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Articolo metodologico

Traduzione di mRNA in vitro senza cellule nei lisati di Drosophila

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DOI:

10.3791/70844

⸱

12 giugno 2026

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

In questo articolo

Sommario

Qui forniamo dettagli su come preparare i lisati ed eseguire la traduzione in vitro utilizzando embrioni di Drosophila .

Abstract

La traduzione in vitro dell'mRNA senza cellule ha svolto un ruolo cruciale nella comprensione del processo di sintesi proteica durante l'espressione genica tra gli eucarioti. Lo sviluppo di lisati da diversi sistemi per la traduzione in vitro è stato determinante nello studio dei ruoli della maggior parte dei componenti della macchina di traduzione e nell'analisi di molti passaggi del processo di sintesi proteica. Diversi aspetti della traslazione e del controllo traslazionale sono stati studiati utilizzando lisati di Drosophila melanogaster. Questo articolo fornisce protocolli dettagliati per la preparazione di template di mRNA sintetici, la coltivazione di colture di mosche viventi su larga scala, la preparazione di lisati competenti per la traduzione da embrioni di Drosophila e l'esecuzione di reazioni di traduzione in vitro senza cellule. Questo protocollo è adatto a qualsiasi specie del genere Drosophila—melanogaster, virilis, pseudoscura, grimshawi, hydei, ecc. Confrontiamo inoltre questo protocollo con altri sistemi di traduzione e discutiamo limitazioni, passaggi critici e risoluzione dei problemi. Sono inclusi risultati rappresentativi per aiutare a valutare le prestazioni e la riproducibilità del protocollo. Infine, discutiamo potenziali applicazioni nella biotecnologia e nella ricerca.

Introduzione

Per oltre un secolo, Drosophila si è dimostrata un potente organismo modello geneticamente trattabile per studiare molti fenomeni e molecole biologiche, incluso il controllo traslazionale e la macchina ditraduzione 1,2,3,4. La traduzione in vitro senza cellule di Drosophila è diventata uno strumento potente per studiare la sintesi proteica, poiché può riprodurre molti eventi osservati in vivo. Pertanto, Drosophila è un sistema ideale per scoprire nuove funzioni e molecole che svolgono il controllo della traduzione e della traslazione. I primi studi hanno stabilito un sistema in vitro e traslazionalmente competente nell'artropode correlato alle mosche Artemia salina5 e successivamente in Drosophila hydei6.

Successivamente, in Drosophila melanogaster, sono stati sviluppati lisati reattivi agli mRNA esogeni. La maggior parte degli studi sulla traduzione in vitro di Drosophila è stata condotta su embrioni di età diverse, anche se alcune varianti del tampone di reazione di traslazione sono state utilizzate da diversi gruppi di ricerca. Per confronto, i diversi fenomeni studiati e le condizioni di reazione di traslazione sono elencati nella Tabella 1. Oltre agli embrioni, sono stati sviluppati protocolli per la traduzione in vitro libera di cellule utilizzando ovociti di Drosophila 10,22,23,24,25,26 e lisati di cellule Schneider o Kc coltivate 17,27,28,29,30,31,32. Una descrizione dei componenti necessari per la traduzione in vitro e un confronto tra lisati di diverse specie sono descritte nellefonti 33,34.

Sebbene il processo di traduzione dell'mRNA sia conservato tra gli eucarioti, differenze significative tra i taxa si riscontrano soprattutto nella fase di inizio della traduzione, dove varie molecole reprimono o promuovono la traduzione durante lo sviluppo in modo specifico per tassoo specie 35,36. Questo protocollo è molto adatto per studiare la traduzione dell'mRNA negli insetti durante tutto lo sviluppo, per la quale non possono essere utilizzati lisati provenienti da Metazoi filogeneticamente distanti, inclusi i lisati commerciali di grano o coniglio. In effetti, questo protocollo può ripetere gli eventi di traduzione che si verificano durante l'embriogenesi, cosa impossibile con l'uso di lisatiovociti 23. Ad oggi, non è stato effettuato alcun confronto tra sistemi Drosophila embrionale, ovocitario e a cellule coltivate. Aggiungere modifiche posttraduzionali alle proteine sintetizzate in vitro è una limitazione di questo protocollo nel suo stato attuale. Inoltre, questo metodo non produce quantità preparative di proteine rispetto ai metodi per la produzione di proteine ricombinanti nei batteri.

