Un flusso di lavoro di microiniezione CRISPR/Cas9 per il marcattura fluorescente endogena nella linea germinale di Caenorhabditis elegans per ottenere linee di knock-in omozigoti per l'analisi in vivo della localizzazione delle proteine.
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Articolo metodologico
Marcatura Endogena Fluorescente mediata da CRISPR/Cas9 dei geni specifici della linea germinale in Caenorhabditis elegans
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La localizzazione delle proteine nella linea germinale di Caenorhabditis elegans (C. elegans) è centrale per interpretare la funzione genica durante la gametogenesi, tuttavia gli approcci transgenici convenzionali spesso producono un'espressione variabile e possono essere silenziati nelle cellule germinali. Qui viene descritto un flusso di lavoro pratico CRISPR/Cas9 che inserisce un tag fluorescente in un locus endogeno, permettendo la generazione di alleli knock-in stabili che riportano la distribuzione proteica sotto regolazione nativa. Il protocollo copre le fasi chiave della procedura: selezione di una strategia di marcatura appropriata per la proteina bersaglio, somministrazione dei reagenti CRISPR tramite microiniezione gonadale in giovani ermafroditi adulti e recupero degli animali iniettati per lo screening. I candidati knock-in vengono identificati tramite genotipizzazione basata su PCR su due generazioni per isolare vermi omozigoti e verificare l'allele modificato. Infine, la microscopia confocale viene utilizzata per verificare la fluorescenza della linea germinale e valutare la localizzazione subcellulare in vivo. Il flusso di lavoro è progettato per essere riproducibile e ampiamente applicabile ai geni arricchiti dalla linea germinale, fornendo una via semplice per stabilire ceppi omozigoti marcati per analisi dello sviluppo e biologica cellulare.
Introduzione
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un modello ben consolidato per lo studio dello sviluppo riproduttivo e della gametogenesi, grazie al suo ciclo vitale breve, al corpo trasparente e all'elevata trattabilitàgenetica 1. C. elegans esiste principalmente come ermafroditi autofecondanti, la cui gonade subisce prima la spermatogenesi, poi passa all'oogenesi. Questa modalità riproduttiva semplifica il mantenimento dello stirpe e rende semplice ottenere lineeomozigoti 2. La recente trascritomica spaziale ha ampito sostanzialmente la lista dei geni arricchiti nella gonade e ha rivelato modelli di espressione specifici per sesso pronunciati in tutto il sistema riproduttivo in C. elegans3. Più recentemente, il sequenziamento a RNA a singola cellula ha permesso la ricostruzione delle traiettorie di sviluppo delle cellule germinali e l'inferenza delle reti regolatorie geniche che governano laspermatogenesi 4. Insieme, questi dataset generano ricche liste di candidati, ma l'interpretazione funzionale spesso richiede di osservare il comportamento delle proteine in vivo—nello specifico, definire quando e dove le corrispondenti proteine si localizzano e come i loro modelli cambiano durante lo sviluppo della linea germinale.
La transgenesi convenzionale in C. elegans spesso si basa su microiniezioni gonadali di DNA plasmidicale, che genera facilmente array extracromosomicimulti-copia 5. Tuttavia, nella linea germinale, questi array sono spesso fortemente silenziati, un meccanismo che si ritiene aiuti a mantenere l'integrità della linea germinale limitando l'espressione dal DNA ripetitivo, preservando così la funzione della linea germinale e la stabilità delle informazioni genetiche attraverso legenerazioni 6, 7. Di conseguenza, i costrutti di espressione dei transgeni che si esprimono facilmente nei tessuti somatici possono essere deboli o incoerenti nella linea germinale. Anche quando l'espressione è rilevabile, gli effetti del numero di copie e gli elementi regolatori modificati possono modificare il dosaggio e il tempismo delle proteine, potenzialmente confondendo le conclusioni sulla localizzazione e dinamica nativa. Per affrontare queste limitazioni, il bombardamento di microparticelle e il Single Copy Insertion (MosSCI) mediato da Mos1 sono ampiamente utilizzati per generare linee transgeniche integrate a bassa o singolacopia 8, 9, 10. Questi approcci possono migliorare l'espressione nella linea germinale, ma differiscono per costo, produttività e quanto bene riproducono la regolazione endogena. L'editing genomico CRISPR/Cas9 offre una via più diretta inserendo un tag fluorescente nel locus endogeno tramite una riparazione diretta dall'omologia, generando alleli knock-in stabili che riportano localizzazione e dinamica proteica sotto controllo regolatorionativo 11,12,13,14.
