Protocollo NetDecoder per la costruzione di reti di interazione proteica specifiche per contesto a partire da dati trascritomici utilizzando la modellazione del flusso di informazioni

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per l'utilizzo di NetDecoder, uno strumento di modellazione di reti, per costruire reti di interazione proteica specifiche e per costruire modelli di utilità genica (GUM). Utilizzando dati trascrivomici, in combinazione con reti di interazione proteina-proteina (PPI) curate, NetDecoder consente l'identificazione di bersagli e sottoreti chiave.

Abstract

L'analisi dell'espressione differenziale è una tecnica comunemente utilizzata per determinare potenziali bersagli terapeutici, ma trascura la complessità delle reti geniche attraverso le vie biologiche. Spesso, geni fortemente espressi non spiegano necessariamente le proprietà di un fenotipo biologico. NetDecoder, uno strumento di biologia delle reti che integra dati trascrittomici con reti di interazione proteina-proteina (PPI) per modellare il flusso informativo specifico del contesto, l'utilità genica, gli spigoli chiave e le reti geniche utilizzate differenzialmente, è stato sviluppato per affrontare questa limitazione dell'analisi dell'espressione differenziale.

Questo protocollo è una guida passo dopo passo per i principianti all'uso di NetDecoder, con linee guida complete che coprono la preelaborazione dei dati, l'esecuzione di NetDecoder e l'analisi degli output. Il flusso di lavoro include la configurazione del software, la costruzione di reti e l'analisi di modellazione basata sul flusso per quantificare differenze tra geni (nodi) e interazioni genico-gene (a livello di bordo) tra condizioni biologiche. Gli output risultanti includono bersagli chiave e router, sottoreti di flusso differenziale e distribuzioni di flusso ai margini, permettendo l'identificazione di geni regolatori chiave e vie associate a specifici stati biologici. Dopo aver seguito i passaggi indicati, i ricercatori saranno in grado di condurre ricerche indipendenti per scoprire il flusso fenotipico tra fenotipi utilizzando dati trascrittomici e reti PPI curate.

Introduzione

La selezione dei geni e delle vie associate per l'indagine terapeutica è spesso guidata da analisi di espressione^{differenziale 1}. Questo metodo di analisi è efficace nel determinare come l'espressione genica differisce tra due o più condizioni. Tuttavia, i geni funzionano all'interno di reti biologiche complesse e interconnesse, il che significa che l'espressione genica individuale non cattura pienamente come i geni interagiscono in una rete e le loro relazioni^{geni-gene 2}. I metodi di propagazione delle reti integrano l'espressione genica con le reti di interazione per identificare geni biologicamente importanti che potrebbero essere trascurati solo dall'espressione^{differenziale 3}. Gli approcci attuali non quantificano esplicitamente l'importanza funzionale dei geni né come le informazioni biologiche vengano ridistribuite all'interno delle reti di interazione proteina-proteina (PPI) attraverso condizioni biologiche. Pertanto, era necessario un metodo per modellare il comportamento della rete specifica per condizione e quantificare i cambiamenti nel flusso di informazioni tra i sistemi biologici. Per spiegare come i geni interagiscono all'interno di una rete biologica più ampia, è stata sviluppata NetDecoder, una piattaforma di biologia di rete, per scoprire geni con la maggiore differenza di flusso informativo tra le condizioni. NetDecoder utilizza un algoritmo di flusso guidato da processo per tradurre la conoscenza esistente della rete PPI umana, in combinazione con dati di sequenziamento di RNA in massa, per costruire un modello di interazioni guidate dal flusso^{informativo 4}.

Utilizzando dati di flusso informativo per reti fenotipiche, si può sviluppare un modello di utilità genica (GUM⁾⁵ per identificare geni con alto flusso di informazioni come dotati di maggiore utilità genica complessiva all'interno di una rete, indipendentemente dai loro valori di espressione differenziali. Questo approccio supporta strategie di prioritizzazione dei bersagli e identificazione più efficaci, fornendo intuizioni che l'analisi tradizionale spesso manca. A differenza dei metodi tradizionali di espressione differenziale o di rete basati su correlazione, NetDecoder quantifica sia i cambiamenti genici (a livello di nodo) sia quelli di interazione (a livello di bordo) nel flusso informativo, consentendo l'identificazione di geni funzionalmente importanti, anche in assenza di grandi variazioni di espressione ^4,5. NetDecoder è ampiamente applicabile a dataset di sequenziamento di RNA in massa che prevedono un'analisi comparativa tra due condizioni biologiche, consentendo l'identificazione di cambiamenti nel flusso informativo e nell'organizzazione della rete. Sebbene NetDecoder supporti l'integrazione di altri dataset omici, inclusi proteomica ed epigenomica, il presente protocollo dimostra specificamente il flusso di lavoro utilizzando dati trascrittomici. In queste applicazioni, gli utenti possono definire geni di origine basati su proteine o geni regolati epigeneticamente, permettendo di avviare l'analisi del flusso di informazioni a partire da queste caratteristiche molecolari. Questa flessibilità consente l'incorporazione di evidenze multi-omiche nelle analisi basate su reti e facilita la scoperta di meccanismi regolatori cross-modali alla base delle differenze fenotipiche.

