF. Incubare a 37 °C, 5% CO₂, 5% O₂ (ipossia) e cambiare il mezzo ogni 24 ore.
   2. Assicurarsi che le colonie siano grandi (>75 μm di diametro) e appiattite prima del passaggio. Aggiungi 500 μL di reagente di dissociazione cellulare per pozzo e incuba per 5 minuti. Aggiungi 2 mL di medium FC mentre pipettassi delicatamente. Conferma >distacco del 90%.
   3. Trasferire le celle in un tubo centrifugo e far girare a 500 × g per 4 minuti.
   4. Risospendere in 1 mL TSF4H medio. Determina la concentrazione e aggiusta a ~20.000 celle per pozzo.
   5. Implacare i MEF e incubare in ipossia. Cambia il mezzo ogni 24 ore e il passaggio ogni 2–3 giorni prima della fusione della colonia.

2. Formazione degli iGATA4-blastoidi

1. Preparazione della piastra di aggregazione microwell per l'aggregazione cellulare
   1. Aggiungi 500 μL di soluzione di risciacquo antiaderente a ciascun pozzo di una piastra di aggregazione Microwell. Centrifugare a 2.000 × g per 5 minuti con il giusto bilanciamento per rimuovere l'aria intrappolata dai micropozzi. Incubare a 37 °C in normoxia per almeno 1 ora o per tutta la notte.
2. Preparazione blastoide, giorno 0 — Preparazione e implaccatura dei WT e iGATA4-ESC
   1. Mezzi preriscaldati N2B27/2i/LIF, FC e FCYL (FC + 10 ng/mL LIF ricombinante di topo (mLIF) + inibitore ROCK Y27632 a 2 μM) fino a 37 °C. Prepara gelatina allo 0,2% in acqua DI e tieni pronto il reagente di dissociazione cellulare.
   2. Aspira la soluzione antiaderente senza toccare il fondo del pozzo. Lavare due volte con 1 mL PBS e una volta con 1 mL di medium FCYL. Fai una pipetta lungo la parete per evitare di danneggiare i micropozzi.
   3. Preparare una piastra a 6 pozzi rivestita di gelatina (incubazione ≥45 min) per le cellule di passaggio.
   4. Raccogliere WT e iGATA4-ESC aspirando il mezzo e aggiungendo un reagente di dissociazione cellulare da 500 μL per pozzo. Incubare per 3 minuti a 37 °C. Aggiungi 2 mL di FC medium e pipetta delicatamente. Confermare distacco completo al microscopio. Trasferisci in un tubo da 15 mL e centrifuga a 500 × g per 4 minuti.
   5. Risospendere in mezzo FCYL da 1 mL. Determinare la concentrazione cellulare usando 10 μL su un emocitometro. Regolare a 500.000–700.000 celle/mL. Calcola il volume necessario per 5 ESC WT e 5 iGATA4-ESC per micropozzo (6.000 celle per pozzo).
      NOTA: Ottimizza per altre linee ESC se necessario. Un intervallo di partenza è di 4–7 ESC per micropozzo con un rapporto 1:1 tra ESC e iGATA4-ESC.
   6. Preparare 500 μL di sospensione a celle per pozzo. Aggiungere goccia alla piastra di aggregazione Microwell usando una pipetta da 1000 μL. Centrifugare a 100 × g per 3 minuti e verificare la distribuzione uniforme. Incubare per 6 ore finché non si formano gli aggregati.
   7. Passaggio degli ESC rimanenti come descritto nella Sezione 1.2.
3. Preparazione blastoide, giorno 0 — Preparazione del medium TX
   1. Prepara un mezzo basale TX di ~20 mL usando DMEM/F12 (Tabella 2). Preparati fresco per ogni esperimento.
      1. Aggiungi 200 μL e 200 mM di integratore L-alanyl-L-glutamina (2 mM finali). Conserva il stock a 4 °C.
      2. Aggiungere 200 μL 10.000 U/mL di penicillina/streptomicina (finale 100 U/mL ciascuno). Conserva a −20 °C.
      3. Aggiungi 40 μL 32 mg/mL di L-ascorbico (finale 64 μg/mL). Preparare in acqua DI, filtrare sterilizzare e conservare a −20 °C.
      4. Aggiungi 20 μL di selenite di sodio (finale 14 ng/mL). Preparare e conservare a −20 °C.