Qui viene descritto un flusso di lavoro pratico per il marcatore endogeno fluorescente mediato da CRISPR/Cas9 in C. elegans , applicato a geni selezionati sulla base di modelli di espressione arricchiti da germline riportati. Il protocollo delinea la selezione del bersaglio, il modello e guida del donatore nella progettazione dell'RNA, la microiniezione gonadale e lo screening a valle per isolare le linee omozigoti knock-in, seguiti dalla validazione tramite genotipazione. Questo approccio è ampiamente applicabile ai geni espressi dalla linea germinale attraverso le fasi dello sviluppo e consente analisi quantitative della localizzazione e dinamica delle proteine in vivo. Questo flusso di lavoro fornisce una strategia pratica per il marcatore dei geni espressi nella linea germinale e per analizzare la localizzazione e la dinamica delle proteine in vivo sotto il controllo regolatorio nativo.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto Caenorhabditis elegans sono stati condotti in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli organismi da laboratorio presso l'Università Normale di Pechino.
Figura 1: Panoramica del marcatore endogeno fluorescente mediato da CRISPR/Cas9 in C. elegans. Flusso di lavoro schematico che illustra le principali fasi della generazione e validazione del knock-in fluorescente endogene. Nella fase di progettazione e costruzione, vengono selezionati un gene bersaglio arricchito dalla linea germinale e un sito di inserimento, pDD162 viene utilizzato come plasmide CRISPR/Cas9 per l'espressione di Cas9 e RNA guida, e pPD95.75 viene utilizzato come dorsale donatrice in cui vengono sottoclonati il tag fluorescente (ad esempio GFP) e i bracci di omologia sinistro e destro. Nella fase di microiniezione, la miscela di iniezione CRISPR/Cas9 (inclusi il plasmide gRNA/Cas9, il modello donatore e i marcatori di co-iniezione) viene somministrata nella gonade di giovani ermafroditi adulti, seguita dal recupero su piastre seminate. Nella fase di validazione, vengono selezionati i progenitori marker-positivi per la genotipizzazione a valle, inclusa l'identificazione basata sulla PCR degli eventi knock-in e la conferma tramite sequenziamento del DNA, e le linee knock-in di successo vengono successivamente esaminate tramite microscopia a fluorescenza per valutare l'espressione della linea germinale e la localizzazione subcellulare della proteina marcata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Selezionare un gene bersaglio arricchito dalla linea germinale
- Identificare geni candidati con espressione predominante nelle gonadi o nelle cellule germinali utilizzando database pubblici e letteratura pubblicata.
- Seleziona un sito di etichettatura appropriato in base alle caratteristiche proteiche. Registra l'isoforma selezionata e la posizione di inserimento del tag per la progettazione a valle dell'RNA guida e del modello donatore (Figura 1).
2. Progettare il modello guida RNA e donatore
- Identificare una sequenza di RNA guida (gRNA) di 20 nt a monte di un motivo adiacente al protospaziatore (PAM; NGG), la sequenza richiesta per il riconoscimento Cas9, e posizionarla il più vicino possibile al sito di inserimento del tag previsto.
- Valutare i gRNA candidati utilizzando uno strumento di progettazione online (ad esempio, lo strumento IDT CRISPR) selezionando il genoma di C. elegans. Seleziona una guida con una forte efficienza di taglio previsto nel target e nessun sito ad alto rischio previsto fuori obiettivo.