I disegni comuni dello studio prevedono confronti binari, inclusi ma non limitati a malattie contro condizioni sane, rispondenti al trattamento vs non rispondenti, trattamenti farmacologici, knockdown o knockout rispetto a esperimenti di controllo, e analisi delle transizioni di stato di sviluppo o cellulari. L'obiettivo di questo protocollo è illustrare un quadro riproducibile per l'applicazione di NetDecoder al fine di scoprire geni con influenza alterata della rete attraverso condizioni biologiche. Questo si ottiene attraverso passaggi facili da seguire per configurare e eseguire NetDecoder, oltre a esempi da seguire insieme a tecniche di troubleshooting di base e metodi per l'interpretazione dei risultati presentati nel protocollo.

Protocollo

Questo studio ha utilizzato dataset di sequenziamento dell'RNA disponibili al pubblico e non ha coinvolto direttamente soggetti umani o animali. Pertanto, non era richiesta l'approvazione del comitato di revisione istituzionale e il consenso informato.

NOTA: NetDecoder richiede i seguenti file di input: espressione genica normalizzata attraverso due condizioni biologiche definite; un file di metadati che descriveva le condizioni biologiche; un elenco di geni sorgente per la costruzione e modellazione di reti; una rete di interazione proteina-proteina (PPI) di dominio pubblico; e una rete ponderata su spigoli (EWN) costruita per ogni condizione biologica.

