Effetti della regolazione dell'espressione di SPRY2 e miR-590-5p sull'autofagia nei condrociti modello di osteoartrite umana

Sommario

Lo stress infiammatorio in un modello di condrociti C28/I2 indotto da IL-1β ha aumentato miR-590-5p e ridotto l'espressione di SPRY2. La modulazione di questo asse ha alterato l'espressione di Beclin-1, LC3-II e Bcl-2, suggerendo una possibile via regolatoria miR-590-5p/SPRY2 che potrebbe influenzare le risposte associate all'autofagia e la sopravvivenza dei condrociti nell'osteoartrite.

Abstract

L'osteoartrite (OA) è una malattia degenerativa articolare diffusa caratterizzata da una progressiva distruzione della cartilagine e dalla perdita dell'omeostasi dei condrociti. Sebbene l'autofagia disregolata contribuisca alla patogenesi dell'OA, i meccanismi molecolari che governano le risposte associate all'autofagia nei condrociti rimangono incompletamente compresi. Questo studio ha indagato il ruolo dell'asse regolatore miR-590-5p/SPRY2 in un microambiente infiammatorio di OA utilizzando condrociti umani C28/I2 indotti da IL-1β. Un modello OA in vitro è stato stabilito trattando le cellule C28/I2 con IL-1β. L'espressione di miR-590-5p e SPRY2 è stata valutata utilizzando PCR quantitativa e Western blotting. Sono stati impiegati approcci di guadagno e perdita di funzione per valutare gli effetti di SPRY2 e miR-590-5p sui marcatori associati all'autofagia Beclin-1 e LC3-II, così come sulla proteina correlata alla sopravvivenza Bcl-2. Analisi bioinformatiche ed esperimenti di salvataggio sono stati utilizzati per indagare la relazione regolatoria tra miR-590-5p e SPRY2. Il trattamento con IL-1β ha aumentato significativamente l'espressione di miR-590-5p riducendo al contempo i livelli di mRNA e proteine SPRY2 (P < 0,05). La sovraespressione di SPRY2 ha ridotto notevolmente l'espressione di Beclin-1 e LC3-II, con riduzioni rispettivamente di circa il 65% e il 77% (P < 0,05). Al contrario, la sovraespressione di miR-590-5p ha aumentato l'espressione di Beclin-1, LC3-II e Bcl-2, mentre l'inibizione di miR-590-5p ha invertito questi effetti e ripristinato l'espressione di SPRY2. Le analisi funzionali supportavano SPRY2 come possibile obiettivo regolatorio a valle del miR-590-5p. Questi risultati identificano l'asse miR-590-5p/SPRY2 come un importante regolatore dell'espressione dei marcatori associati all'autofagia e della sopravvivenza dei condrociti in condizioni infiammatorie, suggerendo la sua potenziale rilevanza come bersaglio terapeutico nell'OA.

Introduzione

Essendo la forma di artrite più diffusa a livello mondiale, l'osteoartrite (OA) è una delle principali cause di dolore, disabilità della mobilità e disabilità fisica, imponendo un onere significativo ai sistemi sanitari e alla^{società 1}. Patologicamente, l'OA è caratterizzata da progressiva degenerazione della cartilagine articolare, infiammazione sinoviale e rimodellamento patologico dell'osso^{sottocondrale 1}. Le stime epidemiologiche indicano che circa 303 milioni di persone nel mondo sono colpite dall'OA, e questo numero dovrebbe aumentare con l'invecchiamento della popolazione e l'aumento dei tassi di^{obesità 2}. In Cina, la prevalenza dell'OA sintomatica al ginocchio è stimata all'8,1%, con una prevalenza sproporzionatamente più alta tra donne e popolazioni^{rurali 3}. Nonostante l'alta prevalenza, le opzioni di trattamento attuali rimangono in gran parte limitate alla gestione dei sintomi tramite farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) e interventi chirurgici per la malattia^{avanzata 4}. L'assenza di farmaci modificanti per l'osteoartrite (DMOAD) riflette una comprensione incompleta dei meccanismi molecolari che regolano l'omeostasi e la sopravvivenza dei^{condrociti 5}.

L'integrità strutturale e funzionale della cartilagine articolare dipende dai condrociti residenti, che mantengono il ricambio della matrice extracellulare (ECM) attraverso un equilibrio tra attività anaboliche e^{cataboliche 6}. Durante la progressione dell'OA, i condrociti sono esposti a stress meccanico anomalo e a mediatori pro-infiammatori, in particolare interleuchina-1β (IL-1 β) e fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), che favoriscono uno spostamento dalla sintesi matriciale alla degradazione^{matriciale 6}. L'IL-1 β contribuisce alla distruzione della cartilagine stimolando la produzione di metalloproteinasi della matrice (MMP) e aggrecanasi, sopprimendo la sintesi di collagene di tipo II e^{proteoglicani 7}. Inoltre, l'IL-1β induce stress ossidativo e disfunzione mitocondriale, portando all'apoptosi dei condrociti e^{alla senescenza 8}. Di conseguenza, identificare vie di segnalazione intracellulare che regolano la sopravvivenza dei condrociti in condizioni infiammatorie rimane una priorità per la ricerca sull'OA.