      5. Aggiungere 240 μL di NaHCO₃ (finale 543 μg/mL). Mescola bene dopo lo scongelamento.
      6. Aggiungere 20 μL di olo-transferrina (finale 10,7 μg/mL). Mescola dopo lo scongelamento.
      7. Aggiungi ~37,5 μL di insulina (finale 19,4 μg/mL; dipendente da lotto). Conserva a 4 °C.
   2. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere Y27632 a una concentrazione finale di 20 μM, CHIR99021 a 3 μM, IL-11 a 30 ng/mL, FGF4 a 25 ng/mL, eparina a 1 μg/mL, mLIF a 10 ng/mL, TGFβ a 15 ng/mL e 8Br-cAMP a 25 μM.
4. Preparazione blastoide, giorno 0 — Preparazione e impiccatura dei TSC
   1. Pre-riscaldamento TSF4H, FC (Tabella 1) e media TX (Sezione 2.3). Preparare le lastre rivestite di gelatina (≥45 min) per l'esaurimento del MEF.
   2. Prelevare i TSC aggiungendo un reagente di dissociazione cellulare di 500 μL per pozzo e incubando per 5 minuti in ipossia. Aggiungi 2 mL di FC medium e pipetta delicatamente. Conferma distacco. Trasferisci in un tubo e centrifuga a 500 × g per 4 minuti.
      NOTA: I TSC coltivati >4 giorni possono richiedere fino a 10 minuti di trattamento con reagente di dissociazione cellulare.
   3. Sospendi con un mezzo TSF4H da 1 mL e regola al volume appropriato per la placcatura a una divisione 1:2.
   4. Placcare pozzi rivestiti di gelatina per l'esaurimento del MEF. Incubare ~45 min in ipossia. Assicurati che i MEF si attacchino mentre i TSC rimangono per lo più non attaccati.
   5. Sostituire il mezzo da 900 μL dai pozzi di aggregazione a piastre micropozzi con un mezzo TX da 500 μL. Ritorno all'ipossia.
   6. Trasferire il sovrandante contenente TSC in un tubo senza disturbare i MEF attaccati. Determinare la concentrazione (obiettivo 500.000–700.000 cellule/mL).
   7. Calcolare il volume per 12 TSC per micropozzo (14.400 celle per pozzo). Centrifuga se è necessaria una concentrazione aggiuntiva.
      NOTA: Ottimizzare per altre linee TSC (10–15 celle per micropozzo raccomandato).
   8. Aggiungi sospensioni a celle da 500 μL per pozzo a caduta. Centrifuga a 100 × g per 3 minuti. Confermare la distribuzione e incubare in ipossia per 24 ore.
   9. Passare i TSC rimanenti secondo necessità (Sezione 1.3).
5. Preparazione blastoide, giorno 1 — Induzione
   1. Circa 24 ore dopo l'aggiunta del TSC, aggiungere 20 μL di 5 mM 8Br-cAMP e 1 μL di 1 μg/mL DOX per pozzo. Incubare per 48–72 ore in caso di ipossia.
6. Preparazione blastoide, giorno 3 — Fissazione
   1. Sospendere gli aggregati utilizzando una punta di pipetta tagliata da 1000 μL. Trasferisci in tubi da 2 mL e lascia sedimentare per 5 minuti.
   2. Rimuovere il sovrantantante e aggiungere 250 μL di paraformaldeide (PFA) al 4%. Risospendi delicatamente.
      ATTENZIONE: Maneggiare il PFA in una cappa con DPI appropriati.
   3. Incubare 15 minuti, scattando ogni 5 minuti.
   4. Rimuovere il PFA e aggiungere 300 μL di PBST (PBS + 0,1% Tween-20). Mescola delicatamente. Conserva a 4 °C per <1 settimana prima di tingere.
7. Immunofluorescenza dei blastoidi
   1. Trasferire 150 μL per campione su una piastra a U a 96 pozzi.
   2. Aggiungi un buffer di permeabilizzazione da 100 μL e incuba per 20 minuti. Sostituire con una soluzione primaria di anticorpi e incubare durante la notte a 4 °C.
   3. Lavare 3× con PBST (5 min ciascuno). Aggiungi anticorpi secondari.
   4. Incubare 2 ore a temperatura ambiente al buio.
   5. Lava 3× e trasferisci nel piatto per l'imaging.
   6. Immagine usando microscopia confocale (≥25× obiettivo, NA ≥0,8).

