Articolo di ricerca

Meccanismo e validazione sperimentale dei flavonoidi totali del rizoma drynariae nel trattamento dell'artrite gottosa

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DOI:

10.3791/70849

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5 giugno 2026

 ,  , 
1School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, 2Quality department, Beijing Tongrentang Kangyang Industry Development Co., Ltd, 3Engineering Research Center of Good Agricultural Practice for Chinese Crude Drugs, Ministry of Education

In questo articolo

Sommario

I flavonoidi totali del Rhizoma Drynariae (TFRD) alleviano l'artrite gottosa (GA) sopprimendo l'infiltrazione delle cellule infiammatorie e riducendo i livelli di TNF-α, IL-6 e IL-17A, principalmente attraverso l'inibizione delle vie di segnalazione di AKT, MACK e NF-κB, evidenziando il loro potenziale terapeutico antinfiammatorio e immunomodulatorio.

Abstract

L'artrite gottosa (GA) è una malattia infiammatoria articolare causata dalla deposizione di cristalli di urato monosodio (MSU) nello spazio articolare e nei tessuti circostanti. Nella medicina tradizionale cinese, il rizoma drynariae (Gusuibu) è da tempo ampiamente utilizzato nel trattamento clinico della GA, e i flavonoidi sono considerati i suoi principali costituenti bioattivi. Questa ricerca ha utilizzato la farmacologia di rete per costruire una rete componente-bersaglio di flavonoidi totali del Rhizoma Drynariae (TFRD) contro la GA, identificando così componenti chiave, bersagli principali e vie correlate. I modelli di ratto sono stati individuati tramite iniezione intra-articolare di una sospensione a cristalli di urato monosodio e trattati con TFRD o il controllo positivo, colchicina, con gavage orale. Dopo la raccolta del campione, i risultati della predizione basata sulla farmacologia di rete sono stati successivamente validati utilizzando metabolomica sirica di ratto, saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) e analisi Western blot. L'analisi della farmacologia di rete ha indicato che gli effetti anti-GA della TFRD sono mediati da bersagli chiave, tra cui IL6, AKT1, TNF, EGFR, JUN e PTGS2, e sono principalmente associati a vie di infiammazione, immunità e apoptosi, come IL-17, TNF, NF-κB, MAPK, PI3K-AKT, JAK-STAT e le vie di segnalazione dei recettori delle cellule T. Analogamente, la metabolomica ha scoperto i ruoli fondamentali della risposta infiammatoria. La colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) ha confermato che la TFRD riduceva l'infiltrazione delle cellule infiammatorie. Il saggio ELISA ha confermato che il gruppo TFRD inibiva significativamente l'espressione dei fattori infiammatori TNF-α, IL-6 e IL-17A nel tessuto sinoviale. L'analisi del Western blot ha rivelato che TFRD inibiva l'iperfosforilazione indotta da GA di AKT, MAPK p38 e NF-κB p65 nel tessuto sinoviale del ratto. La TFRD può efficacemente mitigare i cambiamenti scatenati dall'infiammazione nei ratti GA modulando direttamente i fattori infiammatori correlati e le vie infiammatorie.

Introduzione

L'artrite gottosa (GA) è una malattia infiammatoria articolare scatenata dalla deposizione di cristalli di urato monosodio (MSU) all'interno e intorno alle articolazioni, che stimolano l'areaarticolare 1,2. La patogenesi dell'AG comporta un'interazione complessa di predisposizione genetica, influenze ambientali e disregolazione metabolica, caratterizzata principalmente da iperuricemia, dovuta a un'eccessiva produzione di acido urico o a un'insufficiente excrezionerenale 3,4. Questo porta all'accumulo sistemico di cristalli di urato nei tessuti renali e negli spazi articolari, dove attivano il sistema immunitario innato e provocano intense cascateinfiammatorie 5,6. Negli ultimi anni, una serie di studi ha dimostrato che la prevalenza globale dell'AG è aumentata parallelamente all'aumento dell'incidenza di obesità e sindrome metabolica, portando a compromissione funzionale e imponendo un notevole onere socioeconomico agli individuicolpiti 7. La strategia di trattamento per l'artrite gottosa si concentra sul controllo dell'artrite articolare locale acuta e sulla gestione dei livelli di acido urico a lungotermine 8,9. Tuttavia, l'utilità delle farmacoterapie esistenti è spesso limitata dai loro profili di effetti avversi e dalle specifiche controindicazioni. Ad esempio, i farmaci antinfiammatori non steroidei sono generalmente evitati nei pazienti con malattia renale cronica a causa del rischio associato di precipitare o aggravare la lesione renaleacuta 10,11. Allo stesso modo, l'agente allopurinolo che abbassa l'urato comporta un rischio ben documentato di gravi reazioni avverse cutanee come la sindrome di Stevens–Johnson, mentre il benzbromarone può indurre una significativaepatotossicità 11,12,13,14,15. Pertanto, rimane un bisogno impellente di sviluppare terapie più sicure, applicabili in modo più ampio e mirate meccanicisticamente per una gestione efficace della GA.