L'autofagia è una via di degradazione lisosomica conservata evolutivamente che mantiene l'omeostasi cellulare attraverso la rimozione e il riciclo di organelli danneggiati e aggregati^{proteici 9}. L'autofagia basale è essenziale per la sopravvivenza cellulare e l'equilibrio energetico; tuttavia, una disregolazione dell'autofagia può contribuire alla progressione della^{malattia 9}. Nell'OA, l'autofagia è generalmente considerata una risposta protettiva che aiuta i condrociti ad adattarsi allo stress cellulare e a resistere all'apoptosi¹⁰. Studi precedenti hanno suggerito che l'attività autofagica diminuisce durante la progressione dell'OA, in particolare nelle malattie in stadio avanzato, causando un controllo cellulare della qualità compromesso e una maggiore perdita di^{condrociti 11}. Diverse proteine sono comunemente utilizzate come indicatori dell'attività associata all'autofagia. Beclin-1 partecipa all'inizio degli autofagosomi, mentre la conversione della proteina 1 associata ai microtubuli della catena leggera 3 (LC3-I in LC3-II) è ampiamente utilizzata come indicatore della formazione^{dell'autofagosoma 12}. Al contrario, il linfoma a cellule B 2 (Bcl-2) inibisce l'autofagia dipendente da Beclin-1 esercitando anche effetti anti-apoptotici¹³. Tuttavia, l'interpretazione dei marcatori associati all'autofagia richiede cautela perché le misurazioni statiche di LC3-II e Beclin-1 non possono distinguere in modo indipendente la formazione aumentata di autofagosomi dalla degradazione lisosomale compromessa. Nonostante queste limitazioni, la modulazione delle vie correlate all'autofagia rimane una strategia terapeutica promettente per l'OA.

I microRNA (miRNA) sono RNA brevi e non codificanti che regolano l'espressione genica post-trascrizionale legandosi a sequenze complementari all'interno delle regioni 3′-non tradotte (3′-UTR) degli RNA messaggeri bersaglio, causando degradazione o repressione traslazionale^{dell'mRNA 14}. L'espressione aberrante di miRNA è stata implicata nella patogenesi dell'OA attraverso effetti su infiammazione, apoptosi e rimodellamento^{ECM 15}. Tra queste molecole, il miR-590-5p ha attirato l'attenzione per i suoi ruoli regolatori nel metabolismo osseo e in altri processi patologici. Studi precedenti hanno dimostrato che miR-590-5p promuove la differenziazione osteogenica e sopprime l'adipogenesi nelle cellule staminali^{mesenchimali 16}. Nei modelli oncologici, il miR-590-5p presenta funzioni dipendenti dal contesto come regolatore oncogenico o soppressore^{del tumore 17}. Inoltre, profili alterati di espressione di microRNA, inclusi membri della famiglia miR-590, sono stati implicati nella rimodellazione patologica dei tessuti articolari durante^{l'OA 18}. Tuttavia, le evidenze ottenute da modelli di cellule staminali o tumorali non possono essere estrapolate direttamente ai condrociti articolari maturi. Pertanto, il ruolo di miR-590-5p nella regolazione delle risposte dei condrociti all'interno del microambiente infiammatorio dell'OA rimane incompletamente compreso.

Per indagare i potenziali meccanismi a valle del miR-590-5p nell'OA, sono state effettuate analisi di previsione dei bersagli in silico , identificando Spro/Sproty2 (SPRY2) come possibile bersaglio a valle. SPRY2 appartiene alla famiglia di proteine Sprouty, che regolano negativamente la segnalazione della tirosina chinasi recettore e sopprimono l'attivazione della via RAS/MAPK/^{ERK 19}. Poiché la segnalazione MAPK influenza la differenziazione dei condrociti, le risposte infiammatorie e l'autofagia, SPRY2 può rappresentare un importante nodo regolatore nella fisiopatologia^{dell'OA 20}. Studi precedenti indicano che SPRY2 può sopprimere le risposte infiammatorie nei modelli di artrite^{reumatoide 21}, partecipare alla regolazione correlata all'apoptosi nei sistemi^{epiteliali 22} ed è associato a risposte legate all'autofagia nei modelli di lesioni ischemiche²³. Sebbene queste osservazioni suggeriscano che SPRY2 partecipi alla regolazione sia dell'apoptosi che dell'autofagia, il suo ruolo nei condrociti articolari rimane poco caratterizzato. È stato quindi ipotizzato che miR-590-5p e SPRY2 costituiscano un asse regolatore che influenza la sopravvivenza dei condrociti sotto stress infiammatorio.

