Misurazione di cellule vive mRNA Dinamica Translazionale con Etichettatura Luminescente Divisa in Cellule HEK293

Sommario

Qui presentiamo un metodo flessibile e compatibile con l'alta produttività per misurare in cellula la dinamica della traduzione dell'mRNA in tempo reale in cellule HEK293, utilizzando un'etichettatura luminiscente divisa. Questo saggio versatile permette di distinguere gli effetti strutturali, supporta l'ottimizzazione della trascrizione in vitro e accelera lo sviluppo di terapie a base di mRNA.

Abstract

Lo sviluppo rapido di vaccini contro il COVID-19 ha illustrato il potenziale dei farmaci basati sull'RNA messaggero (mRNA) di trasformare lo sviluppo terapeutico. Come l'mRNA maturo, l'mRNA trascritto in vitro possiede gli stessi elementi, tra cui un cap 5’, regioni non tradotte (UTR), sequenza codificante e una coda poli(A). Studi precedenti che hanno analizzato gli effetti di questi componenti sulla traduzione dell'mRNA hanno utilizzato principalmente proteine reporter altamente ingegnerizzate, che mostrano traduzione efficiente e stabilità proteica. Poiché gli elementi strutturali di ciascun mRNA influenzano in modo differenziale la loro traduzione, è fondamentale identificare la progettazione ottimale in relazione alla proteina terapeutica di interesse (POI). Per consentire la caratterizzazione della traduzione della POI, è stato impiegato un sistema di complementazione della luciferasi divisa. Un breve peptide marcatore (HiBiT), che può essere fuso a uno dei due estremi della POI, si associa al suo eterodimero complementare (LgBiT), ristabilendo l'attività enzimatica in presenza di un substrato permeabile alle cellule. Finora, il marcatore luminiscente diviso è stato utilizzato principalmente per studi ad alto rendimento sul turnover proteico. In precedenza abbiamo dimostrato come il marcatore luminiscente diviso possa essere impiegato per quantificare in modo ad alto rendimento la traduzione dell'mRNA nel tempo in cellulo in cellule HEK293 che esprimono costitutivamente l'eterodimero complementare. In questo studio, ulteriormente dimostriamo la versatilità del saggio e descriviamo come possa essere utilizzato per ottimizzare la trascrizione in vitro, riducendone i costi. Il sistema del saggio è in grado di distinguere in modo univoco le alterazioni nei componenti strutturali, evidenziando al contempo gli effetti dell'ottimizzazione della sequenza codificante mediante geni non ingegnerizzati. Inoltre, dimostriamo che una riduzione del 4 volte nella concentrazione del cap 5’ durante la trascrizione in vitro produce una traduzione equivalente in cellulo. Questi risultati illustrano come il marcatore luminiscente diviso possa essere facilmente integrato nel flusso di lavoro dei farmaci a base di mRNA, consentendo il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'espressione proteica mediata dall'mRNA in cellulo, offrendo così un metodo versatile per lo sviluppo di terapie basate sull'mRNA.

Introduzione

I farmaci e le applicazioni di ricerca basati sull'RNA messaggero (mRNA) si sono rapidamente sviluppati negli ultimi anni, grazie al successo dei vaccini a mRNA^1,2 e alla crescente consapevolezza della versatilità dell'RNA come biomolecola programmabile. Una sfida centrale in questo campo è la capacità di valutare in modo quantitativo e dinamico l'efficienza della traduzione dell'mRNA in diversi contesti. Il metodo descritto in questo articolo – che sfrutta un sistema di marcatura luminiscente diviso – fornisce una piattaforma flessibile e scalabile per lo studio della traduzione dell'mRNA in tempo reale all'interno delle cellule in cellulo³. L'obiettivo generale di questo metodo è consentire ai ricercatori di misurare come caratteristiche della sequenza, modifiche chimiche ed elementi strutturali influenzino la cinetica della traduzione e il successivo turnover proteico, offrendo così uno strumento potente per ottimizzare le costruzioni di mRNA per applicazioni terapeutiche e nella ricerca di base.

In vitro l'mRNA trascritto rispecchia l'architettura essenziale dei trascritti maturi, incorporando un cap 5′, regioni non tradotte (UTR), una sequenza codificante e una coda poli(A), includendo spesso nucleotidi modificati per ridurre l'immunogenicità^4,5. Studi approfonditi hanno dimostrato che ciascuno di questi elementi – singolarmente e in combinazione – può essere ingegnerizzato per influenzare fortemente l'efficienza della traduzione e il rendimento proteico^6,7. Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti si è basata su proteine reporter altamente ottimizzate come la Green Fluorescent Protein (GFP)⁷, NanoLuc⁸ o la proteina spike di SARS-CoV-2^8,9, progettate per tradursi con elevata efficienza e produrre proteine estremamente stabili, e pertanto non riflettono le sfide incontrate nei contesti terapeutici. Poiché gli mRNA terapeutici codificano per diverse proteine di interesse (POI), ciascuna soggetta a vincoli strutturali unici e a regolazioni specifiche per tipo cellulare, i principi di progettazione che massimizzano la traduzione per un costrutto potrebbero non essere generalizzabili a un altro, come precedentemente riportato³. L'identificazione della configurazione ottimale per una data POI terapeutica è quindi essenziale e richiede metodi in grado di valutare in modo sensibile e sistematico come le singole caratteristiche del trascritto contribuiscano all'output proteico.

Metodi basati sui ribosomi, come il profilo dei polisomi, distinguono le frazioni di traduzione mediante centrifugazione su gradiente¹⁰, mentre il profilo dei ribosomi (Ribo-seq) fornisce una risoluzione a livello nucleotidico dell'occupazione ribosomiale, dei siti di inizio e delle pause¹¹. Come nel caso del Ribo-seq, altri approcci basati sul sequenziamento, come il sequenziamento ad alta capacità dell'RNA isolato mediante immunoprecipitazione con crosslinking (HITS-CLIP) e la purificazione per affinità dei ribosomi in traduzione (TRAP), caratterizzano ulteriormente la traduzione di RNA associati a proteine leganti l'RNA o a ribosomi¹². Sebbene potenti, queste tecniche richiedono preparazioni complesse, attrezzature specializzate e competenze informatiche, risultando quindi inadatte allo sviluppo ad alto rendimento di mRNA terapeutici. L'immunoprecipitazione delle catene nascenti¹³ misura l'efficienza di traduzione utilizzando proteine marcate con il FLAG immunoprecipitate dai ribosomi e quantificate mediante reazione a catena della polimerasi associata alla trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR). Sebbene adattabile agli mRNA terapeutici, questo saggio è laborioso, manca di risoluzione temporale ed è inadatto ad applicazioni ad alto rendimento. Il sistema SunTag¹⁴ consente misurazioni in tempo reale dell'output della sintesi proteica e della regolazione traduzionale a partire da singole molecole di mRNA, sfruttando l'interazione tra un frammento variabile monocatenario (scFv) fuso alla GFP e ripetizioni in tandem di un epitopo peptidico. Questo sistema permette misurazioni dinamiche della traduzione e del localizzazione con risoluzione a livello di singolo mRNA ed è stato pertanto utilizzato per sviluppare numerosi sistemi di tracciamento delle catene nascenti^15,16. Tuttavia, questo approccio ha un basso rendimento ed esige l'uso di microscopi ad alta potenza.