Nella medicina tradizionale cinese (MTC), l'AG rientra in categorie diagnostiche come "Malattia di Lijie" (dolore da corsa articolare), "Gout bi" (impedimento della gotta) e "Yu Zhuo bi" (impedimento di stasi-torbidità). Gli interventi della MTC per l'AG offrono effetti sinergici attraverso azioni antinfiammatorie e analgesiche, modulazione del metabolismo dell'acido urico, miglioramento della microcircolazione e preservazione della funzione articolare, rendendolo un ambito di rilievo della ricercacontemporanea 16,17,18,19. Rhizoma Drynariae (Gusuibu), derivato dal rizoma essiccato di Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm., una felce perenne della famiglia delle Polypodiaceae, è comunemente utilizzato nella pratica clinica per trattare la GA. I composti bioattivi del rizoma Drynariae contengono principalmente flavonoidi, fenilpropanoidi, triterpenoidi, acidi fenolici e i loroglicosidi 20,21. Tra questi, i flavonoidi rappresentano la classe di composti più studiata negli ultimianni 22,23,24. Studi precedenti hanno dimostrato che i flavonoidi possiedono notevoli proprietà antinfiammatorie e antiossidanti25.

Ricerche preliminari hanno rilevato che i flavonoidi totali del rizoma drynariae (TFRD) possono sopprimere efficacemente le risposte infiammatorie nell'osteoartrite, nell'artrite reumatoide e in altre condizioni infiammatoriearticolari 26,27,28. Tuttavia, i meccanismi sottostanti della TFRD contro l'AG devono ancora essere approfonditi. Pertanto, questo studio mira a impiegare un approccio integrato che combini farmacologia di rete, metabolomica ed esperimenti di biologia molecolare per esplorare e convalidare i meccanismi specifici e l'efficacia terapeutica della TFRD nel trattamento della GA. Un'indagine sistematica sui meccanismi multi-componenti, multi-bersaglio e multi-percorso alla base del trattamento TFRD contro l'AG dovrebbe promuovere la scoperta di farmaci e fornire opzioni innovative e soluzioni pratiche per la gestione clinica della GA.

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Protocollo

Questo studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale dell'Amicizia Cina-Giappone (Approvazione n.: zryhyy21-22-08-10) e condotto seguendo le linee guida istituzionali per la cura etica e l'uso degli animali da laboratorio.

Previsione e screening di bersagli correlati al TFRD e associati alla GA
I costituenti chimici di Rhizoma Drynariae sono stati recuperati dal Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) utilizzando "Rhizoma Drynariae" come terminedi ricerca 29. Lo screening per costituenti potenzialmente bioattivi è stato effettuato basandosi sui criteri di biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e somiglianza farmacologica (DL) ≥ 0,18, 30,31,32. Dal pool di composti risultante, i componenti flavonoidi sono stati successivamente identificati e selezionati in base alle loro strutture chimiche. Questi componenti flavonoidi, d'ora in poi chiamati flavonoidi totali del Rhizoma Drynariae (TFRD), sono stati incorporati nell'analisi a valle. Dopo aver recuperato i geni target associati a TFRD dal database TCMSP, i loro simboli genici standardizzati corrispondenti sono stati annotati utilizzando il databaseUniProt 33. Utilizzando "gotta" come termine di ricerca, i target correlati alle malattie sono stati recuperati dal database GeneCards per stabilire un insieme di genicandidati 34.

