Modello murino per la transezione selettiva dei nervi autonomi intestinali

Sommario

Questo protocollo mira a consentire una transezione precisa e selettiva dei nervi simpatici e parasimpatici innervanti intestinali nei topi utilizzando l'arteria mesenterica superiore come punto di riferimento anatomico coerente, fornendo un modello focalizzato e riproducibile per studiare la regolazione autonoma della fisiologia intestinale e delle malattie.

Abstract

I nervi autonomi comprendono i sistemi simpatico e parasimpatico, che agiscono in modo largamente antagonista per regolare diverse funzioni fisiologiche. Con il crescente interesse per i ruoli dell'innervazione autonoma nella fisiologia e patologia intestinale, cresce la necessità di modelli sperimentali che permettano una manipolazione precisa degli input simpatici e parasimpatici diretti dall'intestino. Qui presentiamo un protocollo chirurgico per trancettare selettivamente i nervi simpatici e parasimpatici che innervano l'intestino. Utilizzando l'arteria mesenterica superiore (SMA) come punto di riferimento anatomico riproducibile, questo approccio consente l'identificazione affidabile dei fasci nervosi autonomi intestinali e la successiva transezione mirata. A differenza degli approcci di denervazione più ampi come la ganglionectomia o la vagotomia subdiaframmatica, questo approccio è pensato per ottenere una transezione più anatomicamente localizzata dei fasci autonomi diretti all'intestino, che può aiutare a ridurre l'interferenza extra-intestinale. La lesione è controllabile ed è tipicamente associata a un sanguinamento minimo, favorendo la coerenza procedurale e il recupero post-operatorio. Sebbene l'intervento richieda una formazione microchirurgica adeguata, il protocollo è adattabile, permettendo agli utenti di adattare parametri chiave a specifici scopi sperimentali. È importante sottolineare che questo modello fornisce una piattaforma pratica per indagare i ruoli dei nervi simpatici e parasimpatici nella regolazione della funzione intestinale sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Questo articolo mira a descrivere in dettaglio la procedura per facilitarne l'adozione da parte di nuovi utenti nelle loro ricerche.

Introduzione

Il tratto gastrointestinale è sotto controllo continuo del sistema nervoso autonomo (SNA), con vie simpatiche e parasimpatiche che coordinano aspetti fondamentali della fisiologia intestinale, tra cui motilità, secrezione, funzione della barriera epiteliale e omeostasi^{immunitaria 1,2}. Nel colon, gli input simpatici estrinseci possono esercitare effetti dipendenti dalla regione su più compartimenti cellulari, sottolineando che ampie perturbazioni dell'ANS possono oscurare fenotipi intestinali specifici^{per il sito 1}. Al contrario, i circuiti parasimpatici, classicamente mediati da segnalazione vagale e meccanismi colinergici a valle, sono sempre più riconosciuti come parte integrante del mantenimento dell'equilibrio immunitario intestinale e della modellazione delle risposte mucose, motivando ulteriormente strategie sperimentali che possono distinguere i contributi simpatici da quelli parasimpatici con precisione^{anatomica 2}.

Oltre alla regolazione fisiologica, l'attività autonoma è emersa come un modificatore rilevante della biologia delle malattie intestinali, incluso il cancro colorettale (CRC). Studi recenti sulla CRC dimostrano un programma bidirezionale nervo simpatico–mesenchimato, in cui la segnalazione β2-adrenergica e i fibroblasti associati al cancro che esprimono NGF rafforzano le interazioni neurali-stromali e promuovono la progressione tumorale, fornendo prove dirette che i circuiti simpatici possono essere funzionalmente accoppiati alla patogenesi^{CRC 3}. Parallelamente, la segnalazione colinergica è stata collegata alla crescita della CRC e alle caratteristiche immunitarie associate al tumore, come dimostrato dall'inibizione farmacologica del recettore muscarinico 3 in un modello topino ortotopico e dal collegamento della segnalazione colinergica con l'espressione dei checkpoint immunitari e altri segni^{maligni 4,5}. È importante sottolineare che le influenze autonome sulle malattie intestinali possono convergere anche con altri modulatori, come lo stress psicologico e il microbiota intestinale. Il sistema nervoso enterico può trasmettere segnali di stress all'infiammazione^{intestinale 6}, e i segnali microbici possono coinvolgere i circuiti intestino-cervello che sintonizzano i neuroni simpatici intestino-estrinseci, supportando collettivamente un quadro multifattoriale in cui la regolazione neurale interseca con l'ecologia immunitaria^{e microbica 6,7}.