Qui descriviamo protocolli dettagliati per la crescita abituale di grandi gabbie di mosche di Drosophila , per preparare modelli di mRNA sintetici, per preparare lisati competenti per la traduzione da embrioni e per eseguire saggi di traduzione in vitro senza cellule. La Tabella dei Materiali mostra i reagenti necessari durante tutto il protocollo.

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Protocollo

1) Costruzione di plasmidi template per la trascrizione in vitro

  1. Seleziona plasmidi contenenti una regione non tradotta (UTR) di 5', un cistrone reporter, un UTR di 3' e una coda poli(A) a valle di un promotore di RNA polimerasi T7, T3 o SP6. Assicurarsi che ogni costrutto contenga un sito di restrizione unico immediatamente a valle della coda poli(A) per la linearizzazione plasmidiale prima della trascrizione (Figura 1).
    NOTA: Il sito enzimatico di restrizione utilizzato deve essere scelto con cura in modo che il sito di riconoscimento sia al di fuori della sequenza trascritta o che permetta al DNA linearizzato di terminare in A. Inoltre, l'enzima di restrizione dovrebbe lasciare una sporgenza smussata o di 5' all'estremità di 3' del modello. I sporgenti a 3' possono causare prodotti di trascrizione aberranti. Se viene utilizzato un enzima con una sporgenza di 3', il frammento dovrebbe essere smussato prima dell'uso.
  2. Verifica tutti i costrutti sequenziandoli prima di usarli come modelli per la trascrizione in vitro .
    NOTA: Per questo flusso di lavoro sono stati utilizzati costrutti reporter luciferasi Firefly (FLuc) con coda poly(A)71 . I costrutti FLuc derivano dalla pLUC-cassette12. Le informazioni su vettori e kit sono elencate nella Tabella dei Materiali.

2) Trascrizione in vitro di mRNA cappati e poliadenilati

  1. Linearizzare ogni costrutto plasmidico usando il sito di restrizione unico a valle della coda poly(A) (qui, KpnI).
  2. Risolvere il DNA linearizzato tramite elettroforesi gel all'1%-agarosio eseguita a 100 V per 1 ora.
  3. Estrarre il DNA in gel e verificarne l'integrità e la corretta linearizzazione tramite elettroforesi identica su gel di agarosio.
    NOTA: Non è necessario purificare il DNA linearizzato con gel—se il DNA è completamente tagliato, allora una purificazione a colonna o precipitazione con estrazione fenolica/ETOH è sufficiente.
  4. Trascrivi il DNA purificato e linearizzato utilizzando un kit di trascrizione in vitro secondo le istruzioni del produttore. Includere un analogo a cappuccio 5' nella reazione di trascrizione per stabilizzare l'RNA e stimolare la traduzione.
    NOTA: Un analogo funzionale del cap, come l'RNAm 7G(5′)ppp(5′)G, supporta la stabilizzazione del trascrizione e la stimolazione della traslazione. Un analogo non funzionale del cap, come G(5′)ppp(5′)A, supporta la stabilizzazione del trascrizione ma non la stimolazione da traslazione. Questo inibitore della traduzione viene utilizzato quando i trascritti bicistronici vengono tradotti per testare la presenza di siti interni di ingresso ribosoma (IRES) che guidano la traslazione del secondocistrone 7. Per testare la dipendenza di una coda poli(A), questa può essere eliminata dal plasmide template prima che venga eseguita la trascrizione.
  5. Trattare tutte le reazioni di trascrizione con DNase senza RNasi per rimuovere il modello di DNA dopo la trascrizione secondo le istruzioni del produttore. Tutti i kit di trascrizione in vitro forniscono la DNase senza RNasi.
  6. Purificare il trascrizione tramite precipitazione di cloruro di litio o pulizia a colonna di RNA secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Tutti i kit di trascrizione in vitro forniscono i reagenti cloruro di litio.
  7. Quantificare con spettroscopia il trascrito purificato e valutare l'integrità dell'mRNA tramite elettroforesi in gel all'1%-agarosio eseguita a 100 V per 1 ora.
  8. Alochi l'mRNA e conserva a -70 °C fino all'uso.