1. Preparazione dei dati

1. Recuperare dati di espressione e metadati del sequenziamento di RNA in blocco
   1. Scarica i dati di sequenziamento dell'RNA (matrice dei conteggi grezzi dell'espressione genica e dei nomi dei campioni) e i relativi metadati (nomi di campioni, condizioni, ecc.) da un repository pubblico, come il Gene Expression Omnibus (GEO), oppure utilizza dataset sperimentali generati in laboratorio. Tipicamente, si tratta di una matrice in cui le righe corrispondono ai nomi dei geni e le colonne corrispondono ai nomi dei campioni.
      NOTA: Il dataset di esempio utilizzato per dimostrare questo protocollo è stato ottenuto dal repository della National Omics Data Encyclopedia (NODE) (database BioSino) sotto accessione OEP001105⁶. Gli utenti possono sostituire i propri dataset di sequenziamento di RNA in massa.
   2. Generare un file di annotazione di esempio (metadati) includendo i nomi dei campioni e i loro gruppi o condizioni associate; ad esempio, "controllo" e "malattia" sono tipi di condizioni comuni. Conferma che i nomi dei campioni corrispondano tra i file di metadati e quelli di espressione.
2. Dati aggregati di espressione e metadati
   1. Assicurati che la matrice di dati generata includa conteggi di espressione, nomi geni e un file di metadati con nomi e condizioni di campione. Se necessario, usa un pacchetto R come org. Hs.eg.db (umano) o AnnotationDbi per abbinare diversi identificatori genici.
   2. Elimina le informazioni non essenziali dal file di metadati usando R o un linguaggio di programmazione simile.
   3. Combina le informazioni dai file di conteggio espressioni in un unico file per una manipolazione più semplice.
3. Dati di espressione del filtro
   1. Pre-elabora la matrice di dati di espressione genica escludendo duplicati genici, valori nulli (NA), bassa espressione (<10 conteggi totali) e/o geni a bassa varianza, ecc.
4. Pre-elaborazione dei dati
   1. Normalizzazione del sequenziamento dell'RNA e analisi dell'espressione differenziale
      NOTA: Questo passaggio è uno (1.4.1) dei due approcci (1.4.2) per selezionare geni per la creazione di Edge Weighted Network (EWN) e la selezione dei geni di origine (passaggi 1.5–1.6) all'inizio dell'analisi dai dati di sequenziamento di RNA in massa. In alternativa, il matching dei template basato sulla correlazione di Pearson può essere utilizzato saltando al passaggio 1.4.3.
      1. Esegui conversioni di identificazione genica in questa fase utilizzando il pacchetto R, AnnotationDbi, in concomitanza con i pacchetti individuali degli organismi. NetDecoder utilizza simboli geni (cioè, ID genico) che corrispondono all'esempio di PPI.
      2. Eseguire normalizzazione e analisi di espressione differenziale tra due condizioni utilizzando i pacchetti R limma, edgeR, DESeq2 o strumenti simili.
      3. Se si utilizza DESeq2, costruire un dataset DESeq utilizzando la funzione DESeqDataSetFromMatrix() con una matrice di conteggio (geni e campioni) e metadati del campione (condizioni) come input.
      4. Usa la funzione DESeq() con le impostazioni predefinite sull'oggetto creato nel passo 1.4.1.3 per calcolare i valori di espressione differenziali.
      5. Salva i risultati in una matrice dati con identificatori geni (Gene ID) come nomi di riga e output chiavi, inclusi il cambiamento di fold log2 (log2FC), il valore p e il valore p aggiustato come colonne.
      6. Opzionalmente, filtra i risultati per valore p aggiustato (<0.05) e/o valori log2FC (ad esempio: |log2FC| > 1) usando dplyr o uno strumento comparabile.
      7. Assicurati che tutte le liste geniche processate e le matrici di cambiamento log2 fold vengano esportate come file delimitati a tabulazioni (.txt o .csv) per l'input in NetDecoder.
      8. Eseguire confronti a coppie per il passo 1.4.1 se vengono utilizzate più di 2 condizioni biologiche e ottenere risultati a coppie utilizzando la funzione results() dall'oggetto DESeq generata nello step 1.4.1.5.
   2. Normalizzazione dell'espressione microarray - Opzionale
      NOTA: Se si utilizzano dati di microarray, eseguite questo passaggio per la normalizzazione dei dati.
      1. Normalizzare i dati aprendo lo script di normalizzazione NetDecoder (HuLiLab/NetDecoder_Example/raw_data/NetDecoder_normalize. R), accessibile da https://github.com/HuLiLab/NetDecoder_Example/tree/main, su una piattaforma di sviluppo R, e modificare la parte corsiva per farla corrispondere alla directory di lavoro contenente file di intensità delle celle (CEL).
         setwd(~/NetDecoder_Example/raw_data/CEL_files)
   3. Abbinamento dei modelli - Opzionale
      NOTA: Questo è il secondo approccio opzionale se non viene condotta l'analisi differenziale delle espressioni (come illustrato nei passaggi 1.1–1.4.1 della "Preparazione dei dati").
      1. Per i dati di sequenziamento RNA non processati tramite limma, edgeR e DESeq2, eseguire la normalizzazione esternamente prima di applicare il template matching. Per i dati dei microarray, utilizzare direttamente i valori di espressione normalizzati generati nei passaggi 1.1–1.4.2.
      2. Scegli la condizione di controllo come modello di base per l'espressione genica e confronta i valori normalizzati di espressione genica con tutte le altre condizioni di interesse.
      3. Calcola i coefficienti di correlazione di Pearson tra il profilo di espressione di ciascun gene e il modello selezionato. Si raccomanda di mantenere geni che mostrano correlazioni statisticamente significative (p < 0,05) e un coefficiente di correlazione assoluto superiore a una soglia definita dall'utente (come |r| > 0,7).
5. Selezione dei geni di origine
   NOTA: L'input per questo passaggio consiste nella matrice di espressione genica normalizzata sviluppata nei passaggi 1.1–1.4.
   1. Scegli un insieme di geni significativi da utilizzare come geni di origine. Per flussi di lavoro basati su espressioni differenziali, scegli soglie di p-value e log2FC aggiustate (come adj p-value < 0.05 e |log2FC| > 2). Per i flussi di lavoro di abbinamento dei template, selezionare i geni di origine tra i geni significativamente correlati identificati al passo 1.4.3.3 utilizzando le soglie di correlazione e significatività scelte. Dovrebbero essere scelte soglie per produrre circa 300–1.000 geni per la costruzione di reti a valle.
      NOTA: I geni sorgente sono il punto in cui il flusso di informazioni inizia e si propaga attraverso la rete.
6. Costruire una rete ponderata ai margini (EWN) per ogni fenotipo
   NOTA: Per questo passaggio sono necessari i seguenti input: la matrice di espressione genica normalizzata sviluppata nei passaggi 1.1–1.4; una rete di interazione proteina-proteina (PPI) formattata come lista di spicchi (coppie geneA-geneB); un file di annotazione del campione (metadati) che specifica le etichette delle condizioni biologiche per ogni campione. La rete PPI è condivisa come oggetto R ed è stata costruita sulla base del database proteico iRefIndex. La versione utilizzata in questo protocollo include tutte le interazioni dirette, ma sono stati esclusi auto-loop e più archi. La rete PPI contiene 15.608 proteine e 180.044 interazioni. Per ulteriori dettagli, consulta la sezione⁴ dei NetDecoder-Methods.
   1. Apri lo script NetDecoder Edge Weighted Network (EWN) (HuLiLab/NetDecoder_Example/input/NetDecoder_Create_EWN. R, accessibile da https:/github.com/HuLiLab/NetDecoder_Example/tree/main⁾⁴, su una piattaforma di sviluppo R.
   2. Modifica le parti dello script, indicate dai commenti (e in corsivo sotto), per impostare percorsi e file di input specifici per l'utente per lo sviluppo di EWN.
      Path<~/NetDecoder_Example/input/
      Questo è il percorso verso la directory di lavoro
      expQuery <- get(load("expBreastCancer_15Set2014.R"))
      Questo è un esempio di oggetto Rdata a matrice di espressione normalizzata
      stQuery < read.csv("stBreastCancer.csv")
      Questi sono i metadati di esempio
   3. Filtra la matrice di espressione per trattenere solo i geni presenti nella rete PPI.
   4. Per ogni condizione, si campionano per fenotipo e si calcolano le correlazioni gene-gene a coppie su tutti gli archi definiti nella rete PPI usando la correlazione di Pearson. Calcola le correlazioni utilizzando la matrice di espressione processata e normalizzata generata nel passo 1.4.
   5. Per ogni coppia di geni, calcola il coefficiente di correlazione, la correlazione assoluta e il valore p associato.
   6. Rimuovere casi incompleti (ad esempio, valori NA).
   7. Esporta una rete ponderata su spigoli per ogni condizione come file delimitato da tab (senza intestazione) con le seguenti colonne: proteinA, proteinB, abs_cor, cor e pvalue.
   8. Esegui lo script R per creare reti di coespressione per tutte le condizioni rilevanti.

