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Articolo metodologico

Misurazione di cellule vive mRNA Dinamica Translazionale con Etichettatura Luminescente Divisa in Cellule HEK293

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DOI:

10.3791/70840

⸱

14 agosto 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un metodo flessibile e compatibile con l'alta produttività per misurare in cellula la dinamica della traduzione dell'mRNA in tempo reale in cellule HEK293, utilizzando un'etichettatura luminiscente divisa. Questo saggio versatile permette di distinguere gli effetti strutturali, supporta l'ottimizzazione della trascrizione in vitro e accelera lo sviluppo di terapie a base di mRNA.

Abstract

Lo sviluppo rapido di vaccini contro il COVID-19 ha illustrato il potenziale dei farmaci basati sull'RNA messaggero (mRNA) di trasformare lo sviluppo terapeutico. Come l'mRNA maturo, l'mRNA trascritto in vitro possiede gli stessi elementi, tra cui un cap 5’, regioni non tradotte (UTR), sequenza codificante e una coda poli(A). Studi precedenti che hanno analizzato gli effetti di questi componenti sulla traduzione dell'mRNA hanno utilizzato principalmente proteine reporter altamente ingegnerizzate, che mostrano traduzione efficiente e stabilità proteica. Poiché gli elementi strutturali di ciascun mRNA influenzano in modo differenziale la loro traduzione, è fondamentale identificare la progettazione ottimale in relazione alla proteina terapeutica di interesse (POI). Per consentire la caratterizzazione della traduzione della POI, è stato impiegato un sistema di complementazione della luciferasi divisa. Un breve peptide marcatore (HiBiT), che può essere fuso a uno dei due estremi della POI, si associa al suo eterodimero complementare (LgBiT), ristabilendo l'attività enzimatica in presenza di un substrato permeabile alle cellule. Finora, il marcatore luminiscente diviso è stato utilizzato principalmente per studi ad alto rendimento sul turnover proteico. In precedenza abbiamo dimostrato come il marcatore luminiscente diviso possa essere impiegato per quantificare in modo ad alto rendimento la traduzione dell'mRNA nel tempo in cellulo in cellule HEK293 che esprimono costitutivamente l'eterodimero complementare. In questo studio, ulteriormente dimostriamo la versatilità del saggio e descriviamo come possa essere utilizzato per ottimizzare la trascrizione in vitro, riducendone i costi. Il sistema del saggio è in grado di distinguere in modo univoco le alterazioni nei componenti strutturali, evidenziando al contempo gli effetti dell'ottimizzazione della sequenza codificante mediante geni non ingegnerizzati. Inoltre, dimostriamo che una riduzione del 4 volte nella concentrazione del cap 5’ durante la trascrizione in vitro produce una traduzione equivalente in cellulo. Questi risultati illustrano come il marcatore luminiscente diviso possa essere facilmente integrato nel flusso di lavoro dei farmaci a base di mRNA, consentendo il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'espressione proteica mediata dall'mRNA in cellulo, offrendo così un metodo versatile per lo sviluppo di terapie basate sull'mRNA.

Introduzione

I farmaci e le applicazioni di ricerca basati sull'RNA messaggero (mRNA) si sono rapidamente sviluppati negli ultimi anni, grazie al successo dei vaccini a mRNA1,2 e alla crescente consapevolezza della versatilità dell'RNA come biomolecola programmabile. Una sfida centrale in questo campo è la capacità di valutare in modo quantitativo e dinamico l'efficienza della traduzione dell'mRNA in diversi contesti. Il metodo descritto in questo articolo – che sfrutta un sistema di marcatura luminiscente diviso – fornisce una piattaforma flessibile e scalabile per lo studio della traduzione dell'mRNA in tempo reale all'interno delle cellule in cellulo3. L'obiettivo generale di questo metodo è consentire ai ricercatori di misurare come caratteristiche della sequenza, modifiche chimiche ed elementi strutturali influenzino la cinetica della traduzione e il successivo turnover proteico, offrendo così uno strumento potente per ottimizzare le costruzioni di mRNA per applicazioni terapeutiche e nella ricerca di base.