3) Manutenzione ordinaria di una coltura di Drosophila su larga scala

  1. Usa il riferimento Drosophila melanogaster del ceppo selvatico Oregon-R.
  2. Prepara il cibo per mosche secondo una ricetta consolidata da un centro di riferimento.
    NOTA: Gli autori hanno utilizzato la ricetta37 del Bloomington Drosophila Stock Center come riferimento per la preparazione del cibo. I dettagli di questa ricetta sono riportati nella Tabella 2, 37. La Figura 2 mostra il flusso di lavoro complessivo dalla raccolta degli embrioni fino alla quantificazione dell'attività della luciferasi.
  3. Installare una gabbia in acrilico cubica o cilindrica di circa 1 m di lunghezza e 50 cm di diametro.
  4. Realizzare un foro di circa 30 cm di diametro nella parte superiore della gabbia e sigillarla con una rete (Figura 3).
  5. Posiziona carta bagnata sopra la rete per fornire acqua alle mosche e sostituisci la carta bagnata ogni giorno (Figura 3).
  6. Tieni la parte anteriore della gabbia aperta e coperta con tessuto per permettere l'accesso all'interno della gabbia. Metti dell'acrilico sul retro della gabbia di plastica, completamente sigillato.
  7. Amplifica lo stock di mosche prima della raccolta degli embrioni e inserisci ~1.000 giovani mosche nella gabbia. Mantieni costantemente la gabbia delle mosche a 22–25 °C.
    NOTA: Diverse gabbie per mosche delle stesse dimensioni e densità di mosche possono essere mantenute contemporaneamente. Le mosche depongono le uova per circa 15 giorni e iniziano a morire intorno al giorno 20.
  8. Nutri le mosche ogni giorno con piatti di succo di agar e frutto guarniti con un cucchiaio di lievito da forno reidratato contenente 200 μL di acido acetico o aceto.
  9. Per stabilire la generazione successiva di mosche, raccogliere diverse lastre di embrioni di 0–12 ore. Posizionare gli embrioni in scatole di plastica da 22 cm × 17 cm × 10 cm contenenti cibo per mosche fino a una profondità di 3 cm. Assicurati che le scatole abbiano un foro sigillato con una rete, per permettere la circolazione dell'aria e impedire la fuga delle larve (Figura 4). Aggiungi lievito attivo secco sopra il cibo e lascia che gli embrioni crescano a 25 °C.
  10. Dopo 3 giorni, si mette carta piegata alta 5 cm nelle scatole in modo che le larve di terzo stadio possano arrampicarsi e diventare pupe.
  11. Dopo 10 giorni, metti le scatole contenenti le mosche adulte appena nate nella gabbia. Lascia che le mosche usciscano dalle casse e si accoppino nella gabbia per 2 giorni.
  12. Per ottenere embrioni di un'età specifica per la preparazione del lisato, si apri con attenzione la gabbia e si posizionano le piastre di succo di agar all'interno della gabbia per il periodo richiesto di deposizione delle uova.
  13. Rimuovi i piatti e raccogli le uova usando una pila di setacci.
    NOTA: Per i lisati embrionali da 0 a 12 anni, posizionare due piastre di succo di agar nella gabbia alle 8:00 e rimuoverle alle 20:00 per la raccolta degli embrioni.
    1. Raccogliere embrioni per la preparazione del lisato tra i giorni 3 e il 10 dopo la schiusa delle mosche adulte.
    2. Parallelamente, raccogliere embrioni nei giorni 2–4 e stabilire una nuova generazione di mosche in scatole contenenti cibo come descritto sopra.

