Questo studio presenta un metodo di alimentazione a base di gelatina che consente una somministrazione orale precisa, non invasiva e basata sulla massa corporea di farmaci negli adulti di pesce zebra. Il protocollo dimostra un'accettazione affidabile del feed e, come prova di principio, la consegna riuscita di MK-801, che ha portato agli effetti comportamentali attesi.
Articolo metodologico
Un approccio semplice e preciso basato su mangimi per la somministrazione orale di farmaci nei pesci
In questo articolo
Sommario
Abstract
I metodi tipici per la somministrazione di farmaci nel pesce (ad esempio, dosaggio con becher, iniezioni intraperitoneali o gavage orale) sono lunghi, imprecisi e/o sprechi. Poiché questi metodi sono anche stressanti per gli animali, sono poco adatti a somministrazioni ripetute o a lungo termine di esperimenti comportamentali e comportamentali sensibili a confondimenti legati alla manipolazione, limitando così l'utilità dei modelli di pesci nella ricerca biomedica. Per superare questi ostacoli, è stato sviluppato un metodo di alimentazione a base di gelatina per consentire una dosaggio rapido e preciso di farmaci nei pesci con il minimo disturbo. Il metodo prevede la preparazione di morselli di mangime su misura individuali composti da gelatina, estratto di gamberi salamoi, spirulina e il farmaco preferito. Le proprietà malleabili al calore della gelatina permettono di liquefare una singola preparazione omogenea, porzionare con precisione in base alla massa corporea individuale e poi risolidificarsi in pezzi personalizzati. Come prova di principio, l'antagonista del recettore NMDA MK-801 (4 mg kg⁻1) è stato somministrato a pesci zebra adulti prima del nuovo test in acquario, con effetti comportamentali coerenti con una riduzione del comportamento ansioso. Questo approccio è particolarmente adatto alla farmacologia comportamentale ed è facilmente adattabile ad altri organismi modello acquatici.
Introduzione
Il pesce zebra (Danio rerio) è ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica per studiare lo sviluppo, la fisiologia, il comportamento ela farmacologia 1,2,3. Tuttavia, l'utilità del pesce zebra per studi farmacologici, in particolare negli animali adulti, è limitata dalla disponibilità di metodi di somministrazione di farmaci che siano sia precisi che minimamentedirompenti 4.
Le tecniche di somministrazione di farmaci comunemente utilizzate nei pesci zebra, come il dosaggio con becher, l'iniezione intraperitoneale e il gavage orale, presentano entrambe svantaggi significativi. L'esposizione tramite immersione totale tramite dosaggio con becher fornisce un controllo limitato sull'assorbimento del farmaco, produce sprechi di composti significativi e introduce variabilità dovuta a differenze nel tasso di assorbimento e nella stabilitàdel composto 5,6,7. Gli approcci basati sull'iniezione e il gavage orale permettono dosaggi più precisi ma richiedono anestesia, contenzione e manipolazioni ripetute, tutte cose che possono indurre risposte allo stress aumentando al contempo il rischio di lesioni o ipossie, potenzialmente confondendo le misurazioni comportamentali efisiologiche 8,9,10. Queste limitazioni sono particolarmente problematiche per esperimenti che coinvolgono somministrazioni ripetute o a lungo termine di farmaci.
Per affrontare queste sfide, è stato sviluppato un metodo di alimentazione a base di gelatina che consente una somministrazione rapida, precisa e non invasiva di farmaci al pescezebra 11. Questo approccio permette di incorporare composti farmacologici in piccoli frammenti di mangime su misura composti da gelatina, estratto di gambero salamoia e spirulina. La somministrazione di farmaci a base di mangimi è un'alternativa non invasiva che si allinea ai principi delle 3R (sostituzione, riduzione e perfezionamento) nella ricerca etica sugli animali. Sebbene studi precedenti abbiano dimostrato la fattibilità della somministrazione di farmaci a base di alimenti negli adulti di pesci zebra 12,13,14, gli approcci esistenti si basano su matrici alimentari eterogenee o volumi fissi che non tengono conto della variazione individuale della massa corporea. Il metodo descritto qui affronta queste limitazioni consentendo la calibrazione della dose basata sul peso.
Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata e passo dopo passo della preparazione e somministrazione di un alimento a base di gelatina negli adulti di pesci zebra. Sebbene il metodo venga dimostrato tramite un saggio comportamentale, il nuovo test in acquario, è ampiamente applicabile ad altri ambiti della biologia dei pesci zebra e si prevede che sia adattabile per l'uso in altri organismi modello acquatici. Questo protocollo offre una soluzione pratica per i ricercatori che cercano una somministrazione efficiente, riproducibile e a basso stress di farmaci nel pesce zebra, in particolare per studi che richiedono manipolazioni farmacologiche precise, ripetute e/o a lungo termine.
Protocollo
In questo studio sono stati utilizzati maschi e femmine adulti AB e TL zebra (4–12 mesi). Tutti gli animali venivano allevati e ospitati alla Wayne State University. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali in conformità con le linee guida della Wayne State University. I pesci venivano tenuti in condizioni standard su rastrelliere ad alta densità (temperatura 27,5 ± 0,5 °C, conducibilità dell'acqua 500 μS ± 10 μS e pH 7,5 ± 0,2) con un ciclo luce:buio di 14 h:10 h (luci accese alle 08:00). I pesci venivano nutriti due volte al giorno con un mangime secco al mattino e gamberetti di salamoia appena schiusi nel pomeriggio. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Pesatura e calcolo del volume del mangime
- Riempi un becher di vetro da 100 mL con circa 50 mL di acqua di sistema e posizionalo su una bilancia digitale. Prova la bilancia.
- Fai delicatamente una rete a un singolo pesce dalla loro vasca di casa usando una rete a rete fine. Tocca brevemente la rete a un tovagliolo di carta asciutto per rimuovere l'acqua in eccesso.
- Trasferisci con attenzione il pesce nel becher, assicurandoti che nessuna acqua si rovesci sulla squama.
- Registra il peso e usa questo peso misurato per calcolare il volume di alimentazione richiesto basandoti sull'1% del volume per peso corporeo (V/BW) per ogni singolo pesce.
2. Preparazione dell'estratto di gamberi salamoi.
- Sospendere la polvere di gambero in salamoia in acqua distillata fino a una concentrazione finale di 250 mg/mL. Mescolare per 1 ora a temperatura ambiente. Centrifugare la sospensione a 12.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente e mantenere il soprantantante.
- Ripeti la centrifugazione ancora una volta e raccogli nuovamente il surnatante.
- Conserva l'estratto di gamberi in salamoia a −20 °C fino a 6 mesi.
3. Preparazione di mangimi a base di gelatina
- Scongelare l'estratto di gambero salamoia prima della preparazione e calcolare le masse target di gelatina (12% p/v), spirulina (4% p/v) e, se applicabile, composti farmacologici necessari per il volume desiderato di alimentazione gelatinosa.
- Pesa la spirulina e la gelatina in polvere (di origine suina; Sfoga ≈ 300 g) in tubi microcentrifughe separati da 1,5 mL e registra la massa effettiva in ogni provetta. Assicurarsi che la massa misurata sia pari o superiore alla massa target per il volume finale previsto.
- Aggiungere i volumi appropriati di estratto di gamberetto salamoi, composto farmacologico e acqua al tubo contenente spirulina per ottenere concentrazioni finali del 4% w/v di spirulina e 80 mg/mL estratto di gamberi salamoi.
- Vortice a fondo per omogeneizzare. Trasferire il volume richiesto della miscela dal passaggio precedente al tubo contenente gelatina per ottenere una concentrazione finale di gelatina del 12% w/v.
- Posiziona il tubo su un blocco riscaldante a 45 °C preriscaldato per 5 minuti, vorticando a intermittenza finché la gelatina non si dissolve completamente. Se la dissoluzione è incompleta, mescolare delicatamente usando un bastoncino sterile in legno o metallo per favorire l'omogeneizzazione.