2. Installazione e configurazione di NetDecoder

1. Scarica NetDecoder
   1. Accedi al software NetDecoder a (https://netdecoder.hulilab.org/#ver), scegliendo R o Java.
2. Installa il software necessario
   1. Installa Oracle JDK e R per ambienti di lavoro/analisi.
   2. Installa i pacchetti R necessari come indicato nella documentazione NetDecoder, utilizzando Bioconductor (https://netdecoder.hulilab.org/#ver)⁴.
3. Dipendenze per il download
   1. Scarica le dipendenze necessarie per NetDecoder, che includono dati di ontologia genica (accessibili da https://geneontology.org/docs/download-ontology/), oltre alla guida di riferimento all'associazione genica (accessibile da https://www.ebi.ac.uk/GOA/human_release).
4. Configura la directory di lavoro
   1. Sposta tutti i file scaricati (dati di espressione, reti di co-espressioni generate per ogni condizione, dati sull'ontologia genica e guida di riferimento alle associazioni) in una cartella, che sarà la directory di lavoro NetDecoder.
5. Aggiungi la cartella necessaria
   1. Scarica la cartella NetDecoder (https://netdecoder.hulilab.org/wp-content/uploads/2025/07/NetDecoder_Example.zip) nella directory di lavoro NetDecoder.
   2. Sblocca la cartella NetDecoder.

3. Esecuzione di NetDecoder

1. Apri lo script bash di analisi
   1. Apri un terminale che esegue GNU Bash e naviga fino alla directory di lavoro NetDecoder.
   2. Esegui il comando nano NetDecoder_Analysis.sh per aprire lo script bash.
2. Modifica gli script
   NOTA: La maggior parte del codice è già scritta. In questo passaggio, i parametri richiesti sono specificati nello script nelle posizioni indicate.
   1. Fai un nome breve:
      Modifica la parte in corsivo per rendere le condizioni da confrontare: myshortname='Your_shortname_here'
   2. Impostare percorsi software:
      Modifica le seguenti tre definizioni di percorso per le tracce corrette modificando le parti in corsivo:
      JAVA="/tu/path/here"
      esporta R="/il tuo/cammino/qui"
      alias R="/your/path/here"
   3. Imposta la directory di lavoro:
      Modifica la parte in corsivo per renderla la directory di lavoro da cui verranno acceduti tutti i file: INPUT_DIR="/tu/percorso/qui"
   4. Imposta la libreria NetDecoder:
      Modifica la parte in corsivo per renderla il percorso verso la libreria NetDecoder installata nel passo 2.4 dal file zip: LIB_DIR="/your/path/here/netdecoder_lib"
   5. Impostare un'ontologia genica e i percorsi di associazione:
      Modifica le seguenti parti in corsivo delle due directory alle posizioni delle ontologie/file di associazione geniche preferite.
      SYMBOL=$LIB_DIR/gene_association_file
      GO=$INPUT_DIR/gene_ontology_file
   6. Stabilire argomenti di input:
      Aggiorna le parti in corsivo delle cinque righe successive secondo i dati, secondo le istruzioni commentate trovate nello script di riferimento NetDecoder.
      geneList=$INPUT_DIR/gene_file
      state_trt=Condizione trattata
      state_ref=Condizione di riferimento
      PPI_trt=$INPUT_DIR/treated_co_expression_network_file
      PPI_ref=$INPUT_DIR/reference_co_expression_network_file
   7. Imposta il terreno giusto:
      Revoca il commento (rimuovendo il simbolo #) la fase di esecuzione desiderata e ricommemora una volta completata la fase. La prima fase è gen_net_trt, seguita dalla gen_net_ref, poi la fase di analisi e infine la fase di raccolta.
      Imposta il livello desiderato da eseguire, iniziando dalla prima fase.
      #STAGE="gen_net_trt"
      #STAGE="gen_net_ref"
      #STAGE="analisi"
      #STAGE="collezionare"
   8. Naviga fino al terminal principale di Bash:
      Premi Ctrl+X, poi Y, per salvare ed uscire dallo script bash.
3. Esegui NetDecoder
   NOTA: Se viene eseguito con successo, i messaggi di logging compaiono nel terminale.
   1. Naviga fino al terminale e corri ./NetDecoder_Analysis.sh.
   2. Esegui le fasi nell'ordine indicato nel passo 3.2.7 finché tutte e quattro non sono state completate singolarmente.
4. Recupero dei risultati
   1. Naviga verso i file di output e i riassunti grafici.

Risultati

Come mostrato nella Figura 1, NetDecoder opera attraverso un flusso di lavoro strutturato composto da elaborazione dati, configurazione di rete e analisi basata su flusso, con output organizzati in directory distinte corrispondenti a ogni fase della pipeline. Questa struttura modulare consente una validazione sistematica degli output, garantendo che i risultati possano essere ricondotti a ogni fase computazionale e supportando la riproducibilità complessiva.

L'esecuzione con successo di NetDecoder (Figura 2) produce output su quattro directory (analisi, collezione, reti e "your_shortname") contenenti dati corrispondenti a varie condizioni, inclusi dati e output quantitativi per valori di flusso, sottoreti e altri output flow-interaction (Figura 1, Figura 2 e Figura 3). La presenza di file e figure popolate in queste directory indica che la pipeline è stata eseguita correttamente. Al contrario, le esecuzioni fallite sono caratterizzate da risultati mancanti e/o figure incomplete. Poiché NetDecoder valuta migliaia di geni all'interno di una rete PPI, le esecuzioni di successo richiedono tipicamente più ore di calcolo, a seconda della dimensione del dataset e delle risorse disponibili. Per l'analisi rappresentativa del cancro delle vie biliari umane presentata qui, l'esecuzione di NetDecoder richiedeva un'esecuzione di circa 4–6 ore sulla workstation Basata su Linux Puget3 (Puget Systems). Tempi di esecuzione insolitamente brevi possono indicare dati di input formattati in modo errato o esecuzione incompleta della pipeline. Dati di input formattati in modo errato o esecuzione fallita della pipeline possono generare messaggi di errore che possono essere ricondotti alla causa del problema. La Figura 3 illustra output rappresentativi presenti dopo l'esecuzione riuscita di NetDecoder. L'analisi rappresentativa qui presentata ha utilizzato dati di sequenziamento dell'RNA provenienti da 255 campioni di cancro delle vie biliari (OEP001105)⁶, permettendo il confronto tra gli stati patologici di stadio I–II e III–IV e il flusso di informazioni alterato tra le condizioni.