In vitro l'mRNA trascritto rispecchia l'architettura essenziale dei trascritti maturi, incorporando un cap 5′, regioni non tradotte (UTR), una sequenza codificante e una coda poli(A), includendo spesso nucleotidi modificati per ridurre l'immunogenicità4,5. Studi approfonditi hanno dimostrato che ciascuno di questi elementi – singolarmente e in combinazione – può essere ingegnerizzato per influenzare fortemente l'efficienza della traduzione e il rendimento proteico6,7. Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti si è basata su proteine reporter altamente ottimizzate come la Green Fluorescent Protein (GFP)7, NanoLuc8 o la proteina spike di SARS-CoV-28,9, progettate per tradursi con elevata efficienza e produrre proteine estremamente stabili, e pertanto non riflettono le sfide incontrate nei contesti terapeutici. Poiché gli mRNA terapeutici codificano per diverse proteine di interesse (POI), ciascuna soggetta a vincoli strutturali unici e a regolazioni specifiche per tipo cellulare, i principi di progettazione che massimizzano la traduzione per un costrutto potrebbero non essere generalizzabili a un altro, come precedentemente riportato3. L'identificazione della configurazione ottimale per una data POI terapeutica è quindi essenziale e richiede metodi in grado di valutare in modo sensibile e sistematico come le singole caratteristiche del trascritto contribuiscano all'output proteico.

Metodi basati sui ribosomi, come il profilo dei polisomi, distinguono le frazioni di traduzione mediante centrifugazione su gradiente10, mentre il profilo dei ribosomi (Ribo-seq) fornisce una risoluzione a livello nucleotidico dell'occupazione ribosomiale, dei siti di inizio e delle pause11. Come nel caso del Ribo-seq, altri approcci basati sul sequenziamento, come il sequenziamento ad alta capacità dell'RNA isolato mediante immunoprecipitazione con crosslinking (HITS-CLIP) e la purificazione per affinità dei ribosomi in traduzione (TRAP), caratterizzano ulteriormente la traduzione di RNA associati a proteine leganti l'RNA o a ribosomi12. Sebbene potenti, queste tecniche richiedono preparazioni complesse, attrezzature specializzate e competenze informatiche, risultando quindi inadatte allo sviluppo ad alto rendimento di mRNA terapeutici. L'immunoprecipitazione delle catene nascenti13 misura l'efficienza di traduzione utilizzando proteine marcate con il FLAG immunoprecipitate dai ribosomi e quantificate mediante reazione a catena della polimerasi associata alla trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR). Sebbene adattabile agli mRNA terapeutici, questo saggio è laborioso, manca di risoluzione temporale ed è inadatto ad applicazioni ad alto rendimento. Il sistema SunTag14 consente misurazioni in tempo reale dell'output della sintesi proteica e della regolazione traduzionale a partire da singole molecole di mRNA, sfruttando l'interazione tra un frammento variabile monocatenario (scFv) fuso alla GFP e ripetizioni in tandem di un epitopo peptidico. Questo sistema permette misurazioni dinamiche della traduzione e del localizzazione con risoluzione a livello di singolo mRNA ed è stato pertanto utilizzato per sviluppare numerosi sistemi di tracciamento delle catene nascenti15,16. Tuttavia, questo approccio ha un basso rendimento ed esige l'uso di microscopi ad alta potenza.