Sulla base di queste osservazioni, è stato proposto che miR-590-5p moduli le risposte associate all'autofagia nei condrociti regolando l'espressione di SPRY2. Sebbene miR-590-5p e SPRY2 siano stati studiati individualmente in altri contesti biologici, la loro relazione funzionale nei condrociti OA non è stata stabilita. Nel presente studio, un modello OA indotto da IL-1β in condrociti umani C28/I2 è stato utilizzato per esaminare i modelli di espressione di miR-590-5p e SPRY2 e per valutarne gli effetti sull'espressione di Beclin-1, LC3-II e Bcl-2. Indagando l'asse regolatorio miR-590-5p/SPRY2, questo studio fornisce una comprensione dei meccanismi epigenetici alla base della sopravvivenza dei condrociti e identifica un potenziale bersaglio terapeutico per l'OA.

Protocollo

Questo studio è stato condotto esclusivamente utilizzando la linea cellulare di condrociti umani C28/I2, disponibile in commercio. Nessun partecipante umano, campioni di tessuto umano, materiali derivati dal paziente o animali vivi sono stati coinvolti in questa ricerca. Pertanto, l'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB) e dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) non erano richieste in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali. Gli strumenti, i prodotti chimici, i kit e i reagenti utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura cellulare e costruzione di modelli OA

La linea cellulare di condrociti umani C28/I2 (dettagli forniti nella Tabella dei Materiali) è stata ottenuta da un fornitore commerciale. Per garantire la riproducibilità sperimentale, le cellule sono state autenticate tramite profilazione a breve ripetizione tandem (STR) e testate regolarmente per confermare l'assenza di contaminazione da micoplasmi. Le celle tra i passaggi 3 e 8 sono state utilizzate per tutti gli esperimenti. Le cellule sono state mantenute nel DMEM integrate con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (tutti i reagenti di coltura sono dettagliati nella Tabella dei Materiali) a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di_CO2.

Per stabilire il modello in vitro dell'osteoartrite (OA), le cellule C28/I2 sono state stimolate con IL-1β umano ricombinante. Sulla base della letteratura^{consolidata 6,7}, esperimenti preliminari di ottimizzazione dose-risposta progettati per indurre uno stato catabolico robusto senza eccessiva citotossicità immediata, le cellule sono state trattate con 20 ng/mL di IL-1β per 24 ore.

2. Raggruppamento sperimentale e trasfezione

Per chiarire le vie meccanicistiche, lo studio è stato suddiviso in tre principali moduli sperimentali, ciascuno con almeno tre repliche biologiche indipendenti:

1. Guadagno/Perdita di funzione SPRY2:
   Le cellule furono assegnate a Controllo, modello OA, OA + vettore vuoto (NC), plasma di sovraespressione OA + SPRY2 (OE-SPRY2) e corrispondenti piccoli gruppi RNA interferenti (si-NC e tre costrutti specifici si-SPRY2: si-695, si-800, si-896) per verificare l'efficienza delle interferenze.
2. Modulazione miR-590-5p:
   Le cellule sono state suddivise in gruppi Controllo, modello OA, OA + mimica NC, OA + miR-590-5p mimetico, OA + inibitore NC e OA + miR-590-5p inibitori.
3. Validazione funzionale della relazione regolatoria miR-590-5p/SPRY2:
   Per valutare ulteriormente la relazione regolatoria proposta tra miR-590-5p e SPRY2, le cellule sono state sottoposte a condizioni miMiche e inibitrici di miR-590-5p per determinare se la modulazione miR-590-5p alterasse l'espressione di SPRY2 nel modello OA.
   Per la trasfezione, le cellule C28/I2 sono state seminate in piastre a 6 pozzi a 2 × 10^{5 celle} per pozzo. Al raggiungimento della confluenza del 70%–80%, le trasfezioni sono state eseguite utilizzando un reagente commerciale a base di lipidi secondo il protocollo del produttore e procedure stabilite per la somministrazione di piccoli RNA nei^{condrociti 24}. Per un breve periodo, plasmidi (OE-SPRY2 e NC; 2 μg/pozzo) e oligonucleotidi (miR-590-5p mimic/inibitore e siRNA; 50 nM) sono stati diluiti in un mezzo siero ridotti. I complessi lipidi-DNA/RNA sono stati incubati a temperatura ambiente per 15 minuti prima di essere aggiunti a goccia alle cellule in DMEM senza siero. A 6 ore dalla trasfezione, il mezzo veniva sostituito con DMEM completo contenente il 10% di FBS, e le cellule venivano coltivate per ulteriori 48 ore prima dell'estrazione di RNA e proteine.

