Farmacologia integrata di rete, metabolomica e validazione in vivo del decotto di Liangxue Dihuang nei topi di colite ulcerosa indotta da DSS

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro riproducibile che integra farmacologia di rete, metabolomica non mirata e validazione in vivo per chiarire i meccanismi multicomponenti della Decoction di Liangxue Dihuang in un modello murino di colite ulcerosa indotto da solfato di sodio da dextrano.

Abstract

La colite ulcerosa (CU) è una malattia infiammatoria intestinale cronica caratterizzata da infiammazione intestinale persistente e disregolazione metabolica. Le formule della medicina tradizionale cinese (MTC) sono ampiamente utilizzate nella pratica clinica per i disturbi infiammatori; tuttavia, gli approcci sperimentali sistematici per chiarire i loro meccanismi multi-componente e multi-bersaglio rimangono limitati. Questo articolo presenta un protocollo sperimentale riproducibile che integra farmacologia di rete, metabolomica non mirata e validazione in vivo per indagare gli effetti antinfiammatori del Decocto di Liangxue Dihuang (LXDHD) in un modello murino di UC indotto da dextrano solfato di sodio (DSS). Il flusso di lavoro include la preparazione del decocto erboristico, la modellazione della colite indotta da DSS, la valutazione dell'attività della malattia, la valutazione istopatologica ed ematologica, la misurazione delle citochine sieriche, il profiling metabolomico basato su LC–MS e l'analisi computazionale delle reti. Utilizzando questo approccio integrato, è stata stabilita con successo la colite indotta da DSS e il trattamento con LXDHD ha portato a miglioramenti misurabili nell'indice di attività della malattia, nella lunghezza del colon, nei danni istopatologici, nei livelli di citochine infiammatorie e nei profili metabolici. Le analisi della farmacologia di rete e della metabolomica hanno ulteriormente dimostrato che questo protocollo consente l'identificazione di bersagli, vie e metaboliti chiave associati all'intervento terapeutico. Questo flusso di lavoro visualizzato e standardizzato fornisce un quadro metodologico pratico per studiare i meccanismi farmacologici delle formule MTC multicomponente nelle malattie infiammatorie intestinali e può essere adattato ad altre prescrizioni erboristiche e modelli di malattia.

Introduzione

La colite ulcerosa (CU) è una malattia infiammatoria intestinale cronica caratterizzata da un'infiammazione mucosa continua del colon¹, che porta a sintomi come dolore addominale, diarrea, sanguinamento rettale e perdita^{di peso 2}. L'incidenza della colite ulcerosa è aumentata in tutto il mondo, imponendo un onere significativo ai sistemi sanitari e compromettendo significativamente la qualità della vita dei^{pazienti 3}. Sebbene l'eziologia della colite ulcerosa rimanga incompleta, le evidenze accumulate indicano che risposte immunitarie disregolate, produzione eccessiva di citochine infiammatorie, stress ossidativo e disturbi metabolici giocano ruoli centrali nella patogenesi della^{malattia 4,5}.

Le strategie terapeutiche attuali per la colite ulcerosa includono principalmente aminosalicilati, corticosteroidi, agenti immunosoppressivi e biologici che mirano alle citochine^{infiammatorie 6}. Sebbene questi trattamenti possano alleviare i sintomi e indurre la remissione, il loro uso a lungo termine è spesso associato a effetti avversi, elevati costi e risposte terapeutiche^{variabili 7,8,9}. Inoltre, una parte considerevole dei pazienti non riesce a raggiungere una remissione prolungata, evidenziando la necessità di approcci terapeutici alternativi o complementari con maggiore sicurezza ed efficacia multi-bersaglio.

La medicina tradizionale cinese (MTC) è stata ampiamente utilizzata per il trattamento dei disturbi gastrointestinali per secoli ed è sempre più riconosciuta per i suoi potenziali benefici nelle malattie infiammatorie complesse come la UC¹⁰. A differenza delle terapie a singolo bersaglio, le formule della MTC esercitano tipicamente effetti terapeutici attraverso molteplici componenti che agiscono su più bersagli e percorsi, il che può affrontare meglio la natura multifattoriale dell'UC¹¹. Studi clinici e sperimentali hanno suggerito che alcune prescrizioni di MTC possono modulare le risposte immunitarie, sopprimere l'infiammazione, proteggere l'integrità della barriera intestinale e regolare l'omeostasi^metabolica 12,13,14,15.

