Analisi di coorte pubbliche ed esperimenti basati su cellule gliomatiche identificano MRC2 come un marcatore di cattiva prognosi associato a una proliferazione aumentata, migrazione, invasione e cambiamenti legati alla β-catenina/EMT nel glioma.
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Articolo di ricerca
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Analisi di coorte pubbliche ed esperimenti basati su cellule gliomatiche identificano MRC2 come un marcatore di cattiva prognosi associato a una proliferazione aumentata, migrazione, invasione e cambiamenti legati alla β-catenina/EMT nel glioma.
Il glioma rimane una malignità letale del sistema nervoso centrale, e sono ancora necessari biomarcatori aggiuntivi che migliorino la stratificazione prognostica e informino l'esplorazione terapeutica. Questo studio ha valutato il recettore della mannosi tipo C (MRC2/Endo180) integrando coorti trascricdemiche pubbliche con la validazione in vitro . Profili di espressione e annotazioni cliniche abbinate sono stati ottenuti dal Cancer Genome Atlas (TCGA) e dal progetto Genotype-Tissue Expression (GTEx) per confronti tumore–normali e screening pan-tumore, e le associazioni prognostiche sono state ulteriormente esaminate nella coorte Chinese Glioma Genome Atlas (CGGA). L'espressione di MRC2 è stata valutata nelle linee cellulari gliomatiche tramite trascrizione inversa tramite PCR quantitativo (RT-qPCR) e immunoblotting, e il knockdown stabile di MRC2 è stato stabilito nelle cellule U87 e U251 utilizzando RNA a forcina corta lentivirale (shRNA). La crescita cellulare e la clonogenicità sono state valutate utilizzando CCK-8 e saghi di formazione di colonie, mentre migrazione e invasione sono state valutate tramite saggi a membrana porosa. I marcatori di transizione (EMT) β-catenina/epiteliale–mesenchimale (EMT) correlati a CDK4, CDK6 e sono stati analizzati tramite immunoblotting. Nei dataset, MRC2 era elevato nel glioma e un'espressione più elevata era associata a una peggiore sopravvivenza complessiva, sopravvivenza specifica per malattia e intervallo privo di progressione. In vitro, la deplezione di MRC2 ha ridotto proliferazione, clonogenicità, migrazione e invasione, accompagnata da una diminuzione dei livelli di proteine CDK4 e CDK6 e da cambiamenti nella β-catenina e nei marcatori correlati all'EMT. Insieme, questi risultati supportano MRC2 come biomarcatore prognostico candidato associato a fenotipi di glioma aggressivo e richiedono ulteriori indagini meccanicistiche e in vivo .
I gliomi rappresentano i tumori primari più comuni che si manifestano nel sistema nervoso centrale e rappresentano una frazione sostanziale delle neoplasieintracraniche 1,2. Gli studi epidemiologici stimano un'incidenza dell'ordine di pochi casi ogni 100.000 persone ogni anno, con differenze geografiche e di sesso segnalate trale popolazioni 3,4. Clinicamente, i gliomi abbracciano un ampio spettro di comportamento: i gliomi di grado inferiore possono seguire un percorso prolungato, mentre la malattia di alto grado—in particolare il glioblastoma—rimane rapidamente fatale per la maggior parte dei pazienti 5,6,7,8. Le moderne classificazioni OMS integrano l'istologia con caratteristiche molecolari chiave (ad esempio, mutazione IDH, alterazione del promotore TERT, metilazione del promotore MGMT e co-delezione 1p/19q), che affinano la diagnosi e informano la prognosi 9,10. Nonostante la gestione multimodale combini chirurgia, radioterapia e chemioterapia, la recidiva è comune e gli esiti a lungo termine per i tumori ad alto grado restano scarsi. Pertanto, identificare ulteriori indicatori prognostici e vulnerabilità mirabili rimane una priorità urgente.
