Un flusso di lavoro a basso costo senza marcatori basato su DeepLabCut per l'analisi spontanea dell'andatura e della locomozione in topi in movimento libero

Sommario

Presentiamo un flusso di lavoro a basso costo e senza marker utilizzando DeepLabCut per quantificare l'andatura spontanea e la locomozione nei topi in movimento libero. Questo protocollo integra l'acquisizione video a camera singola, il tracciamento senza marcatori dei punti di riferimento anatomici e l'estrazione dei parametri locomotori spaziotemporali, fornendo un quadro non invasivo e accessibile per l'analisi del comportamento motorio senza apparecchiature specializzate.

Abstract

L'andatura è un biomarcatore funzionale ampiamente utilizzato per rilevare alterazioni motorie in varie malattie e condizioni, poiché riflette cambiamenti nella coordinazione, nella forza, nell'equilibrio e nell'integrazione sensorimotoria. Tuttavia, i metodi tradizionali per analizzare l'andatura nei modelli animali spesso richiedono attrezzature costose, configurazioni complesse o procedure invasive che possono alterare il comportamento naturale. Qui presentiamo un flusso di lavoro a basso costo e senza marker basato su DeepLabCut, un software open source per la stima della posa, per l'analisi quantitativa dell'andatura e della locomozione spontanea nei topi in movimento libero. Il metodo si basa sull'acquisizione video con una singola camera, il tracciamento senza marcatori dei punti di riferimento anatomici e l'estrazione dei parametri locomotori spaziotemporali, senza la necessità di marcatori fisici o hardware specializzato. Per dimostrare l'applicabilità del protocollo, è stato implementato nel modello topino triplo transgenico della malattia di Alzheimer (3xTg-AD) come esempio rappresentativo di applicazione. Questo approccio preserva la libera mobilità e riduce lo stress correlato alla manipolazione, consentendo una valutazione non invasiva del comportamento motorio. Il protocollo è compatibile con gli ambienti standard di test comportamentali. Nel complesso, questo metodo fornisce un quadro accessibile e non invasivo per l'analisi quantitativa dell'andatura e della locomozione nella ricerca preclinica.

Introduzione

Il passo è un processo motorio complesso che emerge dall'interazione in tempo reale tra sistemi motori, sensoriali e cognitivi, richiedendo un elaboramento coordinato del feedback sensoriale, controllo posturale, pianificazione motoria e attivazione muscolare per generare un movimento stabile e^{adattativo 1}. A causa di questa natura integrativa, le alterazioni dell'andatura sono sempre più riconosciute come indicatori funzionali di disfunzione neurologica sia nella pratica clinica che nella ricerca sperimentale. Negli esseri umani e nei modelli animali, l'analisi dell'andatura consente la rilevazione di cambiamenti nella mobilità, nel rischio di cadute, nella fragilità e nella capacità funzionale, ed è stata proposta come biomarcatore per la progressione della malattia e l'efficacia dell'intervento in molteplici^{condizioni 2,3,4}.

Nella ricerca di base, in particolare nei modelli murini, valutare l'andatura spontanea e l'attività locomotoria rappresenta una strategia ampiamente utilizzata per caratterizzare i fenotipi motori e valutare l'impatto di perturbazioni fisiologiche e interventi terapeutici. La quantificazione oggettiva dei parametri locomotori consente di rilevare sottili alterazioni motorie che non vengono catturate in modo affidabile solo con l'ispezione visiva, una limitazione particolarmente rilevante negli studi preclinici che mirano a fenotipi precoci o^{lievi 5}. In questo contesto, l'analisi dell'andatura è emersa come uno strumento prezioso per indagare alterazioni nel comportamento motorio e identificare cambiamenti funzionali associati a diverse condizioni sperimentali, come le malattie neurologiche e^{neurodegenerative 6}.