- Aliquota la miscela completamente omogenea (fino a 100 μL per tubo) in tubi microcentrifuga marcati da 1,5 mL.
- Conservare le aliquote a −20 °C durante la notte per consentire la completa solidificazione e facilitare la manipolazione durante l'alimentazione.
4. Formazione di singoli bocconi di alimentazione
- Riscaldare la miscela di gelatina alquotata a 45 °C fino a quando non è completamente liquefatta prima dell'alimentazione.
- Vortice la miscela di gelatina liquefatta con un vortice.
- Pipetta il volume corrispondente all'1% della massa corporea del pesce su un foglio di film di paraffina per formare singoli bocconi (Figura 1).
NOTA: Per facilitare la manipolazione e la conservazione, inserire un foglio di film di paraffina all'interno di una piastra di Petri prima di dispensare il volume. Questo permette alla paraffina di rimanere piatta e facilita il trasferimento dei bocconi preparati a −20 °C per la conservazione. - Posiziona i bocconi a −20 °C per almeno 20 minuti per permettere la risolidificazione.
- Tieni i bocconi sul ghiaccio fino al pastacolo.
5. Amministrazione del mangime per gelatina
- Trasferisci i pesci dal rack alloggiato alla stanza comportamentale e lasciali abituare per 1 ora.
- Isola temporaneamente ogni pesce nell'acquario usando barriere trasparenti per 2–5 minuti prima dell'alimentazione.
- Usando una pinza, posiziona il boccone individualizzato di gelatina corrispondente all'1% del peso corporeo del pesce sulla superficie dell'acqua davanti a ciascun pesce isolato.
- Osserva ogni pesce per confermare il consumo dell'intero boccone entro 5 minuti.
- Dopo che i pesci hanno consumato il mangime, rimuovere le barriere e riportare i pesci nelle loro vasche di origine oppure procedere con procedure sperimentali.
NOTA: Un esempio elaborato che descrive la preparazione del mangime e il calcolo delle quantità target e reali di dosaggio è fornito nel File Supplementare 1, con valori di esempio presentati anche nella Tabella 1.
Risultati
Palatabilità per l'alimentazione della gelatina
Per valutare la palatabilità del mangime, agli adulti AB e TL zebra è stato somministrato un mangime a base di gelatina per cinque giorni consecutivi al posto del loro pasto mattutino (Figura 2). Tutti i pesci TL hanno consumato il mangime entro 5 minuti alla prima esposizione, mentre i pesci AB hanno richiesto esposizioni ripetute, con 15 su 16 individui che hanno consumato costantemente il mangime dopo quattro giorni consecutivi di acclimatazione (Figura 2A). L'analisi del tempo di consumo dell'alimentazione utilizzando una ANOVA a tre vie (ceppo × sesso × giorno) ha rivelato effetti principali significativi dello sforzo (F₁,₁₂₅ = 19,4, P < 0,0001) e del giorno (F₄,₁₂₅ = 5,80, P < 0,001), ma nessun effetto principale del sesso (F₁,₁₂₅ = 0,24, P = 0,63). Sono state osservate interazioni significative tra deformazione e giorno (F₄,₁₂₅ = 3,35, P = 0,012) e tra stir, giorno e sesso (F₄,₁₂₅ = 2,55, P = 0,04). I pesci TL di entrambi i sessi hanno consumato rapidamente il mangime dalla prima esposizione (4–20 s), mentre i pesci AB hanno mostrato tempi di consumo iniziali più lunghi (7–144 s) che sono diminuiti nel corso dei giorni (Figura 2B). Entro il quarto e il quinto giorno, tutti i pesci tranne un maschio AB consumavano il mangime entro 10 secondi. Circa il 95% dei pesci consuma il mangime gelatinoso entro 30 secondi dalla presentazione dopo 2–3 giorni di acclimatazione, come riportato inprecedenza 15,16.