Sebbene il marcamento della proteina nascente sia inevitabile, è stato identificato il potenziale utilizzo di un piccolo marcatore peptidico derivato dalla luciferasi NanoLuc per rilevare la traduzione dell'mRNA in cellule vive. La NanoLuciferasi è stata ingegnerizzata in modo da suddividersi in una subunità piccola, di 11 amminoacidi (HiBiT), e una più grande, di 158 amminoacidi (LgBiT), che possono dimerizzarsi rapidamente e, in presenza di substrato, ricostituire una luciferasi funzionale17,18. Il sistema di marcamento luminiscente diviso presenta diversi vantaggi chiave per lo studio della dinamica dell'mRNA. In primo luogo, le dimensioni minime della subunità piccola fusa al POI consentono al costrutto codificato di rimanere il più possibile simile alla proteina d'interesse nativa. Poiché la lunghezza della sequenza codificante può influenzare direttamente i rapporti di traduzione19, la riduzione al minimo della lunghezza del marcatore migliora la previsione della dinamica di traduzione degli mRNA sintetici. In modo cruciale, questa strategia di marcatura minima permette di rilevare differenze nella traduzione indotte da variazioni sinonime nella sequenza codificante, consentendo di analizzare l'efficienza traduttiva indipendentemente dalla sequenza o stabilità della proteina3. Per questo motivo, l'uso di marcatori più grandi, come proteine fluorescenti o luciferasi a lunghezza intera, risulta subottimale. In secondo luogo, il sistema di marcamento luminiscente diviso qui impiegato consente una generazione immediata del segnale. La sua rapida ed efficiente reazione di complementazione in cellulo presenta un'affinità elevata (KD = 700 pM) ed è stata utilizzata per misurare la modulazione del turnover proteico con letture distanziate anche soltanto di 30 secondi18. Mentre il sistema originale di marcamento luminiscente diviso è stato principalmente confrontato con altri sistemi di luciferasi divisa17,18, il vantaggio principale in questo contesto è che la generazione del segnale non è limitata dalla maturazione della proteina. Al contrario, le proteine fluorescenti richiedono la maturazione del cromoforo, un processo che può richiedere da minuti a ore20, limitando così la risoluzione temporale. Infine, il sistema di marcamento luminiscente diviso qui impiegato supera i limiti dei sistemi basati su proteine fluorescenti divise, che tipicamente necessitano della formazione del cromoforo dopo la complementazione21, introducendo un ulteriore ritardo e limitandone l'idoneità per lo studio di processi rapidi e dinamici. Studi precedenti hanno dimostrato l'utilità del marcamento luminiscente diviso in saggi di turnover proteico e in studi sulla degradazione22,23,24. L'estensione di questa tecnologia consolidata alla cinetica della traduzione rappresenta un significativo avanzamento metodologico. Ad esempio, mentre il profiling dei ribosomi può rivelare la densità ribosomiale lungo i trascritti, non riesce facilmente a catturare variazioni dinamiche nei tassi di inizio o allungamento della traduzione in diverse condizioni. Come illustrato in precedenza3, questo sistema di marcamento luminiscente diviso è in grado di rilevare differenze derivanti da alterazioni della struttura del cap, della composizione della regione non tradotta 5′ (UTR), dell'ottimizzazione dei codoni, delle modifiche nucleotidiche e della lunghezza della coda poli(A), tutti fattori determinanti critici per l'efficienza traduttiva. Questa ampia applicabilità rende il metodo particolarmente potente per analizzare il contributo di singole caratteristiche dell'mRNA al livello complessivo di espressione proteica. Vale la pena notare che, a seconda dello strumento utilizzato, questa tecnologia consente di acquisire dati sia a livello di singola cellula che di pozzetto intero. Piattaforme di imaging in grado di acquisire immagini basate sulla luminescenza possono potenziare questa tecnologia per lo studio della dinamica traduttiva a livello di singola cellula. In questo lavoro ci concentriamo su un'applicazione basata su lettore di piastre e pozzetti, grazie alla sua natura da media ad alta produttività e al ridotto fabbisogno di analisi dei dati.

