Visualizzazione e quantificazione dell'accoppiamento di basi di RNA intermolecolari in cluster di RNA in vitro utilizzando reporter di RNA broccolo spaccato

Summary

Questo protocollo descrive un saggio visivo che utilizza segnalatori di RNA broccoli divisi per rilevare e quantificare l'accoppiamento intermolecolare di basi in cluster di RNA in vitro.

Abstract

Il clustering dell'RNA, guidato da interazioni intermolecolari multivalenti RNA–RNA, può verificarsi in vitro in assenza di proteine. Sebbene le sondaggi chimiche e le simulazioni computazionali siano state utilizzate per prevedere queste interazioni, i metodi per valutare direttamente l'accoppiamento intermolecolare di basi nei cluster di RNA restano limitati. Questo studio presenta un saggio visivo basato su segnalatori di RNA broccoli spezzati coniugati con RNA di interesse marcati fluorescente. Il saggio consente il rilevamento e la quantificazione dell'accoppiamento intermolecolare di basi nei cluster di RNA. Il sistema di broccoli spaccato contiene sequenze reporter complementari che dimerizzano formando l'aptamero dell'RNA broccolo. La struttura di RNA dimerizzato risultante si lega a DFHBI-1T, un fluoroforo che emette fluorescenza verde al momento del legame. Al momento del clustering dell'RNA, la comparsa della fluorescenza verde riporta un accoppiamento di basi mediato dalle sequenze di reporter complementari tra gli RNA di interesse. La misurazione della fluorescenza DFHBI-1T consente una valutazione quantitativa di come le condizioni di clustering in vitro dell'RNA influenzino l'accoppiamento intermolecolare di basi tra queste sequenze di reporter.

Introduction

Gli RNA trascritti in vitro possono auto-assemblarsi in cluster visibili all'aggiunta di sali e reagenti di affollamento^molecolare 1,2,3,4,5. In particolare, questi cluster di RNA possono formarsi in assenza di altri componenti cellulari, incluse proteine, indicando che in condizioni specifiche le interazioni intermolecolari RNA–RNA sono sufficienti a favorire la condensazione dell'RNA in vitro.

Tra i vari tipi di interazioni intermolecolari RNA–RNA, l'accoppiamento intermolecolare di basi ha ricevuto notevole attenzione nel campo del^condensato 1,2,4,6,7,8,9,10. Queste interazioni possono essere guidate da sequenze complementari esposte ("CAP") tra trascrivi, come dimostrato dal co-clustering degli mRNA BNI1 e SPA2 nel fungo filamentoso Ashbya gossypii² o dall'oligomerizzazione dell'mRNA oskar in Drosophila melanogaster ^6,7. In alternativa, l'accoppiamento intermolecolare di basi può essere promosso rimodellando le strutture secondarie dell'RNA, esponendo sequenze complementari che altrimenti sarebbero strutturalmente incorporate. Questo meccanismo è stato osservato in RNA ripetuti in silico⁹ e in riboswitch di guanidina in vitro¹⁰. Sia le sequenze complementari esposte sia la rimodellazione strutturale dell'RNA possono essere misurate utilizzando sondaggi^{chimici 11,12} o approcci^{di simulazione} 4,9,13,14. Tuttavia, i metodi che visualizzano direttamente l'accoppiamento intermolecolare di basi negli saghi di clustering in vitro dell'RNA rimangono limitati.

I saggi di pull-down a RNA utilizzando i reticulatori di base 15,16,17 e l'elettroforesi in gel ^4,6,7 sono comunemente impiegati per studiare l'accoppiamento intermolecolare di basi di RNA in vitro. Tuttavia, questi metodi mancano della risoluzione spaziale per distinguere l'accoppiamento di basi all'interno dei cluster da quello esterno a essi. Inoltre, isolare i cluster di RNA per l'analisi a valle è tecnicamente complesso, poiché richiede la preservazione della stabilità del cluster garantendo al contempo la compatibilità del buffer con i test successivi.