Le tre heatmap nella Figura 4 riassumono i cambiamenti complessivi nel flusso di informazioni di rete tra geni attraverso le condizioni, inclusi geni router che trasmettono un flusso di informazioni sostanziale all'interno della rete, geni target a valle importanti o geni complessivi altamente impattati. Una distribuzione ampia sia del flusso differenziale positivo che negativo indica che le informazioni vengono ridistribuite nella rete, invece che aumentate o diminuite uniformemente. Questa eterogeneità e varietà di tipi genici supportano la capacità di NetDecoder di identificare geni con alterazione di importanza funzionale tra fenotipi.

La Figura 4 mostra anche grafici a barre a livello di spicco che quantificano i cambiamenti di flusso per le singole interazioni gene-gene tra coppie di geni e varie condizioni. Questi risultati dimostrano che il flusso attraverso interazioni specifiche può variare a seconda delle condizioni, riflettendo un ricablaggio di rete dipendente dal contesto. Così, il flusso di margine cattura i cambiamenti a livello di interazione nel trasferimento delle informazioni, mentre il flusso differenziale fornisce un riassunto a livello di nodo di questi cambiamenti, consentendo la priorità dei geni con il maggiore cambiamento complessivo nell'influenza della rete.

Insieme, questi output dimostrano che NetDecoder cattura alterazioni geniche (a livello di nodo), gene-gene (a livello di bordo) e a livello di rete nel flusso di informazioni all'interno delle reti biologiche (Figura 4). Le heatmap identificano geni con propagazione, instradamento e ricezione delle informazioni alterate nella rete, mentre le analisi a livello di margine rivelano le interazioni specifiche che guidano questi cambiamenti. Le reti informative specifiche per fenotipo forniscono una rappresentazione visiva del ricablaggio della rete tra condizioni, dove i nodi rappresentano geni e lo spessore dei bordi corrisponde alla grandezza del flusso informativo (Figura 4). Questa rappresentazione a livello di sistema supporta l'identificazione dei geni regolatori chiave e delle vie associate alle condizioni studiate. Inoltre, la produzione riuscita di queste figure indica che NetDecoder è stato eseguito correttamente.

Poiché NetDecoder produce un gran numero di file di output, identificare i risultati più rilevanti è essenziale per l'interpretazione. Ad esempio, per esaminare le differenze di flusso tra condizioni (ad esempio, stadio basso vs. stadio alto), possono essere utilizzati due file chiave (i passaggi di navigazione sono guidati dalla struttura dei file della Figura 3). La prima, "EDGE_CENTERED_SUBNET_flowDifference_Malattia.txt" (situata nella directory di analisi/Malattie ), identifica le interazioni (bordi) con i maggiori cambiamenti di flusso tra le condizioni. Il secondo, "flowDifference_PRIORITIZED_NETWORK.txt" (situato nella directory "your_shortname"), identifica i geni (nodi) con le maggiori differenze di flusso. Insieme, questi file forniscono una visione completa sia dei cambiamenti a livello di interazione che a livello genico nel comportamento della rete.

Più in generale, la cartella "analisi" contiene informazioni su router di rete, target chiave e importanti geni di flusso differenziale. La cartella "your_shortname" contiene file di testo grezzi con dati specifici per fenotipo, come valori di flusso totale e target chiave e router. La cartella reti contiene le sottoreti generate da NetDecoder, che possono essere ulteriormente analizzate e visualizzate in Cytoscape⁷. Infine, la cartella "collezionare" contiene dati e figure consolidate che forniscono un riassunto generale dei risultati. Ulteriori visualizzazioni e analisi dei risultati di NetDecoder possono essere effettuate utilizzando pacchetti R come ggplot2, igraph, pheatmap, ecc.