Queste linee di evidenza convergenti evidenziano la necessità di approcci sperimentali in grado di isolare gli effetti autonomi diretti dall'intestino con sufficiente precisione anatomica da supportare l'inferenza causale sia in contesti fisiologici che patologici. Nonostante i rapidi progressi nella mappatura dei circuiti e nella neuromodulazione, molti interventi comunemente utilizzati rimangono limitati nella specificità degli organi. La manipolazione farmacologica sistemica, la simpatectomia chimica e la vagotomia subdiaframmatica possono influenzare ampie uscite autonome e quindi alterare i punti di riferimento immunitari e metabolici oltre l'intestino, complicando l'attribuzione causale agli input neurali specifici del^{colon 8}. Ad esempio, i circuiti vagali possono sopprimere la produzione di citochine^{infiammatorie 9}, e la stimolazione vagale può modulare la funzione endocrina pancreatica e la dinamica β cellulare, dimostrando che interventi a monte o non selettivi possono introdurre effetti extra-intestinali che confondono l'interpretazione dei fenotipi^{intestinali 10}. Queste limitazioni sono particolarmente rilevanti per studi che mirano a isolare i meccanismi autonomi vincolati dal colon in fisiologia e patologia. L'obiettivo generale del metodo è quindi consentire la transezione selettiva e guidata anatomicamente delle fibre simpatiche e parasimpatiche dirette dall'intestino nei topi, fornendo un modello pratico per interrogare la regolazione autonoma intestinale con un impatto fuori bersaglio ridotto.

In sintesi, questo protocollo riporta un approccio più preciso alla denervazione autonoma intestinale murina con una minima interruzione dell'innervazione autonoma di altri organi addominali, migliorando così l'interpretabilità riducendo il potenziale bias dovuto agli effetti extra-intestinali.

Protocollo

Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali (IACUC) dell'Ospedale dell'Amicizia di Pechino, Capital Medical University (n. 24-2026). In questo studio sono stati utilizzati maschi maschi di tipo selvatico C57BL/6J (8–10 settimane, 20–30 g). Informazioni dettagliate su reagenti e attrezzature sono fornite nella Tabella dei Materiali.

Criteri di inclusione: Topi della stessa stirpe, sesso e fascia d'età sono stati utilizzati all'interno di ogni esperimento per minimizzare la variabilità biologica. Sono stati inclusi solo animali sani che hanno dimostrato attività normale, comportamento di toelettatura, assunzione di cibo e acqua e produzione di feci durante il periodo di acclimatazione. Inoltre, i topi sono stati abituati alla struttura per animali per almeno 7 giorni prima dell'intervento.

Criteri di esclusione: I topi sono stati esclusi in casi di sanguinamento incontrollato o lesioni vascolari gravi durante l'intervento, perforazione intestinale o danni tissutali significativi incompatibili con la sopravvivenza. Anche gli animali che non si sono ripresi dall'anestesia, definiti come non deambulanti entro 2 ore dall'intervento, sono stati anch'essi esclusi. Ulteriori criteri di esclusione includevano complicazioni post-operatorie come deiscenza persistente della ferita, infezione grave o perdita di peso superiore al 15% entro 48 ore o il 20% in un periodo di 72 ore. I topi con errata identificazione chirurgica del ramo nervoso, confermata da una valutazione istologica post-hoc, sono stati anch'essi esclusi dallo studio.