Un saggio visivo basato su¹⁸ reporter di RNA di broccolo divisi coniugati con RNA di interesse marcati fluorescentmente è stato precedentemente impiegato per consentire la rilevazione diretta dell'accoppiamento intermolecolare di basi durante la condensazione dell'RNA in vitro⁴. In questo contesto, il sistema di broccoli divisi riporta la probabilità di interazioni intermolecolari tra reporter o tra RNA che li trasportano in condizioni definite di clustering in vitro . Pertanto, il saggio indaga come il contesto della sequenza e i fattori ambientali influenzino la propensione all'accoppiamento intermolecolare di basi all'interno di un ambiente simile a un cluster di RNA.

Il sistema di broccoli divisi è composto da due sequenze di RNA complementari, superiore e inferiore, che si dimerizzano per ricostituire l'aptamero dell'RNA di broccolo (Figure 1A–C)¹⁸. Al momento della dimerizzazione, l'aptamero si lega al fluorofero DFHBI-1T, ottenendo fluorescenza verde (Figure 1A–C)¹⁸. Utilizzando questo sistema, si dimostra che l'entità dell'accoppiamento intermolecolare di basi tra sequenze complementari reporter all'interno dei cluster di RNA dipende dal ripiegamento dell'RNA. Confrontando il rapporto tra fluorescenza DFHBI-1T e livelli di RNA tra diverse condizioni sperimentali, si può valutare quantitativamente l'influenza delle condizioni in vitro sull'accoppiamento intermolecolare di basi mediato da reporter all'interno dei cluster di RNA.

Questo saggio integra gli approcci di pull-down dell'RNA e dell'elettroforesi su gel per studiare l'accoppiamento intermolecolare di basi nei cluster di RNA. Tuttavia, una rilevazione robusta del segnale può richiedere reagenti di affollamento molecolare, e la sensibilità è limitata dall'efficienza della dimerizzazione e del ripiegamento degli RNA spezzati tra la parte superiore e inferiore del broccolo.

Protocol

Questo protocollo fornisce un metodo passo dopo passo per implementare questo saggio e ne discute le applicazioni. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di template di DNA per la trascrizione in vitro di RNA

1. Aggiungere una sequenza promotrice T7 all'estremità 5′ di ogni template di DNA contenente le sequenze splittate di Broccolo aptamer per la trascrizione in vitro dell'RNA. Usa le sequenze di aptamere spaccate del broccolo (in alto e in basso) da sole oppure inserile in qualsiasi posizione a valle del promotore T7, con o senza una sequenza di RNA aggiuntiva di interesse.
   NOTA: Le sequenze per il promotore T7, i reporter broccoli divisi e i primer utilizzati per amplificare i template di DNA sono elencate nella Tabella 1.
   NOTA: La RNA polimerasi T7 preferisce fortemente iniziare la trascrizione con una "G" nella posizione +1. La presenza di ulteriori G immediatamente a valle nelle posizioni +2 e +3 può aumentare la resa di trascrizione¹⁹. Tuttavia, quando la sequenza a valle inizia con G, come nelle costruzioni superiore e inferiore che iniziano con due G, la trascrizione può iniziare in posizioni^{diverse 20}. Di conseguenza, i trascrizioni possono contenere una, due o tre G all'estremità 5′ (ad esempio, GATCC, GGATCC o GGGATCC), il che può influenzare l'interpretazione dell'accoppiamento di basi nei costrutti progettati.
2. Utilizzare blocchi genici, plasmidi o frammenti di DNA sintetizzati commercialmente come modelli per la PCR. Se il modello originale non contiene un promotore T7, si utilizza un primer frontale con una sporgenza promotere T7 da 5′ insieme al necessario primer inverso.
3. Prepara una reazione PCR da 50 μL in un tubo PCR da 200 μL contenente 2,5 μL ciascuno di primer avanti e indietro, un template di DNA da 20 ng, un mix master ad alta fedeltà 25 μL da 2×5 μL e acqua priva di nucleasi. Mescola accuratamente pipettando su e giù e centrifuga a 2.000 × g per 2 secondi.
4. Eseguire la reazione PCR in un termociclatore utilizzando il seguente programma: 98 °C per 30 secondi (1 ciclo); 98 °C per 10 secondi, temperatura di ricottura ottimizzata per 30 secondi e 72 °C per 30 secondi per kilobase (35 cicli); 72 °C per 2 minuti (1 ciclo).
   NOTA: Determina la temperatura ottimizzata di ricottura utilizzando uno strumento online come una calcolatrice Tm. I prodotti PCR possono essere conservati a 4 °C dopo il completamento.
5. Mescola 2 μL di prodotto PCR con 8 μL di acqua priva di nucleasi e 2 μL 6× di colorante di carico. Carica la miscela su un gel di agarosio all'1% per l'elettroforesi.
   NOTA: Il prodotto PCR dovrebbe apparire come una banda singola. Se si osservano più fasce, si elimina la banda corretta e si purifica usando un kit di estrazione gel prima di procedere.
6. Purificare il prodotto PCR o il DNA estratto dal gel utilizzando un kit di purificazione del DNA ed eluire in 20–30 μL di acqua priva di nucleasi in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
7. Misurare la concentrazione e la purezza del DNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume. Assicurati che A260/A280 sia approssimativamente 1.8 e A260/A230 superiore a 2.0.
   NOTA: Se A260/A230 è inferiore a 2,0, eseguire un ulteriore passaggio di purificazione.
8. Conservare il modello di DNA a −20 °C fino all'utilizzo.