L'analisi del comportamento motorio e dell'andatura nei modelli murini si è tradizionalmente basata su piattaforme tecnologiche specializzate progettate per quantificare variabili cinematiche spaziali e temporali. Sistemi come passerelle illuminate, piattaforme strumentate e software commerciali per il tracciamento del movimento sono comunemente utilizzati; tuttavia, la loro dipendenza da hardware costoso e infrastrutture dedicate limita significativamente l'accessibilità per molti^laboratori 7,8,9,10. Oltre alle considerazioni economiche, questi approcci introducono ulteriori vincoli sperimentali. Diversi sistemi richiedono agli animali di attraversare corridoi stretti o vie altamente illuminate, imponendo schemi locomotori forzati che riducono comportamenti spontanei, mentre altri si affidano a marcatori fisici, macchie di vernice o etichette adesive attaccate agli arti. Tali interventi possono indurre stress, alterare la meccanica dell'andatura e confondere l'interpretazione fisiologica degli esiti^motori 11,12,13,14. Collettivamente, queste limitazioni evidenziano la necessità di metodologie in grado di catturare l'andatura in condizioni naturali e libere senza dipendere da procedure invasive o infrastrutture costose.

Valutare l'andatura durante la locomozione non vincolata permette di osservare schemi motori più naturali, evitando vincoli esterni che regolano artificialmente velocità, traiettoria o postura. Questo approccio facilita la caratterizzazione del comportamento locomotorio in condizioni minimamente vincolate. DeepLabCut è un framework open-source basato su deep learning basato su stima della posa che utilizza reti neurali convoluzionali per tracciare punti di riferimento anatomici definiti dall'utente senza la necessità di marcatori fisici. Abilitando il tracciamento anatico dei punti da registrazioni video standard, DeepLabCut consente l'estrazione dei parametri cinematici riducendo sostanzialmente i costi e la complessità^sperimentale 15,16,17,18. È importante sottolineare che il tracciamento senza marcatori minimizza l'interferenza sperimentale, rendendolo adatto per studi sul comportamento spontaneo. Questo approccio senza marcatori a camera singola è più adatto per studi che richiedono una quantificazione accessibile e non invasiva dell'attività locomotoria spontanea e delle caratteristiche bidimensionali legate all'andatura in condizioni di libero movimento. Tuttavia, sono necessarie piattaforme di camminatura strumentate o sistemi di cattura del movimento tridimensionale quando sono necessarie variabili biomeccaniche dirette, come forze di reazione al suolo, pressione plantare, angoli articolari o una cinematica completa tridimensionale degli arti.

L'obiettivo di questo articolo è presentare un flusso di lavoro a basso costo e senza marcatori basato su DeepLabCut per la quantificazione non invasiva dell'andatura e della locomozione spontanea nei topi in movimento libero, integrando l'acquisizione video a camera singola, il tracciamento anatomico dei punti di riferimento e l'estrazione di parametri locomotori spaziotemporali all'interno di un flusso di lavoro accessibile che non richiede hardware specializzato o manipolazioni invasive. Questo protocollo si concentra sull'implementazione metodologica e sugli output rappresentativi del flusso di lavoro.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con la Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio e sono state approvate dal Comitato di Bioetica dell'Istituto di Neurobiologia dell'Università Nazionale Autonoma del Messico, secondo il protocollo numero 117.

1. Contesto di studio

1. Utilizzare topi nelle condizioni sperimentali richieste per lo studio. In questo articolo sul protocollo, utilizziamo il modello murino triplo transgenico della malattia di Alzheimer (3xTg-AD), che ospita i transgeni APPSwe e tauP301L su uno sfondo knock-in PS1M146V, insieme a topi non transgenici come controlli, come esempio rappresentativo di implementazione del flusso di lavoro.
2. Genotipa tutti gli animali prima che inizi lo studio.
3. Mantenere i topi con cibo e acqua ad libitum in condizioni controllate che comprendono un ciclo chiaro-buio di 12:12 ore, una temperatura di 22 °C ± 2 °C e umidità relativa del 60% ± 5%, sotto supervisione veterinaria.
4. Esegui registrazioni durante la fase luminosa dopo un periodo di abituazione di 60 minuti, utilizzando una singola sessione in campo aperto per ogni animale per preservare il comportamento esplorativo spontaneo ed evitare una riduzione dell'attività associata all'esposizione ripetuta all'arena.
   NOTA: In questo articolo sul protocollo, presentiamo registrazioni rappresentative esclusivamente per illustrare il flusso di lavoro e il tipo di output locomotori e di camminata generati dal metodo, piuttosto che per supportare confronti biologici tra gruppi.