3. rilevamento qPCR

L'RNA totale e il miRNA sono stati isolati utilizzando un kit dedicato di estrazione dei miRNA secondo il protocollo del produttore. La purezza e la concentrazione di RNA sono state valutate utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis, e campioni con rapporti A260/A280 di 1,8–2,0 sono stati utilizzati per analisi a valle. Reagenti commerciali a trascrizione inversa venivano utilizzati per sintetizzare cDNA. La procedura di ciclaggio qPCR è stata la seguente: 95 °C per 10 minuti; 40 cicli a 95 °C per 10 s, 58 °C per 30 s e 72 °C per 30 s; seguita dall'analisi della curva di fusione per verificare la specificità dell'innesto e l'assenza di dimeri insettori. β-actina e U6 servivano rispettivamente come controlli interni per mRNA e miRNA. L'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo ^{2-ΔΔCt 25}. Tutte le sequenze di innesco, incluse quelle per Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p e geni di riferimento, sono elencate nella Tabella 1.

Nome di guida	Primer anteriore (5′-3′)	Primer inverso (5′-3′)
U6	ATTGGAACGATACAGAAGATT	GGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5p	GCGTAAGGCACGCGGTG	AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actin	TGGCACCCAGCACAATGAA	CTAAGTCATAGTCCCCCCTAGAAGCA
SPRY2	TAAGCCACTGAGCAAGGAAGAT	TGGAAGGTAACACCATAAAAAGG
Bcl-2	TGGGATTCCTGCGGATTGAC	TCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1	TCCCGTGGAATGGAATGAGA	GTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTCTG
LC3-II	CATCCAACCAAAATCCCGGT	GAGCTGTAAGCGCCTTTTTTAA

Tabella 1: Sequenze di primer utilizzate per l'analisi quantitativa PCR (qPCR). Sequenze di primer forward e back utilizzate per l'amplificazione e quantificazione dei trascritti target e i controlli interni di riferimento tramite qPCR.

Salvo diversa specificazione, i dati sono espressi come deviazione media ± standard (SD). La significatività statistica è stata determinata utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc S-N-K. I simboli indicano: *P < 0,05 vs. Control; #P < 0,05 rispetto al modello indicato o al gruppo di controllo negativo; &P < 0,05 vs. OA+Inibitore-NC.

4. Rilevamento del western blot

Le cellule sono state prelevate e lisate utilizzando un tampone RIPA integrato con cocktail di proteasi e inibitori della fosfatasi, seguendo procedure consolidate di estrazione proteica e immunoblotting. Dopo la centrifugazione a 14.000 × g per 15 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari, il soprantantante è stato raccolto e le concentrazioni proteiche sono state quantificate utilizzando un kit di analisi proteica BCA. Quantità uguali di lisato proteico (30 μg) sono state denaturate, risolte da SDS-PAGE per 1,5 ore e trasferite sulle membrane PVDF a 300 mA per 1,5 ore^{e 26}. Le membrane sono state bloccate con latte secco al 5% di scremito in soluzione salina Tween 20 (TBST) con tampone tris-buffer contenente 0,1% Tween 20 (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente, seguita da incubazione a 4 °C per 16 ore con anticorpi primari specifici (ad esempio, anti-SPRY2, diluizione 1:1000). Dopo tre lavaggi in TBST, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con HRP appropriati a temperatura ambiente per 2 ore. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un sistema di rilevamento ECL e quantificate tramite il software ImageJ.

5. Analisi statistica

I dati sono stati analizzati utilizzando software di analisi statistica. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con almeno tre repliche biologiche indipendenti (n ≥ 3), e i dati quantitativi sono presentati come la media ± deviazione standard (SD). Prima dei test parametrici, la normalità dei dati veniva valutata utilizzando il test di Shapiro-Wilk e veniva misurata l'omogeneità della varianza. La significatività statistica tra più gruppi è stata valutata utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), seguita dal test post hoc Student-Newman-Keuls (S-N-K) per confronti multipli. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Stabilimento del modello infiammatorio dei condrociti in vitro

Per indagare i meccanismi molecolari alla base della patologia dell'osteoartrite, è stato stabilito un modello infiammatorio in vitro utilizzando condrociti umani C28/I2 stimolati con IL-1β. La validità di questo modello è stata confermata valutando l'espressione della catena alfa-1 di tipo II (Col-II), componente principale della matrice extracellulare della cartilagine ialina e caratteristica dei condrociti sani. L'analisi quantitativa ha rivelato che l'esposizione a IL-1β ha portato a una riduzione statisticamente significativa dell'espressione dell'mRNA Col-II rispetto al gruppo di controllo. Questa alterazione fenotipica indica un primo spostamento verso uno stato catabolico simile al microambiente osteoartritico, fornendo così un modello fondamentale per studi meccanicistici successivi (Figura 1).