2. Preparazione della reazione di trascrizione in vitro dell'RNA

1. Pulisci la superficie di lavoro, i rack dei tubi e le pipette con una soluzione di decontaminazione RNasi. Usa punte senza RNasi, filtrate.
2. Soluzioni di tampone di reazione e nucleotidi di scongelamento (ATP, CTP, GTP, UTP) fornite con il kit di trascrizione T7, insieme a UTP-Cy5, su ghiaccio. Centrifuga tutti i tubi a 2.000 × g per 2 secondi prima dell'uso.
   NOTA: Proteggi UTP-Cy5 dalla luce.
3. Calcola il numero di basi timina nel modello di DNA (escludendo il promotore T7) e determina i volumi richiesti di UTP e UTP-Cy5 per una reazione di trascrizione di 20 μL. Mantenere una densità di marcatura costante tra le specie di RNA.
   NOTA: Ad esempio, per etichettare un RNA contenente 100 basi uracilli con circa tre uracilli marcati con Cy5, si aggiungono 4,5 μL di 1 mM UTP-Cy5 e 1,9 μL di 75 mM UTP.
4. Prepara una reazione di trascrizione da 20 μL combinando 2 μL ciascuno di ATP, CTP e GTP, volumi calcolati di UTP (tutti forniti con il kit) e UTP-Cy5, 2 μL 10× tampone di reazione, miscela enzimatica da 2 μL, modello di DNA da 200 ng e acqua priva di nucleasi. Mescola accuratamente pipettando su e giù e centrifuga a 2.000 × g per 2 secondi.
5. Incubare la reazione a 37 °C per 6 ore.
6. Aggiungere 1 μL di DNasi fornito con il kit. Mescola accuratamente pipettando su e giù e centrifuga a 2.000 × g per 2 secondi.
7. Incubare a 37 °C per altri 15 minuti.
8. Trasferire la reazione (~20 μL) su un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 115 μL di acqua senza nucleasi e 15 μL di soluzione di cesto di acetato di ammonio fornita con il kit. Mescola accuratamente pipettando su e giù e centrifuga a 2.000 × g per 2 secondi.
   NOTA: Al posto dei Passaggi 2.9–3.7 può essere utilizzato un kit commerciale di purificazione dell'RNA.
9. Aggiungi 150 μL di fenolo/cloroformio e mescola delicatamente.
   ATTENZIONE: Maneggia fenolo/cloroformio in una cappa chimica.
10. Centrifugare a 16.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
11. Trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo.
    NOTA: Evitare di disturbare l'interfase; lo strato inferiore può apparire blu a causa di coloranti non incorporati.
12. Aggiungi un volume uguale di cloroformio e mescola bene.
    ATTENZIONE: Maneggiare il cloroformio in una cappa chimica.
13. Centrifugare a 16.000 × g per 2 minuti a 4 °C.
14. Ripeti i passaggi 2.11–2.13.
15. Trasferire lo strato acquoso (~100–150 μL) in un nuovo tubo. Aggiungi 900 μL di isopropanolo e mescola bene.
16. Aliquot in tre volumi uguali in tubi separati.
    NOTA: Ogni aliquota è sufficiente per reazioni di clustering multiplo dell'RNA.
17. Conserva a −20 °C durante la notte o fino a un mese.