- Clonare la sequenza gRNA nella regione tra il promotore U6 e l'impalcatura del gRNA all'interno della spina dorsale plasmidiale di espressione CRISPR.
NOTA: Innesco di progettazione che incorporano la sequenza gRNA come sporgenti. Eseguire amplificazione PCR seguita da assemblaggio omologo basato su ricombinazione, un metodo di clonaggio indipendente dalla legatura che elimina la digestione enzimatica di restrizione e consente il clonaggio in un solo passaggio direttamente nel vettoredi espressione 15. - Conferma l'inserimento corretto tramite sequenziamento Sanger.
- Costruire il plasmide donatore usando un tag fluorescente affiancato da bracci di omologia sinistra di circa 1.000 pb e 1.000 pb destra, derivati dal locus bersaglio.
NOTA: Amplificare i bracci di omologia dal DNA genomico N2 preparato come lisato di vermi utilizzando la digestione della proteinasi K. I primer di progettazione con 15–20 pb si sovrappongono al vettoriale linearizzato e al tag fluorescente. Assemblare i bracci di omologia e taggarlo nella spina dorsale tramite ricombinazione omologa in una singola reazione. Inserire il tag fluorescente immediatamente dopo il codone di partenza ATG per il tag N-terminale o prima del codone di stop per il tag C-terminale. Includere una sequenza di collegamento tra il gene bersaglio e il tag fluorescente per mantenere il corretta piegatura e la funzione delle proteine. Usa il linker per ridurre le interferenze steriche tra i partner di fusione e assicurati che sia il linker che il tag siano inseriti nel frame con la sequenza di codifica. Seleziona con cura il sito di inserimento per evitare di disturbare domini funzionali noti o previsti, peptidi del segnale o regioni transmembrana (File Supplementare 1). - Introdurre sostituzioni silenziose nella sequenza modello omologa del donatore per interrompere la sequenza PAM o di legame guida senza alterare la sequenza proteica e prevenire il ritaglio di Cas9 dopo l'integrazione.
NOTA: Incorporare mutazioni puntuali sinonime nei primer utilizzati per l'amplificazione del braccio omologico, mirando ai codoni all'interno della regione PAM. - Confermare l'integrità della sequenza donatrice sia tra i bracci di omologia che le giunzioni del tag tramite sequenziamento Sanger.
NOTA: Conservare plasmidi verificati a −20 °C per la conservazione a breve termine o a −80 °C per la conservazione a lungo termine.
3. Prepara la miscela di iniezione
- Assemblare la miscela di iniezione combinando il plasmide di espressione CRISPR, il plasmide donatore (costruito sulla base di pPD95.75) e i marcatori di co-iniezione in ddH₂O sterile per un volume finale di 10 μL alle concentrazioni elencate nella Tabella 1.
NOTA: Ottimizzare empiricamente le concentrazioni per bilanciare la leggibilità dei marcatori, il recupero dei candidati e la sopravvivenza post-iniezione. - Centrifugare la miscela di iniezione a 10.000 × g per 10–20 minuti per distribuire il materiale particolato e prevenire l'ostruzione del capillare di microiniezione.
| Componente | Funzione | Concentrazione operativa (ng/μL) |
| pDD162 | Plasmide CRISPR/Cas9 (espressione di Cas9 e gRNA) | 50-100 |
| Plasmide donatore (spina dorsale pPD95.75) | Modello donatore HDR che trasporta un tag fluorescente affiancato da bracci di omologia di ~1 kb | 50-100 |
| pRF4 | Marcatore di co-iniezione (fenotipo a rullo) | 50-100 |
| pPD122.11 | Marcatore di co-iniezione (espressione GFP) | 5-10 |
| Sterile ddH2O | Porta al volume finale | – |
Tabella 1: Miscela di iniezione, composizione e funzioni plasmidi. La miscela di iniezione contiene plasmide di espressione CRISPR, plasmide donatore, pRF4 e pPD122.11 alle concentrazioni indicate, per un volume totale di 10 μL.