MRC2 (recettore della mannosa tipo C 2; noto anche come Endo180/CD280/uPARAP) è un membro transmembrana della famiglia dei recettori della lectinadi tipo C 11. È arricchita nei compartimenti stromali e immunitari, come fibroblasti e macrofagi, e partecipa al ricambio della matrice extracellulare (ECM), al rimodellamento correlato alla fibrosi e alle interazioni tumore-microambiente12,13. Strutturalmente, MRC2 contiene una regione ricca di cisteina N-terminale, un dominio di fibronectina di tipo II che lega il collagene, diversi domini simili a lectine di tipo C, un segmento transmembrana e una codacitoplasmatica 14,15. Attraverso l'internalizzazione e la rimodellazione del collagene, MRC2 può facilitare la motilità cellulare e l'invasione tissutale, e un aumento di MRC2 è stato collegato a comportamenti aggressivi in diversi tumori, tra cui seno, pancreas, prostata, melanoma eglioblastoma 11,14,16,17,18 . Lavori precedenti suggeriscono anche collegamenti tra MRC2 e programmi di segnalazione pro-invasivi (ad esempio, vie associate al TGF-β), attività della metalloproteinasi della matrice e cambiamenti fenotipici simili a quelli EMT, oltre a ruoli negli stati associati a fibroblasti emacrofagi associati al cancro 17,18,19,20,21 . Tuttavia, il significato clinico di MRC2 nel glioma e le conseguenze funzionali della disregolazione di MRC2 nelle cellule gliomatiche rimangono poco chiari.
Sebbene MRC2 sia stato implicato nel rimodellamento della matrice extracellulare e nel comportamento invasivo in diverse neoplasie, il suo significato clinico nel glioma non è stato sistematicamente stabilito tra coorti trascrinomiche indipendenti, e i suoi effetti associati al fenotipo nelle cellule gliomase non sono stati valutati all'interno di un quadro integrato che combini analisi di dataset pubblici con validazione funzionale. Questo studio, quindi, ipotizzò che MRC2 sia associato a esiti clinici avversi e fenotipi maligni nel glioma. Per affrontare questa domanda, sono stati integrati esperimenti pan-cancerosi, validazione indipendente della coorte di glioma e esperimenti di knockdown stabile nelle linee cellulari gliomatiche per valutare il significato prognostico di MRC2 e la sua associazione con proliferazione, migrazione, invasione e cambiamenti nei marcatori correlati β-catenina/EMT. Poiché MRC2 appartiene alla famiglia dei recettori del mannosio e la progressione del glioma è anch'essa influenzata dal microambiente tumorale, è stata inclusa un'ulteriore analisi esplorativa dell'espressione di MRC1 in base allo stato IDH per fornire informazioni contestuali sulle differenze immunocompatibili tra i sottotipi di glioma.
La novità di questo lavoro risiede nella valutazione combinata di MRC2 su dataset pubblici di glioma e saghi funzionali in vitro , fornendo così evidenze cliniche ed esperimentali complementari della sua rilevanza nel glioma. Rispetto alle analisi a coorte singola o agli studi solo cellulari, questo flusso di lavoro integrato offre diversi vantaggi pratici. L'incorporazione di TCGA, GTEx e CGGA consente la validazione tra le coorti e riduce la dipendenza da un singolo dataset. Inoltre, l'accoppiamento di analisi di coorte pubblica con saghi di knockdown delle cellule gliomatiche collega associazioni cliniche a evidenze a livello fenotipico. Infine, l'uso di letture complementari, tra cui RT-qPCR, immunoblotting, CCK-8, formazione di colonie e saggi inseriti a membrana porosa, consente la valutazione parallela di cambiamenti trascrizionali, a livello proteico, proliferativo e correlato alla motilità. Il disegno complessivo dello studio e il flusso di lavoro analitico sono riassunti nella Figura 1. Insieme, questa strategia migliora la robustezza e l'interpretabilità biologica dei risultati rispetto agli approcci basati solo sulla bioinformatica o con un singolo saggio.