Sebbene il marcamento della proteina nascente sia inevitabile, è stato identificato il potenziale utilizzo di un piccolo marcatore peptidico derivato dalla luciferasi NanoLuc per rilevare la traduzione dell'mRNA in cellule vive. La NanoLuciferasi è stata ingegnerizzata in modo da suddividersi in una subunità piccola, di 11 amminoacidi (HiBiT), e una più grande, di 158 amminoacidi (LgBiT), che possono dimerizzarsi rapidamente e, in presenza di substrato, ricostituire una luciferasi funzionale^17,18. Il sistema di marcamento luminiscente diviso presenta diversi vantaggi chiave per lo studio della dinamica dell'mRNA. In primo luogo, le dimensioni minime della subunità piccola fusa al POI consentono al costrutto codificato di rimanere il più possibile simile alla proteina d'interesse nativa. Poiché la lunghezza della sequenza codificante può influenzare direttamente i rapporti di traduzione¹⁹, la riduzione al minimo della lunghezza del marcatore migliora la previsione della dinamica di traduzione degli mRNA sintetici. In modo cruciale, questa strategia di marcatura minima permette di rilevare differenze nella traduzione indotte da variazioni sinonime nella sequenza codificante, consentendo di analizzare l'efficienza traduttiva indipendentemente dalla sequenza o stabilità della proteina³. Per questo motivo, l'uso di marcatori più grandi, come proteine fluorescenti o luciferasi a lunghezza intera, risulta subottimale. In secondo luogo, il sistema di marcamento luminiscente diviso qui impiegato consente una generazione immediata del segnale. La sua rapida ed efficiente reazione di complementazione in cellulo presenta un'affinità elevata (K_D = 700 pM) ed è stata utilizzata per misurare la modulazione del turnover proteico con letture distanziate anche soltanto di 30 secondi¹⁸. Mentre il sistema originale di marcamento luminiscente diviso è stato principalmente confrontato con altri sistemi di luciferasi divisa^17,18, il vantaggio principale in questo contesto è che la generazione del segnale non è limitata dalla maturazione della proteina. Al contrario, le proteine fluorescenti richiedono la maturazione del cromoforo, un processo che può richiedere da minuti a ore²⁰, limitando così la risoluzione temporale. Infine, il sistema di marcamento luminiscente diviso qui impiegato supera i limiti dei sistemi basati su proteine fluorescenti divise, che tipicamente necessitano della formazione del cromoforo dopo la complementazione²¹, introducendo un ulteriore ritardo e limitandone l'idoneità per lo studio di processi rapidi e dinamici. Studi precedenti hanno dimostrato l'utilità del marcamento luminiscente diviso in saggi di turnover proteico e in studi sulla degradazione^22,23,24. L'estensione di questa tecnologia consolidata alla cinetica della traduzione rappresenta un significativo avanzamento metodologico. Ad esempio, mentre il profiling dei ribosomi può rivelare la densità ribosomiale lungo i trascritti, non riesce facilmente a catturare variazioni dinamiche nei tassi di inizio o allungamento della traduzione in diverse condizioni. Come illustrato in precedenza³, questo sistema di marcamento luminiscente diviso è in grado di rilevare differenze derivanti da alterazioni della struttura del cap, della composizione della regione non tradotta 5′ (UTR), dell'ottimizzazione dei codoni, delle modifiche nucleotidiche e della lunghezza della coda poli(A), tutti fattori determinanti critici per l'efficienza traduttiva. Questa ampia applicabilità rende il metodo particolarmente potente per analizzare il contributo di singole caratteristiche dell'mRNA al livello complessivo di espressione proteica. Vale la pena notare che, a seconda dello strumento utilizzato, questa tecnologia consente di acquisire dati sia a livello di singola cellula che di pozzetto intero. Piattaforme di imaging in grado di acquisire immagini basate sulla luminescenza possono potenziare questa tecnologia per lo studio della dinamica traduttiva a livello di singola cellula. In questo lavoro ci concentriamo su un'applicazione basata su lettore di piastre e pozzetti, grazie alla sua natura da media ad alta produttività e al ridotto fabbisogno di analisi dei dati.

I ricercatori che prendono in considerazione questo metodo dovrebbero valutarne l'idoneità alla luce dei loro specifici obiettivi sperimentali. Il saggio è particolarmente utile in contesti in cui è richiesta la schermatura ad alto rendimento di costrutti di mRNA sintetico, come nelle linee di progettazione terapeutica basate sull'mRNA. È ben adatto ad analisi comparative di caratteristiche di sequenza dell'mRNA sintetico – inclusi le regioni non tradotte, l'uso dei codoni o le modifiche dei nucleotidi – in cui possono essere rilevate differenze sottili nell'efficienza della traduzione³. Poiché il sistema è compatibile con piattaforme di traduzione acellulare, saggi su cellule vive e un saggio litico specifico per punto temporale, offre flessibilità ai ricercatori che desiderano adattare il proprio disegno sperimentale a studi meccanicistici o a ricerche applicate. Allo stesso tempo, è importante riconoscere i limiti della tecnica. In modo critico, il saggio di marcatura luminiscente divisa non fornisce risoluzione dell'occupazione dei ribosomi, una capacità che rimane unica agli approcci di footprinting ribosomiale, né misura direttamente la stabilità o la degradazione dell'RNA, che potrebbe dover essere valutata mediante metodi complementari. Tuttavia, a causa dei limiti delle tecniche esistenti basate sui ribosomi, i ricercatori dipendono da saggi basati su marcatori, come il sistema di luminescenza divisa, per indagare l'espressione proteica guidata dall'mRNA in funzione del tempo come proxy della dinamica traduttiva. Pertanto, sebbene questo sistema rappresenti uno strumento potente per monitorare l'espressione proteica guidata dall'mRNA sintetico, la sua appropriatezza dipende dal fatto che la domanda di ricerca si concentri sull'output proteico dinamico piuttosto che sul posizionamento fine dei ribosomi o sul decadimento dell'RNA.

In sintesi, il sistema di marcatura luminiscente divisa rappresenta un metodo potente e versatile per lo studio della traduzione dell'mRNA. Il suo obiettivo generale è fornire ai ricercatori un sistema flessibile, scalabile, ad alto rendimento e in grado di rilevare differenze nell'espressione proteica derivanti da mRNA sintetici con diversi elementi strutturali e di sequenza³. La motivazione alla base del suo sviluppo risiede nella necessità di superare i limiti delle tecniche esistenti, offrendo vantaggi in termini di sensibilità, scalabilità e risoluzione temporale. Inserito nel contesto più ampio della letteratura sulla biologia e terapia dell'RNA, questo metodo costituisce un prezioso arricchimento del repertorio sperimentale, consentendo sia approfondimenti fondamentali sia progressi applicativi. Valutando attentamente i punti di forza e le limitazioni del saggio, i ricercatori possono determinarne l'adeguatezza per le loro specifiche applicazioni, massimizzandone così l'impatto nel campo in rapida evoluzione delle scienze dell'RNA.