3. Schermi ad alta produttività utilizzando il modello iGATA4-blastoid

1. Preparazione e test dei fattori ambientali per iGATA4-blastoidi
   1. Preparare la piastra di aggregazione dei micropozzi come descritto nella Sezione 2.1 e generare iGATA4-blastoidi seguendo le Sezioni 2.2–2.4. Preparare pozzi sufficienti, inclusi i controlli appropriati. Includere un controllo a vuoto (blastoidi preparati secondo il protocollo standard), un controllo portante e una o più condizioni sperimentali.
   2. Incubare blastoidi durante la notte in ipossia. Circa 24 ore dopo la semina del TSC, preparare il mezzo TX integrato con 8Br-cAMP, doxiciclina (DOX) e il composto di interesse (o controllo dei portatori). Sono state testate le seguenti condizioni:
      1. Caffeina: 3,5 mg/L, diluita da scorte d'acqua ultrapura.
      2. Nicotina: 330 ng/L, diluita da stock al 100% etanolo (EtOH).
      3. Etanolo: 17 mM, diluito dall'EtOH assoluto.
      4. Amminoacidi ad alta catena ramificata (BCAA): +5%, +25%, +50% rispetto alle concentrazioni basali (0,45 mM L-leucina, 0,45 mM L-valina, 0,42 mM L-isoleucina), preparati da stock concentrati in acqua ultrapura.
      5. Metionina e leucina basse: −5%, −25%, −50%, −100% rispetto alle concentrazioni basali (0,12 mM L-metionina, 0,45 mM L-leucina), preparati usando DMEM/F12 senza Met/Leu. Il DMEM senza Met/Leu (LM-DMEM) viene integrato con 1x Ham's F-12 Nutrient Mix prima dell'uso.
         ATTENZIONE: Prepara e maneggia scorte concentrate di caffeina e nicotina in una cappa fumaria utilizzando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata (DPI; guanti, camice da laboratorio, protezione per gli occhi). L'etanolo è infiammabile e deve essere tenuto lontano dalle fonti di calore.
   3. Aspira il mezzo da ogni pozzo e aggiungi 1 mL di mezzo TX contenente composto. Lavora un pozzo alla volta per evitare l'asciugatura. Riportare il piatto nell'incubatore per ipossia e coltura fino al terzo giorno.
   4. Cattura immagini rappresentative del campo chiaro al terzo giorno utilizzando un microscopio a luce trasmessa. Fissare le strutture ed eseguire l'immunofluorescenza come descritto nelle Sezioni 2.6 e 2.7.
      NOTA: Regola le finestre di trattamento in base all'obiettivo sperimentale. I trattamenti possono essere applicati durante l'aggregazione precoce (giorno 1) o nelle fasi successive (ad esempio, espansione della carie). Esempi di finestre includono il giorno 1–3, il giorno 1–2 (seguito dalla sostituzione del supporto) e il giorno 2–3.
2. Analisi multiparametrica iGATA4-blastoide
   1. Utilizzare immagini in campo chiaro per quantificare la percentuale di pozzi contenenti strutture cavitate (cioè strutture con una cavità centrale chiaramente definita) e misurare il diametro del blastoide.
      1. Immagini aperte nel software di analisi delle immagini.
      2. Usa lo strumento a linea retta per tracciare una linea attraverso ogni struttura.
      3. Misura il diametro usando Analizza > Misura.
   2. Selezionare campioni immunocolorati rappresentativi (20–40 strutture per replica biologica, con almeno tre repliche biologiche per condizione) e l'immagine come descritto nella Sezione 2.7.
   3. Quantificare il numero totale di cellule e la composizione della linea di discendenza utilizzando marcatori di immunofluorescenza: TE (CDX2-positivo), EPI (SOX2-positivo e SOX17-negativo) e PE (SOX17-positivo).
   4. Valutare l'organizzazione strutturale e la morfologia determinando se le cellule PE sono separate spazialmente dalle celle EPI all'interno della massa delle cellule interne (ICM) (classificazione binaria: sì/no).
   5. Classificare la morfologia come buona (struttura chiara simile a un blastocisti con cavità definita e compartimenti TE, EPI ed PE ben organizzati), mediocri (anomalie minori come forma irregolare o cavità parzialmente formata) o negativa (anomalie maggiori come assenza di cavità o linee di discendenza disorganizzate/non ordinate).
   6. Quantificare parametri aggiuntivi, inclusi la dimensione o il volume della cavità, dove applicabile. Utilizzare strumenti bioinformatici o altri strumenti per tracciare e analizzare statistica, e software di analisi delle immagini 3D per il conteggio delle cellule e/o la preparazione delle immagini per la visualizzazione.