Istituzione della rete compound-target
L'intersezione tra i bersagli associati alla TFRD e quelli correlati alla GA è stata identificata e definita come i principali bersagli terapeutici che mediano gli effetti anti-GA della TFRD, e l'insieme sovrapposto è stato visualizzato utilizzando un diagramma di Venn. Inoltre, è stata costruita e analizzata una rete regolatoria di "TFRD - target - GA" utilizzando il softwareCytoscape 35.

Rete di interazione proteina-proteina
I principali target terapeutici della TFRD contro l'AG sono stati importati in un database online per generare una rete di interazione proteina-proteina (PPI), con il punteggio minimo richiesto impostato su "alta confidenza (0,700)"36. La rete PPI è stata ottimizzata utilizzando il software Cytoscape, e i primi 30 target core classificati per centralità di grado sono stati selezionati per generare un grafico a barre37,38.

Analisi dell'arricchimento delle vie KEGG
L'analisi di arricchimento delle vie KEGG è stata effettuata su questi target principali utilizzando il software R e il databaseBioconductor 38,39. I percorsi con un valore p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Dopo aver escluso le vie correlate a malattie e metabolismo, in Cytoscape è stata visualizzata una rete di interazione via-bersaglio. Tra questi percorsi, i primi 20 percorsi classificati per valore P crescente sono stati presentati in un grafico a barre.

Preparazione dei farmaci
Per la preparazione di una sospensione cristallina di monosodio urato (MSU), 500 mg di cristalli MSU venivano pesati utilizzando una bilancia analitica, dispersi in 10 mL di soluzione salina normale e 2 mL di Tween 80, e riscaldati durante la mescolare magneticamente. La miscela è stata poi regolata a un volume finale di 20 mL con soluzione salina normale per ottenere una sospensione di 25 mg/mL. Dopo l'autoclav, la sospensione veniva conservata a 4 °C fino all'uso. La dose clinica comune per TFRD è di 750 mg al giorno per un adulto di 70 kg, corrispondente a una dose di 67,5 mg/kg di peso corporeo al giorno per ratti. Il TFRD veniva disciolto in acqua distillata fino a una concentrazione di 6,75 mg/mL e conservato a 4 °C per un uso successivo. Secondo il metodo di normalizzazione della superficie corporea, la dose orale equivalente di colchicina (il farmaco positivo) nei ratti convertiti dalla dose clinica umana (0,6 mg/60 kg) è 0,062 mg/kg. Una soluzione di colchicina veniva preparata in acqua distillata a una concentrazione di 0,0062 mg/mL e conservata a 4 °C per un uso successivo.

Animali
In questo studio sono stati utilizzati in totale 36 maschi di ratti Sprague–Dawley (SD) di sei settimane (220 ± 10 g) (licenza animale n. SCXK [Jing] 2025-0008). Gli animali venivano ospitati presso il Centro per Animali da Laboratorio dell'Ospedale dell'Amicizia Cina-Giappone in condizioni dietetiche standard a una temperatura di 22–24 °C e umidità del 50–70%.

Istituzione e intervento del modello
Dopo una settimana di acclimatazione, i ratti sono stati divisi casualmente in quattro gruppi (n = 9 ciascuno): controllo, modello, TFRD e farmaco positivo. La randomizzazione veniva effettuata utilizzando una tabella dei numeri casuali. La raccolta e l'analisi dei dati sono state condotte in condizioni di cieco. Tutti i trattamenti venivano somministrati una volta al giorno tramite gavaga orale. Tutti gli interventi sono stati somministrati una volta al giorno tramite gavage orale alle 08:00 per sette giorni consecutivi. I gruppi di controllo e modello a vuoto hanno ricevuto soluzione fisiologica normale (10 mL/kg), mentre i gruppi TFRD e quelli positivi hanno ricevuto le rispettive sospensioni farmacologiche a un volume equivalente (10 mL/kg). Il quarto giorno di interventi, il gruppo di controllo a vuoto ha ricevuto un'iniezione intra-articolare di soluzione fisiologica normale sterile, mentre i ratti del modello, TFRD e dei gruppi farmaci positivi sono stati iniettati con una sospensione cristallina MSU per indurre artrite gottosa acuta. Prima dell'iniezione, i ratti venivano anestetizzati utilizzando un sistema anestesiario a isoflurano. Ogni ratto nel modello, TFRD e i gruppi di farmaci positivi ricevevano 200 μL di sospensione MSU nella cavità dell'articolazione della caviglia sinistra. Dopo il ritiro dell'ago, si applicava una pressione delicata sul sito di iniezione con un cotton fioc sterile per alcuni secondi per evitare perdite.