Protocollo

Una rappresentazione grafica dell'intero protocollo è mostrata nella Figura 1.

1. Preparazione del modello per la trascrizione in vitro (IVT)

NOTA: Per preparare il modello di DNA per la trascrizione in vitro (IVT), assicurarsi che il DNA plasmidico contenga un promotore per la RNA polimerasi (generalmente T7 o SP6), le regioni UTR 5’ e 3’ e il frame di lettura aperto del POI (Figura 1).

1. Linearizzare il DNA plasmidico utilizzando un enzima di restrizione con un sito di taglio singolo localizzato dopo l'UTR 3’ e assemblare la reazione secondo le istruzioni del produttore. Dopo l'incubazione, purificare la reazione di digestione mediante un kit di purificazione del DNA basato su colonnine. Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro.
2. Per confermare la linearizzazione, preparare un gel di agarosio TAE al 1% contenente il colorante per DNA Bromuro di Etidio a 0,1 µg/mL. Mescolare 150 ng di DNA digerito con acqua e colorante di carico. Caricare sul gel di agarosio il campione, il plasmide non tagliato e una scala di DNA, ed eseguire l'elettroforesi a 100 V per 40 minuti in tampone TAE 1× (Tris-acetato-EDTA). Visualizzare con un sistema di imaging per gel.
   ATTENZIONE: La soluzione di Bromuro di Etidio è un potente mutageno e richiede un'attenta manipolazione con l'uso di idonei dispositivi di protezione individuale (DPI).
3. Se il DNA plasmidico non presenta una coda poli(A) immediatamente dopo l'UTR 3’, introdurla mediante PCR. Eseguire la PCR secondo le istruzioni del produttore utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà e primer opportunamente progettati. Assicurarsi che l'amplicone includa il promotore T7, la sequenza codificante (open reading frame) e una coda poli(A).
   NOTA: Le tecnologie di cappuccio possono richiedere sequenze specifiche al promotore T7; tali requisiti possono essere soddisfatti con un adeguato design del primer diretto. Il primer inverso si lega all'estremità dell'UTR 3’ e introduce una coda poli(A) (lunghezza raccomandata di almeno 80 T). Per costrutti con alto contenuto di GC, si raccomandano PCR a incremento termico (step-up PCR) e/o l'aggiunta di DMSO al 3%.
4. Per verificare il successo della PCR, preparare un gel di agarosio TAE contenente Bromuro di Etidio (vedi passaggio 1.2). Se la lunghezza del costrutto è ≥1 kb oppure <1 kb, preparare rispettivamente un gel al 1% o al 2%. Mescolare 5 µL della reazione PCR con acqua e colorante di carico. Caricare sul gel di agarosio sia il campione che una scala di DNA ed eseguire l'elettroforesi a 100 V per 40 minuti in tampone TAE. Visualizzare con un sistema di imaging per gel.
5. Dopo la conferma dimensionale della PCR, purificare la reazione PCR mediante un kit di purificazione del DNA basato su colonnine. Eluire in 15–20 µL di tampone di eluizione (spesso fornito insieme al kit di purificazione del DNA) o in acqua priva di nucleasi per concentrare il template di DNA da utilizzare nella trascrizione in vitro (IVT). Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro.

2. Trascrizione in vitro

1. Prima di iniziare, spruzzare e pulire il banco di lavoro, i guanti e le pipette con una soluzione decontaminante per RNasi. Per migliorare resa e qualità, eseguire questa procedura in un ambiente sterile sotto cappa.
2. Scongelare e assemblare i componenti di un kit per la trascrizione in vitro (IVT) basato su T7 seguendo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Alcuni produttori raccomandano l'uso di ditiotreitolo (DTT, 0,1 M) per limitare l'ossidazione della reazione e migliorarne l'efficienza. Questo passaggio è raccomandato quando compatibile con il kit. Se si utilizzano dNTP modificati, sostituire il corrispondente nucleotide non modificato con la stessa quantità di nucleotide modificato. Valutare la resa di una reazione dimezzata, poiché non è stata osservata alcuna sostanziale miglioramento della resa con una reazione completa. Quando si sintetizza più di un mRNA, si raccomanda di preparare una miscela master per ridurre errori di pipettaggio e variabilità.
3. Pipettare accuratamente e mescolare brevemente, quindi incubare a 37 °C per 5 h con coperchio riscaldato per evitare condensa. Prolungare l'incubazione per tutta la notte se necessario, poiché ciò ha un effetto minimo sulla resa o integrità dell'mRNA.
4. Aggiungere 1 µL di DNasi I e pipettare accuratamente. Incubare a 37 °C per 30 min.
5. Purificazione dell'RNA trascritto in vitro (IVT)
   1. Pulire la reazione IVT utilizzando un kit di purificazione dell'RNA basato su colonne seguendo le istruzioni del produttore (diversi kit possono portare a livelli diversi di recupero e avere capacità di legame differenti). Per l'eluzione, aggiungere 60 µL di acqua priva di nucleasi e incubare a temperatura ambiente per 5 min prima della centrifugazione.
   2. In alternativa, utilizzare la precipitazione con cloruro di litio come approccio più economico e flessibile.
      1. Aggiungere un volume uguale di cloruro di litio 7,5 M alla reazione, mescolare e incubare a -20 °C per tutta la notte.
      2. Centrifugare a 18.300 × g per 20 min a 4 °C, quindi rimuovere con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet di RNA.
      3. Lavare con 950 µL di etanolo al 70% e centrifugare a 18.300 × g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il soprannatante, lasciare asciugare il pellet per circa 5 min a temperatura ambiente e risospendere in acqua priva di nucleasi (60 µL è standard; ridurre il volume in base alle dimensioni del pellet per aumentare la concentrazione).
         ATTENZIONE: Il cloruro di litio può causare irritazione cutanea o oculare se non si utilizzano dispositivi di protezione individuale adeguati. Indossare guanti e protezione oculare durante la manipolazione. L'etanolo è un liquido altamente infiammabile e può causare irritazione oculare. Mantenere lontano da fiamme libere e indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusa la protezione oculare.
6. Quantificare l'mRNA utilizzando uno spettrofotometro. Assicurarsi che il rapporto A260/A280 per l'mRNA sia ~2,0 e verificare che il rapporto A260/A230 rientri tra 1,8 e 2,2.
7. Per confermare il successo della IVT, preparare un gel di agarosio al 1% in tampone TAE (non denaturante) contenente bromuro di etidio. Mescolare 500 ng di mRNA con acqua e colorante di carico, e seguire le istruzioni del produttore per la preparazione della scala di RNA e le istruzioni di denaturazione. Caricare il gel di agarosio ed eseguire l'elettroforesi a 80 V per 40 min in tampone TAE. Visualizzare con un sistema di imaging per gel.
8. Per una ulteriore conferma della dimensione corretta dell'mRNA, analizzare i campioni su un Bioanalyzer.
9. Per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento, aliquotare l'mRNA nel volume richiesto per l'esperimento. Ad esempio, utilizzare 1,2 pmol di mRNA per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Pertanto, aliquotare il volume appropriato per 1,2 pmol × n replicati, quindi conservare a -80 °C.