2. Materiali

1. Noi sono i materiali e le attrezzature elencati nella Tabella dei Materiali e delle Attrezzature per la registrazione e l'analisi della locomozione e del passo spontanei. Vedi la Figura 1 per l'assemblaggio complessivo dell'allestimento sperimentale.

3. Abituazione e registrazione della locomozione spontanea

1. Preparazione e abituazione degli animali
   1. Trasferire con attenzione il topo dalla sua stanza alloggiata alla sala dei test comportamentali almeno 60 minuti prima dell'esperimento per consentire l'abituazione ambientale.
   2. Mantenere la sala di test comportamentali in condizioni ambientali controllate, inclusa una temperatura costante di 20 °C–22 °C, intensità di illuminazione standardizzata (120–150 lux misurata a livello arena) e rumore bianco continuo per minimizzare gli stimoli uditivi esterni.
   3. Durante il periodo di abituazione, tieni l'animale nella gabbia di casa senza introdurre stimoli o arricchimenti aggiuntivi. Maneggiare gli animali in conformità con le linee guida istituzionali per il benessere animale per minimizzare la variabilità comportamentale indotta dallo stress.
   4. Maneggia l'animale usando guanti puliti e movimenti lenti e deliberati. Solleva delicatamente l'animale per la base della coda e sostieni il corpo con la mano opposta prima di posizionarlo nell'arena aperta.
      Nota: PASSO CRITICO: Una gestione incoerente o un tempo di abituazione insufficiente possono aumentare i comportamenti legati all'ansia e introdurre variabilità nei parametri locomotori. Assicurati procedure di abituazione identiche per tutti gli animali e le sessioni.
2. Preparazione dell'arena e della telecamera in campo aperto
   1. Prima di ogni sessione di registrazione, pulisci accuratamente l'arena acrilica da campo aperto con etanolo al 70% (v/v) per rimuovere odori residui e precedenti segnali di odore. Lascia asciugare completamente la superficie prima dell'uso.
   2. Maneggia il 70% di etanolo in un'area ben ventilata, tienilo lontano da fonti di calore o accensione e lascia asciugare completamente l'arena prima dell'uso.
   3. Posiziona l'arena del campo aperto saldamente sulla piattaforma di legno, assicurandoti che la struttura sia stabile e priva di vibrazioni.
   4. Ispeziona le pareti in acrilico trasparente e la superficie opaca del pavimento per confermare che siano privi di polvere, umidità o residui riflettenti che potrebbero interferire con il tracciamento video.
   5. Posizionare lampade bianche laterali esterne su entrambi i lati dell'arena con un angolo approssimativo di 30–45° rispetto al piano dell'arena per fornire un'illuminazione uniforme nell'area di registrazione e minimizzare ombre, riflessi o luminosità eccessiva. Regola la posizione della lampada prima di ogni sessione e verifica che l'illuminazione a livello dell'arena rimanga nell'intervallo target di 120-150 lux.
   6. Posizionare la telecamera sotto l'arena in una configurazione di vista inferiore a una distanza fissa di circa 80 cm dal piano dell'arena, garantendo una visibilità completa dell'area di registrazione. Si noti che questa distanza ottimale potrebbe dover essere regolata in base al diaframma dell'obiettivo e al campo visivo (FOV) della fotocamera specifica per mantenere la copertura completa dell'arena.
   7. Collega la telecamera al sistema informatico e avvia il software di acquisizione video prima di introdurre l'animale.
   8. Regola la messa a fuoco e il campo visivo della telecamera per assicurarti che l'intera superficie dell'arena sia visibile e risolta in modo netto.
   9. Acquisire un'immagine di riferimento per la calibrazione spaziale posizionando la griglia a scacchiera o il motivo di calibrazione con dimensioni note sul piano dell'arena.
      NOTA: PASSO CRITICO: Allineamento accurato della fotocamera, distanza fissa e illuminazione costante sono essenziali per una stima affidabile della posa senza marcatori. Deviazioni nella geometria o nelle condizioni di illuminazione possono ridurre la precisione del tracciamento e compromettere la comparabilità dei dati tra le sessioni.
      NOTA: Materiali alternativi, incluso acciaio inossidabile, possono essere utilizzati per la struttura di supporto esterna, a condizione che l'impianto rimanga stabile e che l'allineamento di registrazione sia preservato.
      NOTA: Può essere utilizzato anche un'arena opaca o materiali alternativi alle pareti, soprattutto quando si desidera un controllo aggiuntivo dell'input visivo esterno, a condizione che l'impianto di registrazione rimanga stabile e che le interferenze visive esterne siano minimizzate.
      NOTA: Le dimensioni dell'arena utilizzate in questo protocollo corrispondono alla configurazione impiegata per registrare i mouse in movimento libero. Queste dimensioni possono essere regolate in base al roditore utilizzato e al protocollo adottato per il campo aperto, a condizione che vengano mantenute la visibilità completa degli animali, la calibrazione spaziale e condizioni di acquisizione coerenti.
3. Registrazione del comportamento locomotorio spontaneo
   1. Prima di inserire il topo nell'arena, visualizza brevemente l'identificatore dell'animale nel fotogramma video per assicurare un'associazione visiva diretta tra la registrazione e la corrispondente sessione sperimentale.
   2. Avvia la registrazione video prima di posizionare il mouse al centro dell'arena in campo aperto per assicurarti la cattura del comportamento esplorativo iniziale fin dall'inizio della sessione.
   3. Posiziona delicatamente il topo al centro dell'arena aperta.
   4. Registra la locomozione spontanea in modo continuo per 3 minuti senza introdurre disturbi visivi, uditivi o tattili. Nel protocollo attuale, veniva eseguita una sola sessione di registrazione per mouse.
   5. Monitora il feed video in diretta sullo schermo del computer per confermare la registrazione ininterrotta e la corretta cattura dei movimenti dell'animale.
   6. Verifica periodicamente l'allineamento delle telecamere e l'uniformità dell'illuminazione tra le sessioni per garantire condizioni di registrazione coerenti tra gli animali.
   7. Al termine del periodo di registrazione, fermare l'acquisizione video e rimuovere con cura l'animale dall'arena utilizzando la stessa procedura di gestione descritta sopra.
   8. Riporta l'animale nella gabbia di casa e lascialo riposare prima di ulteriori procedure.
      NOTA: Evitare di riposizionare l'animale durante la registrazione, poiché interferenze esterne possono alterare i modelli di camminata spontanei e influenzare l'analisi a valle.
4. Pulizia, archiviazione dati e completamento della sessione
   1. Pulisci nuovamente l'arena in campo aperto con etanolo al 70% (v/v) dopo ogni sessione e lascia asciugare completamente prima di introdurre il prossimo animale.
   2. Assicurati che non rimangano residui di etanolo o odore sulla superficie dell'arena prima di introdurre il prossimo animale.
   3. Documenta immediatamente dopo ogni registrazione l'identificatore dell'animale, la data e l'ora della sessione, la condizione sperimentale e il nome dell'operatore.
   4. Se vengono testati altri animali, si ripete la procedura a partire dal passaggio 3.1.1 in condizioni ambientali ed sperimentali identiche.
   5. Salva ogni file video in una cartella dedicata utilizzando una convenzione di denominazione standardizzata (ad esempio, AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4).
   6. Al termine della giornata sperimentale, disattivare il sistema di telecamere e le apparecchiature di illuminazione per evitare la deriva nelle impostazioni di illuminazione tra le sessioni.
      NOTA: Sebbene nell'attuale protocollo sia stato utilizzato etanolo al 70% perché è un disinfettante comunemente usato in questo tipo di procedura, possono essere utilizzati anche disinfettanti compatibili con acrilici per evitare il progressivo deterioramento della superficie, a condizione che l'arena sia completamente asciutta e priva di odori residui prima della prossima registrazione.
      NOTA: Quando possibile, possono essere preparati più ambiti per consentire il passaggio immediato tra le sessioni e facilitare la progressione continua dell'esperimento tra gli animali.
      Vedi Figura 1 per i materiali e l'assemblaggio dell'allestimento sperimentale, inclusa la piattaforma in legno (Figura 1A), l'arena in acrilico (Figura 1B), il sistema di illuminazione laterale (Figura 1C), il posizionamento della telecamera in vista inferiore (Figura 1D) e l'intera configurazione sperimentale (Figura 1E).