Raccolta e lavorazione dei campioni
72 ore dopo l'induzione del modello, i ratti sono stati anestetizzati e posizionati supini. Dopo la disinfezione addominale, la cavità peritoneale è stata aperta e l'intestino è stato delicatamente retrato per esporre l'aorta addominale. Un ago per la raccolta del sangue veniva inserito parallelo al vaso per prelevare sangue aortico addominale, che veniva immediatamente trasferito in tubi eparinizzati pre-raffreddati in un bagno d'acqua ghiacciato. I campioni sono stati centrifugati a 3000 × g per 10 minuti a 4 °C per ottenere il siero, che è stato allicitato e conservato a -80 °C per una successiva profilazione metabolomica. Gli animali sono stati poi soppressi tramite asfissia con CO₂. Il pelo intorno all'articolazione della caviglia sinistra è stato rasato e la pelle e i muscoli circostanti sono stati accuratamente rimossi per esporre la struttura articolare intatta. Il tessuto sinovicale, che appare come una sottile membrana biancastra che riveste la capsula articolare, è stato delicatamente isolato dalla fascia adiacente usando pinze sottili. I campioni di articolazione raccolti sono stati fissati al 4% di paraformaldeide a 4 °C per 72 ore. Successivamente, parte del tessuto articolare è stata decalcificata in soluzione di decalcificazione EDTA, con la soluzione rinnovata settimanalmente per 8 settimane. La completa decalcificazione è stata confermata tramite test con puntura a ago: se si incontrava resistenza, la decalcificazione veniva proseguita fino a quando il tessuto non era completamente penetrabile.

Dopo la decalcificazione, le articolazioni della caviglia venivano sezionate sagittalmente, inserite in cassette di elaborazione e sottoposte a disidratazione da etanolo graduale. I tessuti venivano eliminati nello xilene, infiltrati con la paraffina e inseriti in blocchi di paraffina. Sezioni di 6 μm di spessore venivano tagliate utilizzando un microtomo automatico, fatte galleggiare su un bagno d'acqua a 40 °C e montate su vetrine adesive. Dopo l'asciugatura a 60 °C per 30 minuti, le sezioni sono state deparafinizzate, colorate con ematossilina ed eosina (H&E) secondo i protocolli standard, e infine coperte con balsamo neutro. Le immagini intere delle diapositive venivano acquisite utilizzando uno scanner digitale per diapositive.

Analisi della metabolomica sierica
I campioni di siero provenienti dai gruppi modello e TFRD sono stati scongelati a 4 °C prima della lavorazione. Per ogni campione, 100 μL di siero venivano trasferiti in un tubo microcentrifuga e combinati con 400 μL di solvente di estrazione preraffreddato (metanolo: acetonitrile, 1:1, v/v) contenente standard interni. La miscela è stata sottoposta a un vortice per 1 minuto, seguita da una sonicazione in un bagno d'acqua ghiacciata per 10 minuti. Successivamente è stato incubato a -40 °C per 1 ora per facilitare la precipitazione delle proteine e successivamente centrifugato a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Il sovrantantante ottenuto dopo la centrifugazione è stato accuratamente raccolto e trasferito in fiale autocampionatore per l'analisi UHPLC–MS. Inoltre, volumi uguali di sovrantanti provenienti da ciascun campione all'interno dello stesso gruppo sono stati messi in comune per generare campioni di controllo qualità (QC).