4. Carica e prepara l'ago di iniezione
- Tira i capillari di vetro in aghi di microiniezione utilizzando un estratore di ago configurato per produrre un lungo rastre con una punta affilata adatta all'iniezione gonadale.
NOTA: Ottimizzare empiricamente i parametri del puller. Parametri di partenza esempi: calore = 540, trazione = 20, velocità = 100.
ATTENZIONE: Maneggiare con attenzione gli aghi estratti per evitare forature. Usa le pinze quando maneggi aghi e getta gli aghi usati in un contenitore per oggetti taglienti. - Riscalda una micropipetta e scomponila in due pezzi per creare uno strumento di caricamento.
NOTA: Come alternativa possono essere usate punte di carico commerciali. - Attacca una lampadina aspiratrice in gomma all'estremità larga della micropipetta microcapillare accorciata.
- Aspirare circa 1 μL di miscela di iniezione chiarificata e sovrantato nel caricatore.
NOTA: Il volume esatto non è fondamentale. Assicurati che la soluzione riempia la punta dell'ago. - Inserisci il caricatore nella parte posteriore dell'ago di iniezione e dispensa delicatamente il mix di iniezione.
- Posiziona l'ago carico orizzontalmente per 10 minuti per permettere alla soluzione di depositarsi verso la punta e confermare una colonna continua.
- Monta l'ago sul microscopio a iniezione e porta la punta a fuoco usando ottica a campo chiaro.
- Apri la punta dell'ago toccandola delicatamente con il bordo di un mantello di copertura in olio halocarburo e prova il flusso di test.
NOTA: Regolare la pressione di iniezione (30–80 psi) per generare una bolla approssimativamente uguale al diametro della gonade entro 1 s16.
5. Prepara i vermi per l'iniezione
NOTA: Preparare le piastre del Mezzo di Crescita Nematodode (NGM) e il buffer M9 come descrittoin precedenza, 17. Mantenere vermi su piastre con Escherichia coli OP50 (d'ora in poi OP50) e eseguire iniezioni in background N2.
- Seleziona ermafroditi L4 da una piastra sana e incuba a 20 °C per 10 ore per ottenere giovani adulti con linee germinali ben sviluppate.
- Trasferire i vermi su un piatto non seminato per ridurre il trasferimento batterico.
- Prepara un tampone secco di agarosio al 2% su un vetrino di vetro e applica una goccia di olio halocarburico.
- Trasferisci un verme sul cuscinetto di agarosio usando un raccoglicciglia.
- Immobilizza il verme e orienta la gonade per l'iniezione.
ATTENZIONE: Completa le iniezioni entro 20–30 minuti per prevenire la disidratazione.
6. Eseguire microiniezione gonadale
Figura 2: Localizzazione del gonade distale sincizio per microiniezione in giovani adulti C. elegans hermaphrodites. (A) Immagine a basso ingrandimento in campo chiaro di un giovane adulto ermafrodita montato. Entrambi i bracci gonadi sono visibili; Il sito di iniezione è indicato per un braccio (freccia) come esempio rappresentativo. La regione in scatola segna l'area mostrata a ingrandimento maggiore nel pannello B. (B) Vista DIC a ingrandimento maggiore della gonade distale corrispondente alla regione in scatola nel pannello A. La freccia indica la posizione di iniezione all'interno del sincizio gonadale distale, dove viene somministrato il mix di iniezione. Barre di scala: 100 μm (A) e 20 μm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Individua un verme immobilizzato e identifica la gonade usando un obiettivo a basso ingrandimento.
- Posiziona l'ago usando i comandi del micromanipolatore.
- Orientare il verme a un angolo di 20–40° rispetto all'ago.
- Concentrati sulla linea germinale distale usando un ingrandimento più elevato.
- Avanza il verme verso l'ago e posiziona la punta all'interno del sincizio gonadale (Figura 2).
- Iniettare la soluzione e confermare l'erogazione tramite gonfiore visibile della gonade.