La Decoczione Liangxue Dihuang (LXDHD) è una formula classica della MTC tradizionalmente usata per "raffreddare il sangue e liberare il calore" ed è stata applicata clinicamente per disturbi infiammatori ed^{emorragici 16}. La prescrizione comprende diverse erbe, tra cui Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis e Glycyrrhiza uralensis. Studi farmacologici moderni hanno dimostrato che diverse erbe costituenti e i loro composti attivi possiedono proprietà antinfiammatorie, antiossidanti e ^{immunomodulatrici.} Tuttavia, gli effetti terapeutici complessivi e i meccanismi sottostanti della LXDHD nella CU non sono ancora stati sistematicamente chiariti.

La farmacologia di rete è emersa come un approccio efficace per esplorare le complesse interazioni tra formule erboristiche multicomponente e bersagli molecolari correlati^{alle malattie 20}. Integrando informazioni provenienti da molteplici database, la farmacologia di rete può prevedere composti attivi potenziali, target terapeutici e vie di segnalazione, fornendo una comprensione a livello di sistema dei meccanismi della^{MTC 21}. Tuttavia, la farmacologia di rete si basa principalmente su previsioni di database e non riflette direttamente i cambiamenti metabolici in vivo .

La metabolomica, come potente strumento per profilare alterazioni metaboliche globali, offre approfondimenti complementari sulla fisiopatologia della malattia e sulle risposte^{terapeutiche 22}. Nelle colite ulcerose, le analisi metabolomiche hanno rivelato significative alterazioni nel metabolismo dei lipidi e degli amminoacidi, così come vie correlate allo stress^ossidativo 23,24,25. L'integrazione della metabolomica con la farmacologia di rete può aiutare a colmare il divario tra i target molecolari previsti e i fenotipi metabolici reali, migliorando così l'affidabilità delle interpretazioni meccanicistiche.

Nel presente studio, è stata impiegata una strategia integrata che combina farmacologia di rete, metabolomica non mirata e validazione sperimentale per indagare gli effetti antinfiammatori e i potenziali meccanismi della LXDHD in un modello murino di UC indotto da dextrano solfato sodio (DSS) (Figura 1A). Questo disegno metodologico complessivo, che integra previsioni in silico con validazione metabolomica e fenotipica in vivo , è in linea con i rigorosi quadri di ricerca^{consolidati 26}. L'analisi farmacologica di rete è stata utilizzata per identificare composti attivi, potenziali bersagli terapeutici e vie di segnalazione arricchite dal trattamento LXDHD. È stata eseguita metabolomica non mirata per caratterizzare le alterazioni metaboliche indotte dalla UC e la loro modulazione tramite LXDHD. Inoltre, i risultati chiave sono stati convalidati tramite esperimenti in vivo , inclusi valutazioni dell'attività della malattia, dei cambiamenti istopatologici, dei parametri ematologici e dei livelli di citochine infiammatorie.

Integrando previsioni computazionali, profilazione metabolica e validazione biologica, questo studio mira a fornire una comprensione completa dei meccanismi multi-componente, multi-bersaglio e multi-percorso alla base degli effetti terapeutici di LXDHD nella UC. Questo lavoro non solo offre evidenze sperimentali a sostegno dell'uso della LXDHD come potenziale terapia complementare per la UC, ma fornisce anche un quadro metodologico per indagare i meccanismi di altre formule complesse della MTC.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state condotte in conformità con le Linee Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio e sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino (Approvazione n. #2025DW-034-01; Data di approvazione: 24 marzo 2025). La preparazione della Decoczione Liangxue Dihuang è stata eseguita secondo le procedure descritte nella Farmacopea^{Cinese 27}. I reagenti, le sostanze chimiche e i software utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione della Decotta Liangxue Dihuang (LXDHD)