I ricercatori che prendono in considerazione questo metodo dovrebbero valutarne l'idoneità alla luce dei loro specifici obiettivi sperimentali. Il saggio è particolarmente utile in contesti in cui è richiesta la schermatura ad alto rendimento di costrutti di mRNA sintetico, come nelle linee di progettazione terapeutica basate sull'mRNA. È ben adatto ad analisi comparative di caratteristiche di sequenza dell'mRNA sintetico – inclusi le regioni non tradotte, l'uso dei codoni o le modifiche dei nucleotidi – in cui possono essere rilevate differenze sottili nell'efficienza della traduzione3. Poiché il sistema è compatibile con piattaforme di traduzione acellulare, saggi su cellule vive e un saggio litico specifico per punto temporale, offre flessibilità ai ricercatori che desiderano adattare il proprio disegno sperimentale a studi meccanicistici o a ricerche applicate. Allo stesso tempo, è importante riconoscere i limiti della tecnica. In modo critico, il saggio di marcatura luminiscente divisa non fornisce risoluzione dell'occupazione dei ribosomi, una capacità che rimane unica agli approcci di footprinting ribosomiale, né misura direttamente la stabilità o la degradazione dell'RNA, che potrebbe dover essere valutata mediante metodi complementari. Tuttavia, a causa dei limiti delle tecniche esistenti basate sui ribosomi, i ricercatori dipendono da saggi basati su marcatori, come il sistema di luminescenza divisa, per indagare l'espressione proteica guidata dall'mRNA in funzione del tempo come proxy della dinamica traduttiva. Pertanto, sebbene questo sistema rappresenti uno strumento potente per monitorare l'espressione proteica guidata dall'mRNA sintetico, la sua appropriatezza dipende dal fatto che la domanda di ricerca si concentri sull'output proteico dinamico piuttosto che sul posizionamento fine dei ribosomi o sul decadimento dell'RNA.

In sintesi, il sistema di marcatura luminiscente divisa rappresenta un metodo potente e versatile per lo studio della traduzione dell'mRNA. Il suo obiettivo generale è fornire ai ricercatori un sistema flessibile, scalabile, ad alto rendimento e in grado di rilevare differenze nell'espressione proteica derivanti da mRNA sintetici con diversi elementi strutturali e di sequenza3. La motivazione alla base del suo sviluppo risiede nella necessità di superare i limiti delle tecniche esistenti, offrendo vantaggi in termini di sensibilità, scalabilità e risoluzione temporale. Inserito nel contesto più ampio della letteratura sulla biologia e terapia dell'RNA, questo metodo costituisce un prezioso arricchimento del repertorio sperimentale, consentendo sia approfondimenti fondamentali sia progressi applicativi. Valutando attentamente i punti di forza e le limitazioni del saggio, i ricercatori possono determinarne l'adeguatezza per le loro specifiche applicazioni, massimizzandone così l'impatto nel campo in rapida evoluzione delle scienze dell'RNA.

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Protocollo

Una rappresentazione grafica dell'intero protocollo è mostrata nella Figura 1.

1. Preparazione del modello per la trascrizione in vitro (IVT)

NOTA: Per preparare il modello di DNA per la trascrizione in vitro (IVT), assicurarsi che il DNA plasmidico contenga un promotore per la RNA polimerasi (generalmente T7 o SP6), le regioni UTR 5’ e 3’ e il frame di lettura aperto del POI (Figura 1).