Figura 1: Stabilimento del modello in vitro di osteoartrite (OA) nei condrociti umani C28/I2. Le cellule sono state trattate con 20 ng/mL di IL-1β per 24 ore. L'espressione relativa dell'mRNA di Col-II è stata determinata tramite qPCR, con β-actin che fungeva da controllo di normalizzazione. I dati sono presentati come la media ± deviazione standard (SD) da tre repliche biologiche indipendenti (n = 3). L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando ANOVA unidirezionale. *P < 0,05 rispetto al gruppo di controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Validazione dell'efficienza di sovraespressione SPRY2 nelle celle C28/I2

Prima di valutare il ruolo funzionale di Sprouty2 (SPRY2) in questo modello, è stata verificata l'efficienza di trasfezione del vettore di sovraespressione SPRY2. I condrociti sono stati trasfettati con il plasmide di sovraespressione (OE) o con un vettore vuoto di controllo negativo (NC). Sia le analisi qPCR che quelle Western blot hanno mostrato una robusta regolazione all'alto di SPRY2 ai livelli di mRNA e proteine nel gruppo OE rispetto ai gruppi NC e non trattati. Questi dati, presentati nella Figura 2, confermano che il sistema sperimentale ha mantenuto livelli elevati di SPRY2, consentendo di indagare sui suoi specifici effetti biologici.

Figura 2: Validazione della sovraespressione di SPRY2 nei condrociti C28/I2. Le cellule sono state trasfettate con un vettore vuoto (NC) o con un plasmide di sovraespressione SPRY2 (OE). I livelli relativi di mRNA e proteine di SPRY2 sono stati valutati rispettivamente tramite qPCR e Western blot. β-actina veniva utilizzata come controllo interno del carico. I dati sono espressi come media ± SD (n = 3). *P < 0,05 rispetto al gruppo NC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La sovraespressione di SPRY2 attenua l'autofagia e modula i marcatori dell'apoptosi in condizioni infiammatorie

Esperimenti successivi hanno cercato di determinare se SPRY2 funzioni come regolatore di autofagia e apoptosi nel contesto infiammatorio. Dopo l'istituzione del modello OA, il trattamento con IL-1β da solo ha indotto un marcato aumento dei marcatori autofagici Beclin-1 e LC3-II, suggerendo una risposta autofagica compensativa allo stress infiammatorio. Contemporaneamente, l'espressione di Bcl-2 era elevata nel gruppo modello. Tuttavia, l'introduzione del vettore di sovraespressione SPRY2 ha modificato significativamente questo profilo. Come mostrato nella Figura 3, il gruppo Model+OE-SPRY2 ha mostrato una significativa riduzione sia dei livelli di mRNA di Beclin-1 che di LC3-II rispetto ai gruppi Model e Model+NC. Inoltre, la sovraespressione di SPRY2 ha attenuato l'elevazione indotta dall'infiammazione di Bcl-2. Questi risultati suggeriscono che SPRY2 regola negativamente l'espressione dei marcatori associati all'autofagia nei condrociti infiammatori.

Figura 3: La sovraespressione di SPRY2 attenua l'autofagia e modula i marcatori di apoptosi in condizioni infiammatorie indotte da IL-1β. I livelli relativi di espressione dell'mRNA di SPRY2, Bcl-2, Beclin-1 e LC3-II sono stati quantificati tramite qPCR nei gruppi Control, Model (trattato con IL-1β), Model+NC e Model+OE-SPRY2. β-actin fungeva da controllo interno. I dati sono presentati come media ± SD (n = 3). La significatività statistica è stata determinata tramite ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc S-N-K. *P < 0,05 rispetto al gruppo di controllo; #P < 0,05 rispetto al gruppo Model+NC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

miR-590-5p regola al rialzo i marcatori associati all'autofagia e promuove la sopravvivenza dei condrociti

Successivamente, è stato indagato l'impatto funzionale di miR-590-5p sui marcatori associati all'autofagia e alla sopravvivenza. Come mostrato nella Figura 4, la trasfezione con un mimetico miR-590-5p nel modello OA ha aumentato significativamente l'espressione di Bcl-2, Beclin-1 e LC3-II, in contrasto con gli effetti inibitori osservati dopo la sovraespressione di SPRY2. Al contrario, l'inibizione di miR-590-5p ridusse notevolmente l'espressione di Bcl-2 e Beclin-1, mentre la riduzione di LC3-II non raggiunse significatività statistica. Questi risultati suggeriscono che miR-590-5p aumenta l'espressione dei marcatori associati all'autofagia e del Bcl-2 correlato alla sopravvivenza nei condrociti, richiedendo ulteriori indagini sui potenziali obiettivi regolatori a valle.