3. Trasfettazione inversa di HEK293

NOTA: Per ottenere misurazioni temporali, è necessaria una linea cellulare che esprima costitutivamente il frammento complementare di luciferasi. Questo risultato può essere ottenuto generando una linea cellulare stabile mediante trasfezione di un plasmide che esprima il frammento di luciferasi richiesto e successiva selezione clonale. Ciò consente all'utente di misurare la dinamica traduttiva dell'mRNA risolta nel tempo in qualsiasi contesto cellulare desiderato. In alternativa, linee cellulari che esprimono il frammento di luciferasi richiesto possono essere acquistate. Questi esperimenti sono stati condotti utilizzando cellule HEK293 che esprimono costitutivamente l'eterodimero complementare.

1. Prima di iniziare, scongelare l'mRNA su ghiaccio per evitare degradazione.
2. Preparare i complessi di trasfezione. Per una piastra a 96 pozzetti, sono necessari 1,2 pmol di mRNA per pozzetto. Se si esegue la replicazione, preparare una quantità sufficiente per 2,5 repliche per compensare eventuali errori di pipettaggio. Mescolare quindi 3 pmol di mRNA con mezzo Opti-MEM a ridotto contenuto di siero fino a un volume finale di 50 µL (20 µL/pozzetto).
3. Aggiungere 0,5 µL di reagente di trasfezione a base di lipidi cationici (0,2 µL/pozzetto), mescolare aspirando e dispensando ripetutamente con la pipetta e incubare a temperatura ambiente. Dopo 5 minuti di incubazione, mescolare nuovamente aspirando e dispensando, quindi aggiungere 20 µL per pozzetto in una piastra microtitolazione bianca a fondo piatto da 96 pozzetti. Si consiglia di posizionare i pozzetti di trasfezione al centro della piastra, lasciando vuoti i pozzetti periferici.
4. Preparare le cellule HEK293 rimuovendo il mezzo e lavandole con 2 mL di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) priva di Ca²⁺ e Mg²⁺. Rimuovere il liquido di lavaggio e aggiungere 500 µL di tripsina-EDTA, quindi incubare a 37 °C per 3 minuti.
5. Durante la dissociazione cellulare, riempire i pozzetti periferici della piastra a 96 pozzetti con PBS per ridurre l'evaporazione del mezzo durante la coltura cellulare. Se tutti i pozzetti sono necessari, la piastra può essere allagata con PBS tra i pozzetti.
6. Aggiungere 4,5 mL di mezzo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con L-glutammina 1× e siero fetale bovino (FBS) al 10% per raccogliere le cellule. Effettuare il conteggio cellulare utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatico.
7. Trasferire la quantità necessaria di cellule (sufficiente per seminare 1 x 10⁵ cellule per pozzetto) più 3 pozzetti aggiuntivi (per errori di pipettaggio) in un tubo nuovo e centrifugare a 500 × g per 2 minuti.
8. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule nel volume richiesto di mezzo Leibovitz L-15 (senza fenolo) integrato con FBS al 10% e substrato per cellule vive Endurazine (1:200) per ottenere una concentrazione finale di 1 × 10⁶ cellule/mL. Mescolare con una pipetta serologica per assicurare una miscelazione completa dell'Endurazine. Pipettare 100 µL (1 × 10⁵ cellule) di cellule risospese per pozzetto.
   NOTA: Se si eseguono esperimenti cinetici della durata di 72 h, aumentare il volume a 200 µL per evitare l'evaporazione.
9. Immediatamente dopo la trasfezione, posizionare le cellule in un lettore di piastre (luminometro) regolato a 37 °C. Registrare i dati a intervalli regolari con un tempo di integrazione di 1 s. A causa dell'efficienza del sistema di complementazione, il segnale è rilevabile entro pochi minuti. Pertanto, per ottenere una lettura accurata del valore di base, questo passaggio deve essere eseguito tempestivamente. Gli intervalli dipendono dall'esperimento e dallo strumento; tuttavia, in questi esperimenti, si è rivelato ottimale misurare ogni 12 minuti per esperimenti con durata di 18 h e ogni 48 minuti per esperimenti di 72 h. La luminescenza non richiede un filtro per la misurazione; tuttavia, si è osservato un rapporto segnale-rumore migliore utilizzando un filtro da 530–540 nm.
   NOTA: Un segnale di trasferimento di energia per risonanza bioluminescente (BRET) viene prodotto da eGFP marcata con luciferasi divisa; pertanto, un filtro a 530–540 nm rileverà sia il segnale luminiscente che quello fluorescente. Per evitare il rilevamento del BRET, utilizzare un filtro a 460–480 nm oppure, in alternativa, impiegare una proteina non fluorescente come MYL3 come riferimento.

4. Analisi dei dati

1. Generare i fold change in unità di luminescenza relativa (RLUs), normalizzando il segnale di ogni condizione al suo primo punto temporale (t0, normalizzato alla media dei replicati tecnici), poiché il segnale all'inizio del saggio rappresenta il livello di fondo.
2. Ridurre la variabilità tra i replicati biologici normalizzando rispetto a una condizione di controllo.
3. Scegliere l'analisi statistica per il saggio, a seconda della domanda posta, tra un singolo punto temporale o l'area sotto la curva (AUC).
   1. Per un singolo punto temporale, utilizzare i punti temporali in cui si verifica l'espressione massima (dipendente dal POI) insieme al punto finale. Riportare in grafico l'RLU calcolato al passaggio 4.1 al punto temporale specifico (ad esempio, 240 min) e analizzarlo mediante un test statistico appropriato.
   2. Misurare la dinamica della traduzione e degradazione proteica calcolando l'AUC per un intervallo di tempo specifico (ad esempio, da t0 a 240 min) o per l'intera durata del saggio (ad esempio, da t0 al punto finale). Normalizzare il valore di AUC per ogni replicato biologico alla media dell'mRNA di riferimento, ottenendo così una misura del fold change in AUC che può essere analizzata mediante test statistici appropriati.