1. Prepara i materiali erboristici essiccati secondo la formulazione standard di LXDHD. La composizione erboristica precisa, i nomi botanici e le dosi esatte prescritte delle undici erbe costituenti sono specificati nella Tabella 1.
   NOTA: Autentica tutti i materiali erboristici da parte di un farmacista qualificato prima dell'uso per garantire l'identità botanica e la coerenza della qualità. Conservare i record di autenticazione per la riproducibilità.
2. Preparazione della polvere
   1. Asciuga all'aria tutti i materiali erboristici a temperatura ambiente in un ambiente pulito e ben ventilato.
   2. Polverizza ogni erba singolarmente con un macinacaffè meccanico finché non ottieni una polvere fine.
   3. Combina le polveri secondo i rapporti prescritti.
   4. Far passare la polvere mista attraverso un setaccio da 80 mesh (diametro interno 180 μm ± 7,6 μm) per garantire una dimensione uniforme delle particelle.
   5. Omogeneizzare accuratamente la polvere setacciata.
      NOTA: Una dimensione uniforme delle particelle è essenziale per un'efficienza di estrazione costante. Una macinazione incompleta o una miscelazione irregolare possono causare variabilità nella composizione chimica.
3. Preparazione dell'estratto acquoso LXDHD
   1. Pesa accuratamente la polvere mista di erbe e aggiungi acqua distillata in un rapporto di 1:10 (p/v).
   2. Riscalda la miscela a bollizione e decocco per 20 minuti.
   3. Filtra l'estratto e raccogli il filtrato.
   4. Aggiungi acqua distillata fresca al residuo e ripeti la decoction per altri 20 minuti.
   5. Combinare i due filtrati per ottenere l'estratto acquoso finale LXDHD.
      NOTA: La doppia decoction è essenziale per garantire un'estrazione efficiente sia dei componenti solubili in acqua che di quelli moderatamente solubili.
4. Concentrazione e stoccaggio
   1. Concentrare il decocto combinato a pressione ridotta o a un riscaldamento delicato fino a raggiungere la concentrazione desiderata.
   2. Lascia raffreddare l'estratto a temperatura ambiente.
   3. Conserva l'estratto LXDHD preparato a 4 °C e usalo entro 48 ore.
      NOTA: Evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo, poiché potrebbero degradare i composti bioattivi e ridurre la riproducibilità sperimentale.
5. Amministrazione
   1. Porta l'estratto a temperatura ambiente prima della somministrazione.
   2. Somministrare la decoction acquosa concentrata di LXDHD ai topi tramite gavage orale alle dosi designate secondo il raggruppamento sperimentale.

2. Progettazione di esperimenti animali

1. Animali e condizioni abitative
   1. Ottieni maschi C57BL/6 topi (età 6–8 settimane, 20–25 g) da un fornitore certificato di animali da laboratorio.
   2. Topolini domestici in condizioni standard di laboratorio con un ciclo di 12 ore di luce e buio, temperatura controllata (22–25 °C) e umidità relativa (50%–60%).
   3. Fornire ai topi accesso gratuito al cibo e all'acqua standard durante tutto l'esperimento.
   4. Permette ai topi di acclimatarsi per almeno 7 giorni prima della sperimentazione.
      NOTA: Includere solo topi sani con attività normale e peso corporeo negli esperimenti successivi.
2. Raggruppamento e calcolo del dosaggio
   1. Calcola la dose di LXDHD nei topi secondo il principio di conversione della dose uomo-animale descritto nella Metodologia degli Esperimenti Farmacologici, basandosi su un peso corporeo adulto standard di 70 kg e una dose clinica giornaliera di 8,4^{g 28}.
   2. Dividere casualmente i topi nei seguenti gruppi (n = 6 per gruppo): gruppo di controllo normale, gruppo modello UC indotto dalla DSS, gruppo LXDHD a bassa dose (1,09 g/kg), gruppo LXDHD ad alta dose (2,18 g/kg) e gruppo controllo positivo 5ASA (100 mg/kg⁾²⁹.
      NOTA: Eseguire la randomizzazione utilizzando una tabella dei numeri casuali per minimizzare il bias di selezione.
   3. Induzione della UC e amministrazione dei farmaci
      1. Prepara una soluzione DSS al 2,5% (w/v) nell'acqua potabile.
      2. Somministrare la soluzione DSS ad libitum ai topi dei gruppi modello, trattati con LXDHD e 5ASA per 7 giorni^{consecutivi e 30}.
      3. Fornisci acqua potabile purificata ai topi del gruppo di controllo normale.
      4. Somministrare LXDHD e 5ASA ai gruppi di trattamento una volta al giorno tramite gavage orale alle dosi corrispondenti durante tutto il periodo sperimentale.
      5. Somministrare un volume uguale di soluzione del veicolo ai gruppi di modelli normali di controllo e DSS.
         NOTA: Prepara la soluzione DSS da zero e sostituisci ogni 2 giorni. I lotti di DSS possono variare nella potenza che induce la colite; Effettua test pilota quando si utilizza un nuovo lotto. L'istituzione con successo del modello UC indotto dal DSS è caratterizzato da una progressiva perdita di peso corporea, diarrea sanguinolenta, punteggi DAI elevati e un marcato accorciamento del colon. Questi criteri e la progettazione metodologica degli esperimenti sui topi sono coerenti con gli standard di riferimento^{stabiliti 31}.
3. Preparazione di siero a vuoto e contenente farmaci per metabolomica esogena
   1. Usa una coorte separata di maschi sani di topi C57BL/6.
   2. Dividiamo casualmente i topi in due gruppi: il gruppo vuoto e il gruppo LXDHD.
   3. Somministrare LXDHD al gruppo LXDHD tramite gavage orale a 2,18 g/kg una volta al giorno per 7 giorni consecutivi.
   4. Somministrare un volume uguale di acqua distillata al gruppo bianco.
   5. Prelevare campioni di sangue 1 ora dopo l'amministrazione finale.
   6. Elaborare i campioni di sangue per ottenere il siero come descritto in seguito nella Sezione 3.5.