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Questo studio ha utilizzato dataset pubblici e de-identificati (TCGA, GTEx e CGGA) e ha consolidato linee cellulari commerciali. Non sono stati coinvolti partecipanti umani appena assunti, né informazioni identificabili del paziente, né campioni derivati dal paziente. Tutte le analisi sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali e internazionali pertinenti per l'uso dei dati pubblici. Pertanto, non è stata necessaria alcuna ulteriore approvazione etica istituzionale o consenso informato per questo studio.
1. Flusso di lavoro bioinformatico e preelaborazione dei dati
Profili di espressione genica e annotazioni cliniche abbinate sono stati ottenuti da risorse pubbliche, tra cui The Cancer Genome Atlas (TCGA), il progetto Genotype-Tissue Expression (GTEx) e il Chinese Glioma Genome Atlas (CGGA). Le matrici di espressione e i metadati clinici sono stati importati in R e armonizzati in base agli identificatori del campione. Sono stati rimossi i moduli duplicati o non corrispondenti e i campioni privi di informazioni essenziali sulla sopravvivenza sono stati esclusi dalle analisi di sopravvivenza. I valori di espressione di MRC2 e le corrispondenti variabili clinicopatologiche sono stati estratti per analisi a valle. Per i confronti tumore-normali, l'espressione di MRC2 è stata confrontata tra i tipi di cancro utilizzando dati solo TCGA quando erano disponibili tessuti normali corrispondenti e utilizzando dati integrati TCGA–GTEx quando erano necessari ulteriori controlli normali. Per le analisi focalizzate sul glioma, i pazienti nelle coorti TCGA-LGG e CGGA sono stati stratificati in gruppi ad alta e bassa espressione in base al livello mediano di espressione MRC2 della coorte. Sono poi state eseguite analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier, analisi della caratteristica operativa del ricevitore dipendente dal tempo (ROC) e regressione Cox a rischi proporzionali per valutare la rilevanza prognostica di MRC2. I modelli di Cox includevano covariate disponibili come età, sesso, grado OMS e altre variabili clinicopatologiche, a seconda della completezza dei dati all'interno di ciascuna coorte. Analisi di sottogruppi sono state effettuate in base a variabili tra cui età, sottotipo istologico, grado WHO, stato di mutazione IDH, stato di codelezione 1p/19q e informazioni correlate al trattamento, dove disponibili. Le figure sono state generate utilizzando i flussi di lavoro standard di graficazione statistica in R e GraphPad Prism.
2. Analisi dell'espressione e della sopravvivenza pan-tumorale
L'espressione di MRC2 è stata confrontata tra tumori e tessuti normali tra i tipi di cancro utilizzando i dataset TCGA e GTEx. Le differenze venivano visualizzate tramite diagrammi a scatola e riassunte tramite grafici radar. Sono state effettuate analisi di regressione dei rischi proporzionali di Cox per valutare le associazioni tra espressione e sopravvivenza complessiva (OS) di MRC2, sopravvivenza specifica per malattia (DSS) e intervallo senza progressione (PFI) tra i tipi di cancro. I rapporti di rischio e i relativi livelli di significatività sono stati visualizzati utilizzando grafici forestali e mappe termiche.
3. Validazione prognostica e analisi di sottogruppi nelle coorti di glioma
Nella coorte del glioma di grado inferiore della TCGA (TCGA-LGG), i pazienti sono stati stratificati in gruppi di espressione MRC2 ad alto e basso livello di espressione. Sono state effettuate analisi di sopravvivenza Kaplan–Meier per confrontare OS, DSS e PFI tra i gruppi. Sono state generate curve di funzionamento del ricevitore (ROC) dipendenti dal tempo per valutare le prestazioni predittive. Sono state condotte analisi di regressione di Cox univariate e multivariate per valutare il valore prognostico indipendente di MRC2. La validazione esterna è stata effettuata utilizzando il dataset del glioma CGGA, inclusa l'analisi di sopravvivenza di Kaplan–Meier, l'analisi ROC e la regressione di Cox. Sono state condotte analisi di sottogruppi per valutare l'espressione di MRC2 su variabili clinicopatologiche, inclusi età, grado tumorale, sottotipo istologico, stato di mutazione IDH, stato di codelezione 1p/19q e variabili correlate al trattamento.