Effetto comportamentale del MK-801 somministrato con mangime alla gelatina
Per dimostrare l'efficacia della somministrazione di farmaci a base di gelatina, è stato somministrato il MK-801, un antagonista del recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR), utilizzando un alimento alla gelatina. La distanza del fondo durante l'esplorazione di un nuovo serbatoio veniva misurata come lettura comportamentale. MK-801 è noto per alterare la locomozione e i comportamenti simili all'ansia o all'evitamento dei predatori negli adulti del pescezebra 17. Gli adulti di pesce zebra AB sono stati acclimatati alla procedura di alimentazione ricevendo frammenti di gelatina senza il farmaco per due giorni consecutivi per garantire familiarità e consumo affidabile. Il terzo giorno, i pesci assegnati al gruppo di trattamento ricevevano una singola dose di MK-801 (4 mg kg⁻1) incorporata nell'alimentazione gelatinosa. I pesci di controllo ricevevano solo un pezzo identico contenente un pezzo di gelatina (acqua). Il mangime è stato somministrato 30 minuti prima della valutazione comportamentale nel nuovo test in acquario.
Il comportamento di ansia o evitamento predatore, misurato come distanza dal fondo, è stato analizzato utilizzando un ANOVA 2 × 2 (droga × sessuale), che ha rivelato un effetto principale significativo di MK-801 (Figura 3) (F₁,₆₉ = 24,5, P < 0,001). I pesci trattati con farmaci trascorrevano più tempo vicino alla sommità dell'acquario, un modello comunemente interpretato come una riduzione dell'ansia o come un comportamento di evitamento del predatore. Non vi è stato alcun effetto principale sul sesso (F1,69=2,52, P=0,12) o sull'interazione con il rapporto con il farmaco (F1,69=1,0, P=0,32). I test t a coppie corretti da FDR hanno confermato che MK-801 ha aumentato la distanza inferiore sia nelle femmine (P = 0,0076) che nei maschi (P = 0,023).
Questi risultati insieme, dimostrano che il mangime a base di gelatina consente una somministrazione efficace orale di composti farmacologici, inducendo cambiamenti attesi nel comportamento di fondo nel nuovo test in vasca.
Figura 1: Preparazione del mangime alla gelatina. L'alimentazione in gelatina veniva pipettata su pellicola di paraffina in pezzi su misura individuali corrispondenti all'1% della massa corporea e lasciata a -20 °C. Questa cifra è stata modificata da Ochocki et al.11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Consumo di mangime a base di gelatina da parte degli adulti di pesce zebra. (A) Percentuale di pesci AB e TL di entrambi i sessi che hanno consumato il mangime entro 5 minuti dall'somministrazione. (B) Tempo per il consumo di alimentazione per i pesci AB e TL per sesso. I pesci che non hanno consumato il mangime sono stati esclusi dall'analisi del tempo di consumo. I dati sono mostrati come media ± s.e.m.; n = 8 pesci per varietà e sesso. Questa cifra è stata modificata da Ochocki et al.11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti comportamentali dell'amministrazione degli antagonisti del recettore NMDA. MK-801 (4 mg/kg) è stato somministrato 30 minuti prima del nuovo test in vasca su pesci zebra AB adulti di entrambi i sessi. La distanza dal fondo dell'acquario è stata utilizzata come misura del comportamento ansioso/evitamento predatore. I dati sono presentati come grafici a scatola e baffi che mostrano la mediana (linea centrale), l'intervallo interquartile (scatola) e ±1,5× l'intervallo interquartile (baffi). *P < 0,05 basato sul tasso di false scoperte – test t corretti a coppie. Dimensioni del campione: veicolo femmina, n = 20; femmina MK-801, n = 19; veicolo maschile, n = 19; maschio MK-801, n = 15. Cinque animali sono stati esclusi dall'analisi perché non hanno consumato il mangime alla gelatina. Questa cifra è stata modificata da Ochocki et al.11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componente | Concentrazione di stock | Concentrazione dei bersagli | Massa/Volume bersaglio | Massa/Volume effettivo |
| Gelatina | - | 12% (a/v) | 60 mg | 62 mg |
| Spirulina | - | 4% (c/v) | 20 mg | 25 mg |
| Estratto di gamberi in salamoia | 250 mg/mL | 80 mg/mL | 160 μL | 200 μL |
| Droga | 10 mg/mL | 0,4 mg/μL (4 mg/kg all'1% della massa corporea) | 20 μL | 25 μL |
| Acqua | - | - | 320 μL | 400 μL |
| Volume totale di alimentazione liquida | - | - | 500 μL | 625 μL |
| Volume Totale dell'Alimentazione Finita | - | - | 500 μL | 516,7 μL |
Tabella 1: Esempio di preparazione per mangimi alla gelatina. Concentrazioni di stock, target e masse o volumi reali ipotetici utilizzati per preparare un mangime a base di gelatina per la somministrazione di 4 mg/kg di farmaco somministrata all'1% del peso corporeo.