3. Valutazione dell'attività della malattia

1. Monitorare quotidianamente il peso corporeo, la consistenza delle feci e il sanguinamento fecale durante l'esperimento.
2. Calcola l'Indice di Attività della Malattia (DAI) in base alla perdita di peso corporeo, alla consistenza delle feci e al sanguinamento fecale. Il quadro specifico di punteggio è dettagliato nella Tabella 3. Calcola il
   punteggio finale DAI come media (o somma) di questi tre parametri³².
3. Alla fine dell'ottavo giorno, anestetizzare i topi di ogni gruppo con pentobarbital sodio al 1% (30 mg/kg). Raccogliere circa 400 μL di sangue dal plesso venoso retro-orbitale di ciascun topo. Successivamente, si sopporta l'eutanasia degli animali tramite lussazione cervicale per garantire la morte, in stretta conformità con le linee guida dell'American Veterinary Medical Association (AVMA) per l'eutanasia degli animali (Figura 1B).
   NOTA: Confermare un'anestesia adeguata pizzicando delicatamente le dita e la superficie plantare delle zampe posteriori; L'assenza di una risposta di astinenza indica una profondità sufficiente dell'anestesia.
4. Raccogli i tessuti del colon e misura la lunghezza del colon come indicatore della gravità della malattia.
   NOTA: La riduzione della lunghezza del colon è considerata un segno distintivo della colite indotta da DSS di^{gravità 33}.
5. Ottenimento del siero ematico
   1. Lascia coagulare una parte dei campioni di sangue raccolti a temperatura ambiente per 1 ora.
   2. Centrifuga campiona a 1.000 × g per 15 minuti a 4 °C per ottenere il siero.
   3. Quantificare i livelli sierici di interleucina (IL)-1β, IL-6, IL-17, fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e IL-10.
   4. Raccogliere campioni di tessuto del colon per l'analisi istopatologica.
   5. Utilizzare i campioni di sangue residui per l'analisi del sangue periferico.
   6. Riservare ulteriori campioni di siero per l'analisi metabolomica.

4. Colorazione ematossilina–eosina (H&E)

1. Fissa i tessuti del colon con paraformaldeide al 4% per almeno 24 ore.
2. Disidratano i tessuti tramite una serie di etanolo gradato.
3. Trasparentare i tessuti con xilene e inserirli nella paraffina.
4. Tagliare le sezioni di tessuto (spesse 3–5 μm) utilizzando un microtomo.
5. Deparafinizza le sezioni con xilene.
6. Reidratare le sezioni con etanolo classificato.
7. Colorare le sezioni con ematossilina per la visualizzazione nucleare.
8. Controcolorare le sezioni con eosina per la colorazione citoplasmatica.
9. Osserva le modifiche istopatologiche al microscopio e cattura immagini rappresentative utilizzando il relativo software di imaging.
10. Valutare i punteggi istologici (HCS) in base alla gravità dell'infiammazione, alla profondità della lesione e al danno della cripta.
11. Consulta la Tabella 4 per criteri dettagliati di punteggio istologico.
    NOTA: Cattura immagini rappresentative di incorporamento, sezionamento e colorazione dei tessuti per migliorare la visualizzazione del protocollo.

5. Analisi del sangue periferico

1. Raccogliere campioni di sangue periferico nei tubi anticoagulanti EDTA-K2 (1,5 mg di EDTA per mL di sangue).
2. Inverti delicatamente i tubi 8–10 volte per assicurare una miscelazione corretta.
3. Analizza il conteggio delle cellule sanguignie utilizzando un analizzatore veterinario di ematologia in tre parti (Mindray BC-2600vet) con calibrazione specifica per specie.
4. Trasportare campioni a 4 °C.
5. Analizza i campioni entro 4 ore dalla raccolta.
   NOTA: Escludere i campioni che mostrano emolisi o coagulazione dall'analisi.

