Dispositivo universale di caricamento di pressione per l'imaging di cellule vive sotto stress fisiologico meccanico sostenuto

Summary

Il dispositivo a carico a pressione descritto qui consente l'imaging ottico time-lapse delle cellule coltivate ed è compatibile con le piastre standard per coltura cellulare e i microscopi rovesciati. Utilizzando questo dispositivo, è stato confermato che il microambiente di pressione idrostatica tumorale potenzia la trasduzione del segnale di calcio, fornendo una piattaforma praticabile per studiare la trasduzione meccanica del segnale nel microambiente tumorale.

Abstract

Questo protocollo descrive un dispositivo di carico di pressione idrostatico che facilita l'osservazione microscopica in tempo reale delle cellule aderenti durante una stimolazione idrostatica sostenuta, ed è compatibile con piatti commerciali di coltura cellulare da 3,5 cm. L'apparecchiatura è composta da una camera di coltura ermetica realizzata con una base in alluminio, un coperchio poli(metilmetacrilato) otticamente trasparente, porte di ingresso/uscita di gas integrate nel coperchio e una finestra di osservazione sigillata. Collegandosi a una sorgente di gas regolata, il dispositivo mantiene una pressione idrostatica stabile (0–200 kPa, regolabile) consentendo al contempo l'imaging continuo a contrasto di fase o fluorescenza. Utilizzando questo dispositivo di carico di pressione, possono essere registrati effetti dipendenti dalla dose indotti dalla pressione sul fenotipo e sui comportamenti cellulari, come morfologia, proliferazione e migrazione. Inoltre, i segnali fluorescenti possono essere registrati in tempo reale. Qui, sono state osservate e quantificate tramite microscopia a fluorescenza inversa tramite microscopia a fluorescenza invertita tramite imaging time-lapse (time-lapse) di segnalazione Ca 2^⁺ per il cancro al seno, MDA-MB-231 e cellule HeLa per il cancro cervicale Questa piattaforma integra il carico meccanico con l'imaging a cellule vive per superare le limitazioni dei sistemi endpoint convenzionali, fornendo uno strumento universale per studi meccanobiologici.

Introduction

Numerose cellule, tessuti e organi sperimentano forze compressive sostenute o intermittenti come parte della loro^{fisiologia 1}. Ad esempio, le cellule alveolari sono sottoposte a pressurizzazione ciclica durante la^{respirazione 2}, mentre le cellule epiteliali della vescica sopportano carichi meccanici durante la ritenzione^{urinaria 3}. In contesti patologici come i tumori solidi, le cellule tumorali sono continuamente esposte a forze di compressione originate dal confinamento spaziale e dall'elevata pressione del liquido^{interstiziale 4}. Analogamente, in altre malattie come la degenerazione del menisco e la fibrosi polmonare, le cellule^{meniscale 5} e le cellule epiteliali alveolari⁶ subiscono anch'esse stress meccanici sostenuti dovute alla tensione e alla pressione derivante dalla rigidità della matrice.

Ci sono sempre più evidenze che confermano che la pressione meccanica agisce come potente regolatore del fenotipo e del comportamento^{cellulare 7,8}. Nelle cellule non maligne, lo stress compressivo favorisce la proliferazione delle cellule staminali parodontali e induce la fusione osteoclasta tramite protuberanze invasive⁹. Al contrario, nei modelli oncologici, la compressione mostra effetti di Janus: sopprime la proliferazione e la migrazione delle cellule del melanoma attivando contemporaneamente la riprogrammazione trascritomica che promuove la chemioresistenza^10,11. Inoltre, la compressione volumetrica causata dalla pressione iperosmotica può indurre l'affollamento intracellulare e stimolare la ridistribuzione della concentrazione proteica e della forza ionica tramite separazione della fase liquido-liquido (LLPS), che altera profondamente i comportamenti e il destino cellulare. Questa perturbazione fisica favorisce l'espansione degli organoidi intestinali tramite segnalazione attivata Wnt/β-catenina e un aumento dell'auto-rinnovamento delle cellule staminali^{intestinali 12}. Inoltre, nel nucleo cellulare, LLPS indotta da variazioni di volume è coinvolta nel controllo trascrizionale genico attraverso il coordinamento dell'inizio, dell'allungamento e della terminazione della^{trascrizione 13,14}.