Results

Mantenere le ESC e le iGATA4-ESC (normoxia) e TSC (ipossia) in condizioni di coltura appropriate è essenziale per una generazione blastoidale di successo. Quando coltivati come descritto, gli ESC e gli iGATA4-ESC dovrebbero essere in gran parte indistinguibili, formando colonie di medie dimensioni, rotonde e ben definite dopo 3 giorni. L'aspetto di colonie appiattite o bordi sporgenti indica una differenziazione incipiente, e tali colture non dovrebbero essere utilizzate per la formazione di blastoidi. I TSC dovrebbero formare colonie epiteliali piatte con bordi leggermente rialzati e centri più piatti. Colonie di TSC cresciute o in fusione (tipicamente dopo >3 giorni di coltura) spesso portano a risultati blastoidi negativi (Figura 1).

Durante l'assemblaggio del blastoide iGATA4, diversi primi segni indicano il successo del protocollo (Figura 2A, B). Circa 6 ore dopo l'aggregazione di ESC e iGATA4-ESC, gli aggregati cellulari stretti dovrebbero essere visibili sul fondo dei micropozzi. Gli aggregati sciolti suggeriscono un'eccessiva esposizione ai reagenti di dissociazione cellulare, che riduce l'adesione cellula-cellula. Progressione al passo successivo (aggiunta del TSC; Sezione 2.4) dovrebbe verificarsi solo una volta osservati aggregati stretti (Figura 2B, punto temporale D0.5). L'immunocolorazione in questa fase dovrebbe mostrare aggregati omogenei SOX2⁺ e GATA4⁻ (Figura 2B, punto temporale D0.5).

Dopo l'aggiunta di TSC e l'incubazione notturna, dovrebbe essere evidente un singolo aggregato coesivo circondato da celle CDX2⁺ (Figura 2B). La presenza di grandi cellule non aggregate sulla superficie degli aggregati spesso indica residui di MEF. La contaminazione da MEF può ridurre l'efficienza della formazione di blastoidi; pertanto, un adeguato esaurimento del MEF è fondamentale per ottenere una popolazione prevalentemente TSC prima dell'aggregazione. Un filtratore per celle da 40 μm può essere utilizzato per rimuovere i residui di MEF, anche se ciò può ridurre la resa del TSC. Una copertura CDX2⁺ incompleta o eccessiva può essere corretta regolando il numero di TSC aggiunti per micropozzo (intervallo raccomandato: 10–15).

Dopo l'aggiunta di DOX e 8Br-cAMP, le carie si osservano tipicamente entro il secondo giorno e possono persistere fino al terzo giorno. Sotto la microscopia a campo chiaro, le cavità appaiono come spazi chiari e vuoti all'interno dei blastoidi (Figura 2B, C; linea tratteggiata bianca). Le celle GATA4⁺ appaiono poco dopo l'induzione di DOX e vengono progressivamente selezionate sulla superficie del compartimento simile all'ICM (Figura 2B). La formazione di blastoidi di successo è caratterizzata da un'elevata efficienza di cavitazione (tipicamente ~80% delle strutture per piastra di aggregazione micropozzo; Figura 2D), un epitelio esterno a singolo strato simile a TE CDX2⁺, una cavità simile a un blastocoel e un compartimento arrotondato simile a un ICM contenente cellule simili a EPI SOX2⁺ sovrapposte da cellule simili GATA4⁺ simili a PE (Figura 2C–E).

Gli esiti subottimali comuni includono strutture non cavitate, blastoidi di forma irregolare con cavità multiple o compartimenti simili a ICM, e pozzi contenenti poche strutture o detriti cellulari. Sebbene si preveda circa il 20% di strutture anomale (Figura 2C), tassi più alti possono indicare problemi come una preparazione errata del mezzo TX, scarsa qualità della cella iniziale, mancata aggiunta di DOX o 8Br-cAMP al giorno 1, o spostamento delle strutture durante i cambi di mezzo.