Risultati

Esistono diversi modi per ottimizzare l'efficacia economica di questo protocollo. Ad esempio, la reazione di trascrizione in vitro (IVT) è stata ridotta a metà del volume raccomandato dal produttore, e si è riscontrato che il rendimento ottenuto soddisfa la quantità necessaria per in cellula esperimenti. Va notato che la lunghezza e la complessità della sequenza influenzano il rendimento della trascrizione in vitro (IVT), pertanto un'ottimizzazione efficace del protocollo dovrebbe produrre almeno 50 µg di mRNA per reazione di IVT. Come i kit per reazioni di IVT, anche i reagenti di capping hanno spesso un costo elevato. Considerando che è richiesto un solo cap per ogni molecola di mRNA, ipotizziamo che la reazione di IVT contenga un eccesso di molecole di cap rispetto al numero risultante di molecole di mRNA. Pertanto, è stata valutata la possibilità di ottimizzare ulteriormente il protocollo titolando la quantità di reagente di capping aggiunta alla reazione di IVT, i cui risultati sono mostrati in Figura 2. È stato aggiunto il 100% (cap finale 10 mM), 50%, 25% oppure 0% (senza cap) del reagente di cappuccio a 10 µL Le reazioni di trascrizione in vitro (IVT) e l'mRNA di eGFP risultante sono stati trasfettati in cellule HEK293 che esprimono costitutivamente l'eterodimero complementare. Come controllo di normalizzazione, è stato trasfettato anche MYL3 (cappucciato al 100%), poiché questo gene endogeno, che codifica per una proteina strutturale arricchita nel muscolo, presenta dinamiche di traduzione simili a quelle dell'eGFP, ma con un segnale più vicino a quello di altri geni endogeni.³. In accordo con dati precedenti³, l'mRNA eGFP privo di cap ha determinato un'assenza di traduzione analoga al controllo con placebo (Figura 2A). L'mRNA di eGFP sintetizzato con il 25% o il 50% del reagente di cappuccio raccomandato ha mostrato livelli di espressione paragonabili al 100%Figura 2A), con conseguente assenza di differenze nei valori dell'area sotto la curva (AUC) durante il periodo di 18 hFigura 2B). Questi risultati indicano che, in queste condizioni, il reagente di cappuccio è presente in eccesso e che la riduzione della sua concentrazione non compromette il rendimento traduzionale, il che è coerente con un'incorporazione sufficiente del cap. I risultati presentati in Figura 2 sono specifiche del marchio del reagente di cappuccio utilizzato e devono essere ottimizzate per reagenti diversi.

Sebbene i progressi nella tecnologia dei cap e l'incorporazione di nucleotidi modificati abbiano potenziato l'espressione dell'mRNA, lo sviluppo di algoritmi di progettazione dell'mRNA ha ulteriormente migliorato tale espressione. Questi algoritmi si concentrano sull'ottimizzazione della stabilità dell'mRNA e dell'uso dei codoni, migliorando rispettivamente l'energia libera minima (MFE) e l'indice di adattabilità dei codoni (CAI). Per testare l'effetto dell'ottimizzazione sull'espressione dell'mRNA, è stato utilizzato LinearDesign⁹. Questo algoritmo si basa sull'inserimento di un valore lambda, un parametro di scala usato nelle formule di ottimizzazione che determina quanto fortemente l'algoritmo privilegi la MFE o il CAI. Le stesse impostazioni di ottimizzazione (ovvero lo stesso valore di lambda) sono state applicate a quattro fattori di trascrizione – HAND2, GATA4, MEF2C e TBX5. Figura 3 analizza gli effetti dell'ottimizzazione sui tassi di traduzione. L'ottimizzazione ha migliorato i valori sia di MFE che di CAI per tutti i fattori di trascrizione, con MEF2C che ha mostrato i cambiamenti maggiori in entrambi i parametri (Figura 3A). Un marcatore luminiscente diviso è stato fuso al termine C-terminale di ciascun costrutto, preceduto da un linker GS, e l'mRNA è stato sintetizzato per tutti e quattro i fattori di trascrizione, sia nella forma non ottimizzata che in quella ottimizzata. Per assicurare che ciascun mRNA possa essere tradotto e produrre una proteina del peso molecolare atteso, è stato impiegato un sistema di traduzione acellulare a base di lisato di reticolociti di coniglio³. Le proteine risultanti sono state separate mediante western blot utilizzando la subunità enzimatica della proteina luciferasi divisa e il substrato appropriato per rilevare il marcatore luminiscente diviso. L'analisi western blot ha mostrato che l'ottimizzazione produceva comunque proteine che corrispondevano al loro peso molecolare atteso (Figura 3B). Le cellule HEK293 sono state trasfettate con le forme non ottimizzate o ottimizzate di ciascun fattore di trascrizione, e sono state effettuate registrazioni in cellule vive per 18 h. Per tutti gli esperimenti di 18 h, sono state effettuate misurazioni da tre replicati biologici, e per ciascun campione sono stati utilizzati tre replicati tecnici in ogni esperimento ripetuto. L'ottimizzazione di HAND2 (Figura 3C) e GATA4 (Figura 3D) non ha avuto alcun effetto sull'espressione (determinato mediante un test t a due campioni indipendenti), con un aumento di 1,07 volte e una diminuzione di 1,25 volte, rispettivamente, rispetto alle controparti non ottimizzate. Al contrario, l'ottimizzazione di MEF2C (Figura 3E) e TBX5 (Figura 3F) ha determinato un aumento statisticamente significativo dell'espressione, con un incremento di 2,25 (P = 0,0486, n = 3, test t a due campioni indipendenti) e di 1,72 volte (P = 0,0379, n = 3, test t a due campioni indipendenti) nell'AUC rispetto alle rispettive versioni non ottimizzate. In linea con questi risultati, si osservano differenze non solo nell'espressione finale, ma anche nella forma e nel tasso delle curve di espressione, indicando che il saggio è in grado di rilevare variazioni nella dinamica traduzionale nel tempo. Per determinare se questo aumento di espressione si mantiene per un periodo più lungo, le cellule HEK293 sono state trasfettate con mRNA di MEF2C, e le registrazioni sono state effettuate per 72 h (Figura 3G). Come negli esperimenti di 18 h, sono state effettuate misurazioni da tre replicati biologici, e per ciascun campione sono stati utilizzati tre replicati tecnici in ogni esperimento ripetuto. Similmente a quanto osservato dopo 18 h, l'MEF2C ottimizzato ha aumentato significativamente l'espressione, con un miglioramento di 2,5 volte (P = 0,0061, n = 3, test t a due campioni indipendenti) nell'AUC rispetto alla versione non ottimizzata. Sebbene vi sia un aumento sostanziale dell'espressione con l'ottimizzazione, questi risultati dimostrano che, in questo caso, l'ottimizzazione non impedisce il decadimento entro 72 h, con entrambe le forme di MEF2C che mostrano pendenze simili a partire da 24 h. Questo decadimento è probabilmente dovuto alla degradazione dell'mRNA lineare e/o alla divisione cellulare. Nel complesso, questi risultati dimostrano il potenziale degli algoritmi di progettazione dell'mRNA nel migliorare l'espressione dell'mRNA; tuttavia, evidenziano che l'ottimizzazione deve essere effettuata in modo dipendente dal POI.