1. Preparazione preoperatoria

1. Sterilizza tutti gli strumenti chirurgici.
2. Somministrare analgesia preventiva a tutti i topi 30 minuti prima dell'intervento per evitare la sensibilizzazione al dolore. Somministrare meloxicam (5 mg/kg di peso corporeo) tramite iniezione sottocutanea.
3. Preriscalda il cuscinetto riscaldante a 37 °C e posizionalo sotto la piattaforma chirurgica.
4. Spruzza l'area chirurgica (inclusa la camera di induzione anestesia) con etanolo al 75% e asciuga accuratamente con carta assorbente. Metti abbastanza asciugamani di carta sul fondo della camera a induzione.
5. Ispeziona la camera di induzione anestesica e il tubo per confermare che non ci siano perdite. Ricarica e assicurati una fornitura adeguata di isoflurano. Indurre l'anestesia con isoflurano somministrato al 3%–3,5% in 1 L/min di ossigeno. Monitorare il mouse continuamente; un piano chirurgico viene tipicamente raggiunto entro 1–2 minuti.
6. Posiziona il topo in posizione supina con tutti e quattro gli arti completamente estesi e fissa con nastro ipoallergenico. Fissa e fissa il cono del naso. Ridurre l'isoflurano all'1,5%–2,5% per il mantenimento. Valuta la profondità anestetica in assenza di una risposta di ritiro del pedale (nessuna reazione al pizzicamento del dito dei piedi) e respirazione regolare (55–65 respiri/minuto).
   NOTA: Durante procedure microchirurgiche prolungate, la profondità anestetica viene monitorata continuamente oltre il piano chirurgico iniziale. Oltre a valutare il riflesso di ritiro del pedale e la frequenza respiratoria ogni 5–10 minuti, monitoriamo il modello respiratorio (ad esempio, regolarità e profondità) e la frequenza cardiaca tramite osservazione visiva o contatto con la parete toracica. Il colore della mucosa (valutato dalle zampe o dalle labbra) viene anche controllato periodicamente per garantire un'adeguata ossigenazione. Se il topo mostra segni di anestesia alleggerente, come aumento della frequenza respiratoria (>80 respirazioni/minuto), movimenti spontanei o ritorno del riflesso del pedale, la concentrazione di isoflurano aumenta a incrementi dello 0,25%–0,5% fino a quando non viene ristabilito un piano chirurgico adeguato. Al contrario, se la respirazione diventa superficiale o irregolare, o se la frequenza cardiaca diminuisce notevolmente, l'isoflurano viene ridotto dello 0,25%–0,5% fino al ritorno della funzione cardiorespiratoria stabile. Questa regolazione dinamica garantisce che il topo mantenga una profondità anestetica adeguata per tutta la procedura, minimizzando la depressione cardiorespiratoria.
7. Applicare una pomata oftalmica su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale e i danni durante l'anestesia.
8. Rasi i peli addominali dal livello della simfisi pubica fino all'area sotto il margine costale usando una rasatura elettrica per capelli. Poi, sposta la piattaforma chirurgica sotto uno stereomicroscopio.
9. Disinfettare il sito chirurgico utilizzando tamponi povidone-iodio in un motivo concentrico verso l'esterno (dal centro alla periferia), coprendo l'area dalla parte inferiore dello xifoide alla simfisi pubica e lateralmente su entrambi i fianchi. Ripeti 3 volte. Poi si pulisce con etanolo al 70% nello stesso modo. Assicurati che il campo sia libero da eventuali peli sciolti.
10. Indossare una mascherina chirurgica e un berretto usa e getta, indossare un camice chirurgico sterile e indossare guanti sterili.
11. Copri il topo con una tenda sterile con finestre. Regolare la finestra a circa 2 × 3 cm e allinearla con la linea mediana addominale per esporre completamente il campo operatorio. Fissa i quattro angoli della tenda.