Figura 1: Configurazione sperimentale per la registrazione video della locomozione nell'arena aperta. (A) struttura di supporto per l'arena; (B) arena acrilica da campo aperto posizionata sulla piattaforma; (C) illuminazione laterale per garantire un'illuminazione uniforme; (D) posizionamento della telecamera per registrare il movimento dal basso; (E) configurazione completa. Le frecce bianche indicano l'orientamento della sorgente luminosa nella Figura 1C e della fotocamera nella Figura 1D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Elaborazione video e analisi cinematica

1. Preparazione video e controllo qualità
   1. Acquisisci video grezzi in . MOV e convertirli in .avi formato per compatibilità con DeepLabCut mantenendo costanti parametri di frame rate e risoluzione.
   2. Barchivia tutti i file video grezzi immediatamente dopo l'acquisizione in una cartella dedicata sul computer di analisi e applica una convenzione di denominazione standardizzata (ad esempio, AnimalID_Session_Date).
   3. Esamina ogni video nella sua interezza per confermare che la registrazione sia completa e priva di interruzioni, frame persi o corruzioni. I video con errori di acquisizione dovrebbero essere esclusi dall'analisi.
   4. Converti i video in MP4 (H.264) o in formato AVI non compresso se il formato originale non è compatibile con DeepLabCut.
   5. Opzionalmente, esegui un taglio temporale delle riprese video per eliminare gli intervalli non sperimentali all'inizio e alla fine della sessione (ad esempio, durante l'introduzione o la rimozione dell'animale dall'arena sperimentale).
   6. Conferma che risoluzione e frame rate corrispondano ai parametri di acquisizione utilizzati durante la registrazione e rimangano coerenti in tutte le sessioni.
   7. Verifica che l'intera superficie dell'arena sia visibile all'interno del fotogramma video e che nessuna parte del corpo sia oscurata in modo persistente durante la locomozione.
   8. Inseriscitutti i video verificati e processati in una directory dedicata ai progetti per l'analisi DeepLabCut.
      NOTA: PASSO CRITICO: Fresi di frame incoerenti, visibilità parziale dell'arena o motion blur ridurranno direttamente la precisione del tracciamento. I video che non soddisfano i criteri di qualità non dovrebbero essere inclusi nell'addestramento o nell'inferenza dei modelli.
2. Creazione e configurazione del progetto
   1. Designa una libreria video per il progetto, utilizzando gli stessi video destinati all'analisi o un sottoinsieme rappresentativo per la formazione in rete.
   2. Avvia l'ambiente Python e importa il pacchetto DeepLabCut.
   3. Crea un nuovo progetto DeepLabCut usando il comando:
   4. deeplabcut.create_new_project('NomeProgetto', 'Autore', 'VideoPath').
   5. Definisci i punti di riferimento anatomici (parti del corpo) di interesse nel file config.yaml, garantendo definizioni chiare e anatomicamente coerenti.
   6. Le definizioni delle parti del corpo dovrebbero essere ottimizzate per la domanda sperimentale e rimanere identiche su tutti gli animali e le sessioni.
3. Estrazione del telaio e etichettatura delle parti del corpo
   1. Specifica start, stop, numframes2extract e cropping_parameters nel file config.yaml in base alla lunghezza del video e alla disposizione spaziale.
   2. Estrarre i frame rappresentativi usando: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'automatic', 'kmeans'/'uniform').
   3. Rivedere i fotogrammi estratti per confermare l'inclusione della variazione nella postura corporea, orientamento, posizione degli arti e copertura della fase dell'andatura durante la registrazione. Se posture specifiche, configurazioni degli arti o fasi locomotorie sono sottorappresentate, si estraggono ulteriori frame per rappresentare meglio queste condizioni.
   4. Quando sono necessarie fasi specifiche del ciclo dell'andatura, estrarre manualmente i fotogrammi utilizzando: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'manuale').
   5. Avvia l'interfaccia grafica di etichettatura usando: deeplabcut.label_frames(config_path).
   6. Etichetta tutti i punti di riferimento anatomici predefiniti mostrati nella Figura 2, inclusi il fotogramma video rappresentativo durante l'acquisizione (Figura 2A), il rilevamento automatico dei punti di riferimento del corpo sovrapposto al fotogramma originale (Figura 2B) e la rappresentazione schematica dei punti di riferimento del corpo definiti e dei punti di riferimento dell'arena utilizzati per l'analisi (Figura 2C). Seguire criteri anatomici coerenti (ad esempio, naso: punta anteriore del muso; base della coda: giunzione tra la colonna vertebrale e la coda)