Per indagare quantitativamente questi effetti biologici indotti dalla pressione, sono essenziali sistemi sperimentali in grado di applicare stimoli compressivi ben definiti e omogenei. Per le cellule coltivate in vitro, che sono circondate da un mezzo acquoso, la pressione idrostatica rappresenta un mezzo primario e fisiologicamente rilevante per applicare tali forze di compressione, ampiamente adottato per studiare la meccanotrasduzione^{cellulare 15}. La pressione idrostatica può aumentare l'attività della fosfatasi alcalina e accelerare l'osteogenesi delle cellule staminali mesenchimali derivate dall'adipo umano senza l'integrazione di fattori^{osteoinduttivi 16}. Nella fegato adiposo non alcolica, forze meccaniche come la pressione idrostatica possono contribuire all'ipertensione portale senza una fibrosi significativa, sottolineandone il ruolo nella diversità^{tissutale 17}. Sebbene la pressione idrostatica svolga un ruolo importante nella regolazione fisiopatologica, gli studi meccanicistici della pressione idrostatica affrontano una limitazione critica: le camere di pressione convenzionali impediscono l'osservazione in tempo reale delle cellule vive durante la stimolazione. La maggior parte dei sistemi sperimentali consente solo l'analisi degli endpoint, mascherando la dinamica spaziale e temporale degli eventi di meccanotrasduzione, come la meccano-attivazione Piezo1, l'eterogeneità del flusso Ca²⁺ e la riorganizzazione del citoscheletro. Questo divario ha limitato la comprensione di come la pressione idrostatica determini la diversità dei fenotipi nei tumori o in altri tessuti.

Per colmare questa lacuna tecnologica, è stata sviluppata una nuova piattaforma sperimentale che consente l'osservazione in tempo reale delle risposte cellulari a una pressione idrostatica controllata con precisione tramite imaging ottico. Questo sistema integra tre capacità chiave: (1) applicazione di pressione idrostatica sostenuta in un intervallo da 0 a 100 kPa tramite un regolatore regolabile della pressione del gas (il manometro ha un intervallo da 0 a 200 kPa, e le pressioni applicate possono essere selezionate in base a parametri fisiologici. Ad esempio, basandosi sugli stress compressivi riportati di vari tipi cellulari: 8-16 kPa per le cellule stromali del midollo osseo^{umano 18}, 12–24 kPa per le cellule muscolari lisce^{vascolari 19}, e 0–15 kPa per cellule epiteliali mammarie^{umane 20}.); (2) imaging continuo a celle vive con alta risoluzione temporale durante l'applicazione di pressione idrostatica; e (3) mantenimento delle condizioni di coltura fisiologica durante esperimenti prolungati. Questo approccio consente la visualizzazione diretta dei processi dinamici, inclusi il reclutamento e l'attivazione del canale Piezo1, le onde di segnalazione calcio e il rimodellamento del citoscheletro che avvengono in risposta alla stimolazione meccanica. Inoltre, questo dispositivo è compatibile con la maggior parte delle piastre di coltura e microscopi rovesciati disponibili commercialmente, rendendolo molto comodo da utilizzare in laboratorio. La capacità di monitorare questi eventi biochimici intracellulari in tempo reale offre intuizioni senza precedenti su come le cellule percepiscono e si adattano alla pressione idrostatica. Catturando la sequenza temporale degli eventi di meccanotrasduzione, che includono la percezione iniziale della forza, la segnalazione a valle e i cambiamenti fenotipici, questa piattaforma fornisce uno strumento potente per indagare i meccanismi fondamentali attraverso cui la pressione idrostatica influenza il comportamento cellulare in contesti fisiologici e patologici.

Protocol

1. Materiali

1. Specifiche del dispositivo (vedi Figura 1)
   1. Prepara i componenti in base alle specifiche menzionate di seguito:
      Basi: alluminio (Ø 56 mm, altezza 15 mm), finestra centrale Ø 40 mm.
      Coperchio: PMMA (Ø 56 mm) con: 6 × fori filettati M3, porta gas Luer-lock, guarnizione in silicone (diametro interno 25 mm, diametro esterno 32 mm, spessore 0,8 mm)
      Regolatore di pressione: (intervallo 0–200 kPa)
2. Celle e reagenti
   1. Utilizzare MDA-MB-231 e cellule HeLa in questo studio. Utilizzare mezzo L-15, medium RPMI 1640, siero per vitelli neonati (NCS), soluzione antibiotica-antimicotica all'1% e una sonda di imaging calcio per la coltura cellulare e la marcatura con Ca²⁺.