Per applicazioni di screening ad alta produttività, i pozzi non trattati e quelli di controllo dei veicoli dovrebbero fornire blastoidi paragonabili alle condizioni di controllo positivo (Figura 3A,B). I trattamenti sperimentali possono influenzare molteplici metriche di qualità, tra cui la dimensione del blastoide (Figura 3C), l'efficienza della cavitazione, il numero totale e specifico di cellule per linea di discendenza (Figura 3D), l'ordinamento PE e la morfologia complessiva (Figura 3E). Ad esempio, il trattamento con caffeina, nicotina o etanolo durante la formazione del blastoide ha portato a strutture più piccole con ridotta efficienza di cavitazione, minori numeri totali o ICM di cellule, compromesso nell'ordinamento delle PE e morfologia più peggiore. Al contrario, concentrazioni crescenti di amminoacidi a catena ramificata hanno prodotto blastoidi più grandi e fortemente cavitati, con un numero cellulare aumentato e una morfologia migliorata (Figura 3C–E). È prevista una variabilità biologica tra gli esperimenti, evidenziando l'importanza di includere sia i controlli vuoti che quelli dei portatori in ciascun esperimento.

Figura 1: Esempi di WT ESC, iGATA4-ESC e TSC di buona e scarsa qualità. Micrografie a campo chiaro di WT ESC, iGATA4-ESC e TSC che mostrano le morfologie attese delle colonie dopo 2–3 giorni di coltura in N2B27/2i/LIF (ESC) o in mezzo TSF4H (TSC). Il panel intitolato "WT ESCs – scarsa qualità" mostra cellule con morfologia subottimale, incluse colonie appiattite con bordi sporgenti (punte di freccia rosse). Il pannello "TSC sovraccresciuto" mostra colonie TSC fuse e ingrandite dopo 4 giorni di coltura. Barra di scala: 100 μm per tutti i pannelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Morfologia schematica e attesa degli iGATA4-blastoidi. Ristampato da Developmental Cell, Vol. 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S et al., Modelli embrionali muscolari efficienti derivati da cellule staminali per studi ambientali, pp. 193–207.e6, Copyright (2025)³, con permesso di Elsevier. (A) Rappresentazione schematica dello sviluppo naturale di blastocisti topini (in alto) e modellazione di blastocisti basata su cellule staminali utilizzando WT ESC, iGATA4-ESC e TSC.
(B) Micrografie che mostrano la morfologia attesa e l'espressione dei marcatori in diverse fasi del protocollo. Proiezione di massima intensità (MIP); Linee tratteggiate delimitano la cavità. Barra di scala: 20 μm. (C) Immagine in campo chiaro di blastoidi iGATA4 al giorno 3. Barra di scala: 100 μm.
(D) Tassi di cavitazione di iGATA4-blastoidi generati utilizzando TSC pre-colti in normoxia o ipossia; Gli aggregati sono stati coltivati in condizioni ipossiche. n ≥ 4; Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. (E) Immunocolorazione di blastocisti E4.5 e blastoidi iGATA4 del giorno 3 per i marcatori di linea (CDX2, ciano; 4 ottobre, rosso; GATA4, verde). Proiezione di massima intensità (MIP); singolo piano Z mostrato dove indicato. Barra di scala: 25 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Effetti dei fattori ambientali sulla formazione e qualità del blastoide. (A) Immagini rappresentative immunofluorescenze 3D (in alto) e ricostruzioni superficiali IMARIS (in fondo) di iGATA4-blastoidi trattati con fattori ambientali (caffeina, nicotina, etanolo e condizioni che imitano diete ad alto contenuto proteico). Barre di scala: 25 μm per tutte le immagini. (B) Schema del flusso di lavoro sperimentale. (C) Diametro del blastoide in condizioni di trattamento diverse. L'intervallo rappresenta il 10° al 90° percentile; le casse indicano l'intervallo interquartile; la linea indica la mediana. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando ANOVA unidirezionale con confronti multipli. (D) Quantificazione del numero totale di cellule (grigi), trofetectodermi (ciano), epiblasti (rossi) e endodermi primitivi (verdi) nei blastoidi di controllo e trattati. Le barre rappresentano la media; Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando ANOVA unidirezionale con confronti multipli. (E) Quantificazione della proporzione di blastoidi classificati come "buoni" (corretta ordinazione della linea con anomalie morfologiche minime), "mediocri" (morfologia in gran parte corretta con anomalie minori, inclusa una classificazione incompleta EPI–PE) o "cattivi" (morfologia gravemente anomala con organizzazione della linea interrotta) sotto condizioni di controllo e trattamento. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando ANOVA bidirezionale rispetto alle condizioni di controllo. Per tutti i pannelli, n ≥ 3. La significatività statistica è indicata come *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Media	Reagente	Concentrazione finale
FC
	DMEM	n.a.
	FBS inattivato dal calore (iFBS)	15%
	GlutaMax	2 mM
	2-Mercaptoetanolo (2-ME)	0,1 mM
	Amminoacidi non essenziali (NEAA)	1x
	Na Pyruvate	1x
	Penicillina–Streptomicina	1x
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	NeurobasalA	50%
	Supplemento B27	1x
	Supplemento N2	0,5x
	2-ME	100 μM
	Penicillina–Streptomicina	1%
	GlutaMax	2 mM
	PD0325901	1 μM
	CHIR99021	3 μM
	LIF ricombinante del mouse	10 ng/mL
TSF4H
	Megacell RPMI-1640 Medium	n.a.
	iFBS	20%
	GlutaMax	2 mM
	Na Pyruvate	1x
	Penicillina–Streptomicina	1x
	FGF4	25 ng/mL
	Eparina	1 μg/mL