Figura 1: Flusso di lavoro per la sintesi di mRNA e il saggio con tag luminiscente diviso in cellule HEK293. Per eseguire la trascrizione in vitro (IVT) per il saggio con tag luminiscente diviso, assicurarsi che il plasmide contenga un promotore per RNA polimerasi (T7 o SP6), le regioni UTR 5’ e 3’, e la sequenza codificante per la proteina di interesse fusa a una piccola subunità della luciferasi HB (HiBiT). Il plasmide viene linearizzato con un enzima di restrizione a taglio singolo, fornendo il template per la PCR con poli T, che successivamente viene utilizzato come stampo per la IVT. L'mRNA viene sintetizzato, complessato con liposomi e retro-trasfettato in cellule HEK293 che esprimono costitutivamente la subunità più grande della luciferasi (LB), che possono essere immediatamente posizionate in un lettore di piastre per acquisire registrazioni in tempo reale. Al termine dell'esperimento, si procede all'analisi dei dati per la normalizzazione e successiva analisi statistica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Una riduzione quadrupla della concentrazione del reagente di cappuccio produce un'espressione di eGFP paragonabile a quella ottenuta con concentrazione piena. (A) Saggio cinetico su cellule vive in cellule HEK293 trasfettate con mRNA di eGFP a concentrazioni variabili di reagente di cappuccio, MYL3 o controllo (Mock), dati normalizzati rispetto a t₀; i punti rappresentano la media di almeno tre replicati biologici per ciascun punto temporale. (B) Il cambiamento in termini di fold rispetto all'area sotto la curva (AUC) per un andamento temporale di 18 h, ottenuto da almeno tre replicati biologici, è stato calcolato normalizzando rispetto al campione di riferimento MYL3 e confrontato mediante ANOVA a un fattore con test di confronto multiplo di Tukey. I dati sono mostrati come media ± errore standard della media (SEM), con ciascun punto che rappresenta la media di un replicato biologico. ***P < 0,001. (eGFP – proteina fluorescente verde potenziata; AUC – Area sotto la curva; RLU – unità di luminescenza relativa) Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: L'ottimizzazione della sequenza migliora la traduzione dell'mRNA in modo dipendente dal POI. (A) L'ottimizzazione della sequenza dell'mRNA mediante LinearDesign ha determinato una riduzione e un aumento rispettivamente dei valori di energia libera minima (MFE) e indice di adattabilità del codone (CAI) per ciascun fattore di trascrizione. (B) Reazioni con lisato di reticolociti di coniglio (RRL) sono state eseguite per 120 min utilizzando mRNA che codificava per HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5 non ottimizzati o ottimizzati, oppure nessun RNA. Le proteine risultanti sono state analizzate mediante western blot e rilevate per chemiluminescenza tramite incubazione della membrana con la subunità enzimatica del sistema luciferasi divisa e il relativo substrato. Saggio cinetico cellulare in tempo reale in cellule HEK293 trasfettate con HAND2 non ottimizzato o ottimizzato (C), GATA4 (D), MEF2C (E), o TBX5 (F), insieme a MYL3 e controllo (Mock). I dati sono stati normalizzati al tempo t₀ e i punti rappresentano la media di tre repliche biologiche per ciascun punto temporale. Il fold change dell'area sotto la curva (AUC) per un andamento di 18 h di tre repliche biologiche è stato ottenuto normalizzando rispetto al campione di riferimento MYL3 e confrontato mediante test t non appaiato con correzione di Welch. I dati sono mostrati come media ± errore standard della media (SEM), con ciascun punto che rappresenta la media di una replica biologica. *P < 0,05. (G) Saggio cinetico cellulare in tempo reale in cellule HEK293 trasfettate con MEF2C non ottimizzato o ottimizzato, MYL3 e controllo (Mock); i dati sono stati normalizzati al tempo t₀, i punti rappresentano la media di tre repliche biologiche per ciascun punto temporale. Il fold change dell'area sotto la curva (AUC) per un andamento di 72 h di tre repliche biologiche è stato ottenuto normalizzando rispetto al campione di riferimento MYL3 e confrontato mediante test t non appaiato con correzione di Welch. I dati sono mostrati come media ± SEM con ciascun punto che rappresenta la media di una replica biologica. **P < 0,01. (MFE – energia libera minima; CAI – indice di adattamento del codone; RRL – lisato di reticolociti di coniglio; AUC – area sotto la curva; RLU – unità di luminescenza relativa) Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Il campo delle terapie basate sull'mRNA si è sviluppato rapidamente negli ultimi anni, evidenziando l'importanza della progettazione e ottimizzazione della sequenza come fase critica nel processo di sviluppo. Sono stati compiuti notevoli sforzi per creare strumenti computazionali in grado di prevedere le strutture e le composizioni dell'RNA più efficaci, con particolare attenzione all'ottimizzazione della sequenza^8,9. Sebbene questi strumenti siano potenti, la validazione sperimentale di tali progetti rimane una parte essenziale del processo. Tuttavia, tale validazione si è basata principalmente su proteine reporter, tra cui GFP⁷, NanoLuc⁸ e la proteina spike di SARS-CoV-2⁹ , che sono già proteine estremamente stabili e altamente traducibili. Per superare questa limitazione, un sistema di luciferasi divisa è stato integrato in un processo per studiare la dinamica della traduzione di mRNA trascritto in vitro in cellule HEK293, consentendo una risoluzione temporale³, dimostrando al contempo i limiti dell'uso di proteine reporter nel rilevare variazioni della traduzione in seguito all'ingegnerizzazione dell'mRNA. L'articolo relativo a questo metodo illustra i passaggi necessari per eseguire questo saggio, mostra che la reazione IVT può essere miniaturizzata e che la concentrazione del cap 5’ può essere ridotta senza conseguenze sulla traduzione, riducendo così i costi. Sulla base delle nostre osservazioni precedenti, sottolineiamo che è necessario un approccio dipendente dalla proteina di interesse (POI) per l'ottimizzazione della sequenza dell'mRNA al fine di ottenere un'espressione aumentata.