NOTA: Ottimizzare la pressione di iniezione (30–80 psi), la pressione di compensazione (0,1–0,5 psi) e la durata dell'iniezione (0,1–0,3 s).
ATTENZIONE: Pressione o volume eccessi possono causare la rottura dei vermi. - Ritira l'ago e riposiziona per le successive iniezioni.
NOTA: Eseguire un'iniezione unilaterale per massimizzare la sopravvivenza, oppure un'iniezione bilaterale per aumentare l'efficienza del montaggio. - Aggiungi un tampone M9 per rilasciare i vermi e trasferisci ciascun verme su una singola piastra di recupero.
- Ripeti le iniezioni per 20–25 vermi.
NOTA: Sostituire l'ago se si intasa o si danneggia. - Incubare i vermi iniettati a 20 °C per 2–3 giorni per permettere il recupero.
7. Selezionare i candidati F1 per identificare le linee knock-in positive
- Selezionare la progenie F1 per i marcatori di co-iniezione e selezionare animali positivi per marcatori.
NOTA: Esempi di marcatori alternativi di coiniezione fluorescente con diversa specificità tissutale e proprietà spettrali sono forniti nella Tabella Supplementare 1.
NOTA: Seleziona animali che esprimono entrambi i marcatori per una maggiore affidabilità. Dai priorità alle covate con alta frequenza di marcatore ("covate jackpot"). - Trasferire ogni verme F1 su una singola piastra e lasciare deporre le uova per 1–2 giorni.
- Lisare ogni verme F1 in un tampone di proteinasi K per preparare i modelli PCR.
NOTA: Conservare i lisati a −80 °C se non processati immediatamente. - Esegui la PCR tramite giunzione utilizzando un primer genomico esterno al braccio di omologia e un primer interno del tag.
NOTA: Conservare le piastre corrispondenti degli animali F1 PCR-positivi.
8. Selezionare la progenie F2 per isolare le linee knock-in omozigoti e confermare l'integrazione
- Isolare i discendenti F2 delle linee F1 PCR-positive su singole piastre.
- Permettere ai vermi F2 di produrre progenie e lisare gli adulti per la genotipazione.
NOTA: Conservare i lisati a −20 °C se necessario. - Eseguire la PCR utilizzando primer che affiancano i bracci di omologia per distinguere alleli di tipo selvatico e alleli knock-in in base alla dimensione del prodotto.
- Confermare la corretta integrazione tramite sequenziamento Sanger su entrambe le giunzioni di inserimento.
- Verifica l'espressione e la localizzazione della fluorescenza della linea germinale utilizzando la microscopia a fluorescenza.
- Espandere le linee omozigote confermate e mantenere le scorte.
NOTA: Linee validate da criopreservazione per conservazione a lungo termine.
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Risultati
Seguendo il protocollo, i giovani ermafroditi adulti sono stati microiniettati gonadalmente con un plasmide CRISPR/Cas9 (pDD162), un donatore di plasmide che codifica per un tag knock-in GFP affiancato da bracci di omologia di circa 1 kb (pPD95.75) e marcatori di co-iniezione (pRF4 e pPD122.11). Un gene bersaglio arricchito dalla linea germinale è stato utilizzato come esempio rappresentativo per generare un allele knock-in stabile e omozigote che riporta la localizzazione proteica sotto...