2. Laparotomia ed esposizione

1. Usando una pinza sterile, solleva delicatamente una piccola piega di pelle appena cranica alla sinfisi pubica. Con forbici sterili a punta affilata, effettuare una piccola incisione iniziale all'apice (~0,3 cm), poi estendere l'incisione cutanea in modo cranico lungo la linea mediana per 1,5–2,0 cm.
   NOTA: Dopo aver inserito le punte affilate delle forbici nell'apertura iniziale, inclina le punte verso l'alto ed esegui un "push-cut" controllato lungo la superficie inferiore della pelle per evitare di tagliare troppo in profondità e danneggiare la muscolatura o le viscere addominali. Usa pinze e forbici per sezionare in modo sottile il tessuto connettivo sottocutaneo sciolto dalla muscolatura della parete addominale sottostante. Disseziona leggermente più largo dell'incisione cutanea per facilitare l'esposizione successiva.
2. Circa 0,5 cm caudali al processo xifoide, inserire con cura le punte delle pinze sterili nella linea alba e sollevare una piccola tenda di tessuto.
3. Utilizzando forbici sterili e con punta affilata, crea una piccola apertura (2–3 mm) nel punto sollevato. A questo punto, il peritoneo liscio e/o gli organi sottostanti (ad esempio, un lobo epatico) dovrebbero essere visibili.
4. Inserire una lama di forbici sterili con punta smussata nella cavità peritoneale, mantenendola strettamente opposta alla parete addominale. Con la visualizzazione diretta, estendi l'incisione lungo la linea alba verso la direzione cranica finché la lunghezza totale non corrisponde a quella cutanea.
   NOTA: Mantieni la punta delle forbici inclinata verso l'alto per tutta la durata e procedi solo sotto la vista diretta per assicurarti che sotto le forbici non ci siano anelli intestinali o vasi sanguigni.

3. Identificazione dell'arteria mesenterica superiore e della transezione nervosa

1. Ritrae delicatamente la parete addominale lateralmente usando strisce di nastro sterile per esporre la cavità peritoneale.
2. Applica una pressione moderata con un cotton fibb sulla parete addominale per permettere all'intestino di esteriorizzarsi. Sposta delicatamente intestino tenue, colon e ceco sul lato sinistro del topo.
   NOTA: Copri l'intestino esposto con un cotton pad sterile o una garza inumidita con soluzione salina sterile calda (≈37 °C) per evitare l'asciugatura dei tessuti e la perdita di calore.
3. Con la mano destra, sposta delicatamente stomaco, duodeno e colon in blocco verso il quadrante superiore sinistro con un cotton fioc sterile e umido (o una micropinza a punta smussata). L'aorta addominale, anteriore alla colonna vertebrale, dovrebbe essere chiaramente visibile in questa fase, talvolta parzialmente coperta da una piccola quantità di grasso retroperitoneale.
4. Identificare la vena renale sinistra e il tronco celiachico. L'arteria mesenterica superiore (SMA) nasce come un unico ramo arterioso dalla parete anteriore dell'aorta addominale, tipicamente a ~2–4 mm caudale fino al tronco celiaco e a livello o leggermente sopra il livello della vena renale sinistra.
   NOTA: La vena renale sinistra è una vena scura e spessa che scorre orizzontalmente attraverso la parte anteriore dell'aorta addominale prima di drenare nella vena cava inferiore. Il tronco celiaco è solitamente il primo ramo arterioso principale che nasce dalla parete anteriore dell'aorta addominale, situato appena nella vena cranica (superiore) della vena renale sinistra, e comunemente si triforca nelle arterie epatica, splenica e gastrica sinistra. Al contrario, la SMA è un tronco singolo senza rami epatici/splenici. Entra nella radice del mesenterio e alimenta il jegiuno, l'ileum e il colon prossimale; Tracciarne il corso nel mesenterio può aiutare a confermare la corretta identificazione.
5. Identifica i fasci bianchi lattiginosi, simili a cordi, che corrono paralleli all'SMA come fibre nervose bersaglio. Il fibrato nervoso situato sopra la SMA corrisponde alle fibre parasimpatiche, mentre il fascio situato inferiore alla SMA corrisponde alle fibre simpatiche (Figura 1A).
6. Usando micropinze e microforbici, separare molto delicatamente il tessuto adiposo e linfatico intorno alla SMA per esporre completamente le fibre nervose. Sollevare delicatamente il fascio nervoso simpatico o parasimpatico con micropinze per separarlo dalla SMA, poi tranectolo rapidamente e con attenzione (Figura 1).
   NOTA: Durante la dissezione, tieni le punte delle pinze e delle forbici orientate verso la parete laterale dell'arteria ed evita di indirizzare gli strumenti verticalmente verso piani più profondi. Se si verifica un sanguinamento significativo (ad esempio, emorragia dovuta all'AME o aorta addominale che non può essere controllata entro 30 secondi applicando pressione con un cotton fioc sterile), la procedura viene immediatamente interrotta. L'animale viene soppresso in modo umano mentre è ancora sotto anestesia ed è escluso da tutte le analisi successive. Questo endpoint è predefinito in conformità con gli endpoint umani approvati dall'IACUC per prevenire sofferenze inutili. Ulteriori indicazioni per la risoluzione delle complicazioni intraoperatorie comuni sono fornite nel File Supplementare 1.