   7. Etichetta tutti e quattro gli arti in modo coerente posizionando ogni punto di riferimento al centro della zampa sopra i cuscinetti plantari al contatto con il suolo.
   8. Salva e ispeziona le etichette usando: deeplabcut.check_labels(config_path), e correggi annotazioni inaccurate se necessario.
   9. Quando possibile, chiedere a un secondo valutatore addestrato di etichettare un sottoinsieme di frame per valutare la coerenza tra i valutatori.
      NOTA: PASSO CRITICO: L'etichettatura incoerente o anatomicamente imprecisa è una delle principali cause di errori di tracciamento a valle. Assicurati di rispettare rigorosamente le definizioni dei punti di riferimento in tutti i quadri.
4. Addestramento delle reti neurali
   1. Addestrare il modello di stima della posa per 200 epoche e ottenere un errore medio finale di addestramento (RMSE) di 3,27 pixel e un errore medio di test di 3,59 pixel, corrispondenti a prestazioni di tracciamento stabili nelle condizioni di acquisizione descritte.
   2. Crea i dataset di addestramento e valutazione utilizzando: deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
   3. Regolare il parametro Training Fraction in config.yaml per definire la proporzione di immagini utilizzate per l'addestramento.
   4. Verifica la disponibilità della GPU eseguendo: nvidia-smi.
   5. Inizia la formazione in rete utilizzando: deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, epoche=200).
   6. Monitorare la perdita e la cessazione dell'addestramento una volta che i valori di perdita si stabilizzano e non si osservano ulteriori miglioramenti.
   7. Se l'addestramento viene interrotto, riprendi dall'ultimo checkpoint salvato.
   8. Valuta il modello addestrato utilizzando: deeplabcut.evaluate_network(config_path) e registra l'errore medio dei pixel.
   9. Se l'errore supera la soglia accettabile per l'allestimento sperimentale, aggiungi frame etichettati aggiuntivi o perfeziona le annotazioni e ripeti l'addestramento.
      NOTA: Le soglie di errore dei pixel accettabili possono variare a seconda della risoluzione della fotocamera e della dimensione dell'arena, ma dovrebbero rimanere costanti tra gli esperimenti.
5. Analisi video e quantificazione dell'andatura
   1. Consideriamo i punti con un valore di verosimiglianza inferiore a 0,3 come mancanti.
   2. Interpolare linearmente i punti mancanti solo quando i gap sono ≤3 fotogrammi consecutivi; escludere i pausi più lunghi dall'analisi.
   3. Definiamo gli scontri locomotori usando una soglia di velocità centrale del corpo di 10 cm/s.
   4. Escludere i movimenti al di sotto di questa soglia e gli eventi transitori inferiori a 3 fotogrammi.
   5. Esegui inferenze su video sperimentali utilizzando: deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=Vero).
   6. Genera video etichettati utilizzando: deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]) per confermare visivamente la qualità del tracking (Figura 2).
   7. Imposta il parametro pcutoff in config.yaml a 0.6 per applicare una soglia di confidenza durante la visualizzazione e valutazione del tracciamento.
   8. Importare i file CSV in uscita nell'ambiente di calcolo statistico indicato nella Tabella dei Materiali, insieme al corrispondente pacchetto di analisi e agli script personalizzati forniti nel Materiale Supplementare 1 per la quantificazione comportamentale.
   9. Converti gli indici di frame in tempo usando la frequenza di campionamento video originale.
   10. Calibrare le dimensioni spaziali trasformando le coordinate dei pixel in unità fisiche usando le dimensioni note dell'arena e i punti di riferimento degli angoli tracciati dell'arena.
   11. Esegui il controllo qualità sulle coordinate tracciate prima dell'estrazione metrica.
   12. Si consideri mancanti punti con un valore di verosimiglianza inferiore a 0,3 e sostituiscili con interpolazione lineare quando opportuno.
   13. Identificare traiettorie atipiche durante l'ispezione visiva e correggerle o escluderle quando necessario.
   14. Definire i segmenti di camminata utilizzando criteri cinematici sincronizzati basati sullo spostamento del centro del corpo e sul movimento degli arti posteriori.
   15. Escludere comportamenti non locomotori come alzarsi, virare e toelettatura.