Tabella 1: Ricette multimediali per FC, N2B27/2i/LIF e TSF4H. Ricette per preparare media FC, media N2B27/2i/LIF e media TSF4H, con concentrazioni finali.

Componente	Concentrazione finale	Concentrazione delle scorte	Solvente e conservazione	Volume a ~20 mL
8Br-cAMP	25 μM	5 mM	PBS, conservare a -20 °C	100 μL
CHIR99021	3 μM	10 mM	DMSO, conserva a -20 °C	6 μL
DMEM/F12	N/A	N/A	Conservare a 4 °C	20 mL
FGF4	25 ng/mL	100 μg/mL	0,1% BSA in PBS, conservare a -20 °C	5 μL
Integratore L-alanyl-L-glutamina	2 mM	200 mM	Conservare a 4 °C	200 μL
Eparina	1 μg/mL	1 mg/mL	PBS, conservare a -20 °C	20 μL
Olo-transferrina	10,7 μg/mL	10,7 mg/mL	Acqua DI, conservare a -20 °C	20 μL
TGF-β1 umano	15 ng/mL	20 μg/mL	4 mM HCl + 0,1% BSA, conservare a -20 °C	15 μL
IL-11	30 ng/mL	25 μg/mL	0,1% BSA in PBS, conservare a -20 °C	24 μL
Insulina	19,4 μg/mL	9,5 - 11,5 mg/mL	La concentrazione dipende dal lotto, conservare a 4 °C	33,7–40,8 μL, regolare il volume in base alla concentrazione dello stock.
L-acido ascorbico-2-fosfato magnesio	64 μg/mL	32 mg/mL	Acqua DI, conservare a -20 °C	40 μL
LIF ricombinante del mouse	10 ng/mL	10 μg/mL	PBS + 0,1% BSA, conservare a -20 °C	20 μL
NaHCO3	543 μg/mL	45,25 mg/mL	Acqua DI, conservare a -20 °C	240 μL
Penicillina/Streptomicina	1x	100x	Conserva a -20 °C	200 μL
Selenite di sodio	14 ng/mL	14 μg/mL	Acqua DI, conservare a -20 °C	20 μL
Y27632	20 μM	20 mM	DMSO, conserva a -20 °C	20 μL

Tabella 2: Ricetta multimediale per il TX. Ricetta per preparare il materiale TX, con dettagli su come preparare e conservare piccole molecole e altri reagenti, e concentrazioni finali.

Discussion

I blastoidi iGATA4 forniscono un modello altamente efficiente, simile a un embrione, basato su cellule staminali della blastocisti del topo, auto-organizzando tre tipi cellulari in vitro-coltura: ESC, GATA4-ESC indutibili (iGATA4-ESC) e TSC coltivati in ipossia. Queste strutture ripropongono caratteristiche chiave del blastocisto E4.5, incluse proporzioni di linea e identità trascrizionale appropriate, e possono essere utilizzate per lo screening ambientale multiparametrico, riflettendo in modo affidabile difetti dello sviluppo dello stadio^{blastocisti 3}. Uno studio recente dimostra inoltre che l'aggregazione di ESC, iGATA4-ESC e TSC in mezzi blastoidi basali produce anche la formazione di blastoidi ad alta efficienza, evidenziando la robustezza e l'adattabilità di questo approccio in laboratori e condizioni^{di coltura 39}. In passato è stato dimostrato che le iGATA4-ESC riproducono le funzioni delle cellule VE nei modelli embrionali basati su cellule staminali^{post-impianto} 28,29,30,31. Insieme, questi risultati illustrano come le iGATA4-ESC possano fungere da sostituti flessibili e affidabili per le cellule PE/VE nella modellazione embrionale basata su cellule staminali attraverso le fasi dello sviluppo.