Figura 1: Rappresentazione della pipeline NetDecoder e funzionalità generali. NetDecoder richiede tre fasi generali (scatola gialla): elaborazione dati, configurazione NetDecoder ed esecuzione NetDecoder. Ogni fase di queste fasi deve essere seguita con attenzione per garantire risultati di successo. NetDecoder richiede dati di espressione da due condizioni (esempi in scatola verde) per prevedere quali geni potrebbero essere associati a un alto flusso informativo e a un'elevata utilità genica. Nell'analogia del rubinetto dell'acqua, i livelli di espressione genica sono illustrati dalla dimensione del rubinetto, cioè da quanto può aprirsi, mentre l'utilità o attività genica riflette il flusso effettivo d'acqua che passa attraverso il rubinetto, illustrando quanto questa via sia effettivamente utilizzata. Come mostrato nella figura, un gene altamente espresso (grande dimensione del rubinetto) può avere una bassa utilità genica (basso flusso d'acqua), mentre un gene con basso livello di espressione (piccola dimensione del rubinetto) può avere un'elevata utilità genica (alto flusso d'acqua). Questo illustra come i geni possano avere una rilevanza complessiva maggiore in una data condizione, anche se i livelli di espressione sono inferiori a quelli di un altro gene. L'illustrazione in basso al centro mostra come i geni possano essere interconnessi e sperimentare diversi livelli di flusso (colore), indipendentemente da quanto siano espressi (dimensioni). Creato in BioRender. Blissenbach, E. (2026) https://BioRender.com/8okynbu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Flusso di lavoro generale di NetDecoder. Il principio fondamentale dell'algoritmo NetDecoder è modellare l'utilità genica in una rete di interazione proteina-proteina (PPI) attraverso l'analisi del flusso di informazioni. Il flusso di lavoro inizia con la pre-elaborazione dei dati e la costruzione di reti ponderate su margine (EWN). I dati di espressione genica di due condizioni biologiche, fenotipo 1 (P1) e fenotipo 2 (P2), vengono elaborati per identificare geni di origine utilizzando approcci di espressione differenziale o di abbinamento di modello. Le matrici di espressione normalizzate vengono poi utilizzate per costruire EWN specifiche per condizione, dove i pesi di spigoli riflettono le relazioni tra coppie geniche in ciascun fenotipo. NetDecoder successivamente quantifica le differenze nel flusso informativo tra le condizioni, consentendo l'identificazione di eventi di riconfigurazione della rete e alterazioni nell'utilità genica. I risultati includono punteggi differenziali di flusso informativo, reti informative specifiche per contesto, heatmap dei punteggi d'impatto e metriche aggiuntive a livello di rete e genetica che facilitano l'interpretazione biologica a valle e la scoperta meccanicistica. Creato in BioRender. Correia, C. (2026) https://BioRender.com/29cmswf. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Output NetDecoder e struttura delle cartelle. Questo diagramma rappresenta la struttura delle directory di output utilizzata per accedere ai file di risultato per l'interpretazione. Rappresentati in corsivo ci sono i nomi delle cartelle (sulle icone delle cartelle), mentre quelli tra virgolette sono specifici per la nomenclatura dell'analisi. I valori nelle icone della casella di posta indicano file o tipi di file, a seconda della codifica a colori. Il rosso indica i tipi di file che si trovano in ogni cartella, mentre i file chiave sono mostrati in grassetto e sottolineati (flowDifference_PRIORITIZED_NETWORK.txt e EDGE_CENTERED_SUBNET_flowDifference_Malattia.txt). Le icone delle cartelle sono state ricavate da icons8 (https://icons8.com). Creato in BioRender. Blissenbach, E. (2026) https://BioRender.com/8okynbu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempio di risultati generati da NetDecoder. I geni d'impatto (A), i router di rete (B) e le heatmap dei target chiave (C), così come le reti specifiche per il contesto (D) e i grafici a barre di flusso dei margini (E), sono output chiave di NetDecoder. In questo esempio, è stato utilizzato un dataset di espressione del cancro delle vie biliari (OEP001105) per confrontare i pazienti con malaltia in stadio iniziale (stadio I-II, basso) e in stadio avanzato (stadio III-IV, alto), e è stato applicato NetDecoder per identificare geni con alta informazione differenziale tra i due gruppi. Ogni grafico mostra il rosso che indica un aumento del flusso e il blu indica la diminuzione del flusso del flusso. I router di rete (B) sono geni intermedi chiave dove passano grandi quantità di flusso attraverso (raccogliere/Disease_Network_routers.pdf), i target chiave (C) sono importanti regolatori a valle (raccogliere/Disease_Key_targets.pdf), e la heatmap della differenza di flusso rappresenta il cambiamento complessivo del flusso informativo a livello genico tra le condizioni (analisi/flowDifference_heatmap.pdf). È possibile visualizzare una rete informativa specifica per fenotipo (D), con ogni gene che rappresenta un nodo e le interazioni gene-gene rappresentate come spigoli (linee) (analisi/EDGE_CENTERED_SUBNET_Disease). Lo spessore dei bordi corrisponde all'entità del flusso di informazioni tra i geni. Il grafico a barre (E) mostra differenze nel flusso di spigoli tra le interazioni gene-gene tra i due fenotipi selezionati, con coppie di stadi basse rappresentate nel teal e coppie di stadi alto in arancione (analisi/Disease_keyEdges.pdf). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo delinea l'implementazione di NetDecoder, un framework di rete-biologia che integra dati di espressione genica con reti di interazione proteina-proteina (PPI) per modellare il flusso informativo specifico di una condizione e dare priorità ai geni in base alla loro influenza funzionale all'interno dei sistemi biologici. L'applicazione con successo di questo metodo dipende da diversi passaggi critici, scelte metodologiche attente e una corretta interpretazione degli output.

Le fasi iniziali del protocollo includono il recupero dei dati di espressione, la generazione di metadati e la costruzione di una matrice di espressione unificata. Questi passaggi sono fondamentali per garantire la compatibilità con l'analisi a valle. La matrice di espressione deve essere formattata con geni come righe e campioni come colonne, con nomi di campioni nella matrice e file di metadati identici che corrispondono allo stesso modo. Eventuali incongruenze in questa fase (ad esempio, identificatori di campioni non corrispondenti o nomi di geni duplicati) si propagherà nella pipeline e causerà guasti nelle fasi successive.

Filtrare dati di bassa qualità (ad esempio, geni con pochi conteggi, valori mancanti o a bassa varianza) è particolarmente importante, poiché queste caratteristiche possono introdurre rumore nella costruzione di reti basate su correlazioni. Un passaggio di pre-elaborazione riuscito è indicato da una matrice di espressione pulita senza valori mancanti e da identificatori genici coerenti che corrispondono a quelli utilizzati nella rete PPI.