   16. Calibrare e affinare manualmente le soglie di definizione in base alle condizioni sperimentali e al modello animale per conservare solo lunghi periodi locomotori continui e robusti per l'analisi.
   17. Calcolare le metriche di camminatura derivate da relazioni geometriche e temporali tra punti di riferimento tracciati utilizzando i segmenti locomotori continui filtrati (Tabella 1). Questi includevano lunghezza del passo, lunghezza del passo, larghezza del passo, cadenza, durata del passo, durata del passo, tempo di posizione, tempo di oscillazione, ampiezza ipsilaterale e misure di spostamento specifiche per arto.
   18. Estrai le metriche di campo aperto dalla registrazione completa utilizzando gli stessi dati di tracciamento (Tabella 1). Questi includevano la distanza totale percorsa, la velocità media, il tempo trascorso in movimento, la percentuale di tempo trascorso in movimento, il numero e la durata delle camminate, e la distanza cumulativa coperta nelle zone centrali, periferiche e angolari.
   19. Compila tutti gli output in un file master strutturato per l'analisi statistica a valle.
   20. Genera rappresentazioni visive (ad esempio, traiettorie, heatmap, spostamenti basati sul tempo, schemi di camminata e grafici di coordinazione inter-arti) utilizzando gli ambienti computazionali elencati nella Tabella dei Materiali e gli script di tracciamento descritti sopra.
   21. Visualizzazioni rappresentative sincronizzate della fiducia nel punto, rilevamento dei momenti di camminata, classificazione esplorativa delle zone e coordinazione inter-arti sono fornite nel Video Supplementare 1 e nel Video Supplementare 2 per facilitare l'interpretazione del flusso di lavoro analitico.
6. Controllo qualità e backup dei dati
   1. Ispeziona visivamente un sottoinsieme casuale di video etichettati per confermare la coerenza anatomica tra fotogrammi e sessioni.
   2. Confronta le posizioni di riferimento previste con etichette annotate per verificare la stabilità e la generalizzazione del modello.
   3. Salva una copia completa del progetto, inclusi config.yaml, etichette originali, pesi di rete addestrati e file di output.
   4. Documenta le versioni software utilizzate nel flusso di lavoro, inclusi DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA e l'ambiente di calcolo statistico, insieme alle specifiche GPU e alla data di analisi.
   5. Genera un rapporto riepilogo degli errori medi e dei tempi di elaborazione da evaluation-results.csv.
   6. Fai un backup dell'intero progetto su un archivio locale e su un server istituzionale o uno storage cloud sicuro.
7. Ambiente computazionale e risorse di riproducibilità
   1. Cattura le registrazioni video originali in . MOV con una risoluzione di 1080 × 1920 pixel e circa 60 FPS.
   2. Pre-elabora e transcodifica dei video in .avi formato.
   3. Durante questa fase di conversione, ritaglia la regione di interesse, ridimensionala a una risoluzione quadrata di 720 × 720 pixel e standardizza il frame rate a un costante 60 FPS per garantire una quantificazione temporale accurata durante l'analisi cinematica successiva.
   4. Implementare il flusso di lavoro di tracciamento senza marker utilizzando DeepLabCut versione 3.0.0rc13 in un ambiente Python configurato con Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1 e CUDA 11.8.
   5. Addestrare il modello di stima della posa per 200 epoche e ottenere un errore medio finale di addestramento (RMSE) di 3,27 pixel e un errore medio di test di 3,59 pixel.
   6. Eseguire analisi post-tracking utilizzando l'ambiente di calcolo statistico e gli script personalizzati forniti nel Materiale Supplementare 1 per la quantificazione dell'andatura e del campo aperto.
   7. Usa una soglia di velocità del centro del corpo di 10 cm/s per identificare i movimenti di camminata. Riempire gli spazi di fino a 3 frame tra le epoche locomotorie ed escludere movimenti transitori inferiori a 3 frame per mantenere i segmenti di andatura continui per l'analisi.
   8. Fornire le impostazioni di config.yaml rilevanti, script di analisi rappresentativa, file video e di tracciamento di esempio e pesi dei modelli nel Materiale Supplementare 1.
   9. Fornire dettagli aggiuntivi sull'implementazione, metriche di valutazione del modello, specifiche hardware e parametri di analisi specifici per caso nel Materiale Supplementare 1, dove applicabile.
      NOTA: Regolare questi parametri in base alle condizioni di acquisizione utilizzate in ogni esperimento.