4) Preparazione di lisati di traslazione da embrioni di Drosophila di 0–12 h

NOTA: Questo protocollo non include il trattamento con nucleasi micrococcica. Questo passaggio è stato omesso per evitare la potenziale degradazione dell'mRNA esogeno reporter se l'inattivazione della nucleasi è incompleta. La traduzione di background dovrebbe essere monitorata in ogni esperimento utilizzando un controllo senza mRNA.
NOTA: Questo metodo deriva dai protocolliprecedentemente descritti 7,12,14,15,16,17,22.

  1. Prepara il tampone di lisi embrionale come descritto nella Tabella 2 e conservalo a -20 °C in 1 mL di aliquote.
    NOTA: Scongelare ogni aliquota fino a 2 volte per l'uso immediato.
  2. Raccogli gli embrioni usando un crivello.
    NOTA: Il protocollo standard utilizza embrioni da 0 a 12 h-n, ma anche altre età embrionali possono essere adatte per la preparazione del lisse.
  3. Lavare gli embrioni con acqua del rubinetto in modo approfondito e poi con un tampone embrionale contenente 0,9% NaCl + 0,03% Triton X-100.
    NOTA: Gli embrioni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 24 ore prima della lavorazione.
  4. Decoriona gli embrioni per 5 minuti in 50% di tampone embrionale e 50% di candeggina domestica (ipoclorito di sodio [NaOCl] 4–6% e idrossido di sodio [NaOH] 0,02–0,1%).
    ATTENZIONE: Usa guanti e occhiali di plastica trasparenti quando maneggia candeggina.
  5. Lava a fondo con acqua del rubinetto. Secca gli embrioni con carta e pesali.
  6. Trasferire embrioni confezionati in un omogeneizzatore tritatessuti di vetro su ghiaccio. Aggiungi 1 mL di tampone per lisi embrionale ogni 1 g di embrioni. Omogeneizzare gli embrioni sul ghiaccio con 20 colpi di cocco.
  7. Trasferire l'omogeneato in tubi microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 15.900 × g per 20 minuti a 4 °C.
  8. Recuperare l'interfase in aliquote da 50 μL sul ghiaccio. Congelare le aliquote in azoto liquido e conservarle a -80 °C.
    NOTA: L'interfase è una soluzione liquida torbida tra la fase superiore e quella inferiore. La fase superiore è uno strato di lipidi opachi e altamente viscosi. La fase inferiore è una pallina solida.
    ATTENZIONE: Evitare di contaminare la soluzione di interfase da fasi adiacenti.
    ATTENZIONE: Usa guanti e occhiali di plastica trasparenti quando manipolhi azoto liquido.

5) Reazione di traslazione in vitro

  1. Installare le reazioni di traslazione in una piastra da 96 pozzi o in singoli tubi PCR da 0,2 mL su un termociclatore PCR. Preparare ogni reazione di traslazione in un volume finale di 17 μL, includendo 5 μL di lisato embrionale e i restanti componenti della reazione descritti nella Tabella 2.
    NOTA: Il lisato embrionale rappresenta il 30% vol./vol. del volume totale della reazione.
  2. Se vengono aggiunte proteine ricombinanti alla reazione di traduzione, si dialitica la proteina contro un pH di 20 mM HEPES-KOH 7,4. Seleziona il volume della cassetta di dialisi e il limite di peso molecolare in base al volume del campione e alla dimensione delle proteine.
    NOTA: L'aggiunta di proteine ricombinanti è rilevante per studiare i repressori traslazionali o saggi dipendenti dalla dose con fattori di iniziazione. Evita di aggiungere PBS alle proteine ricombinanti utilizzate nella reazione di traduzione. Mantieni il glicerolo a o sotto il 5% nel campione proteico o nella reazione di traduzione. Se possibile, evita di aggiungere glicerolo alla reazione.
  3. Denatura l'mRNA riscaldando a 65 °C per 2 minuti e raffreddandolo rapidamente sul ghiaccio per 2 minuti prima della reazione in vitro di traduzione.
  4. Eseguire la traduzione di ogni mRNA in triplice. Impostare la reazione come segue: 2,7 μL di cocktail di reazione (Tabella 2) + 5 μL di lisato embrionale + mRNA (30 ng) + H2O a 17 μL di volume finale. Come master mix di base, segui il cocktail di reazione per una reazione nella Tabella 2 e scala il numero di reazioni da eseguire. Incubare la reazione a 25 °C per 60 minuti.
    NOTA: ATP e GTP non vengono aggiunti separatamente alla reazione standard descritta qui. Nelle nostre mani, integrare la reazione con ATP/GTP aggiuntivo non ha migliorato l'output FLuc e ha ridotto la traduzione nelle condizioni testate. Pertanto, la reazione viene eseguita con il sistema rigenerante di energia descritto nella Tabella 2 senza integrazione di nucleotidi aggiuntivi.
  5. Programma il termociclatore con un passo iniziale di 5 minuti a 4 °C, seguito da 60 minuti a 25 °C e un passo finale di 10 minuti a 4 °C.
  6. Fermare la reazione aggiungendo 20 μL di tampone di lisi passiva fredda 1×. Metti la reazione sul ghiaccio per altri 10 minuti.
  7. Conservare i campioni a -20 °C oppure procedere alla quantificazione della luciferasi.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