Figura 4: miR-590-5p aumenta l'espressione dei marcatori associati all'autofagia e l'espressione di Bcl-2 correlata alla sopravvivenza. I livelli relativi di espressione di mRNA di Bcl-2, Beclin-1 e LC3-II sono stati misurati tramite qPCR nel modello OA dopo la trasfezione con un mimetico miR-590-5p, un inibitore o i rispettivi controlli negativi (NC). β-actina fungeva da controllo di normalizzazione. I dati sono mostrati come media ± SD (n = 3). *P < 0,05 rispetto al gruppo Model+Mimic-NC; #P < 0,05 rispetto al gruppo Model+Inibitore-NC (per Bcl-2 e Beclin-1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

IL-1β modula l'asse miR-590-5p/SPRY2 e l'espressione dei marcatori associati all'autofagia

Per chiarire i meccanismi regolatori a monte che controllano SPRY2 e la sua relazione con miR-590-5p, i loro profili di espressione sono stati esaminati in condizioni infiammatorie. Dopo l'osservazione morfologica del modello cellulare C28/I2 indotto da IL-1β (Figura 5A), sono state verificate le efficienze di trasfezione per la manipolazione genetica SPRY2. Sia le analisi qPCR che quelle Western blot hanno confermato una robusta regolazione al rialzo SPRY2 nel gruppo di sovraespressione (OE) e un knockdown riuscito tra i piccoli gruppi di RNA interferente (siRNA) rispetto ai rispettivi controlli (Figure 5B e 5C). Al contrario, i livelli di miR-590-5p sono stati significativamente aumentati dopo il trattamento con IL-1β.

Figura 5: Osservazione morfologica e validazione delle efficienze di trasfezione SPRY2. (A) Osservazione morfologica delle cellule C28/I2 dopo il trattamento con IL-1β (20×, micrografia a contrasto di fase). (B) Livelli relativi di espressione di mRNA e proteine di SPRY2 nei gruppi di controllo, NC e sovraespressione (OE) SPRY2. (C) Immagini rappresentative del Western blot che confermano la sovraespressione di SPRY2 (a sinistra) e il knockdown di SPRY2 da parte di specifici siRNA (si-896, si-800, si-695) rispetto ai controlli (destra). β-actina fungeva da controllo interno del carico. I dati sono espressi come media ± SD (n = 3). *P < 0,05 rispetto al gruppo di controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per determinare se questo schema di espressione inversa riflettesse una potenziale relazione regolatoria, è stato utilizzato TargetScan Human 7.1 per identificare un sito di legame potenziato di 8 mer per has-miR-590-5p all'interno del 3′-UTR di SPRY2 umano (nucleotidi 236–243). L'allineamento della sequenza nella Figura 6 illustra la complementarità prevista tra la regione seme. Sono stati quindi condotti esperimenti di salvataggio per esaminare funzionalmente se la modulazione miR-590-5p alterasse l'espressione di SPRY2 nel modello OA. Dopo aver confermato l'efficienza di trasfezione del mimetico e inibitore miR-590-5p (Figure 7A, B), i saggi di salvataggio hanno mostrato che l'inibizione miR-590-5p invertiva la soppressione associata all'OA dell'espressione dell'mRNA SPRY2 (Figura 7C). Il mimetismo miR-590-5p non ha ulteriormente ridotto l'espressione di SPRY2 oltre la marcata soppressione indotta da IL-1β, mentre l'inibizione di miR-590-5p ha aumentato significativamente l'espressione di SPRY2 rispetto al controllo inibitore negativo. Questi risultati supportano una relazione regolatoria inversa, presunta, tra miR-590-5p e SPRY2 nei condrociti infiammatori.