4. Espressione di MRC1 nei gliomi mutanti IDH contro quelli di tipo selvatico IDH
L'associazione tra espressione di MRC1 e stato di mutazione IDH è stata valutata utilizzando la piattaforma web GlioVis e il dataset TCGA GBMLGG. I casi sono stati raggruppati in base allo stato annotato di IDH in gliomi mutanti IDH e di tipo selvatico IDH. L'espressione dell'mRNA di MRC1 è stata interrogata all'interno del dataset selezionato e i livelli di espressione tra i due gruppi sono stati confrontati utilizzando la funzione di analisi statistica integrata della piattaforma. Le distribuzioni di espressione per gruppo venivano visualizzate come generate dalla piattaforma, e la significanza statistica era definita come P < 0,05.
5. Coltura cellulare
Linee cellulari di glioma umano e astrociti umani normali sono stati ottenuti da depositi cellulari consolidati. Le cellule sono state coltivate nel mezzo d'Aquila modificato (DMEM) di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e mantenute a 37 °C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂ e circa il 95% di umidità relativa. Le cellule U87 e U251 sono state selezionate per esperimenti sulla perdita di funzionalità perché lo screening di base nel pannello delle cellule gliomate testate ha mostrato che queste due linee cellulari esprimevano livelli relativamente più alti di MRC2 e quindi erano adatte ad analisi funzionali basate su knockdown.
6. Knockdown lentivirale di MRC2
Gli RNA a gomino corto (shRNA) che mirano MRC2 e un controllo non targeting sono stati clonati in vettori lentivirali. Le particelle lentivirali sono state prodotte co-transfettando cellule HEK293T con plasmidi di trasferimento e imballando plasmidi utilizzando un reagente standard per la transfezione. I soprannatanti virali sono stati raccolti a 48 ore e 72 ore dopo la trasfezione, centrifugati a 2.100 × g per 5 minuti per rimuovere cellule di imballaggio e detriti cellulari, e poi passati attraverso un filtro da 0,45 μm prima dell'uso immediato o della conservazione a −80 °C 19. I soprannatanti contenenti virus venivano usati immediatamente o allicitati e conservati a −80 °C. Furono evitati cicli ripetuti di congelamento-disgelo. Le cellule gliomali sono state infettate da particelle lentivirali in presenza di polibrene. Dopo l'infezione, le cellule sono state selezionate con puromicina per stabilire linee cellulari stabili di eliminazione. Le sequenze utilizzate erano le seguenti: sh-MRC2-1: 5′-GAAATGAATGAGCAGCAAGAA-3′; sh-MRC2-2: 5′-CCGGTATTGCTATAAGGTT-3′; sh-NC: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′.
7. Validazione del knockdown di MRC2 tramite RT-qPCR e immunoblotting
L'RNA totale è stato estratto utilizzando il reagente TRIzol e il cDNA è stato sintetizzato utilizzando un kit di trascrizione inversa secondo le istruzioni del produttore. La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando la chimica SYBR Green nelle seguenti condizioni di cicli: denaturazione iniziale a 95 °C per 30 secondi, seguita da 40 cicli a 95 °C per 5 secondi e 60 °C per 30 secondi, con un'analisi della curva di dissociazione eseguita alla fine dell'amplificazione. Le sequenze di innesco erano le seguenti: MRC2 avanti, 5′-GGCAAGGAAGAAGTGCGTGT-3′; MRC2 retromarcia, 5′-CTTTGGTGACGTTGCTGCTGCTT-3′; GAPDH avanti, 5′-TCCACCCATGGCAATTCC-3′; e GAPDH inverso, 5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′. L'espressione relativa dell'mRNA è stata calcolata utilizzando il metodo comparativo Ct (2^-ΔΔCt) con GAPDH come controllointerno 20. L'immunoblotting è stata eseguita in parallelo per confermare il knockdown di MRC2 a livello proteico. Per la RT-qPCR, sono state analizzate tre repliche biologiche indipendenti e ogni campione è stato analizzato in triplicata tecnica.