3. Purificazione di RNA trascritto in vitro

1. Centrifugare il campione di RNA in isopropanolo a 16.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
2. Rimuovere con attenzione l'isopropanolo senza disturbare il pellet di RNA.
3. Aggiungi 1 mL di etanolo al 70% preparato in acqua priva di nucleasi.
4. Centrifugare a 16.000 × g per 2 minuti a 4 °C.
5. Rimuovi l'etanolo e ripeti i passaggi 3.3–3.4.
6. Durante il lavaggio finale con etanolo, rimuovere la maggior parte dell'etanolo usando una pipetta da 1000 μL. Centrifugare brevemente a 2.000 × g per 2 secondi in una minicentrifuga da banco e rimuovere l'etanolo residuo usando una pipetta da 20 μL.
7. Asciugare all'aria la pellet di RNA per 1–2 minuti a temperatura ambiente (RT).
8. Risospendere il pellet di RNA in acqua priva di nucleasi da 20 μL. Tieni il campione sul ghiaccio e proteggilo dalla luce.
9. Misura la concentrazione e la purezza dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume. Assicurati che A260/A280 sia approssimativamente 2.0 e A260/A230 superiore a 2.0.

4. Preparazione della reazione di clustering in vitro dell'RNA

NOTA: In questo protocollo, l'induzione del clustering dell'RNA richiede spermina e PEG 8000, basandosi su studi^{precedenti 2,4,5}. In particolare, una soluzione di stock di tetraidrocloruro di spermina da 100 mM preparata in acqua priva di nucleasi è stata allicitata in più tubi microcentrifuga da 1,5 mL e conservata a −20 °C.

1. Scongela un tubo di soluzione di spermina da 100 mM e il 50% di PEG 8000 su ghiaccio.
   NOTA: Dopo l'apertura, il PEG 8000 al 50% deve essere utilizzato per non più di due mesi a causa di un potenziale degrado.
2. Per preparare 500 μL tampone di ripiegamento RNA appena prodotto da 10×, combinare 50 μL di 2M KCl, 50 μL di 1M_{MgCl 2}, 50 μL di 1M Tris (pH 7,0) e 350 μL di acqua priva di nucleasi. Mescola accuratamente pipettando su e giù. Centrifuga a 2.000 × g per 2 secondi in una minicentrifuga da banco da banco.
   NOTA: Il buffer di ripiegamento dovrebbe essere preparato il giorno dell'esperimento di clustering dell'RNA.
   NOTA: I passaggi 4.3-4.4 dipendono dalle condizioni sperimentali e possono essere adattati secondo necessità. Due condizioni esempi per il clustering dell'RNA utilizzate in questo studio sono descritte di seguito. La condizione di co-folding è adattata da un metodo utilizzato per ricottare oligonucleotidi antisense in^{RNA 2}. In questo metodo, gli RNA vengono miscelati in un tampone salino e riscaldati insieme per favorire l'accoppiamento intermolecolare di basi tra RNA che trasportano sequenze complementari. Al contrario, per la condizione di ripiegamento separato, ogni RNA viene piegato singolarmente prima della miscelazione. Questa condizione è pensata per approssimare uno scenario cellulare in cui gli RNA vengono ripiegati prima di interagire.
3. Co-folding
   NOTA: Questa condizione favorisce l'accoppiamento intermolecolare di basi tra RNA contenenti le sequenze superiore e inferiore . Serve come controllo positivo per l'accoppiamento intermolecolare di basi guidato dal reporter nella condizione di clustering dell'RNA.
   1. In un tubo PCR da 200 μL, combinare 16 pmol di ciascun RNA trascritto in vitro che trasporta la sequenza superiore o inferiore , 2 μL di 10× tampone RNA ripiegato e acqua priva di nucleasi per un volume finale di 14 μL. Mescola accuratamente pipettando su e giù. Centrifugare a 2.000 × g per 2 secondi in una minicentrifuga da banco.
      NOTA: Per calcolare la massa dell'RNA corrispondente a 16 pmol.
   2. Riscalda il campione di RNA a 90 °C per 2 minuti.
   3. Trasferisci immediatamente il campione in RT e proteggilo dalla luce. Incubare la reazione a RT per 1 ora.
4. Piegamento separato
   1. Riscalda il campione di RNA a 90 °C per 2 minuti e poi mettilo subito sul ghiaccio per almeno 15 minuti.
   2. In un tubo PCR da 200 μL, si combinano 16 pmol di RNA trascritto in vitro che trasporta sequenza superiore o inferiore , 1 μL di 10× tampone RNA ripiegato e acqua priva di nucleasi per un volume finale di 7 μL.
      NOTA: Per calcolare la massa dell'RNA corrispondente a 16 pmol.
   3. Incubare la reazione a RT per 30 minuti, protetto dalla luce.
   4. Combina i campioni di RNA contenenti le sequenze superiore e inferiore in un unico tubo PCR. Mescola accuratamente pipettando su e giù. Centrifugare a 2.000 × g per 2 secondi in una minicentrifuga da banco. Incubare a RT per 30 minuti.
5. Aggiungi 6 μL di un premix 1:2 (v/v) di 100 mM di spermina e 50% di PEG 8000. Mescola accuratamente pipettando su e giù. Centrifuga a 2.000 × g per 2 secondi in una minicentrifuga da banco.
   NOTA: il PEG 8000 al 50% è altamente viscoso. Pipette lentamente e con attenzione.
6. Aggiungere 2 μL di 1 mM di DFHBI-1T alla reazione. Mescola accuratamente pipettando su e giù. Centrifuga a 2.000 × g per 2 secondi in una minicentrifuga da banco. La reazione dovrebbe apparire giallo-verde.
   NOTA: Per preparare una soluzione stock DFHBI-1T da 20 mM da 1 mg di colorante liofilizzato DFHBI-1T (MW: 320.21), aggiungere 156 μL di DMSO anidro di grado biologico molecolare. Lo stocco in piccole quantità in più tubi microcentrifughe e conservato a -20 °C. Evita cicli ripetitivi di congelamento-scongelamento per il colorante. Prepara una soluzione lavorativa DFHBI-1T appena diluita da 1 mM diluendo il stock da 20 mM in acqua priva di nucleasi e conservandolo sul ghiaccio.
7. Carica la reazione in un vetro coperto con camera di vetro.
8. Incuba la camera a RT per 4 ore al buio con il coperchio per minimizzare l'evaporazione.