6) Quantificazione della luciferasi sintetizzata

  1. Porta le reazioni a temperatura ambiente per 20 minuti prima di quantificare l'attività FLuc.
  2. Porta 10 μL di ogni reazione di traslazione e 50 μL di substrato luciferasi (per almeno 2 ore prima dell'uso) a temperatura ambiente.
  3. Aggiungi il substrato luciferasi alla reazione di traslazione. Registra le unità luminose relative usando un luminometro automatico o manuale. Programma il luminometro per effettuare 10 letture distanziate di 1 secondo.

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Risultati

Abbiamo eseguito reazioni di traduzione per analizzare la variabilità di efficienza tra sei preparazioni indipendenti di lisato (ovvero ripetizioni biologiche) utilizzando embrioni di età 0–12 ore. Ogni barra rappresenta un triplicatore tecnico (Figura 5). È stata osservata un'efficienza traslazionale simile, sebbene con una certa variabilità. Abbiamo inoltre confrontato l'efficienza della traduzione tra embrioni di età diversa. Pertanto, abbiamo testato lis...

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Discussione

I lisati di Drosophila per la traduzione in vitro senza cellule possono produrre risultati riproducibili. Embrioni di età diverse e variazioni nella composizione del tampone sono stati utilizzati per indagare una vasta gamma di fenomeni fondamentali nella sintesi proteica e nel suo meccanismo (Tabella 1). Qui, abbiamo descritto un metodo standard adatto a embrioni di qualsiasi età per condurre studi in modo preciso e quantitativo (Tabel...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