  1. Linearizzare il DNA plasmidico utilizzando un enzima di restrizione con un sito di taglio singolo localizzato dopo l'UTR 3’ e assemblare la reazione secondo le istruzioni del produttore. Dopo l'incubazione, purificare la reazione di digestione mediante un kit di purificazione del DNA basato su colonnine. Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro.
  2. Per confermare la linearizzazione, preparare un gel di agarosio TAE al 1% contenente il colorante per DNA Bromuro di Etidio a 0,1 µg/mL. Mescolare 150 ng di DNA digerito con acqua e colorante di carico. Caricare sul gel di agarosio il campione, il plasmide non tagliato e una scala di DNA, ed eseguire l'elettroforesi a 100 V per 40 minuti in tampone TAE 1× (Tris-acetato-EDTA). Visualizzare con un sistema di imaging per gel.
    ATTENZIONE: La soluzione di Bromuro di Etidio è un potente mutageno e richiede un'attenta manipolazione con l'uso di idonei dispositivi di protezione individuale (DPI).
  3. Se il DNA plasmidico non presenta una coda poli(A) immediatamente dopo l'UTR 3’, introdurla mediante PCR. Eseguire la PCR secondo le istruzioni del produttore utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà e primer opportunamente progettati. Assicurarsi che l'amplicone includa il promotore T7, la sequenza codificante (open reading frame) e una coda poli(A).
    NOTA: Le tecnologie di cappuccio possono richiedere sequenze specifiche al promotore T7; tali requisiti possono essere soddisfatti con un adeguato design del primer diretto. Il primer inverso si lega all'estremità dell'UTR 3’ e introduce una coda poli(A) (lunghezza raccomandata di almeno 80 T). Per costrutti con alto contenuto di GC, si raccomandano PCR a incremento termico (step-up PCR) e/o l'aggiunta di DMSO al 3%.
  4. Per verificare il successo della PCR, preparare un gel di agarosio TAE contenente Bromuro di Etidio (vedi passaggio 1.2). Se la lunghezza del costrutto è ≥1 kb oppure <1 kb, preparare rispettivamente un gel al 1% o al 2%. Mescolare 5 µL della reazione PCR con acqua e colorante di carico. Caricare sul gel di agarosio sia il campione che una scala di DNA ed eseguire l'elettroforesi a 100 V per 40 minuti in tampone TAE. Visualizzare con un sistema di imaging per gel.
  5. Dopo la conferma dimensionale della PCR, purificare la reazione PCR mediante un kit di purificazione del DNA basato su colonnine. Eluire in 15–20 µL di tampone di eluizione (spesso fornito insieme al kit di purificazione del DNA) o in acqua priva di nucleasi per concentrare il template di DNA da utilizzare nella trascrizione in vitro (IVT). Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro.

2. Trascrizione in vitro

  1. Prima di iniziare, spruzzare e pulire il banco di lavoro, i guanti e le pipette con una soluzione decontaminante per RNasi. Per migliorare resa e qualità, eseguire questa procedura in un ambiente sterile sotto cappa.
  2. Scongelare e assemblare i componenti di un kit per la trascrizione in vitro (IVT) basato su T7 seguendo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Alcuni produttori raccomandano l'uso di ditiotreitolo (DTT, 0,1 M) per limitare l'ossidazione della reazione e migliorarne l'efficienza. Questo passaggio è raccomandato quando compatibile con il kit. Se si utilizzano dNTP modificati, sostituire il corrispondente nucleotide non modificato con la stessa quantità di nucleotide modificato. Valutare la resa di una reazione dimezzata, poiché non è stata osservata alcuna sostanziale miglioramento della resa con una reazione completa. Quando si sintetizza più di un mRNA, si raccomanda di preparare una miscela master per ridurre errori di pipettaggio e variabilità.