Dopo la rilevazione dei metaboliti in campioni di siero dei due gruppi, i dati grezzi della spettrometria di massa sono stati processati da software dedicato per la rilevazione, estrazione, allineamento e integrazione automatizzati dei picchi, ottenendo una matrice di dati strutturata delle caratteristiche spettrali degli ioni. Le caratteristiche spettrali rilevate sono state confrontate con le librerie spettrali metabolomiche consolidate per identificare i metaboliti derivati dalla TFRD che erano entrati nella circolazione sistemica. Le caratteristiche non identificate e quelle con valori eccessivi mancanti sono state rimosse dal dataset. Il dataset curato è stato ri-indicizzato e strutturato in un formatostandardizzato 40.

L'espressione differenziale dei metaboliti tra i due gruppi è stata valutata calcolando sia il cambiamento di piega (FC, espresso come rapporto intergruppo) sia la significatività statistica (p-valore). Metaboliti che soddisfano la soglia di |log₂FC| ≥ 1 e P < 0,05 sono stati definiti come metaboliti differenzialmente espressi (DEM). I risultati dello screening sono stati riassunti visivamente utilizzando metodi come i grafici vulcanici. I metaboliti differenziali selezionati sono stati successivamente importati nel database di PubChem per ottenere i loro identificatori canonici (CID)41. Gli ID KEGG corrispondenti sono stati poi ottenuti in base ai CID. Infine, gli ID KEGG sono stati importati in una piattaforma di analisi metabolomica per effettuare un'analisi di arricchimento delle vie metaboliche e identificare le vie di segnalazione significativamente associate ai DEM.

ELISA
I campioni di tessuto sinoviale venivano congelati rapidamente in azoto liquido e polverizzati in una polvere fine. Circa 100 mg di polvere venivano pesati con una bilancia elettronica di precisione, miscelati con 1 mL di PBS gelato e omogeneizzati su ghiaccio usando un omogeneizzatore di vetro. L'omogenato fu centrifugato a 10.000 × g per 5 minuti a 4 °C, e il soprannatante fu raccolto per una successiva rilevazione ELISA. Prima dell'analisi, il kit ELISA è stato lasciato bilanciare a temperatura ambiente per 30 minuti. Tutti i reagenti, inclusi standard diluiti serialmente, tampone di lavaggio, soluzione di lavoro con anticorpi marcati con biotina e soluzione coniugata enzimaticamente, sono stati preparati secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, 100 μL di standard a diverse concentrazioni e campioni sono stati aggiunti ai pozzi designati della micropiastra pre-rivestita. La piastra è stata sigillata e incubata a 37 °C per 90 minuti. Dopo l'incubazione, il contenuto veniva scartato e i pozzi venivano lavati quattro volte. Successivamente, sono stati aggiunti 100 μL di soluzione di lavoro per anticorpi biotinilati in ciascun pozzo, seguiti da un'incubazione a 37 °C per 60 minuti e un altro passaggio di lavaggio. Successivamente, sono stati introdotti 100 μL di soluzione lavorativa coniugata enzimatica, e la piastra è stata incubata a 37 °C per 30 minuti, seguita da un ulteriore lavaggio. È stato poi aggiunto un substrato cromogenico e la piastra è stata incubata al buio a 37 °C per 10 minuti. La reazione veniva interrotta aggiungendo 100 μL di soluzione di stop, e l'assorbanza veniva misurata a 450 nm utilizzando un lettore a micropiastre. Una curva standard è stata costruita adattando i valori di densità ottica (OD) degli standard alle corrispondenti concentrazioni, e le concentrazioni campionarie sono state calcolate di conseguenza.

Tachia occidentale
I tessuti sinoviali venivano rapidamente congelati e macinati meccanicamente fino a ottenere una polvere fine. Una porzione misurata della polvere è stata lisata in un volume appropriato di buffer RIPA gelato integrato con proteasi e proteasi e interferenti della fosfatasi (1:100, v/v), seguita da incubazione sul ghiaccio per 30 minuti. I lisati sono stati poi centrifugati a 10.000 × g per 5 minuti a 4 °C, e i soprannatanti sono stati accuratamente raccolti. Le concentrazioni proteiche sono state quantificate tramite un saggio BCA e tutti i campioni sono stati regolati a concentrazioni uguali con il tampone RIPA. Le proteine sono state separate tramite SDS-PAGE e trasferite sulle membrane PVDF. Le membrane sono state bloccate e poi incubate con anticorpi primari (diluizione 1:1000), seguite da anticorpi secondari (diluizione 1:5000). I segnali proteici sono stati visualizzati utilizzando un sistema di rilevamento ECL, e le intensità delle bande sono state quantificate tramite il software Image Lab (Versione 5.2.1). I livelli relativi di espressione sono stati normalizzati rispetto alla β-actina.

Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software SPSS (versione 20.0). I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Per confronti tra gruppi multipli, è stata utilizzata l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) quando si è soddisfatta l'assunzione di omogeneità della varianza, seguita dal test LSD per confronti a coppie post hoc. Se non veniva raggiunta l'omogeneità della varianza, veniva eseguita l'ANOVA di Welch, seguita dal test T3 di Dunnett per confronti multipli. Un p-valore < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Componenti chiave del TFRD
I potenziali ingredienti bioattivi del Rhizoma Drynariae sono stati recuperati dal database TCMSP, risultando 71 candidati. Questi 71 costituenti attivi sono stati poi sottoposti a un processo di screening basato sulla biodisponibilità orale (OB ≥ 30%) e sulla somiglianza del farmaco (DL ≥ 0,18), che ha portato all'identificazione di 18 composti. Ulteriori perfezionamenti di questa lista hanno rivelato che 10 di questi composti atti...

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Discussione

L'AG è una forma comune di artrite infiammatoria. Attualmente, la gestione clinica si basa principalmente su farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), corticosteroidi e agenti riducentidell'urato. Tuttavia, la somministrazione combinata di questi farmaci infligge una serie di effetti avversi ai pazienti e impone un carico metabolico significativo su fegato ereni. Questo è particolarmente dannoso per i pazienti con insufficienza epatica ...

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Dichiarazioni

Gli autori riferiscono che non ci sono conflitti di interesse in questo lavoro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4% ParaformaldeideSolarbioP1110
Buffer di caricamento proteico 5XSolarbioP1040
Anticorpo AKTTecnologia di segnalazione cellulare4691S
Soluzione diluente anticorpaleBeyotime BiotechnologyP0268
Database Bioconductor https://www.bioconductor.org/
ColchicinaShanghai Yuanye Co., Ltd
Database GeneCards https://www.genecards.org/
Ematossilina ed eosina (H&; E) Kit per la TinturaSolarbioG1120
Piattaforma online MetaboAnalyst 6.0  https://www.metaboanalyst.ca/
Mouse IL-17A ELISA Kit4a Biotech Co LtdCME0041
Mouse IL-6 ELISA Kit4a Biotech Co LtdCME0006
Mouse TNF-α ELISA Kit4a Biotech Co LtdCME0004
NF-& kappa; Anticorpo B p65Tecnologia di segnalazione cellulare8242T
Latte secco scremoSolarbioD8340
p38 Anticorpo MAPKAbclonaleA14401
Cocktail di inibitori della fosfatasiBeyotime BiotechnologyP1081
Anticorpo fosfo-AKT (Ser473)Tecnologia di segnalazione cellulare4060S
Fosfo-NF-κ Anticorpo B p65Tecnologia di segnalazione cellulare3031S
Anticorpo MAPK Fosfo-p38AbclonaleAP0526
Fenilmetilsulfonil Fluoruro (PMSF)SolarbioR0010
Membrana di Polivinilidene Fluoruro (PVDF)MilliporeIPVH00010
PubChem databashttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
R software www.r project.org/
Buffer di lisi RIPASolarbioR0010
Acqua priva di RNasiAmbionAM9937
Ratti SDBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. 
Buffer di elettroforesi SDS-PAGEServicebioG2144
STRING Databasehttps://string-db.org/
Buffer TBST (10X)SolarbioT1085
TCMSPhttps://old.tcmsp-e.com
Buffer di trasferimento tris-glicinaServicebioG2017
TFRDBeijing Qihuang Pharmaceutical Co., Ltd.
UniProt database https://www.uniprot.org/
β-Anticorpo di ActinaZhongshan Jingqiao BiotecnologiaTA-09

Riferimenti

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