N.B-Á e G.H. erano sostenuti dal programma di finanziamento intramurale dell'Istituto Nazionale di Oncologia (Instituto Nacional de Cancerología, INCan), Messico; D.E.V. è borsista posdottorale del Programma Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) "Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022". Ringraziamo Fannis Missirlis e Bety Osorio (CINVESTAV, Messico) per le mosche.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Aluminum foil sheetReynoldsN/AFoglio di alluminio standard per uso domestico; qualsiasi marca commerciale equivalente è accettabile.
Amino acids mixturePromegaL4461N/A
Apple cider vinegarHeinzN/AAceto di mele commerciale (acidità 5%); qualsiasi marca commerciale equivalente è accettabile.
Apple or grape fruit juiceJumexN/ASucco d'uva commerciale; o qualsiasi marca commerciale equivalente.
Bacteriological agarMerck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
Boric acid (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent, grado Molecular Biology, ≥99.5%, polvere; utilizzato per la preparazione del tampone TBE.
Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structureBioLabsS1411SN/A
Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structure analogNew England BiolabsS1404SN/A
Cap: Non-functional cap analogue G(5´)ppp(5´)ANew England BiolabsS1406N/A
Centrifuge Tube (15 mL)Corning430053N/A
Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11836170001N/A
Creatine phosphokinase from rabbit muscleMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
Creatine phosphoric acid, disodium saltMerck1120A47950N/A
Dehydrated baker´s yeastFleischmann'sN/ALievito secco attivo commerciale; qualsiasi marca commerciale equivalente è accettabile.
Diethyl pyrocarbonateMerck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchD4004N/A
Drosophila melanogaster wild-type strain Oregon-RBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; mutant strains of Drosophila melanogaster, as well as wild-type reference strains of other Drosophila species, such as virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, etc. are also provided by this Stock Center.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS reagent, 99.4-100.6%, polvere; utilizzato per la preparazione del tampone TBE.
HEPESSigmaSLBH4583V99.5%(titration)
Hydrogen peroxide (H2O2)EquateN/APerossido di idrogeno commerciale (~2,5-3,5% soluzione di perossido di idrogeno; qualsiasi marca commerciale equivalente è accettabile.
In vitro transcription mMessage mMachine T7, T3, or SP6 KitThermo Fisher ScientificAM1344 and AM1348N/A
KOAc, also termed KCH3COOMerck/Sigma-AldrichSeveralN/A
Lb broth (lennox)Merck/Sigma-AldrichL30221kg
Luciferase assay systemPromegaE1501N/A
MAXIscript T7, T3, or SP6 in vitro transcription KitInvitrogenAM1316 and AM1312N/A
Mg(OAc)2, also termed Mg(CH3COO)2Merck/Sigma-AldrichSeveralN/A
NaCl (sodium chloride)J.T BakerB17W53ACS Reagent
OligonucleotidesAny companyN/ASpecifico per sequenza.
Pasive lysis 5X bufferPromegaE1941N/A
Pipet TipsAxygenT-200-YSuggerimenti in giallo da 200 microlitri.
Pipet TipsAxygenT-1000-BSuggerimenti blu da 1 ml.
Pipet TipsAxygenT-300Suggerimenti trasparenti da 0,5-10 microlitri.
Propionic AcidMerck/Sigma-Aldrich79-09-04ACS reagent grade, ≥99.5%, liquid.
PYREX® 5 mL Glass Pestle Tissue GrinderPYREX®7724-5N/A
QIAprep spin plasmid miniprep kitQiagen27106N/A
QIAquick gel extraction kitQiagen28704N/A
Rabbit reticulocyte lysate (RRL)PromegaL4960N/A
Renilla luciferase (RLuc) assay systemPromegaE2820N/A
RNasin ribonuclease inhibitorPromegaN2111AN/A
RNeasy minielute RNA clean up kitQiagen74204N/A
Slide-A-Lyzer Dialysis CassettesThermo Scientific87735 (Tuttavia, dipende dal taglio molecolare).N/A
Sodium hypochlorite (bleach)CloroxN/ACandeggina commerciale (~5-6% NaOCl); qualsiasi marca commerciale equivalente con concentrazione simile è accettabile.
SpermidineMerck85558N/A
Stainless steel sieveN/AN/AQualsiasi fornitore commerciale.
Taq plus precision DNA polymeraseStratagene600211-51N/A
Transfer ribonucleic acid (tRNA) from bovine liver type XIMerck/Sigma-Aldrich9014-25-9 or R4752N/A
Tris (Tris base)IBI ScientificIB70145Molecular biology grade powder; utilizzato per la preparazione del tampone TBE.
Triton X-100SigmaSLBX9437Laboratory Grade
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500N/A
Unflavored gelatin powderKnoxN/APolvere di gelatina non aromatizzata commerciale; qualsiasi marca commerciale equivalente è accettabile.
Unrefined cane sugar (piloncillo)N/AN/AZucchero di can

Riferimenti

  1. Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.
  2. Hernández G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.
  3. Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.
  4. Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.
  5. Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5′-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.
  6. Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.
  7. Hernández G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.
  8. Zapata JM, Martínez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.
  9. Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.
  10. Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.
  11. Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.
  12. Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5′ and 3′ UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.
  13. Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.
  14. Vázquez-Pianzola P, Hernández G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.
  15. Hernández G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.
  16. Hernández G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.
  17. Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.
  18. Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.
  19. Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.
  20. Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.
  21. Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.
  22. Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.
  23. Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.
  24. Hernández G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.
  25. Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.
  26. Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.
  27. Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.
  28. Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.
  29. Krüger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.
  30. Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.
  31. Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.
  32. Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.
  33. Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.
  34. Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.
  35. Hernández G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.
  36. Hernández G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.
  37. Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.

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