Diversi passaggi del protocollo sono fondamentali per ottenere blastoidi di alta qualità. Questi includono la qualità delle popolazioni cellulari iniziali, in particolare i TSC coltivati con ipossia (Figura 1); la preparazione del medium TX, che dovrebbe essere preparato fresco al giorno 0 (Tabella 2; Sezione 2.3); e una gestione attenta delle lastre dopo l'aggregazione. Le letture chiave del successo del protocollo includono l'efficienza della cavitazione (tipicamente ~80%), la morfologia appropriata (strutture di diametro ~100 μm con una cavità simile a un blastocoel, uno strato esterno simile a TE-CDX2⁺ e una massa interna di cellule SOX2⁺ e GATA4⁺ ordinata con un rapporto PE approssimativo di 3 TE:1 EPI:1), e la presenza di uno strato simile GATA4⁺ simile PE correttamente ordinato. Queste sono metriche comunemente utilizzate nel^campo 1,2,4,5. Tra i blastoidi cavati, circa il 75% delle strutture presenta tutte queste caratteristiche. Queste metriche possono essere utilizzate come indicatori iniziali per la risoluzione dei problemi. Una qualità cellulare subottimale si riflette tipicamente in morfologia anomala delle colonie, con conseguente strutture poco aggregate o non cavitate. Una preparazione impropria del mezzo può portare a aggregazioni incomplete o difetti di linea, mentre una gestione ruvida può portare a più aggregati per micropozzo o pozzi vuoti.

Ulteriori ottimizzazioni possono includere l'adattamento del numero di celle semi (intervalli iniziali raccomandati: 4–7 ESC e iGATA4-ESC, e 10–15 TSC per micropozzo), il raffinamento dei metodi di esaurimento MEF (ad esempio, filtrazione tramite un filtro cellulare da 40 μm) e la modifica della composizione del mezzo TX. Ad esempio, la rimozione di FGF4 ed eparina può comunque supportare una formazione efficiente di blastoidi promuovendo un'identità più murale simile a quella dei TE. Gli iGATA4-blastoidi possono essere mantenuti in coltura fino a 6 giorni; tuttavia, le strutture dai giorni 4 al 6 spesso aumentano di dimensione mantenendo proporzioni simili a blastocisti della linea di discesa. Il protocollo produce risultati coerenti tra repliche biologiche, ma in ciascun esperimento dovrebbero essere inclusi controlli appropriati.

Rispetto ad altri sistemi blastoidi di topi, che variano nelle popolazioni cellulari iniziali e nelle condizioni^di coltura 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , i blastoidi iGATA4 raggiungono sia un'elevata efficienza della formazione sia una rappresentazione accurata della linea. Sebbene molti protocolli esistenti generino strutture cavitate e siano preziosi per applicazioni biologiche specifiche, spesso mostrano una formazione incompleta di PE, identità cellulari eterogenee o indefinite, o proporzioni di linea errate. Combinando tre popolazioni di cellule staminali dirette alla linea in modo graduale, iGATA4-blastoidi superano queste limitazioni e forniscono un sistema riproducibile, modulare e sperimentalmente accessibile.

Nonostante questi vantaggi, rimangono diverse limitazioni. La coltura in vitro prolungata nel mezzo TX oltre 4–6 giorni provoca una crescita eccessiva, anche se le proporzioni della linea di disci rimangono simili a blastocisti. Circa il 12,5% dei blastoidi iGATA4 passa a morfologie simili a peri-impianto in vitro, caratterizzate da un epiblasto pseudostratificato a forma di coppa che circonda una cavità pro-amniotica, un compartimento extraembrionale esteso simile a un ectoderma adiacente all'epiblasto prossimale e uno strato esterno viscerale simile a un endoderma. Tuttavia, i blastoidi iGATA4 non riescono a impiantarsi e si sviluppano ulteriormente dopo il trasferimento in un topo ospite. Pertanto, i blastoidi iGATA4, e i blastoidi più in generale, non sono adatti allo studio dell'impianto o delle interazioni embrione–madre.

La base molecolare del fallimento dell'impianto dei blastoidi rimane poco chiara, anche se le evidenze attuali suggeriscono che la modellazione incompleta del trofectodermo possa essere un fattore contributivo. Le cellule simili a TE nei blastoidi iGATA4 mostrano un'identità molecolare eccessivamente polare. I futuri sforzi per ingegnerizzare TSC che assomiglino di più alle cellule TE murali, o per introdurre linee cellulari alternative che riproducano meglio TE competente per l'impianto, rappresentano direzioni promettenti per superare queste limitazioni. La natura modulare degli iGATA4-blastoid, in cui modifiche specifiche per TE possono essere implementate indipendentemente dalla formazione di EPI e PE, rende questo sistema particolarmente adatto a tali sviluppi.