Come descritto qui, il saggio con marcatura luminiscente divisa rappresenta un flusso di lavoro relativamente semplice che consente la misurazione in media scala della traduzione dell'mRNA, permettendo agli utenti di studiare in tempo reale l'espressione temporale del loro POI. Tuttavia, sono necessari diversi passaggi critici e considerazioni per ottenere risultati robusti. In primo luogo, tutti i risultati ottenuti successivamente dipendono dalla qualità dell'mRNA, che inizia con la trascrizione in vitro (IVT) e dalla decontaminazione dell'equipaggiamento utilizzato per questa procedura. Dopo la sintesi, la conservazione dell'mRNA è fondamentale: deve essere mantenuto sul ghiaccio dopo l'eluzione e, dopo aver confermato le dimensioni dell'mRNA, quest'ultimo deve essere suddiviso in aliquote di volume lavorativo per evitare cicli di congelamento-scongelamento, conservandolo a -80°C. In secondo luogo, la piastra a 96 pozzetti utilizzata è di fondamentale importanza e deve essere mantenuta costante tra un esperimento e l'altro. Per questo protocollo, assicurarsi di utilizzare una piastra a 96 pozzetti interamente bianca. Piastre con fondo trasparente e pareti bianche possono essere utilizzate se è necessario monitorare la morfologia cellulare; tuttavia, queste producono un segnale molto più debole, pertanto i due tipi di piastra non sono intercambiabili. È stato osservato che, misurando la traduzione degli stessi mRNA su una piastra con fondo trasparente e pareti bianche, il segnale luminiscente risultante era 5 volte inferiore rispetto a quello ottenuto su una piastra completamente bianca. Questa nota tecnica può avere un impatto significativo quando si valutano geni con dinamiche traduttive inefficienti. Oltre a introdurre inconsistenze nei dati, la riduzione del segnale potrebbe impedire il rilevamento di differenze sottili indotte da variazioni nella sequenza o nella struttura dell'mRNA. In terzo luogo, l'uso del mezzo L-15 è essenziale per questo saggio, poiché consente la vitalità cellulare in un ambiente privo di integrazione di CO₂²⁵, offrendo flessibilità nell'uso del luminometro. Inoltre, l'impiego di L-15 senza fenolo riduce il segnale di fondo durante la misurazione della luminiscenza. Infine, è importante coltivare e misurare la luminiscenza a 37°C (o nelle condizioni di coltura specifiche per il tipo cellulare di interesse). Eseguire questo esperimento a temperatura ambiente altererebbe notevolmente i risultati, poiché la velocità di allungamento della traduzione sarebbe ridotta²⁶, impedendo così l'osservazione di cinetiche normali.

La versatilità di in vitro la progettazione dell'mRNA trascritto può essere trasferita al processo di sintesi, consentendo numerose modifiche. Come osservato, la concentrazione del cap 5’ può essere ridotta di 4 volte, ottenendo comunque un'espressione paragonabile, permettendo ai ricercatori di ridurre i costi. Sebbene l'efficienza di cappuccamento non sia stata misurata direttamente dopo la trascrizione in vitro (IVT), una proporzione crescente di mRNA non cappucciato all'interno del pool IVT determinerebbe un segnale ridotto, come dimostrato dall'mRNA non cappucciato; tale riduzione non è stata osservata. Inoltre, considerando che eGFP è una proteina relativamente piccola, con un peso molecolare di soli 27 kDa, questa modulazione della concentrazione del cap dovrebbe tradursi facilmente a geni più grandi, poiché vi saranno meno trascritti da cappucciare dopo l'IVT. Esistono diversi analoghi del cap caratterizzati da differenti modifiche di metilazione, che influenzano l'immunogenicità³ e l'espressione proteica²⁷Inoltre, il processo di cappuccio può essere eseguito co-trascrizionalmente (come dimostrato in questo caso) o post-trascrizionalmente utilizzando il virus Vaccinia, il quale determina un'efficienza di cappuccio del 100%²⁸ ma richiede ulteriori passaggi di purificazione. Per la produzione di mRNA su scala da laboratorio, si utilizzano comunemente colonne di purificazione, in quanto rapide ed efficienti, ma costose. Un approccio più economico e versatile è la precipitazione con cloruro di litio, che, sebbene più lunga, consente all'utente di concentrare l'mRNA e non limita il rendimento alla capacità di legame della colonna; pertanto, è adatta per l'ampliamento della scala produttiva. Come le colonne di purificazione, anche questo metodo non rimuove completamente l'RNA a doppio filamento e i frammenti di RNA troncati, che causano immunogenicità.²⁹. Analogamente al cap 5’, l’introduzione della coda poli(A) può essere ottenuta mediante metodi alternativi rispetto a quanto descritto qui. In modo analogo all’introduzione della coda mediante PCR, il DNA plasmidico può essere modificato per contenere una coda poli(A); tuttavia, queste sequenze lunghe possono andare incontro a ricombinazione, generando sequenze poli(A) eterogenee e accorciate. Tuttavia, la segmentazione della coda poli(A) – l’inserimento di spaziatori eteronucleotidici – ha ridotto al minimo questi effetti.^30,31In alternativa, la coda poli(A) può essere generata utilizzando una poli(A) polimerasi indipendente dallo stampo, che consente la produzione di code poli(A) più lunghe³² ma con il rischio che l'eterogeneità influisca sui requisiti normativi³³.

Sebbene il saggio con marcatura luminiscente divisa descritto sia estremamente efficace nel misurare l'espressione proteica dell'mRNA esogeno, esistono alcune limitazioni da considerare in base alla domanda di ricerca. In primo luogo, è necessario generare una linea cellulare che esprima costitutivamente una delle due metà della luciferasi divisa. Sebbene tale linea possa essere acquistata pronta all'uso, al momento è disponibile soltanto per cellule HEK293. Se la creazione di una linea stabile nel tipo cellulare di interesse risulta difficoltosa, esiste un saggio lisico che, secondo i nostri risultati, mostra lo stesso andamento in cellule HEK293, cellule staminali embrionali umane e cardiomiociti differenziati³. Tuttavia, il punto temporale scelto per il saggio lisico in questo studio precedentemente pubblicato³ è stato determinato dai dati ottenuti con le cellule vive HEK293. In secondo luogo, il saggio fornisce una risoluzione temporale in cellule vive, ma non è in grado di offrire una risoluzione spaziale in tempo reale, aspetto che potrebbe essere rilevante per alcuni ricercatori. Tuttavia, esiste un anticorpo primario che funziona bene per l'immunocitochimica fluorescente contro il breve marcatore peptidico della luciferasi utilizzato in questi esperimenti, consentendo un'analisi spaziale della proteina d'interesse tradotta. Inoltre, un microscopio in grado di effettuare imaging luminiscente potrebbe fornire dati con risoluzione a livello singola cellula. Un approccio in grado di fornire informazioni spaziotemporali è SunTag, che misura la traduzione attiva e la localizzazione mediante imaging in cellule vive sfruttando le interazioni tra scFv marcati con GFP e epitopi peptidici^14,34. Tuttavia, sono richieste 24 ripetizioni in tandem di questi epitopi, il che potrebbe potenzialmente alterare la traduzione, e inoltre il protocollo ha una produttività relativamente bassa. In terzo luogo, il marcatore luminiscente diviso permette di misurare l'abbondanza dell'mRNA, ma non nelle cellule vive. Nel nostro lavoro precedente³, è stata eseguita una qRT-PCR sull'RNA estratto utilizzando primer specifici per il trascritto esogeno, confermando i livelli di mRNA in termini di efficienza di trasfezione tra diversi costrutti e di decadimento nei diversi punti temporali. Un altro approccio ha impiegato il Northern blotting per misurare la stabilità dell'mRNA³⁵. Tuttavia, entrambi gli approcci sono laboriosi e non consentono misurazioni continue. Attualmente, non esiste alcun metodo in grado di misurare simultaneamente traduzione e abbondanza dell'mRNA in cellule vive, rappresentando questa una possibile via per lo sviluppo futuro di nuovi saggi.