File supplementare 1: Esempio di preparazione di mangime a base di gelatina per più pesci. Esempio risolto che dimostra la formulazione del mangime contenente farmaci e il calcolo dei volumi dosali individualizzati basandosi sul peso corporeo individuale. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
Il metodo di alimentazione a base di gelatina presentato qui supera i limiti chiave degli approcci di somministrazione di farmaci comunemente usati nei pesci zebra, consentendo dosaggi individualizzati basati sulla massa corporea con una gestione minima. Questo migliora la precisione sperimentale e la riproducibilità. La natura malleabile al calore della gelatina permette di liquefacere, porzionare con precisione e risolidificare una singola preparazione omogenea in morsi individuali, garantendo una distribuzione uniforme del farmaco e al contempo la variabilità di dimensione tra i singoli. Inoltre, la somministrazione orale tramite gelatina evita lo stress e il potenziale danno associati ai metodi basati sull'iniezione, rappresentando un importante raffinamento secondo il quadro delle3R 4.
I vantaggi di questo approccio dipendono da un'esecuzione accurata. Diversi fattori procedurali sono fondamentali per un'implementazione di successo. Una misurazione precisa della massa corporea individuale è essenziale, poiché gli adulti possono mostrare un'eterogeneità di dimensioni significativa anche all'interno di gruppi di età, sesso e ceppo, con la massa corporea che varia quasi tre volte tra gliindividui 11, 18 e 19. Un'omogeneizzazione accurata del composto all'interno della matrice gelatinosa è altrettanto importante per garantire una dosazione costante tra le porzioni del mangime. Infine, l'acclimatamento dei pesci al mangime gelatinoso prima della somministrazione dei farmaci riduce il rifiuto del mangime; Si raccomanda una conferma visiva dell'ingestione del mangime per garantire una corretta somministrazione della dose.
Anche con una corretta esecuzione, tuttavia, ci sono alcune sfide pratiche nella somministrazione di farmaci tramite alimenti. Un problema potenziale è la disposizione imcorretta dei bocconi del mangime, che può causare una rapida disintegrazione del mangime dopo la sua introduzione in acqua. Ciò deriva tipicamente da un controllo e/o miscelazione inadeguato della temperatura durante la preparazione, riscaldamento prolungato o cicli ripetuti di congelamento-disgelo delle materie prime. Per prevenire ciò, la completa dissoluzione della gelatina dovrebbe essere garantita tramite un adeguato riscaldamento/miscelazione, e i stock preparati dovrebbero essere alquotati in porzioni monouso che vengono scongelate una sola volta e utilizzate prontamente. Per le preparazioni sensibili, si raccomanda di preparare un ulteriore boccone di alimento, che può essere aggiunto a un becher d'acqua, confermando la corretta assenatura prima della sperimentazione. Per i composti che riducono la palatabilità del mangime, l'accettazione può essere migliorata incorporando attrattivi come il succo di vongola12˒13 o gli attrattivi commercialiper pesci 20. Nel presente studio, l'estratto di gamberetto salamoia è stato utilizzato per migliorare la palatabilità ed è risultato efficace. In alternativa, somministrare più dosi più piccole può migliorare il consumo ottenendo l'esposizione cumulativa desiderata. Oltre a queste considerazioni pratiche, anche la somministrazione tramite mangimi presenta limitazioni farmacocinetiche intrinseche. Come per tutti i metodi di somministrazione orale, l'assorbimento gastrointestinale può ritardare o ridurre la biodisponibilità rispetto agli approcci basati sull'iniezione, e la stabilità del composto all'interno della matrice di alimentazione può variare.