2. Preparazione del dispositivo

1. Produzione
   1. Il design personalizzato è il componente centrale di questo studio. Lavorare con precisione la base in alluminio e il rivestimento in PMMA secondo le specifiche (vedi Figura 1 e Figura Supplementare 1).
   2. Taglia la guarnizione in silicone e lavorala fino alla dimensione richiesta.
      NOTA: La trasmittanza ottica del materiale PMMA è sufficiente per l'imaging standard della luce trasmessa. Tutti i componenti erano sterilizzabili e biocompatibili per i successivi esperimenti di coltura cellulare. Non sono imposti requisiti particolari sulle tolleranze di fabbricazione di questa camera (in questo studio è stata adottata una tolleranza di ±0,1 mm).
2. Sterilizzazione
   1. Per sterilizzare la base (alluminio), autoclava a 121 °C per 20 minuti.
   2. Per sterilizzare la copertura (PMMA), strofina con etanolo al 75%, poi sterilizza con UV per 30 minuti.
   3. Sterilizza la guarnizione in silicone autoclavando a 121 °C per 20 minuti.

3. Elaborazione delle celle

1. Coltura cellulare
   1. Cellule di semi in vasche da 35 mm con confluenza del 30%–70%. Coltivare le cellule per 24 ore in mezzo RPMI-1640 o L15 (integrato con 10% di NCS) in un incubatore di CO₂ a 37 °C con il 5% di CO₂.
   2. Per il passaggio cellulare, si dissociano le cellule con lo 0,25% di tripsina e si interrompe la digestione con il mezzo intero. Usa le cellule per riseminare una volta che raggiungono il 70%–80% di confluenza.
2. Colorazione Ca²⁺
   1. Rimuovi il substrato, poi lava le cellule due volte con Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) preriscaldato in un armadietto di biosicurezza.
   2. Tingere la Ca²⁺ intercellulare con una sonda di imaging calcio a 5 μM in un mezzo privo di siero. Incubare le cellule per 20 minuti a 37 °C in un ambiente protetto dalla luce.
   3. Rimuovi il colorante, lava le cellule tre volte con HBSS, poi deesterifica per 30 minuti in un mezzo senza siero.

4. Assemblaggio del dispositivo (Figura 2)

1. Trasferire il piatto di coltura alla finestra centrale della camera di pressione, poi rimuovere il mezzo di coltura.
2. Metti la guarnizione sterilizzata nella teglia di coltura.
3. Allinea il coperchio sopra il camino piatto-guarnizione.
4. Stringi le viti diagonalmente prima a mano finché non si percepisce resistenza, poi aggiungi 1,5 giri aggiuntive usando un avvitatore a coppia.
5. Collega il tubo del gas in silicone alla porta Luer-lock e inietta gas misto nel dispositivo per verificare eventuali perdite.
6. Scollega il tubo di gas in silicone e inietta un nuovo mezzo nella piastra di coltura cellulare attraverso la porta Luer-lock usando una siringa sterile da 5 mL.

5. Carico di pressione e imaging

1. Collega il tubo del gas in silicone (diametro interno di 4 mm) dalla porta Luer-lock sulla guarnizione in silicone al manometro digitale e al serbatoio del carburante.
2. Monta il dispositivo assemblato sul palco del microscopio.
3. Calibra la pressione.
   1. Valida la stabilità dell'intervallo 0–200 kPa utilizzando il manometro.
      NOTA: Per la coltura delle cellule HeLa viene utilizzato un gas misto contenente 75% azoto, 20% ossigeno e 5% anidride carbonica. Un gas misto contenente l'80% di azoto e il 20% di ossigeno viene utilizzato per la coltura cellulare MDA-MB-231. Il tipo di gas utilizzato nell'esperimento di carico di pressione può essere sostituito in base al tipo di cella, al tipo di mezzo o a specifiche esigenze sperimentali. Nessun componente è specifico per modello, e le dimensioni del modulo di rilevamento della pressione e del suo tubo di ingresso possono essere selezionate secondo necessità.
4. Imposta la pressione target (ad esempio, 100 kPa) tramite il regolatore di pressione digitale.
5. Avviare l'imaging una volta raggiunta la pressione bersaglio.
6. Imaging
   1. Regola lo stadio, conferma l'area di imaging e assicurati che le cellule siano a fuoco.
   2. Acquisire immagini a fluorescenza delle cellule colorate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita dotato di un obiettivo del 20×, con i seguenti parametri: tempo di esposizione di 400 ms, intervalli time-lapse di 5 s e durata totale dell'imaging di 10 min (filtro FITC: Ex/Em = 490/525 nm, cutoff = 515 nm).
   3. Immagini in condizioni non pressurizzate per 10 minuti per garantire il corretto funzionamento del sistema e ottenere dati di segnale di base.
   4. Dopo aver aperto la valvola del gas per la pressione di carico, regolare nuovamente l'altezza dello stadio per assicurarsi che le cellule siano a fuoco, poi iniziare a visualizzare i segnali dinamici del calcio.
   5. Seleziona la lente dell'obiettivo in base allo spessore inferiore del piatto di coltura e alla distanza di lavoro dell'obiettivo. Scegliere il tempo di esposizione utilizzato per monitorare le oscillazioni del segnale di calcio evitando un fotosbiancamento eccessivo e danni fotografici.
   6. Regolare i parametri in base al tipo di sonda e ai requisiti sperimentali quando si osservino altri segnali dinamici.