5. Preparazione per l'imaging

1. Acquisire immagini tridimensionali utilizzando un microscopio a illuminazione strutturata o confocale dotato di laser e obiettivi appropriati.
   NOTA: La microscopia confocale è necessaria per minimizzare la luce fuori fuoco.
2. Configura il microscopio per visualizzare ogni regione di interesse (ROI) con il canale Cy5 prima su ciascun piano z, seguito dall'imaging dello stesso ROI usando il canale GFP.
3. Imposta il tempo di esposizione a 500 ms per tutti i canali. Imposta la potenza laser all'80% per GFP e al 40% per Cy5.
4. Immagini una regione di copertura al di fuori della goccia di reazione a RT usando una dimensione z-step di 150 nm.

6. Quantificazione dell'accoppiamento intermolecolare di basi

1. Importare immagini nel software di analisi^{delle immagini 21}. Identificare i canali GFP (DFHBI-1T) e Cy5 (RNA).
2. Disegna un ROI di 5 × 5 pixel all'interno di un cluster RNA e misura la densità integrata per entrambi i canali nello stesso piano z. Seleziona 5–8 ROI da diversi cluster di RNA in ogni immagine.
   NOTA: Regola la dimensione del ROI a seconda della configurazione della telecamera, ma mantieni la coerenza tra gli esperimenti.
3. Seleziona 5–8 ROI al di fuori della goccia di reazione per la misurazione di fondo e calcola la densità media integrata per entrambi i canali.
4. Calcola l'intensità normalizzata di DFHBI-1T per ogni ROI utilizzando:
   

7. Problemi comuni e risoluzione dei problemi

1. Se non si osserva alcun pellet di RNA dopo la centrifugazione, si considera la degradazione dell'RNA, un tempo di trascrizione insufficiente, la polimerasi inattiva, i sali residui o una bassa concentrazione di RNA. Usa reagenti senza RNasi, prolunga il tempo di trascrizione, usa enzimi freschi e purifica i modelli.
2. Se non vengono osservati cluster di RNA marcati con Cy5, si considera la degradazione dell'RNA o la degradazione di PEG 8000 o UTP-Cy5. Usa reagenti freschi e condizioni prive di RNasi.
3. Se non viene osservato alcun segnale DFHBI-1T in condizioni di co-ripiegatura, si consideri scarsa qualità del colorante, mancanza di formazione della struttura del broccolo o trascritti troncati. Usa un colorante fresco, assicurati una corretta composizione del tampone e verifica la dimensione del trascrizione tramite analisi in gel.
4. Se il segnale di fluorescenza sbianca, riduci la potenza del laser e i tempi di esposizione, minimizza i passaggi di imaging e protegge i campioni dalla luce durante l'incubazione.