Figura 6: Previsione in silico della presunta interazione regolatoria miR-590-5p/SPRY2. L'analisi bioinformatica è stata effettuata utilizzando TargetScan Human 7.1 ^31,32 per identificare siti di legame dei miRNA presuntivi. Lo schema illustra l'allineamento della sequenza previsto e la complementarità della regione seme tra has-miR-590-5p e il 3′-UTR dello SPRY2 umano (nucleotidi 236–243). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Effetti della modulazione miR-590-5p sull'espressione di SPRY2 nei condrociti. Le efficienze di trasfezione sono state confermate tramite qPCR per il mimetico (A) e l'inibitore (B) del miR-590-5p rispetto ai rispettivi controlli. (C) L'espressione relativa dell'mRNA SPRY2 è stata misurata tra i gruppi sperimentali indicati dopo la modulazione miR-590-5p nel modello OA. U6 e β-actin sono stati utilizzati come controlli interni rispettivamente per la quantificazione di miRNA e mRNA. I dati sono presentati come media ± SD (n = 3). *P < 0,05 rispetto al gruppo di controllo; #P < 0,05 rispetto al rispettivo gruppo Mimic-NC o Inibitore-NC; &P < 0,05 rispetto al gruppo OA+Inibitore-NC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In linea con i risultati della Figura 4, le variazioni dei marcatori associati all'autofagia sono state parallele agli effetti attesi dalla riduzione dell'espressione di SPRY2, suggerendo che miR-590-5p potrebbe aumentare la loro espressione alleviando l'inibizione mediata da SPRY2. Nel complesso, questi risultati supportano un asse di segnalazione presuntivo in cui IL-1β regola al rialzo miR-590-5p, miR-590-5p sopprime l'espressione di SPRY2 e una riduzione di SPRY2 è associata a un aumento dell'espressione dei marcatori di Beclin-1 e LC3-II.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I dati per questo studio sono forniti nel Fascicolo Supplementare 1.

File supplementare 1: I dataset utilizzati per questo studio, inclusi dati sorgente qPCR, immagini delle fonti Western blot e output di analisi statistica.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Studi precedenti hanno dimostrato che i miRNA regolano l'autofagia in molteplici stadi, inclusi l'inizio, l'allungamento della vescicola e^{la maturazione 27}. Il coinvolgimento dei miRNA nella patogenesi dell'OA è stato sempre più documentato, in particolare attraverso effetti su infiammazione, apoptosi, rimodellamento della matrice extracellulare e vie correlate all'autofagia. miR-590-5p è stato collegato all'omeostasi cellulare e ai processi associati al^cancro 28,29,30. In contesti scheletrici e cartilaginesi, miR-590-5p è stato segnalato come favorendo la differenziazione condrogenica delle cellule staminali mesenchimali umane 16, mentre nei modelli di condrociti OA può regolare proliferazione, apoptosi e risposte infiammatorie mirando a FGF^18,24. Tuttavia, non è chiaro se il miR-590-5p influenzi le risposte legate all'autofagia nei condrociti dell'OA.

Pertanto, RNAInter e TargetScan sono stati utilizzati per esplorare potenziali mediatori a valle, e entrambe le analisi hanno suggerito SPRY2 come possibile bersaglio associato al miR-590-5p. TargetScan Human 7.1^31,32 ha identificato un sito di legame previsto per 8 mer nella regione seme ai nucleotidi 236–243 dello SPRY2 3′-UTR (Figura 6). SPRY2 è un regolatore negativo della segnalazione della tirosina chinasi del recettore/MAPK ed è espresso in più^{tessuti 19}. Il trasferimento genico intraarticolare SPRY2 è stato riportato come attenuante dell'artrite indotta da adiuvante nei^{ratti 21}. La sovraespressione di SPRY2 può inibire la crescita, l'invasione, la migrazione e la citocinesi cellulare mediate da HGF/^SF, mentre la perdita della funzione Spry2 è stata associata all'iperattivazione di MAPK-ERK e all'aumento della proliferazione delle cellule^B. SPRY2 è stato inoltre implicato nella regolazione²² correlata all'apoptosi, nel controllo della migrazione associato a^{miRNA 35} e nelle risposte legate all'autofagia nei modelli^{ischemici 23}. Insieme, questi studi supportano SPRY2 come nodo regolatore che collega la segnalazione infiammatoria, le vie legate alla sopravvivenza e le risposte associate all'autofagia.

Data la relazione precedentemente non riportata tra miR-590-5p e SPRY2 nei condrociti OA, la previsione bioinformatica della loro potenziale interazione ha stimolato ulteriori indagini sperimentali. I risultati attuali hanno mostrato che SPRY2 è stato significativamente ridimensionato mentre miR-590-5p è stato aumentato nei condrociti C28/I2 stimolati da IL-1β, implicando questo asse nelle risposte infiammatorie dei condrociti. Dal punto di vista funzionale, la sovraespressione di SPRY2 ha ridotto l'espressione di Beclin-1 e LC3-II, supportando un effetto inibitorio sull'espressione dei marcatori associati all'autofagia. Al contrario, l'inibizione di miR-590-5p ha ridotto l'espressione di Beclin-1 e Bcl-2 e ripristinato l'espressione di SPRY2, coerente con una relazione regolatoria inversa presunta. Poiché Bcl-2 può inibire l'autofagia dipendente da Beclin-1 esercitando anche effetti anti-apoptotici13, l'elevazione concomitante di Bcl-2 con Beclin-1 e LC3-II deve essere interpretata in modo specifico per contesto. In questo modello infiammatorio di OA, la regolazione all'alza di Bcl-2 potrebbe riflettere principalmente una risposta anti-apoptotica legata alla sopravvivenza, mentre l'aumento dell'espressione di Beclin-1 e LC3-II potrebbe riflettere un sollievo dalla soppressione associata a SPRY2. Questi risultati suggeriscono un modello in cui miR-590-5p coordina la segnalazione legata alla sopravvivenza dei condrociti e l'espressione dei marcatori di autofagia sopprimendo SPRY2 sotto stress infiammatorio.