8. Saggio di proliferazione cellulare
La proliferazione cellulare è stata valutata utilizzando il saggio CCK-8. Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzi a una densità adeguata e coltivate per i periodi di tempo indicati. Ad ogni momento temporale, il reagente CCK-8 veniva aggiunto a ogni pozzo e incubato secondo le istruzioni del produttore, dopodiché l'assorbanza a 450 nm veniva misurata utilizzando un lettore di microplacche. Sono state effettuate almeno tre repliche biologiche indipendenti.
9. Saggio sulla formazione della colonia
Le cellule sono state seminate a bassa densità in piastre a sei pozzi e coltivate per 10–14 giorni. Le colonie sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente e colorate con viola cristallino allo 0,1% per 15 minuti. Le colonie sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), essiccate all'aria e contate manualmente o utilizzando il software di analisi delleimmagini 21. Sono state effettuate almeno tre repliche biologiche indipendenti.
10. Saghi di migrazione e invasione cellulare
La migrazione e l'invasione cellulare sono state valutate utilizzando saggi a inserto dimembrana porosa 22. Per i saggi di invasione, gli inserti superiori erano pre-rivestiti con gel della matrice extracellulare; Per i test di migrazione venivano utilizzati inserti non rivestiti. Cellule sospese in un mezzo siero sono state aggiunte nella camera superiore, e il mezzo contenente siero è stato inserito nella camera inferiore come chemioattrante. Dopo l'incubazione, le cellule non migrate sulla superficie superiore della membrana sono state delicatamente rimosse con un cotton fibb. Le cellule che avevano migrato o invaso la superficie inferiore sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti, colorate con viola cristallino allo 0,1% per 15 minuti, risciacquate con soluzione salina tamponata a fosfato freddo, asciugate all'aria e imaggiate al microscopio rovesciato a un ingrandimento ×200. Le cellule sono state conteggiate in cinque campi microscopici selezionati casualmente per ogni inserto. Sono state effettuate almeno tre repliche biologiche indipendenti.
11. Analisi del western blot
Le cellule sono state lisate in un tampone RIPA integrato con inibitori della proteasi, e la concentrazione proteica è stata determinata tramite un saggio BCA. Quantità uguali di proteina totale sono state separate da SDS-PAGE e trasferite nelle membrane PVDF. Le membrane sono state bloccate nel latte scremato al 5% per 1 ora a temperatura ambiente e incubate con anticorpi primari durante la notte a 4 °C. I seguenti anticorpi primari e diluizioni operative sono stati utilizzati per il western blotting: anti-MRC2 (1:5.000), anti-CDK4 (1:1.000), anti-CDK6 (1:2.000), anti-β-catenina (1:5.000), anti-E-cadherin (1:10.000), anti-N-cadherina (1:3.000) e anti-β-actin (1:5.000). Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari anti-IgG anti-topo o anti-coniglio IgG coniugati con perossidasi di rafano (1:5.000) per 1 ora a temperatura ambiente. I segnali venivano visualizzati tramite chemiluminescenza, e le intensità delle bande venivano quantificate e normalizzate a β-actina. Sono state effettuate almeno tre repliche biologiche indipendenti.
12. Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando R e GraphPad Prism. Le curve di sopravvivenza sono state confrontate utilizzando il test log-rank. Sono stati utilizzati modelli di regressione dei rischi proporzionali di Cox per analisi univariate e multivariate. Per gli esperimenti basati su cellule, i dati sono presentati come media ± SD. Prima dei test parametrici, la normalità veniva valutata utilizzando il test di Shapiro–Wilk. Per i dati normalmente distribuiti, le differenze tra due gruppi sono state valutate utilizzando il test t di Student, e sono stati effettuati confronti tra più gruppi utilizzando ANOVA unidirezionale. Se le assunzioni di normalità non venivano soddisfatte, venivano utilizzati i corrispondenti test non parametrici. I valori di P sono stati aggiustati per test multipli utilizzando la procedura Benjamini–Hochberg del tasso di false discovery23,24. Una P a due facce < 0,05 è stata considerata statisticamente significativa.