Results

In questo esperimento dimostrativo, la capacità dei reporter di RNA superiore e inferiore di individuare la coppia di basi e formare la struttura del broccolo è stata valutata per la prima volta utilizzando il protocollo di clustering in ^{vitro RNA 4} descritto in precedenza. L'accoppiamento di basi tra superiore e basso genera due bracci di broccolo, ciascuno capace di intercalare una molecola DFHBI-1T (Figure 1A–C)^18,22.

All'induzione del clustering di RNA con spermina e PEG 8000, entrambi gli RNA formarono cluster sia individualmente che insieme (Figure 1D–Eii). Quando gli RNA superiori o inferiori sono stati esaminati in isolamento, la fluorescenza di DFHBI-1T all'interno dei cluster di RNA era sostanzialmente inferiore rispetto alla condizione di co-ripiegamento, in cui i due RNA venivano combinati prima della denaturazione e ripiegatura del calore (Figura 1F). Nella condizione di co-ripiegamento, il rapporto molare di DFHBI-1T (0,1 mM) rispetto al massimo (0,8 μM) e al basso (0,8 μM) è stato stimato in 125:1:1. Questo corrisponde a un eccesso di circa 62,5 volte di DFHBI-1T rispetto al numero massimo di potenziali strutture broccoli.

Il segnale DFHBI-1T basso ma non nullo osservato sia per il livello superiore che per il basso è coerente con i rapporti precedenti che mostravano una fluorescenza minima del DFHBI-1T quando ogni segnalatore è espresso individualmente¹⁸. DFHBI-1T ha inoltre mostrato una fluorescenza di fondo molto bassa ma rilevabile in assenza di RNA (Figura 1F). Insieme, questi risultati dimostrano che DFHBI-1T è compatibile con il saggio di clustering in vitro dell'RNA e che il co-folding migliora l'accoppiamento intermolecolare di basi tra gli RNA superiore e inferiore .

Dopo la normalizzazione all'intensità dell'RNA, l'intensità di fluorescenza normalizzata di DFHBI-1T nella condizione di co-folding ha raggiunto 1,03, significativamente superiore a quella di top e bottom da soli (0,054 e 0,023, rispettivamente) (Figura 1D, Figura 1Ei e Figura 1F). Sono stati poi esaminati i cluster di RNA formati mescolando RNA superiore e inferiore che erano stati piegati separatamente prima del clustering (Figura 1D, Figura 1Eii e Figura 1F). In questa condizione di piegamento separata, il segnale normalizzato DFHBI-1T era 0,031, paragonabile ai livelli di base osservati nei controlli negativi (solo in alto o in basso ) (Figura 1F). Questi risultati indicano che il co-folding favorisce l'accoppiamento intermolecolare di basi tra gli RNA superiori e inferiori , mentre il folding separato limita tali interazioni.

Le sequenze superiore e inferiore sono state successivamente inserite nella regione non tradotta (UTR) a 3′ dello shutdown (shu), di un granulo germinale ^{mRNA 4,23,24} e nel suo corrispettivo antisens (shu^anti). La UTR shu 3′ è stata scelta perché lavori precedenti hanno dimostrato che questo RNA esiste prevalentemente come monomero in Drosophila melanogaster e non dimerizza nemmeno a concentrazioni molari elevate nei saggi di gel di^{RNA 4,24}. Inoltre, shu-top e shu-bottom non formano omodimeri nei gel di^{RNA 4}, permettendo una valutazione più diretta delle interazioni intermolecolari tra top e bottom e dell'influenza delle sequenze laterali derivate da shu.
I modelli di DNA per shu-top, shu-bottom, shu^anti-top e shu^anti-bottom sono elencati nella Tabella 2. Le sequenze superiore e inferiore sono state inserite al centro della shu o ^{shu anti-3}′ UTR, richiedendo un rimodellamento strutturale per facilitare l'interazione e mimetizzare meglio le interazioni fisiologiche RNA–RNA, in cui le regioni interagenti sono tipicamente incorporate nei trascrizioni⁴.