  3. Pipettare accuratamente e mescolare brevemente, quindi incubare a 37 °C per 5 h con coperchio riscaldato per evitare condensa. Prolungare l'incubazione per tutta la notte se necessario, poiché ciò ha un effetto minimo sulla resa o integrità dell'mRNA.
  4. Aggiungere 1 µL di DNasi I e pipettare accuratamente. Incubare a 37 °C per 30 min.
  5. Purificazione dell'RNA trascritto in vitro (IVT)
    1. Pulire la reazione IVT utilizzando un kit di purificazione dell'RNA basato su colonne seguendo le istruzioni del produttore (diversi kit possono portare a livelli diversi di recupero e avere capacità di legame differenti). Per l'eluzione, aggiungere 60 µL di acqua priva di nucleasi e incubare a temperatura ambiente per 5 min prima della centrifugazione.
    2. In alternativa, utilizzare la precipitazione con cloruro di litio come approccio più economico e flessibile.
      1. Aggiungere un volume uguale di cloruro di litio 7,5 M alla reazione, mescolare e incubare a -20 °C per tutta la notte.
      2. Centrifugare a 18.300 × g per 20 min a 4 °C, quindi rimuovere con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet di RNA.
      3. Lavare con 950 µL di etanolo al 70% e centrifugare a 18.300 × g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il soprannatante, lasciare asciugare il pellet per circa 5 min a temperatura ambiente e risospendere in acqua priva di nucleasi (60 µL è standard; ridurre il volume in base alle dimensioni del pellet per aumentare la concentrazione).
        ATTENZIONE: Il cloruro di litio può causare irritazione cutanea o oculare se non si utilizzano dispositivi di protezione individuale adeguati. Indossare guanti e protezione oculare durante la manipolazione. L'etanolo è un liquido altamente infiammabile e può causare irritazione oculare. Mantenere lontano da fiamme libere e indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusa la protezione oculare.
  6. Quantificare l'mRNA utilizzando uno spettrofotometro. Assicurarsi che il rapporto A260/A280 per l'mRNA sia ~2,0 e verificare che il rapporto A260/A230 rientri tra 1,8 e 2,2.
  7. Per confermare il successo della IVT, preparare un gel di agarosio al 1% in tampone TAE (non denaturante) contenente bromuro di etidio. Mescolare 500 ng di mRNA con acqua e colorante di carico, e seguire le istruzioni del produttore per la preparazione della scala di RNA e le istruzioni di denaturazione. Caricare il gel di agarosio ed eseguire l'elettroforesi a 80 V per 40 min in tampone TAE. Visualizzare con un sistema di imaging per gel.
  8. Per una ulteriore conferma della dimensione corretta dell'mRNA, analizzare i campioni su un Bioanalyzer.
  9. Per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento, aliquotare l'mRNA nel volume richiesto per l'esperimento. Ad esempio, utilizzare 1,2 pmol di mRNA per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Pertanto, aliquotare il volume appropriato per 1,2 pmol × n replicati, quindi conservare a -80 °C.