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Gli autori riportano che non ci siano interessi concorrenti.
Questo lavoro ha ricevuto supporto finanziario dal Fondo di Ricerca in Scienza e Tecnologia Medica della Provincia del Guangdong (n. A2024508), dal programma provinciale Science and Technology Expert Workstation presso l'Ospedale Centrale del Popolo di Huizhou, e dal Huizhou Science and Technology Innovation and Entrepreneurship Leading Talent Project (n. 2025EQ050012).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-CDK4 | Proteintech Group, Inc., USA | 11026-1-AP | Anticorpo primario per il western blotting. RRID: AB_2078702. |
| Anticorpo anti-CDK6 | Proteintech Group, Inc., USA | 66278-1-IG | Anticorpo primario per il western blotting. RRID:AB_2881661. |
| anticorpo anti-E-cadherina | Proteintech Group, Inc., USA | 20874-1-AP | Anticorpo primario per il western blotting. RRID:AB_10697811. |
| Anticorpo anti-MRC2 | Proteintech Group, Inc., USA | 86028-1-RR | Anticorpo primario per il western blotting. RRID:AB_2879692. |
| Anticorpo anti-N-cadherina | Proteintech Group, Inc., USA | 22018-1-AP | Anticorpo primario per il western blotting. RRID:AB_2813891. |
| Anticorpo anti-β-actin | Proteintech Group, Inc., USA | 66009-1-IG | Anticorpo di controllo del carico per il western blotting. RRID: AB_2687938. |
| Anticorpo anti-β-catenina | Proteintech Group, Inc., USA | 51067-2-AP | Anticorpo primario per il western blotting. RRID: AB_2086128. |
| Kit per il test proteico BCA | Beyotime Biotechnology, Cina | P0012 | Kit di analisi proteica BCA per la determinazione della concentrazione proteica. |
| Kit di conteggio delle celle-8 (CCK-8) | Laboratori Dojindo, Giappone | CK04-500T | Saggio di vitalità/proliferazione cellulare. |
| Sistema di imaging a chemiluminescenza | Uvitec Limited, Francia | Manuale Avanzato Alleanza Q9 | Sistema di acquisizione di immagini per il rilevamento del western blot. |
| Incubatore CO2 | Apparecchiature generiche di laboratorio | Non specificato | Incubatore umidificato CO2 utilizzato per la coltura cellulare a 37 °C; C e 5% CO2. |
| Soluzione viola cristallina (0,1%) | Beyotime Biotechnology, Cina | C0121-100 mL | Soluzione di colorazione viola cristallina usata a una concentrazione di lavoro dello 0,1%. |
| DMEM, glucosio alto | Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA | C11995500BT | Mezzo basale per la coltura cellulare del glioma. |
| Siero fetale bovino (FBS) | ExCell Bio, Cina | FSP500 | Integratore siero per coltura cellulare. |
| GlioVis | gliovis.bioinfo.cnio.es | Non applicabile | Piattaforma web per la visualizzazione e l'analisi di dataset sull'espressione dei tumori cerebrali, in particolare i gliomi. |
| GraphPad Prism | Software GraphPad, USA | Versione 10.4.0 | Software per analisi statistica e grafici. RRID: SCR_002798. |
| HEK293T celle | Collezione di Cultura dei Tipi dell'Accademia Cinese delle Scienze, Shanghai, Cina | GNHu43 | Linea cellulare di imballaggio utilizzata per la produzione di lentivirali. RRID:CVCL_0063. |
| IgG Anti-Topo per Capra (H+L) coniugato con HRP | Proteintech Group, Inc., USA | SA00001-1 | Anticorpo secondario per il western blotting. RRID: AB_2722565. |
| IgG Anti-Coniglio di Capra (H+L) coniugato con HRP | Proteintech Group, Inc., USA | SA00001-2 | Anticorpo secondario per il western blotting. RRID: AB_2722564. |