Nel complesso, il protocollo iGATA4-blastoide fornisce una piattaforma robusta e scalabile per studiare la specifica della linea di discendenza e i primi processi di sviluppo nell'embrione dei mammiferi. La sua riproducibilità e adattabilità la rendono particolarmente adatta per applicazioni di screening ambientale, farmacologico e genetico ad alto rendimento. In quanto tali, i blastoidi iGATA4 rappresentano un potente sistema per indagare i meccanismi precoci dello sviluppo e valutare come le diverse perturbazioni influenzino lo sviluppo pre-impianto.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	Usato per la preparazione generale dei media
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	Usato per la preparazione del media TX e la cavitazione blastoide
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	Piatto di aggregazione in micropozzi; Usato per la preparazione blastoide
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Usato per la preparazione blastoide
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	Pipette a canale largo per lo spostamento dei blastoidi durante l'immunosinatura.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Usato per la preparazione dei media
Caffeine	Sigma	58-08-2	Usato come fattore ambientale per test negli iGATA4-blastoidi
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	Per immunofluorescenza, usato a 1:200
CellXpert (normoxia incubator)	Eppendorf	6731010015	Altre marche/modelli potrebbero funzionare anche.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	Usato per la preparazione dei media
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	Usato per scopi generali di coltura cellulare
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Usato per immunofluorescenza, usato a 1:500-1:1,000
DMEM	Gibco	11995040	Usato per la preparazione del media FC
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	Usato per la preparazione di N2B27 e TX media
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	Integrare DMEM-LM con polvere di nutrienti Ham's F-12 per ottenere una concentrazione finale di 1x e ottenere DMEM/F12 libero da Met e Leu
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	Usato per immunofluorescenza, usato a 1:500-1:1,000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor® 647	Invitrogen	A-31571	Usato per immunofluorescenza, usato a 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor® 568	Invitrogen	A10042	Usato per immunofluorescenza, usato a 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	Usato per immunofluorescenza, usato a 1:500-1:1,000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Usato per immunofluorescenza. Scongelare a 4°C; e conservare in aliquote a -20°C.
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	Per l'induzione iGATA4 durante la preparazione blastoide
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	Usato nel nostro laboratorio, altri funzioneranno. Richiede adattatori per tubi e piastre.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	Usato per immunofluorescenza
FGF4	R&D Systems	5846-F4	Usato per la preparazione dei media
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	Usato per l'analisi delle immagini
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	Usato per immunofluorescenza, usato a 1:500
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	Usato per scopi generali di coltura cellulare
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	Per immunofluorescenza e imaging
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Supplemento di L-alanil-L-glutamina; Usato per la preparazione dei media
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	Usato come supplemento per DMEM-LM, per condizioni di dieta a basso contenuto proteico.
Heparin	Sigma	H3149	Usato per la preparazione dei media
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	Altre marche/modelli potrebbero funzionare anche.
Holo-transferrin	Sigma	T4132	Usato per la preparazione del media TX.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	Usato per la preparazione del media TX.
IL-11	PeproTech	200-11	Usato per la preparazione del media TX.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	Usato per l'analisi delle immagini e la preparazione delle immagini.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Usato per la preparazione dei media
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	Linea cellulare disponibile dal laboratorio Zernicka-Goetz su richiesta
Insulin	Sigma	I9278	Usato per la preparazione del media TX.
Irradiated C57bl/6 Mouse Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A34960	Usato come strato di alimentazione per la coltura TSC. Scongelare come indicato nel protocollo e utilizzare entro una settimana.
L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium	Sigma	A8960	Usato per la preparazione del media TX.
L-isoleucine	Thermo Fisher Scientific	73-32-5	Usato per integrare il media TX.
L-leucine	Thermo Fisher Scientific	61-90-5	Usato per integrare il media TX.
L-valine	Thermo Fisher Scientific	72-18-4	Usato per integrare il media TX.
Megacell RPMI-1640 Medium	Sigma	M3817	Usato per la preparazione dei media
Miscellaneous pipette tips	Multiple providers	NA	Per la manipolazione generale dei liquidi
Mouse recombinant LIF	STEMCELL Technologies	78056	Usato per la preparazione dei media
N2 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048	Usato per la preparazione dei media