3. Trasfettazione inversa di HEK293

NOTA: Per ottenere misurazioni temporali, è necessaria una linea cellulare che esprima costitutivamente il frammento complementare di luciferasi. Questo risultato può essere ottenuto generando una linea cellulare stabile mediante trasfezione di un plasmide che esprima il frammento di luciferasi richiesto e successiva selezione clonale. Ciò consente all'utente di misurare la dinamica traduttiva dell'mRNA risolta nel tempo in qualsiasi contesto cellulare desiderato. In alternativa, linee cellulari che esprimono il frammento di luciferasi richiesto possono essere acquistate. Questi esperimenti sono stati condotti utilizzando cellule HEK293 che esprimono costitutivamente l'eterodimero complementare.

  1. Prima di iniziare, scongelare l'mRNA su ghiaccio per evitare degradazione.
  2. Preparare i complessi di trasfezione. Per una piastra a 96 pozzetti, sono necessari 1,2 pmol di mRNA per pozzetto. Se si esegue la replicazione, preparare una quantità sufficiente per 2,5 repliche per compensare eventuali errori di pipettaggio. Mescolare quindi 3 pmol di mRNA con mezzo Opti-MEM a ridotto contenuto di siero fino a un volume finale di 50 µL (20 µL/pozzetto).
  3. Aggiungere 0,5 µL di reagente di trasfezione a base di lipidi cationici (0,2 µL/pozzetto), mescolare aspirando e dispensando ripetutamente con la pipetta e incubare a temperatura ambiente. Dopo 5 minuti di incubazione, mescolare nuovamente aspirando e dispensando, quindi aggiungere 20 µL per pozzetto in una piastra microtitolazione bianca a fondo piatto da 96 pozzetti. Si consiglia di posizionare i pozzetti di trasfezione al centro della piastra, lasciando vuoti i pozzetti periferici.
  4. Preparare le cellule HEK293 rimuovendo il mezzo e lavandole con 2 mL di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) priva di Ca2+ e Mg2+. Rimuovere il liquido di lavaggio e aggiungere 500 µL di tripsina-EDTA, quindi incubare a 37 °C per 3 minuti.
  5. Durante la dissociazione cellulare, riempire i pozzetti periferici della piastra a 96 pozzetti con PBS per ridurre l'evaporazione del mezzo durante la coltura cellulare. Se tutti i pozzetti sono necessari, la piastra può essere allagata con PBS tra i pozzetti.
  6. Aggiungere 4,5 mL di mezzo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con L-glutammina 1× e siero fetale bovino (FBS) al 10% per raccogliere le cellule. Effettuare il conteggio cellulare utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatico.
  7. Trasferire la quantità necessaria di cellule (sufficiente per seminare 1 x 105 cellule per pozzetto) più 3 pozzetti aggiuntivi (per errori di pipettaggio) in un tubo nuovo e centrifugare a 500 × g per 2 minuti.
  8. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule nel volume richiesto di mezzo Leibovitz L-15 (senza fenolo) integrato con FBS al 10% e substrato per cellule vive Endurazine (1:200) per ottenere una concentrazione finale di 1 × 106 cellule/mL. Mescolare con una pipetta serologica per assicurare una miscelazione completa dell'Endurazine. Pipettare 100 µL (1 × 105 cellule) di cellule risospese per pozzetto.
    NOTA: Se si eseguono esperimenti cinetici della durata di 72 h, aumentare il volume a 200 µL per evitare l'evaporazione.
  9. Immediatamente dopo la trasfezione, posizionare le cellule in un lettore di piastre (luminometro) regolato a 37 °C. Registrare i dati a intervalli regolari con un tempo di integrazione di 1 s. A causa dell'efficienza del sistema di complementazione, il segnale è rilevabile entro pochi minuti. Pertanto, per ottenere una lettura accurata del valore di base, questo passaggio deve essere eseguito tempestivamente. Gli intervalli dipendono dall'esperimento e dallo strumento; tuttavia, in questi esperimenti, si è rivelato ottimale misurare ogni 12 minuti per esperimenti con durata di 18 h e ogni 48 minuti per esperimenti di 72 h. La luminescenza non richiede un filtro per la misurazione; tuttavia, si è osservato un rapporto segnale-rumore migliore utilizzando un filtro da 530–540 nm.
    NOTA: Un segnale di trasferimento di energia per risonanza bioluminescente (BRET) viene prodotto da eGFP marcata con luciferasi divisa; pertanto, un filtro a 530–540 nm rileverà sia il segnale luminiscente che quello fluorescente. Per evitare il rilevamento del BRET, utilizzare un filtro a 460–480 nm oppure, in alternativa, impiegare una proteina non fluorescente come MYL3 come riferimento.

4. Analisi dei dati

  1. Generare i fold change in unità di luminescenza relativa (RLUs), normalizzando il segnale di ogni condizione al suo primo punto temporale (t0, normalizzato alla media dei replicati tecnici), poiché il segnale all'inizio del saggio rappresenta il livello di fondo.
  2. Ridurre la variabilità tra i replicati biologici normalizzando rispetto a una condizione di controllo.
  3. Scegliere l'analisi statistica per il saggio, a seconda della domanda posta, tra un singolo punto temporale o l'area sotto la curva (AUC).
    1. Per un singolo punto temporale, utilizzare i punti temporali in cui si verifica l'espressione massima (dipendente dal POI) insieme al punto finale. Riportare in grafico l'RLU calcolato al passaggio 4.1 al punto temporale specifico (ad esempio, 240 min) e analizzarlo mediante un test statistico appropriato.
    2. Misurare la dinamica della traduzione e degradazione proteica calcolando l'AUC per un intervallo di tempo specifico (ad esempio, da t0 a 240 min) o per l'intera durata del saggio (ad esempio, da t0 al punto finale). Normalizzare il valore di AUC per ogni replicato biologico alla media dell'mRNA di riferimento, ottenendo così una misura del fold change in AUC che può essere analizzata mediante test statistici appropriati.