4. Chiusura della cavità addominale

1. Rimuovi tutte le garze/cotton pad intra-addominali. Ispezionare attentamente la cavità addominale per eventuali sanguinamenti attivi, con particolare attenzione al campo di dissezione della SMA, al sito di transezione nervosa e ai bordi del taglio della parete addominale.
2. Irrigare delicatamente la cavità peritoneale con un piccolo volume di soluzione salina calda sterile (0,5–1,0 mL), poi rimuovi con cura l'eccesso di liquido usando un cotton fioc sterile e secco.
3. Esegui un conteggio con strumenti e garze/cotone per assicurarti che nessun materiale estraneo venga trattenuto nella cavità addominale.
4. Utilizzando la sutura assorbibile 6-0, chiudi lo strato peritoneo e muscolare con un punto continuo che parte da un'estremità dell'incisione. Ogni morso deve includere il peritoneo e la muscolatura della parete addominale su entrambi i lati.
   NOTA: Solleva i bordi della ferita con una pinza e posiziona ogni punto sotto visualizzazione diretta per evitare di catturare l'intestino o l'omento sottostante. Se necessario, sposta delicatamente l'intestino lontano dall'incisione usando un cotton fioc umido.
5. Chiudi la pelle con punti interrotti utilizzando suture intrecciate in seta 5-0 non assorbibili. Posizionare le suture a intervalli di ~2 mm e fare nodi con tensione moderata, approssimando (ma senza strangolare) i bordi della pelle per evitare l'ischemia.
   NOTA: Una scarsa deposizione della ferita può causare un'ernia incisionale. Assicurati che lo strato muscolare sia ben sigillato e che i bordi della pelle siano ben allineati.
6. Pulisci delicatamente l'incisione cutanea chiusa ancora una volta con un tampone di povidone-iodio.
7. Segna il topo (orecchio o coda) con la data dell'intervento.
8. Rimuovere il cono nasale e trasferire il topo in una gabbia di recupero pulita e morbida posizionata su un cuscinetto riscaldante a 37 °C (singola custodia). Mantieni l'animale in posizione di posizione laterale per ridurre il rischio di aspirazione.
   NOTA: Confermare che il pad riscaldante rimanga stabile a 37 °C per prevenire l'ipotermia. Se necessario, somministrare 1 mL di soluzione salina calda sterile per via sottocutanea per il supporto del volume.
9. Monitora continuamente il topo finché non ha ripreso completamente conoscenza e riesce a mantenere una posizione prona in modo indipendente.
   NOTA: L'analgesia postoperatoria è stata proseguita con meloxicam (5 mg/kg, sottocutaneo, una volta ogni 24 ore per un massimo di 48 ore dopo l'intervento), con ulteriore valutazione veterinaria se sono stati osservati segni di dolore persistente o disagio.