Un punto decisionale chiave nel protocollo è la scelta tra analisi di espressione differenziale e abbinamento di template per selezionare i geni di origine utilizzati nella costruzione di Edge Weighted Network (EWN). L'analisi di espressione differenziale è più appropriata quando si confrontano gruppi sperimentali ben definiti con repliche sufficienti. Questo approccio identifica geni con variazioni di espressione statisticamente significative tra le condizioni e fornisce risultati quantitativi come il cambiamento di log2 fold (log2FC) e i valori p correti. L'esecuzione riuscita è indicata da una distribuzione sia di geni significativi che non significativi, piuttosto che da risultati uniformemente nulli. Al contrario, l'abbinamento dei template è più adatto quando l'obiettivo è identificare geni con modelli di espressione correlati a un profilo continuo o di riferimento. Questo metodo mantiene i geni basati sulla forza di correlazione piuttosto che sulla magnitudine dell'espressione differenziale. Un passaggio di abbinamento del modello di successo produce un insieme di geni con correlazioni statisticamente significative con la condizione di riferimento. La scelta tra questi approcci influisce sulla topologia della rete a valle; L'espressione differenziale enfatizza i cambiamenti di magnitudine, mentre l'abbinamento dei template enfatizza i modelli di espressione coordinati.

Il passaggio di costruzione dell'EWN è uno dei componenti più critici del protocollo. Qui, i dati di espressione genica normalizzati sono integrati con una rete PPI per calcolare le correlazioni geni-gene a coppie per tutte le interazioni presenti nella rete. Vengono mantenuti solo i geni condivisi tra il dataset di espressione e la rete PPI, garantendo rilevanza biologica e coerenza computazionale. Per ogni condizione, i coefficienti di correlazione di Pearson vengono calcolati su tutti gli archi, insieme ai corrispondenti valori p e valori di correlazione assoluti. Queste metriche definiscono i pesi degli archi utilizzati da NetDecoder. La costruzione riuscita di EWN è indicata da migliaia di correlazioni gene-gene, ampia distribuzione dei valori di correlazione e valori minimi mancanti dopo il filtraggio. Il fallimento in questa fase è spesso dovuto a identificatori genici non corrispondenti, dimensioni del campione insufficienti o dati di espressione non correttamente normalizzati. I punti di guasto comuni del NetDecoder possono spesso essere risolti tramite una verifica metodica dei file di input e della configurazione software. Se NetDecoder termina inaspettatamente o produce output incompleti, gli utenti dovranno verificare che gli identificatori di campione siano identici tra matrici di espressione e file di metadati, che gli identificatori geni siano coerenti tra dataset di espressione, liste geniche di origine e rete PPI, e che le matrici di espressione non contengano valori mancanti. Se si verificano errori o risultati troncati, gli utenti possono verificare la compatibilità di installazione e versione del software, ispezionare i messaggi di log generati durante l'esecuzione e confermare il completamento con successo di ogni passaggio intermedio prima di procedere con le analisi a valle. L'ispezione dei file di output e/o dei messaggi della console può aiutare a localizzare la fonte di un errore prima che vengano tentate analisi successive. NetDecoder richiede una configurazione meticolosa dei percorsi dei file, degli argomenti di input e delle dipendenze. I passaggi chiave includono la specificazione dei percorsi funzionanti di directory e librerie, dei file di ontologia e annotazione genica, degli input EWN specifici per condizione e delle liste geniche sorgente.

Poiché la pipeline viene eseguita in fasi (generazione di rete di entrambe le condizioni, analisi e raccolta dei risultati), gli errori nelle fasi precedenti impediranno il completamento con successo di quelli successivi. Un'esecuzione funzionante correttamente produce quattro directory (analisi, raccogliere, reti, "your_shortname"), ciascuna contenente risultati specifici per condizione. Un altro indicatore pratico dell'esecuzione corretta è il tempo di esecuzione. Le esecuzioni riuscite richiedono tipicamente diverse ore per essere elaborate perché NetDecoder valuta grandi reti di interazione; Tempi di esecuzione estremamente brevi spesso indicano input mal configurati o passaggi di calcolo saltati.

NetDecoder differisce fondamentalmente dagli approcci tradizionali di priorità genica e analisi di rete. Metodi come la Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA)⁸ raggruppano geni basati sulla struttura di correlazione, ma non incorporano il flusso direzionale né quantificano come l'informazione si propaga attraverso una rete. Analogamente, le analisi di arricchimento dei percorsi^identificano la sovrarappresentazione funzionale, ma non tengono conto delle dinamiche a livello di interazione o dei cambiamenti nella connettività della rete.

NetDecoder utilizza un approccio integrato combinando dati di espressione genica con reti PPI per modellare il flusso informativo specifico per condizione. Quantificando sia i singoli punteggi genici (a livello di nodo) sia i cambiamenti di flusso di interazione (a livello di bordo), si cattura come la struttura della rete e l'instradamento delle informazioni vengano riadattati tra le condizioni. Ciò consente l'identificazione di geni che potrebbero non mostrare una forte espressione differenziale pur svolgendo un ruolo centrale nel mediare il comportamento della rete, coerente con il modello di utilità genica (GUM⁾⁵, che sostiene che i geni con alto flusso di informazioni differenziale guidano la funzione specifica della rete.