Nonostante l'acclimatamento, una piccola percentuale di animali potrebbe non consumare il mangime alla gelatina e dovrebbe essere esclusa dall'analisi, poiché potrebbe non ricevere la dose attesa del farmaco. I tassi di rifiuto variano tipicamente dal 2,4% al 6,4% 15,16, e quindi non rappresentano un ostacolo metodologico importante. L'assunzione di alimentazione può variare anche a seconda delle varianti. Questo effetto di ceppo è coerente con precedenti segnalazioni che indicano che il background genetico può influenzare la latenza nell'avvicinarsi alcibo 20. Questi fattori dovrebbero essere considerati nella progettazione degli esperimenti. Si raccomanda di segnalare la conformità all'alimentazione insieme all'identità del ceppo per migliorare la trasparenza e la riproducibilità.
Un'altra importante limitazione del presente studio è che il protocollo è stato sviluppato e validato esclusivamente negli adulti di pesci zebra e quindi non è direttamente trasferibile allo stadio larvale. Questo metodo si basa su dosaggi individualizzati basati sulla massa corporea e sull'assunzione di frammenti di gelatina discreti. Questo è fattibile negli adulti ma poco pratico nelle larve a causa delle piccole dimensioni della gap, del comportamento di alimentazione basato sulla sospensione e della difficoltà di ottenere misurazioni affidabili della massa corporea individuale. Di conseguenza, l'adattamento alle applicazioni larvariche richiederebbe modifiche sostanziali. Queste modifiche potrebbero includere lo sviluppo di particelle su scala microscopica e strategie alternative di somministrazione.
Rispetto ai metodi basati su mangimi descritti in precedenza, questo approccio offre una precisione di dosaggio superiore e facilità d'uso. Gli alimenti gelatinosi commerciali richiedono porzioni di materiale eterogeneo, limitando la precisione della dose12, mentre altri metodi somministrano quantità uniformi a tutti gli animali e assumono una massa corporeaidentica 14,21. Consentendo dosaggi individualizzati, il metodo di alimentazione a base di gelatina descritto qui evita sottodosaggi o sovradosaggi e migliora il controllo sperimentale; Questo porta anche il dosaggio di farmaci negli adulti in linea con le migliori pratiche nei roditori che tipicamente dosano in base al peso. Questo metodo è anche molto adatto a studi che richiedono manipolazioni farmacologiche precise e ripetute, poiché provoca uno stress minimo. Questo include applicazioni nelle neuroscienze comportamentali, nella neurofarmacologia e nella ricerca sull'invecchiamento. È inoltre vantaggioso per composti che interagiscono con gli anestetici o che mostrano scarsa stabilità in ambienti acquosi. Sebbene dimostrato qui negli adulti di pesci zebra, l'approccio è facilmente adattabile ad altri organismi modello acquatici. Nel complesso, questa tecnica migliora la precisione del dosaggio, il benessere animale e la flessibilità metodologica, ampliando l'utilità dei modelli di pesci nella ricerca biomedica.
Dichiarazioni
Questo protocollo si basa su lavori precedentemente pubblicati sul Journal of Experimental Biology, Ochocki AJ, Kenney JW, 202311. Il presente articolo fornisce una guida metodologica dettagliata ed ampliata per la riproducibilità.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (R35GM142566) a J.W.K.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| (+) MK-801 hydrogen maleate powder | SIGMA-ALDRICH | M107-5MG | |
| Gelatin From porcine skin powder | SIGMA-ALDRICH | G1890-100G | Gel strength ~300 g Bloom, Tipo A, Bioreagent |
| Mikro Fine Dried Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/mikro-fine-dried-brine-shrimp-16-ounce | Fine < 400 micron |
| Spirulina powder | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/spirulina-powder-spirulina-powder-2-oz | 99% Pure blue green algae |
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Ristampe e permessi