5. Parametri di monitoraggio postoperatorio

NOTA: Il monitoraggio postoperatorio è stato effettuato due volte al giorno per le prime 72 ore e poi quotidianamente per tutta la durata dello studio. I parametri valutati includevano:

1. Monitora l'aspetto generale, inclusi la toelettatura, le condizioni del mantello, la postura e il livello di attività.
2. Misura il peso corporeo quotidianamente; Definire come endpoint umano una perdita di più del 15% del peso corporeo preoperatorio entro 48 ore, ovvero il 20% in qualsiasi periodo di 72 ore.
3. Ispezionare il sito chirurgico per segni di infezione, deiscenza o secrezione.
4. Monitorare il comportamento, inclusi movimenti spontanei, risposta alla manipolazione e segni di disagio (ad esempio, vocalizzazione e irrequietezza).
5. Valuta qualsiasi animale che mostra segni persistenti di dolore o disagio nonostante le analgesie da parte del personale veterinario e, se necessario, sopporta l'animale.

Risultati

Utilizzando l'AMS come punto di riferimento anatomico coerente, i fasci di nervi autonomi intestinali possono essere identificati come strutture sottili, bianchi perlati che corrono parallele al vaso. In base alla loro posizione anatomica rispetto all'SMA, il fascio superiore è stato designato come fascio parasimpatico presunto e il fascio inferiore come fascio simpatico presunto (Figura 1A,D). Un risultato positivo intraoperatorio si ottien...

Discussione

La SMA murina nasce dalla parete anteriore dell'aorta addominale, inferiore al tronco celiacco, e fornisce un afflusso arterioso alle principali viscere addominali, incluso^{l'intestino 14}. Davanti alla SMA si trovano il colon e il mesenterio, mentre posteriormente è strettamente correlato alla vena renale sinistra e all'aorta addominale; La vena mesenterica superiore tipicamente corre lungo il suo lato destro. Nei topi, l'SMA è estremamente delicato ed è circondato...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
5-0 silk braided non-absorbable suture	Ethicon	W500
6-0 PGA Suture	Jinhuan	CR631
Anesthesia Induction Chambers	RWD Life Science	V100
Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500IP
Anti-Choline Acetyltransferase antibody	Abcam	ab181023
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
C57BL/6J Mice	Shanghai Model Organisms CenterTechnology	SM-001
Cholera Toxin Subunit B (CTB), Alexa FluorTM 555 Conjugate	Thermo Scientific	C34776
Compound Microscope	Yuyan Instruments	512
DAPI and Hoechst Nucleic Acid Stains	Invitrogen	D3571
Fast Green	Thermo Scientific	F7252
Fine Hemostatic Forceps	Jinzhong surgical instrument	JCG020
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Micro Forceps(Curved)	Jinzhong surgical instrument	WCC200
Micro Forceps(Straight)	Jinzhong surgical instrument	WCC190
Micro Needle holders	Jinzhong surgical instrument	WBA050
Micro scissors	Jinzhong surgical instrument	Y3F010
Micro syringe	Hamilton	7632-01
Ophthalmic Scissors(pointed tip)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Ophthalmic Scissors(rounded tip)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Povidone-Iodine Swabstick	Winner Medical	206
Tissue and Cell Fixative (4% Paraformaldehyde, PFA)	MedChemExpress	HY-DY3003
Tissue OCT-Freeze Medium	Sakura	C2077
Tyrosine Hydroxylase (E2L6M) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell Signaling Technology	58844S