Figura 2: Flusso di lavoro rappresentativo per il tracciamento senza marcatori dei punti corporei e l'analisi dell'andatura da registrazioni video. (A) Fotogramma video rappresentativo di un topo che si muove liberamente all'interno dell'arena in campo aperto durante l'acquisizione. (B) Esempio di rilevamento automatico dei punti del corpo sovrapposto al fotogramma video originale dopo la stima della posa, illustrando i punti di riferimento anatomici utilizzati per l'analisi. (C) Rappresentazione schematica dei punti di riferimento definiti del corpo e dei punti di riferimento dell'arena utilizzati per la ricostruzione del cammino, la calibrazione spaziale e l'analisi quantitativa della locomotoria. Punti di riferimento e punti di riferimento per l'arena: muso, gola, centro del corpo, centro sinistro (bcl), centro destra (bcr), anca sinistra (hipl), anca destra (hipr), base della coda, centro della coda, punta della coda, zampa anteriore sinistra (lfp), zampa posteriore sinistra (lhp), zampa anteriore destra (rfp), zampa posteriore destra (destra), in alto a sinistra (tl), in alto a destra (tr), in basso a sinistra (bl) e in basso a destra (br). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Dopo l'applicazione del flusso di lavoro di tracciamento e analisi, l'elaborazione automatica ha ricostruito la locomozione spontanea in campo aperto utilizzando il punto di riferimento del centro del corpo definito e ha generato risultati quantitativi adatti all'analisi a valle. I grafici rappresentativi delle traiettorie illustrano come il protocollo catturi lo spostamento spaziale attraverso l'arena, l'occupazione temporale e la dinamica della velocità durante l'esplorazione libera. Le variabili di campo aperto mostra...