Il sistema della luciferasi divisa è stato inizialmente applicato per studiare la dinamica proteica, ma è evidente che questo saggio ha importanti implicazioni anche in altri settori della ricerca. Con le terapie a base di mRNA in prima linea negli approcci innovativi di terapia genica, questo saggio si presta perfettamente a consentire ai ricercatori di caratterizzare l'espressione del loro potenziale farmaco e di ottimizzarla per un'espressione potenziata. Come menzionato in precedenza, l'ottimizzazione dei codoni si è rivelata uno strumento potente e innovativo nella progettazione degli mRNA, grazie allo sviluppo di diversi strumenti^8,9,36. Quando un approccio uniforme di ottimizzazione della sequenza è stato applicato a quattro fattori di trascrizione, ha migliorato sia l'MFE che l'CAI per tutti i geni, ma solo MEF2C e TBX5 hanno mostrato un'espressione aumentata. In particolare, consentendo il rilevamento delle differenze di espressione derivanti esclusivamente da variazioni sinonime nella sequenza codificante, questo approccio fornisce una piattaforma unica per analizzare l'efficienza della traduzione in cellule vive con elevata risoluzione temporale. Questi risultati indicano che l'ottimizzazione della sequenza deve considerare in modo dipendente dal POI il contenuto iniziale di GC, l'uso dei codoni e la struttura secondaria dell'RNA per ottenere un'espressione potenziata. Sebbene potrebbero essere necessari ulteriori test su un numero maggiore di costrutti, il saggio con il marcatore luminiscente diviso ha il potenziale per analisi ad alto rendimento al fine di identificare il candidato ottimale per il POI. Inoltre, come mostrato in precedenza³, questo saggio può misurare gli effetti della perturbazione di qualsiasi componente sequenziale o strutturale dell'mRNA, delineandone ulteriormente le applicazioni. Oltre allo studio di alterazioni dell'mRNA, il saggio con il marcatore luminiscente diviso potrebbe essere utilizzato anche nella ricerca su sistemi di somministrazione e formulazione. Nonostante i miglioramenti nelle cappe 5’ e l'uso di nucleotidi modificati, l'mRNA esogeno richiede un sistema di incapsulamento per prevenire la degradazione e favorire l'assorbimento cellulare³⁷. Sebbene le nanoparticelle lipidiche³⁸, le vescicole extracellulari³⁹ e i biomimetici⁴⁰ siano all'avanguardia nel campo della somministrazione dell'mRNA, è ancora necessario un ulteriore sviluppo. L'incapsulamento di mRNA marcato con il sistema luminiscente diviso in uno qualsiasi di questi vettori permetterebbe di caratterizzare l'efficienza di somministrazione e consentirebbe ai ricercatori di testare vettori modificati in modo da medio ad alto rendimento. Al di fuori della ricerca focalizzata sulla traduzione, il saggio con il marcatore luminiscente diviso è facilmente utilizzabile anche nella biologia fondamentale. Che si tratti di valutare gli effetti delle perturbazioni di elementi sequenziali e strutturali sulla traduzione dell'mRNA, di interferire con la funzione del macchinario traduttivo o di esplorare il proteasoma, il sistema di marcatura con luciferasi divisa rappresenta un'opzione particolarmente interessante.

Nel complesso, il sistema di marcatura luminiscente divisa qui descritto offre un saggio flessibile e robusto per monitorare temporalmente l'espressione proteica mediata da mRNA sintetico come lettura delle dinamiche traduttive. L'implementazione di un saggio su cellule vive supera molte delle limitazioni precedenti nel campo della traduzione dell'mRNA e rivela informazioni cruciali sulle dinamiche della sintesi proteica e sul degrado della proteina di interesse (POI). Poiché i trascritti possiedono diversi profili regolatori ed espressivi, è fondamentale caratterizzare la POI terapeutica, consentendo così ai farmaci a base di mRNA di continuare a evolvere e di tradursi in applicazioni cliniche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido acetico	Sigma-Aldrich	A6283	Componente del buffer TAE
Agarosio	Sigma-Aldrich	A9539	Elettroforesi su gel
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939B	Bioanalizzatore utilizzato per il controllo di qualità dell'mRNA
CLARIOstar Plus Luminometer	BMG Labtech	430-501S-F	Lettore di piastre/luminometro utilizzato per misurare la luminescenza
CleanCap AG	Trilink Biotechnologies	N-7113	Cappuccio 5' utilizzato per la trascrizione in vitro (IVT)
DMEM, ad alto contenuto di glucosio, con piruvato	Thermo Fisher Scientific	41966029	Mezzo utilizzato per la coltura delle cellule HEK293-LgBiT
DNasi I	New England Biolabs	M0303	Degrada il template di DNA dopo la reazione di IVT
Soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Utilizzata per il lavaggio delle cellule e aggiunta alla piastra per prevenire l'evaporazione
EDTA, pH 8,0, privo di RNasi	Thermo Fisher Scientific	AM9260	Componente del buffer TAE
Bromuro di etidio	Sigma-Aldrich	E1510	Colorante per elettroforesi su gel
Serum fetale bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524	Integratore aggiunto al DMEM
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040	Kit per trascrizione in vitro (IVT)
Mezzo Leibovitz L-15, senza fenolo rosso	Thermo Fisher Scientific	21083027	Mezzo utilizzato per la coltura delle cellule HEK293-LgBiT durante le misurazioni di luminescenza
L-glutammina	Thermo Fisher Scientific	25030-024	Integratore aggiunto al DMEM
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778150	Reagente di trasfezione a base lipidica
Soluzione di precipitazione al cloruro di litio	Thermo Fisher Scientific	AM9480	Approccio alternativo per la purificazione dell'mRNA dopo la reazione di IVT
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup Kit	New England Biolabs	T1130	Kit di purificazione dopo linearizzazione del plasmide
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Spettrofotometro utilizzato per la quantificazione della concentrazione di DNA e mRNA
Nano-Glo Endurazine Live Cell Substrate	Promega	N2570	Substrato necessario per la luminescenza, aggiunto al mezzo L-15
NucleoSpin RNA Cleanup Kit	Macherey-Nagel	12708612	Purifica l'mRNA dopo la reazione di IVT
Piastra micropiastre Nunc MicroWell a 96 pozzetti, trattata Nunclon Delta, fondo piatto	Thermo Fisher Scientific	136101	Piastra utilizzata per la semina delle cellule HEK293-LgBiT e per le misurazioni successive
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	Mezzo utilizzato per la reazione di trasfezione
Phusion High-Fidelity PCR Kit	New England Biolabs	E0553	Kit PCR
RiboRuler High Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	11883993	Scala di RNA per elettroforesi su gel
RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	R2020	Disinfettante spray contro le RNasi
TRIZMA Base	Sigma-Aldrich	T6066	Componente del buffer TAE
Soluzione di tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174	Reagente per la dissociazione cellulare
Acqua distillata ultrapura priva di DNasi/RNasi	Thermo Fisher Scientific	10977035	Utilizzata per la preparazione del template e per la IVT