6. Saggio immunoenzimatico legato agli enzimi (ELISA)

NOTA: IL-6, IL-17, IL-1β e TNF-α sono citochine pro-infiammatorie chiave, mentre IL-10 è una citochina antinfiammatoria fondamentale. Queste citochine riflettono la presenza e la gravità delle risposte^{infiammatorie 34}.
La misurazione di queste citochine è fondamentale per comprendere i processi infiammatori e valutare l'efficacia dei trattamenti antinfiammatori.

1. Preleva campioni di sangue dal plesso venoso retro-orbitale.
2. Lascia coagulare i campioni a temperatura ambiente per 1 ora.
3. Centrifugare campioni a 1.000 × g per 15 minuti a 4 °C per ottenere il siero.
4. Misurare i livelli sierici di IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α e IL-10 utilizzando kit ELISA commerciali.
5. Misurare l'assorbenza utilizzando un lettore di microplacche dotato di software standard per l'acquisizione dati.
6. Calcola le concentrazioni di citochine basandosi su curve standard.
   NOTA: Analizzare tutti i campioni e gli standard in duplicato per ridurre la variabilità tecnica.

7. Analisi LC–MS della Decoczione di Liangxue Dihuang

1. Preparazione del campione
   1. Pesa con precisione 10 g di polvere erbatica cruda mista LXDHD.
   2. Scioglie la polvere in 30 mL di acqua calda.
   3. Esegui l'estrazione ultrasonica per 30 minuti.
   4. Mescola 100 μL dell'estratto con 400 μL di metanolo.
   5. Vortice per 10 minuti.
   6. Centrifuga a 14.000 × g per 10 minuti.
   7. Raccogli il soprantantante come soluzione di prova.
2. Condizioni LC–MS
   1. Eseguire la separazione cromatografica utilizzando un sistema LC accoppiato a uno spettrometro di massa Q.
   2. Usa una colonna C18 (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   3. Imposta la fase mobile come segue: solvente A, acido formico allo 0,1% in acqua; solvente B, metanolo.
   4. Imposta la portata a 0,30 mL/min.
   5. Imposta la temperatura della colonna a 35 °C.
   6. Imposta il volume di iniezione a 5 μL.
   7. Applica il seguente programma di eluzione del gradiente:
      0–2 min, 5% B;
      2–15 min, 5–95% B;
      15–18 min, 95% B;
      18–18,1 min, 95–5% B;
      18,1–22 min, 5% B.
   8. Imposta i parametri della spettrometria di massa come segue: portata di gas a guaina, 35 arb; portata di gas aux, 10 arb; tensione di spruzzo, 3,5 kV (positivo) e 2,8 kV (negativo); temperatura capillare, 320 °C; temperatura del riscaldatore a gas ausiliario, 350 °C.
   9. Acquisire dati MS sia in modalità ionica positiva che negativa con un intervallo completo di scansione MS di m/z 100–1500 (risoluzione: 70.000).
   10. Esegui scansioni MS2 (dd-MS2) dipendenti dai dati con una risoluzione di 17.500.
   11. Elabora i dati grezzi e identifica i composti utilizzando il database mzCloud.