6. Risoluzione dei problemi

1. Consulta la Tabella 1 per consigli sulla risoluzione dei problemi.

7. Analisi statistica

1. Presenta tutti i dati come media ± deviazione standard (SD). Il software GraphPad Prism (USA) è stato utilizzato per confrontare i risultati tra due gruppi tramite il test t dello studente non accoppiato. Consideriamo le differenze come statisticamente significative quando **p < 0,01, ***p < 0,001 o ****p < 0,0001.

Results

Per verificare la funzione di imaging in tempo reale di questo dispositivo di carico di pressione idrostatica, sono state osservate le dinamiche dei segnali di calcio nelle cellule tumorali dopo l'applicazione della pressione idrostatica. Le cellule confluenti MDA-MB-231, HeLa e A549 sono state seminate in vasche di coltura da 35 mm per un uso successivo. Dopo essere state colorate con una sonda di imaging a calcio, le cellule coltivate senza siero sono state sottoposte a una pressione i...

Discussion

Questo protocollo mostrava un dispositivo di carico di pressione universalmente adattabile che permetteva l'osservazione in tempo reale della dinamica della meccanotrasduzione sotto pressione idrostatica regolabile. Integrando una copertura in PMMA otticamente trasparente con una base in alluminio lavorata con precisione, il sistema supera la limitazione critica delle camere convenzionali, che possono eseguire solo analisi degli endpoint. Questo dispositivo a caricamento a pressione, che...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotico-Antimicotico (100 volte)	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122	Concentrazione dell'1% in mezzo intero
Autoclave	Panasonic, Giappone	MLS-3751-PC	Per sterilizzare la base in alluminio e la guarnizione in silicone
Armadio di biosicurezza	Thermo Fisher Scientific, USA	Armadietti di sicurezza biologica della serie 1300 A2 Classe II, tipo A2	Fornisce un ambiente sterile per la gestione delle cellule
Cal-520 AM, indicatore di calcio permeato cellulare	AAT Bioquest, USA	21131	Per la rilevazione dinamica della concentrazione di ioni calcio nelle cellule viventi
Piatto per coltura cellulare (35 mm)	BIOFIL, Cina	TCD010035	Ciotola standard da 35 mm usata per la semina delle celle
Base della camera (alluminio)	Quanyi, Cina	/	Progettato su misura & Oslash; 56 mm, H 15 mm, finestra centrale e Oslash; 40 mm
Coperchio della camera (PMMA)	Quanyi,  Cina	/	Progettato su misura & Oslash; 56 mm, con 6 e volte; Fori filettati M3, porta gas Luer-lock
Incubatore CO2	Thermo Fisher Scientific, USA	HERAcell 3111	Mantiene condizioni di coltura a 37° C con o senza 5% CO2
HBSS (Soluzione salina bilanciata di Hanks)	Beyotime, Cina	C0219	Per lavare le celle prima e dopo la tintura
Linea cellulare HeLa	Centro Risorse Cellulari, Istituto di Scienze Mediche di Base, CAMS/PUMC, Cina	CRM-CCL-2	Cellule umane di cancro cervicale
Microscopio a fluorescenza invertita	Nikon, Giappone	Eclipse Ti2	Per l'imaging a fluorescenza
L-15 Medium di Leibovitz	Thermo Fisher Scientific, USA	41300039	Per la coltura cellulare MDA-MB-231
Linea cellulare MDA-MB-231	Centro Risorse Cellulari, Istituto di Scienze Mediche di Base, CAMS/PUMC, Cina	CRM-HTB-26	Cellule umane di cancro al seno
Siero per vitelli neonatali (NCS)	Thermo Fisher Scientific, USA	16010142	Concentrazione del 10% in mezzo completo
Regolatore di pressione	Hongrun, Cina	DP20	Autonomia: 0-200 kPa
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific, USA	31800022	Per la coltura cellulare MDA-MB-231
Siringa sterile (5 mL)	KDL, Cina	1101010198	Per iniettare mezzo o reagenti attraverso la porta Luer-lock
Tripsina (0,25%)	Thermo Fisher Scientific, USA	2520056	Per cellule aderenti dissocianti per il passaggio