Sebbene questo studio fornisca preziose intuizioni meccanicistiche sull'asse miR-590-5p/SPRY2, vanno riconosciute diverse limitazioni. Innanzitutto, tutti gli esperimenti sono stati condotti in un sistema 2D in vitro utilizzando la linea cellulare C28/I2 immortalata. Questo modello semplificato non può ricapitolare completamente lo stress biomeccanico, le interazioni multicellulari e il microambiente infiammatorio della cartilagine articolare in vivo, limitando l'applicabilità traslazionale immediata dei risultati. In secondo luogo, sebbene le previsioni bioinformatiche e i saggi di salvataggio supportino una relazione regolatoria presunta tra miR-590-5p e SPRY2, l'assenza di un saggio a doppio rapporto luciferasi impedisce una conferma definitiva del legame fisico diretto tra miR-590-5p e SPRY2 3′-UTR. In terzo luogo, le misurazioni statiche di Beclin-1 e LC3-II non possono distinguere l'aumento della formazione di autofagosomi dalla degradazione autolisosomica compromessa; pertanto, studi futuri dovrebbero valutare il flusso autofagico utilizzando approcci come il trattamento con Bafilomicina A1 o i saghi fluorescenti tandem con reporter. I lavori futuri dovrebbero includere anche un pannello più ampio di marcatori fenotipici dell'OA (ad esempio, MMP13 e ADAMTS5), condrociti umani primari, modelli 3D di cartilagine explant e modelli OA in vivo come la destabilizzazione del menisco mediale per valutare gli effetti a lungo termine della modulazione miR-590-5p e SPRY2.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-β-actin antibody	Proteintech	66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938	Controllo di carico interno per l'analisi Western blot
Anti-SPRY2 antibody	Proteintech	11383-1-AP ; RRID: AB_2196324	Rilevamento dell'espressione proteica SPRY2
Kit per dosaggio proteico BCA	Thermo Fisher Scientific	23225	Determinazione della concentrazione totale delle proteine
Linea cellulare di condrociti umani C28/I2	Punocel	CP-H107	Modello in vitro di condrociti per studi sull'osteoartrite
DMEM completo	KeyGen Biotec	KGM12800S	Mezzo basale per la coltura cellulare di routine
Kit CWBIO per l'estrazione di miRNA ultrapuri	CWBIO	CW0627S	Isolamento di RNA totale e miRNA
Sistema di rilevamento ECL	Thermo Fisher Scientific	32106	Visualizzazione chemiluminescente delle bande proteiche
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	1891605	Supplemento di crescita per la coltura cellulare
GraphPad Prism versione 9.0	GraphPad Software	N/A	Analisi statistica e generazione di grafici
HiScript II Q RT SuperMix	Vazyme	R223-01	Trascrittura inversa dell'mRNA in cDNA
Software ImageJ	National Institutes of Health	N/A	Quantificazione dell'intensità delle bande Western blot
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015	Trasfezione di plasmidi e oligonucleotidi
miR-590-5p mimic, inibitore e NC	RiboBio	Sintetizzati su misura	Modulazione dell'espressione miR-590-5p
Kit per la sintesi del primo filamento di cDNA di miRNA	Vazyme	MR101-02	Trascrittura inversa del miRNA in cDNA
Mezzo Opti-MEM	Gibco	31985-062	Preparazione di complessi di trasfezione
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140122	Prevenzione della contaminazione batterica nella coltura cellulare
Cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi	MedChemExpress	HY-K0010	Protezione delle proteine durante l'estrazione
Membrane PVDF	Millipore Sigma	ISEQ00010	Membrane per il trasferimento di proteine per immunoblotting
IL-1β umana ricombinante	MedChemExpress	HY-P78459	Induzione di condizioni infiammatorie simili all'OA
Buffer RIPA	Beyotime	P0013B	Lisis cellulare ed estrazione delle proteine
Costrutti si-SPRY2 e si-NC	GenePharma	Sintetizzati su misura	Silenziamento dell'espressione di SPRY2
Plasmid di sovraespressione SPRY2 (OE) e vettore vuoto (NC)	GeneChem	Costruiti su misura	Valutazione degli effetti della sovraespressione di SPRY2
Spettrofotometro UV-VIS (NanoDrop 2000)	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Misurazione della concentrazione e della purezza dell'RNA