8. Analisi metabolomica non mirata sul siero

1. Preparazione del campione di siero e controllo qualità (QC)
   1. Campioni di siero per lo scongelamento su ghiaccio.
   2. Trasferire 50 μL di siero in un tubo centrifuga da 1,5 mL.
   3. Aggiungi 200 μL di metanolo/acetonitrile freddo (1:1, v/v).
   4. Vortice per 1 minuto per precipitare le proteine.
   5. Incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
   6. Centrifugare a 14.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
   7. Trasferisci il soprandanante in un nuovo tubo.
   8. Asciuga l'estratto usando un concentratore a vuoto.
   9. Ricostituire in 100 μL di acetonitrile/acqua (1:1, v/v).
   10. Vortice a fondo.
   11. Centrifugare di nuovo a 14.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
   12. Raccogliere il soprandanante per l'analisi LC-MS.
   13. Prepara i campioni di controllo qualità concentrando 10 μL di aliquote da ciascun campione.
   14. Iniettare un campione QC ogni 8–10 campioni sperimentali per monitorare la stabilità e la ripetibilità dello strumento.
2. Impostazioni di acquisizione LC-MS
   1. Eseguire la separazione cromatografica utilizzando il sistema LC con colonna C18 (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   2. Imposta la temperatura della colonna a 35 °C.
   3. Imposta la portata a 0,30 mL/min.
   4. Imposta il volume di iniezione a 2 μL (modalità positiva) o 5 μL (modalità negativa).
   5. Usa il solvente A (acido formico allo 0,1% in acqua) e il solvente B (acetonitrile con acido formico allo 0,1%).
   6. Applica un programma di eluzione a gradiente lineare.
   7. Fai funzionare lo spettrometro di massa in modalità HESI positiva e negativa.
   8. Imposta l'intervallo di scansione di massa su m/z 100–1500.
   9. Imposta la tensione di spruzzatura a 3,5 kV (positivo) e 2,8 kV (negativo).
   10. Imposta la temperatura capillare a 320 °C.
3. Elaborazione dei dati e identificazione differenziale dei metaboliti
   1. Importare i dati grezzi LC-MS (file .raw) nel software.
   2. Esegui allineamento dei picchi, selezione dei picchi e correzione di base.
   3. Normalizzare le caratteristiche dell'area di picco estratte all'intensità totale degli ioni.
   4. Identificare i metaboliti confrontando con precisione i pattern di frammentazione di massa (tolleranza alla massa < 5 ppm) e MS/MS con i database mzCloud e ChemSpider.
   5. Eseguire analisi statistiche multivariate (PCA e OPLS-DA/PLS-DA).
   6. Definire metaboliti differenziali basandosi sulle seguenti soglie: VIP > 1,0 e p < 0,05 (test Student's t).

9. Analisi della farmacologia delle reti

NOTA: La farmacologia di rete è stata impiegata per prevedere i componenti attivi e i target chiave della LXDHD in UC^35,36. La metodologia include il mining di database, l'elaborazione delle informazioni chimiche, l'acquisizione di dati di bioattività, il recupero di bersagli proteici, la profilazione dell'espressione genica, la costruzione di reti di interazione e l'analisi dell'arricchimento delle vie^37,38.

1. Screening attivo dei composti
   1. Recuperare i composti attivi dal database Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology Database and Analysis (TCMSP) (consultato il 10 dicembre 2025) utilizzando OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18.
   2. Integrare i composti tramite ricerche bibliotecniche su PubMed e Web of Science (10–15 dicembre 2025).
   3. Standardizzare i target utilizzando il database UniProt (consultato il 15 dicembre 2025).
2. Identificazione dei bersagli per malattie
   1. Raccogli target correlati all'UC dai database GeneCards, OMIM, TTD e DrugBank (consultato il 15 dicembre 2025).
3. Costruzione e analisi della rete
   1. Identificare i target che si intersecano utilizzando il pacchetto VennDiagram nel software R.
   2. Costruisci la rete usando il software Cytoscape.
   3. Analizza la topologia utilizzando il plugin NetworkAnalyzer e il plugin CytoNCA.
4. Identificazione della rete PPI e dei bersagli core
   1. Importare i target intersecanti nel database STRING.
   2. Limitare le specie all'Homo sapiens.
   3. Rimuovi i nodi isolati.
   4. Applica una soglia di punteggio PPI > 0,9.
   5. Esporta i dati e analizza nel software.
   6. Calcola DC, BC, EC, CC, NC e LAC.
   7. Eseguire filtraggio basato su mediane per generare sottoreti e identificare i target^{principali 39}.
5. Analisi dell'arricchimento di GO e KEGG
   1. Esegui l'arricchimento GO e KEGG utilizzando pacchetti R e Bioconductor.
   2. Usa pacchetti R, inclusi org. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, enrichplot, stringi e ggplot2.
   3. Imposta soglie di significatività a p = 0,05 e q = 0,05.
   4. Effettua analisi GO per le categorie MF, BP e CC.
   5. Eseguire l'arricchimento^{e la} classificazione 40 del percorso KEGG.
6. Aggancio molecolare
   1. Scarica strutture composte da TCMSP in formato SDF.
   2. Scarica le strutture proteiche da AlphaFold in formato PDB.
   3. Eseguire l'docking utilizzando il server web CB-DOCK2 (CADD Lab, Università del Sichuan, Chengdu, Cina).
   4. Definisci di conseguenza i file recettori e i ligandi.
   5. Registra la posizione ottimale del lego e l'energia del vincolo.
      NOTA: L'attracco è stato eseguito utilizzando un algoritmo^{genetico 41}. I risultati sono stati classificati in base all'energia di legame.