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Discussione
Questo flusso di lavoro è progettato per generare linee knock-in stabili e omozigoti in cui viene inserito un tag fluorescente al locus endogeno per segnalare la localizzazione proteica sotto controllo regolatorionativo 5,6,7,8,9,10. In pratica, il successo si valuta al meglio tramite una cat...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Key Research and Development Program della Cina (2023YFA1801100 a L.M.), della Natural Science Foundation of China (32400698 a P.W., 32270774 a L.M.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Beijing Lablead Biotech Co., Ltd. | QZ02 | Componente per la preparazione di piastre di agar NGM |
| Agarose | NOVON | ZZ14011 | Preparazione di pastiglie di agarose al 2% |
| Cenorhabditis elegans ceppo N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Ceppo di sfondo per iniezione | |
| Centrifughe | Eppendorf | 5425 | Chiarimento del mix per iniezione |
| Colesterolo | Beijing Chemical Reagents Company | 57-88-5 | Componente per la preparazione di piastre di agar NGM |
| Plasmidi per marcatori di co-iniezione rol-6 (su1006) (pRF4) | Guangshuo Ou Lab | Marcatore roller per arricchire i candidati | |
| Microscopio confocale | ZEISS | LSM880 + Airyscan | Convalida dell'espressione/localizzazione GFP |
| Di-Potassio idrogeno fosfato (K2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7758-11-4 | Componente per la preparazione di piastre di agar NGM |
| Di-Sodio idrogeno fosfato (Na2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7558-79-4 | Componente per la preparazione del buffer M9 |
| Scala di DNA | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF288-01 | Riferimento dimensionale per gel di agarose |
| Backbone plasmide donatore (pPD95.75) | Addgene | 1494 | Backbone per la costruzione del donatore HDR |
| Sistema di elettroforesi | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | 112-0630 | Separazione di ampliconi PCR su gel di agarose per lo screening delle giunzioni e il genotipizzazione della zigosi |
| Ceppo di Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Fonte di cibo per i vermi | |
| Plasmidi marcatori co-iniezione fluorescenti (pPD122.11) | Fire Lab | Co-marcatore GFP per arricchire i candidati | |
| Stereomicroscopio fluorescente | SOPTOP | SZX12-HT | Screening di vermi vivi per marcatori co-iniezione fluorescenti |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF079-plus-01 | Visualizzazione delle bande di DNA |
| Capillari di vetro | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Usati con il tira-aghi per realizzare aghi di iniezione |
| Olio di Halocarbon 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | Prevenzione dell'essiccamento durante l'iniezione |
| Incubatrice | Wuhan Ruihua Instrument & Equipment Co., Ltd. | HP400S | Mantenimento dei vermi a temperatura standard |
| Solfato di magnesio (MgSO4) | Sinapharm | CAS: 7487-88-9 | Componente per la preparazione di piastre di agar NGM e buffer M9 |
| Pipette microcapillari | KIMBLE | 71900-50 | Riscaldati e spezzati per creare lo strumento di caricamento |
| Unità microiniettore | Eppendorf | FemtoJet 4i | Erogazione di impulsi di pressione controllati di mix di iniezione nel gonade distale tramite un ago di microiniezione (attivato tramite pedaliera) |
| Vetrini di copertura per microscopio | Fisherbrand | 12545A 22×30-1 | Preparazione di pastiglie di agarose al 2% per il montaggio e l'immobilizzazione dei vermi durante la microiniezione; Apertura delle punte degli aghi di iniezione contro il bordo del vetrino |
| Microscopio per microiniezione | ZEISS | Axio Observer.A1 | Microscopio per iniezione |
| Tira-aghi | Sutter Instrument Company | Model P97 | Trasformazione di capillari di vetro in aghi di iniezione |
| Termociclatore PCR | Bio-Rad | C1000 Touch Thermal Cycler | Amplificazione PCR |
| pDD162 (Peft-3::Cas9 + sgRNA vuoto) | Addgene | 47549 | Espressione Cas9 + sgRNA |
| Peptone | Gibco | 308723 | Componente per la preparazione di piastre di agar NGM |
| Di-Potassio diidrogeno fosfato (KH2PO4) | Sinapharm | CAS: 7778-77-0 | Componente per la preparazione di piastre di agar NGM e buffer M9 |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sinapharm | CAS: 7647-14-5 | Componente per la preparazione di piastre di agar NGM e buffer M9 |
| Stereomicroscopio | Motic | K400L | Prelievo e montaggio dei vermi su pastiglie di agarose e esecuzione delle fasi di recupero post-iniezione |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