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Risultati

Esistono diversi modi per ottimizzare la convenienza economica di questo protocollo. Ad esempio, la reazione di trascrizione in vitro (IVT) è stata ridotta a metà del volume raccomandato dal produttore ed è stato riscontrato che il rendimento ottenuto soddisfa la quantità necessaria per in cellula esperimenti. Va notato che la lunghezza e la complessità della sequenza influenzano il rendimento della trascrizione in vitro (IVT), pertanto un'ottimizzazione efficace del protocollo dovrebbe produrre almeno 50 µg di ...

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Discussione

Il campo delle terapie basate sull'mRNA si è sviluppato rapidamente negli ultimi anni, evidenziando l'importanza della progettazione e ottimizzazione della sequenza come fase critica nel processo di sviluppo. Sono stati compiuti notevoli sforzi per creare strumenti computazionali in grado di prevedere le strutture e le composizioni dell'RNA più efficaci, con particolare attenzione all'ottimizzazione della sequenza8,9. Sebbene questi strumenti siano potenti, la va...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Laura Itzhaki per la linea cellulare HEK293 LgBiT. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa progettuale e da un premio traslazionale del British Heart Foundation (G114642 e G919651 a CHW) e da una borsa di ricerca GenScript Life Science (CAPB).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido aceticoSigma-AldrichA6283Componente del buffer TAE
AgarosioSigma-AldrichA9539Elettroforesi su gel
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BBioanalizzatore utilizzato per il controllo di qualità dell'mRNA
CLARIOstar Plus LuminometerBMG Labtech430-501S-FLettore di piastre/luminometro utilizzato per misurare la luminescenza
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113Cappuccio 5' utilizzato per la trascrizione in vitro (IVT)
DMEM, ad alto contenuto di glucosio, con piruvatoThermo Fisher Scientific41966029Mezzo utilizzato per la coltura delle cellule HEK293-LgBiT
DNasi INew England BiolabsM0303Degrada il template di DNA dopo la reazione di IVT
Soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537Utilizzata per il lavaggio delle cellule e aggiunta alla piastra per prevenire l'evaporazione
EDTA, pH 8,0, privo di RNasiThermo Fisher ScientificAM9260Componente del buffer TAE
Bromuro di etidioSigma-AldrichE1510Colorante per elettroforesi su gel
Serum fetale bovino (FBS)Sigma-AldrichF7524Integratore aggiunto al DMEM
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040Kit per trascrizione in vitro (IVT)
Mezzo Leibovitz L-15, senza fenolo rossoThermo Fisher Scientific21083027Mezzo utilizzato per la coltura delle cellule HEK293-LgBiT durante le misurazioni di luminescenza
L-glutamminaThermo Fisher Scientific25030-024Integratore aggiunto al DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Reagente di trasfezione a base lipidica
Soluzione di precipitazione al cloruro di litioThermo Fisher ScientificAM9480Approccio alternativo per la purificazione dell'mRNA dopo la reazione di IVT
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130Kit di purificazione dopo linearizzazione del plasmide
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WSpettrofotometro utilizzato per la quantificazione della concentrazione di DNA e mRNA
Nano-Glo Endurazine Live Cell SubstratePromegaN2570Substrato necessario per la luminescenza, aggiunto al mezzo L-15 
NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612Purifica l'mRNA dopo la reazione di IVT
Piastra micropiastre Nunc MicroWell a 96 pozzetti, trattata Nunclon Delta, fondo piattoThermo Fisher Scientific136101Piastra utilizzata per la semina delle cellule HEK293-LgBiT e per le misurazioni successive
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985062Mezzo utilizzato per la reazione di trasfezione
Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553Kit PCR
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993Scala di RNA per elettroforesi su gel
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020Disinfettante spray contro le RNasi
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066Componente del buffer TAE
Soluzione di tripsina-EDTASigma-AldrichT4174Reagente per la dissociazione cellulare
Acqua distillata ultrapura priva di DNasi/RNasiThermo Fisher Scientific10977035Utilizzata per la preparazione del template e per la IVT

Riferimenti

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