Nonostante i suoi punti di forza, NetDecoder presenta diverse limitazioni. Primo, è un quadro computazionale che inferisce l'importanza genica basandosi sul flusso di informazioni modellati della rete piuttosto che su prove sperimentali^{dirette 10}. Pertanto, le sue previsioni devono essere interpretate come ipotesi che richiedono validazione tramite esperimenti biologici. Approcci di validazione funzionale, come gli studi di knockout^{genico 11} o i saggi di perturbazione^{mirata 12}, sono essenziali per confermare se i geni identificati come ad alta utilità da NetDecoder influenzino realmente i processi biologici o gli stati patologici studiati. In secondo luogo, il metodo dipende fortemente dalla qualità e completezza della rete PPI sottostante. Poiché i database PPI sono spesso orientati verso geni ben studiati, le interazioni meno caratterizzate potrebbero essere sottorappresentate, limitando potenzialmente la scoperta di nuove relazioni regolatorie. La variabilità nella dimensione del campione, nel disegno sperimentale e nella qualità dei dati può anche influenzare la costruzione della rete e i calcoli di flusso a valle. In terzo luogo, NetDecoder non presume che gli archi statici catturino completamente il flusso dinamico di informazioni. Invece, NetDecoder deduce attività specifiche per contesto e quantifica il flusso di informazioni utilizzando una rete PPI come prior strutturale, che funge da impalcatura per definire lo spazio delle interazioni biologicamente plausibili. Il comportamento dinamico viene quindi introdotto sovrapponendo dati molecolari specifici per lo stato (ad esempio, l'espressione genica), ripesando o attivando efficacemente sottoinsiemi della rete in modo dipendente dal contesto.

L'obiettivo principale di NetDecoder è modellare la propagazione delle informazioni su un'impalcatura PPI statica, preservando al contempo relazioni quantitative e continue tra geni (nodi). Al contrario, approcci come le reti booleane offrono una rappresentazione semplificata e interpretabile della dinamica modellando l'attività proteica come stati discreti on/off governati da interazioni^{logiche 13}. Questi approcci sono stati ampiamente utilizzati per studiare le reti regolatorie e di segnalazione genica in condizioni^variabili 14,15,16. Tuttavia, tipicamente richiedono regole logiche predefinite e la discretizzazione degli stati proteici, che possono essere difficili da definire su larga scala per grandi reti biologiche eterogenee di^{PPI 17}. In questo contesto, la modellazione delle reti booleane rappresenta una direzione complementare a NetDecoder. Sebbene NetDecoder catturi flussi di informazioni continui e quantitative, l'integrazione di dinamiche logiche basate su regole o modelli ibridi discreto-continui potrebbe migliorare l'interpretabilità dei comportamenti di segnalazione specifici per condizione. Sviluppare algoritmi di flusso informativo in stile booleano rappresenta quindi una prospettiva promettente per lavori futuri.

Le direzioni future per NetDecoder includono l'integrazione con ulteriori tipi di dati omici e l'espansione alla trascritomica a singola cellula per migliorare la risoluzione e il contesto biologico. Ad esempio, gli approcci basati sul deep learning per la predizione e imputazione spaziale delle espressioni trastrasscrittomiche mirano a migliorare la qualità dei dati e il recupero dei segnali, ma non modellano esplicitamente il flusso di informazioni tra reti di interazione^18,19. L'incorporazione di livelli multi-omici di analisi potrebbe sia aumentare ulteriormente il suo potere predittivo sia portare a risultati più affidabili. Con lo sviluppo metodologico continuo, NetDecoder sarà in grado di produrre molteplici livelli di flusso informativo, fornendo agli scienziati di ricerca una validazione multi-omica per i loro dati di interesse.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AnnotationDbi	Bioconductor	versione 1.68.0	Annotatione e mappatura dei geni
Bioconductor	Bioconductor	versione 3.19	Framework per l'analisi dei dati transcriptomici ed ecosistema di pacchetti che supporta DESeq2, edgeR, limma, AnnotationDbi e database degli organismi, ecc.
Cytoscape	The Cytoscape Consoritum	versione 3.10.4	Visualizzazione e analisi delle reti
DESeq2	Bioconductor	versione 1.46.0	Analisi dell'espressione differenziale (con modellazione binomiale negativa)
dplyr	Posit Software, PBC formerly RStudio, PBC	versione 1.1.4	Manipolazione e trasformazione dei dati
edgeR	Bioconductor	versione 4.4.2	Analisi dell'espressione differenziale basata sui conteggi
ggplot2	Posit Software, PBC formerly RStudio, PBC	versione 4.0.0	Visualizzazione e plot dei dati
GNU Bash	GNU Project	Predefinito di sistema	Bash, Esecuzione degli script del pipeline NetDecoder
igraph	igraph Development Team	versione 2.1.4	Costruzione di reti e analisi grafica
Limma	Bioconductor	versione 3.62.2	Modelli lineari per l'analisi dell'espressione genica
NetDecoder	Hu Li Laboratory, Mayo Clinic	(2024 Hu Li Lab)	Costruzione di reti di interazione proteica specifiche del contesto tramite modellazione del flusso di informazioni
org.Hs.eg.db	Bioconductor	versione 3.20.0	Database di annotazione dei geni umani
Oracle JDK	Oracle Corporation	≥ versione 1.8	Ambiente di esecuzione per l'esecuzione di NetDecoder
pheatmap	Raivo Kolde	versione 1.0.13	Visualizzazione della struttura di espressione e correlazione
R	The R Foundation	versione 4.4.2	Ambiente di base per l'analisi transcriptomica e delle reti