10. Analisi statistica

1. Esegui analisi statistiche utilizzando il software GraphPad Prism.
2. Esprimi i dati quantitativi come media ± deviazione standard (SD).
3. Testare la normalità usando il test di Shapiro–Wilk.
4. Testare l'omogeneità della varianza usando il test di Brown–Forsythe.
5. Eseguire ANOVA unidirezionale con il test post hoc di Tukey per dati normalmente distribuiti.
6. Eseguire il test di Kruskal–Wallis con il test di Dunn per dati non parametrici.
7. Consideriamo p < 0,05 come statisticamente significativo.
   NOTA: Un p-valore più piccolo indica una differenza statistica maggiore tra i gruppi.

Risultati

Analisi farmacologica di rete della LXDHD nella UC

La farmacologia di rete è stata applicata per prevedere i potenziali bersagli terapeutici e i meccanismi molecolari della LXDHD nella UC. Un totale di 211 composti con proprietà farmacocinetiche favorevoli sono stati selezionati dal database TCMSP, inclusi 36 da Scutellaria baicalensis, 37 da Phellodendron chinense, 10 da Rehmannia glutinosa, 11 da Paeonia suffru...

Discussione

Questo metodo presenta un flusso di lavoro sperimentale visualizzato e riproducibile che integra farmacologia di rete, metabolomica non mirata e validazione in vivo per indagare gli effetti antinfiammatori delle formule della MTC in un modello murino di UC indotto dal DSS. A differenza degli studi farmacologici convenzionali che si concentrano principalmente su conclusioni meccanicistiche isolate, questo protocollo enfatizza la solidità stessa del quadro metodologico stesso rive...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
5-Aminosalicilico (5-ASA)	Sigma-Aldrich	A3537	Farmaco di controllo positivo per la colite ulcerosa; somministrato a 100 mg/kg con gavage orale.
Acetonitrile (grado LC-MS)	Merck	100030	Utilizzato per la preparazione del campione di metabolomica e per la fase mobile LC-MS.
Database della struttura delle proteine AlphaFold	EMBL– Istituto Europeo di Bioinformatica	https://alphafold.ebi.ac.uk/	Database utilizzato per ottenere strutture tridimensionali previste delle proteine bersaglio.
Angelica sinensis (Dang Gui)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costitutiva di LXDHD (Dose: 1,6 g).
CB-Dock2	CADD Lab	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	Piattaforma web utilizzata per l'aggancio molecolare e la previsione di ligando e ndash; modalità di legame proteica.
Citrus aurantium (Zhi Ke)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costituente di LXDHD (dose: 0,5 g).
Compound Discoverer Software	Thermo Fisher Scientific	Versione 3.3	Utilizzato per l'elaborazione dati di LC– MS e l'identificazione di composti.
CTAn Software	Bruker	Versione 1.17	Utilizzato per la ricostruzione di immagini 3D Micro-CT e l'analisi dell'erosione ossea.
Cytoscape	Consorzio Cytoscape	Versione 3.8.0	Software utilizzato per la costruzione e visualizzazione di reti.
Dextrano Solfato di Sodio (DSS)	MP Biomedici	160110	Peso molecolare 36.000– 50.000 Da; Usata per indurre colite ulcerosa nei topi.
Tubi anticoagulanti EDTA-K2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Usato per la raccolta del sangue periferico.
Soluzione per la colorazione con eosina	Biosharp	N/A	Utilizzato per la controcolorazione citoplasmatica in H& Colorazione con E.
Etanolo	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	64-17-5	Usato per la disidratazione dei tessuti.
Acido formico (grado LC-MS)	Merck	5.33002	Utilizzato per la preparazione della fase mobile LC-MS.
Glycyrrhiza uralensis (Gan Cao)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costituente di LXDHD (dose: 0,5 g).
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versione 9.0	Utilizzato per analisi statistiche e presentazioni grafiche.
Analizzatore di ematologia	Mindray	BC-2600vet	Analizzatore ematologico veterinario in tre parti per analisi di routine del sangue.
Soluzione per la colorazione dell'ematossilina	Biosharp	BL700B	Utilizzato per H& Colorazione elettronica delle sezioni di tessuto del colon.
Centrifuga ad alta velocità	Hitachi	CT15E/CT15RE	Usato per la preparazione del siero e del campione.
Kit IL-10 ELISA (Mouse)	MEIMIANA	MM-0176M2	Usato per valutare i livelli sierici di IL-10.