Discussione

Questo studio presenta un approccio a basso costo e senza marker per analizzare la locomozione spontanea e l'andatura in topi in movimento libero, utilizzando l'acquisizione video standard e la stima della posa basata su DeepLabCut all'interno di un flusso di lavoro accessibile. Il flusso di lavoro consente l'estrazione di variabili locomotorie e legate all'andatura dalle registrazioni video, preservando il comportamento locomotorio naturale e riducendo le interferenze sperimentali. In q...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
70% etanolo	Generico	N/A	Pulizia dell'arena tra le sessioni
Lampade a luce bianca regolabili	Generico	N/A	Illuminazione costante (100–150 lx)
Tende nere/controllo della luce	Generico	N/A	Riduci luce esterna/riflessi
Modello griglia a scacchi	Generico	N/A	Immagine di riferimento per la calibrazione spaziale
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	Open-source	N/A	Software di stima della posa
Videocamera digitale (HD, 16:9; ≥60 fps)	Generico	N/A	Impostazioni fisse per tutte le sessioni
Stazione di lavoro con GPU Nvidia	Costruzione personalizzata	N/A	Hardware per l'addestramento/inferenza del modello
Luxmetro	Generico	N/A	Verifica dell'illuminazione a livello dell'arena
PyTorch	Pytorch Foundation	N/A	Framework richiesto da DeepLabCut
Arena aperta in acrilico trasparente (42 × 42 × 42 cm)	Realizzato su misura / In-house	N/A	Arena aperta
Supporto per videocamera sotto l'arena (vista a 90°)	Realizzato su misura / In-house	N/A	Supporto stabile per la registrazione dal basso
CUDA	Nvidia Corporation	N/A	Elaborazione parallela accelerata da GPU
Lingua di programmazione R	R Foundation	N/A	Lingua di programmazione per l'analisi dei dati