| Astrociti umani | Collezione di Cultura dei Tipi dell'Accademia Cinese delle Scienze, Shanghai, Cina | Non disponibile al pubblico | Astrociti umani normali usati come controllo non tumorale; numero di catalogo non disponibile pubblicamente. |
| Microscopio rovesciato | Apparecchiature generiche di laboratorio | Non specificato | Microscopio rovesciato utilizzato per l'acquisizione di immagini in saggi di migrazione e invasione. |
| Matrice matrigel | Corning, USA | 354234 | La matrice di membrana del basale utilizzata per rivestire gli inserti per gli saggi di invasione. |
| Lettore di microplacche | Apparecchiature generiche di laboratorio | Non specificato | Lettore di microplacche utilizzato per la misurazione dell'assorbanza a 450 nm negli saghi CCK-8. |
| PAGE Kit di preparazione gel, 10% | EpiZyme, Cina | PG212 | Kit di preparazione gel SDS-PAGE. |
| Kit di preparazione gel PAGE, 7,5% | EpiZyme, Cina | PG111 | Kit di preparazione gel SDS-PAGE. |
| Soluzione di paraformaldeide (4%) | Beyotime Biotechnology, Cina | P0099-100 mL | 4% di fissatore paraformaldeide per la formazione delle colonie e per i saggi di migrazione/invasione. |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA | 15140163 | Integratore antibiotico per colture cellulari. |
| Polybrene | Beyotime Biotechnology, Cina | C0351-1 mL | Soluzione di bromuro di esadimetrina (10 mg/mL) utilizzata per facilitare la trasduzione lentivirale. |
| Marcatore proteico prestained | Elabscience, Cina | E-IR-R331 | Marcatore di peso molecolare delle proteine. |
| Kit di reagenti PrimeScript RT | Takara Bio Inc., Giappone | RR047A | Kit di trascrizione inversa per la sintesi del cDNA. |
| Puromicina | Beyotime Biotechnology, Cina | ST551-10 mg | Puromicina diidrocloruro utilizzata per la selezione di cellule stabili di knockdown. |
| Membrana PVDF | Beyotime Biotechnology, Cina | FFP20 | Membrana PVDF idrofila (0,45 & micro; m) per il trasferimento di western blot. |
| R | R Foundation for Statistical Computing, Austria | Versione 4.5.1 | Ambiente di calcolo statistico utilizzato per analisi bioinformatiche. RRID: SCR_001905. |
| Buffer di lisi RIPA | Beyotime Biotechnology, Cina | P0013B | RIPA lysis buffer (forte) per l'estrazione proteica. |
| Buffer di caricamento SDS-PAGE (5 volte e volte) | Beyotime Biotechnology, Cina | P0015L | Buffer di caricamento campioni di proteine. |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Bio Inc., Giappone | RR066A | Master mix qPCR. |
| Inserti Transwell, 8.0-& micro; m dimensione dei pori | Corning, USA | 3422 | Inserti in coltura cellulare con 8.0 & micro; membrana policarbonatica di dimensione m; Formato standard a 24 pozzi per saggio di migrazione e invasione. |
| Reagente Trizol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA | 10296010CN | Reagente di estrazione di RNA. |
| Cellule gliomali U251 | Collezione Nazionale di Colture Cellulari Autenticate, Cina | SCSP-559 | Linea cellulare di glioma umano utilizzata per saghi di knockdown e funzionali. RRID: CVCL_0021. |
| Cellule gliomatiche U87 | Collezione Nazionale di Colture Cellulari Autenticate, Cina | SCSP-5432 | Linea cellulare di glioma umano utilizzata per saghi di knockdown e funzionali. RRID:CVCL_0022. |