Kit IL-17 ELISA (Mouse)	Abclonale	RK00039	Usato per misurare i livelli di IL-17 sierico.
IL-1 e beta; Kit ELISA (Mouse)	Abclonale	RK00006	Utilizzato per la rilevazione di IL-1 e beta siero; livelli.
Kit IL-6 ELISA (Mouse)	Abclonale	RK00008	Usata per quantificare i livelli sierici di IL-6.
ImageJ (Fiji) Software	Istituti Nazionali di Salute (NIH)	Versione 1.53c	Software open source utilizzato per l'elaborazione e la quantificazione delle immagini.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	Versione 3.7	Software di imaging utilizzato per la cattura di vetrine istopatologiche.
Metanolo (grado LC-MS)	Merck	106035	Utilizzato per la preparazione del campione di metabolomica e per la fase mobile LC-MS.
Topi (Maschio C57BL/6)	Anokang Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Animali da sperimentazione (età 6 e ndash; 8 settimane, 20 e ndash; 25 g) usata per il modello UC indotto dal DSS.
Database mzCloud	Thermo Fisher Scientific	https://www.mzcloud.org/	Database utilizzato per il matching spettrale MS/MS.
Microscopio ottico	Leica	DM500	Utilizzato per l'osservazione istopatologica.
Paeonia lactiflora (Chi Shao)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costituente di LXDHD (Dose: 0,6 g).
Corteccia suffruticosa della Paeonia (Mu Dan Pi)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costituente di LXDHD (dose: 0,5 g).
Paraformaldeide (4%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Usato per fissare i tessuti del colon.
Microtomo patologico	Leica	RM2016	Utilizzato per la preparazione di sezioni di tessuto paraffinico.
Cheldendron chinense (Huang Bo)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costituente di LXDHD (dose: 0,5 g).
Platycladus orientalis (Ce Bai Ye Tan)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costitutiva di LXDHD (Dose: 0,7 g).
Spettrometro di massa ad alta risoluzione Q	Thermo Fisher Scientific	Q Esattivo	Spettrometro di massa basato su Orbitrap per analisi LC–MS.
R Software	R Foundation for Statistical Computing	Versione 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	Software utilizzato per analisi di arricchimento GO e KEGG.
Rehmannia glutinosa (Sheng Di Huang)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costitutiva di LXDHD (Dose: 2,1 g).
Sanguisorba officinalis (Di Yu Tan)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costituente di LXDHD (Dose: 0,6 g).
Saposhnikovia divaricata (Fang Feng)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costitutiva della LXDHD (Dose: 0,3 g).
Scutellaria baicalensis (Huang Qin)	Ospedale di Medicina Cinese della Provincia di Jiangsu	Gruppo: 2409001	Erba costituente di LXDHD (dose: 0,5 g).
Pentobarbital sodico (1%)	Sigma-Aldrich	P3761	Utilizzato per anestesia animale prima della raccolta del campione.
SoftMax Pro Software	Dispositivi molecolari	Versione 7.1	Software di acquisizione e analisi dati utilizzato con il lettore di micropiastre per ELISA.
STRING Database	Consorzio STRING	https://string-db.org/	Database utilizzato per proteine e ndash; Analisi delle interazioni proteiche.
TCMSP Database	Piattaforma TCMSP	https://tcmsp-e.com/	Database utilizzato per lo screening dei composti attivi e la previsione dei target dei farmaci.
TNF-α Kit ELISA (Mouse)	Abclonale	RK00027	Utilizzato per determinare TNF-e alfa sierico; concentrazioni.
Sistema Ultimate 3000 RS LC	Thermo Fisher Scientific	Ultimate 3000 RS	Sistema UHPLC accoppiato con spettrometria di massa.
Purificatore a ultrasuoni	Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd	KQ3200E	Utilizzato per l'estrazione ultrasonica di LXDHD.
UniProt Database	Consorzio UniProt	https://www.uniprot.org/	Database utilizzato per la standardizzazione dei nomi di geni e proteine.
Miscelatore a vortice	Beijing PowerStar Technology Co., Ltd	LC-Vortice-P1	Usato per il mixaggio di campioni.
Colonna Welch AQ-C18 (150 e volte 2,1 mm, 1,8 e mu; m)	Materiali Welch	AQ-18-15021	Colonna utilizzata per la separazione di metaboliti e componenti erboristici.
Xylene	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	1330-20-7	Utilizzato per la pulizia dei tessuti durante l'elaborazione istologica.