All'induzione del clustering dell'RNA, shu-top, shu-bottom, shu^anti-top e shu^anti-bottom hanno individualmente mostrato una fluorescenza minima di DFHBI-1T, simile a quella solo top e bottom (Figure 2A e 2B). Costantemente, il co-folding di shu-top con shu-bottom o shu^anti-top con shu^anti-bottom produceva un segnale DFHBI-1T più alto rispetto al folding separato (Figure 2Ci e Cii). Dopo la normalizzazione a controlli di intensità e negatività dell'RNA (definiti come il segnale medio normalizzato di DFHBI-1T da ogni RNA da solo), il co-folding di shu-top e shu-bottom ha portato a un aumento di 5,63 volte della fluorescenza normalizzata di DFHBI-1T (Figure 2Di e 2Dii). Al contrario, il folding separato ha mostrato solo un aumento di 1,04 volte, paragonabile ai livelli di base osservati singolarmente per shu-top e shu-bottom. Tendenze simili sono state osservate per shu^anti-top e ^{shu anti-bottom} in condizioni di co-folding e separate folding (Figure 2Di e 2Dii). Questi risultati indicano che il ripiegamento separato non favorisce l'accoppiamento intermolecolare di basi tra shu-top e shu-bottom o shu^anti-top e shu^anti-bottom, mentre il co-folding potenzia queste interazioni, probabilmente grazie alle sequenze di reporter inserite.

Per testare se la coppia base shu e ^{shu anti-can}, shu-top è stato mescolato con shu^anti-bottom, e shu^anti-top con shu-bottom. Entrambe le combinazioni hanno mostrato una fluorescenza DFHBI-1T più elevata sia in condizioni di co-folding che separata rispetto a shu-top con shu-bottom o shu^anti-top con ^{shu anti-bottom} (Figure 2Ci e 2Cii). Dopo la normalizzazione, il co-folding di shu-top con shu^anti-bottom e shu^anti-top con shu-bottom ha portato rispettivamente a aumenti di fluorescenza DFHBI-1T di 61,86 e 82,60 volte (Figure 2Di e 2Dii). Al contrario, il folding separato ha prodotto aumenti rispettivamente di 2,69 volte e 4,94 volte (Figure 2Di e 2Dii). Sebbene sostanzialmente inferiori rispetto a condizioni di co-ripiegatura, questi valori erano più alti rispetto a quelli osservati per shu-top con shu-bottom o shu^anti-top con shu^anti-bottom (rispettivamente 1,04 e 1,16).

Insieme, questi risultati indicano che i reporter che portano sequenze complementari aggiuntive hanno una maggiore capacità di accoppiamento di basi rispetto a quelli senza tali sequenze. Questo effetto è ulteriormente rafforzato nella condizione di co-ripiegatura, che favorisce le interazioni intermolecolari.

Figura 1: Strutture secondarie previste degli RNA superiore e inferiore e quantificazione della loro accoppiamento intermolecolare di basi in cluster di RNA in vitro. (A–B) Esempi di strutture secondarie di top (A) e bottom (B) che si piegavano singolarmente, come previsto da^{RNAfold 25}. Quando piegate separatamente, superiore e inferiore non ricostituiscono l'aptame del broccolo, e DFHBI-1T (stella grigia) produce una fluorescenza minima. (C) Esempio della struttura secondaria degli RNA superiori e inferiori accoppiati a basi, come previsto da RNAcofold²⁵. L'accoppiamento intermolecolare di basi tra i due RNA ricostituisce due bracci^{di broccolo 18}, permettendo il legame di DFHBI-1T e risultando in una forte fluorescenza verde (stelle verdi). (D) Immagini del solo DFHBI-1T (controllo solo con colorante) e cluster di RNA in vitro (magenta) formati da RNA superiore e inferiore in presenza di DFHBI-1T (verde). (Ei, ii) Cluster di RNA in vitro (magenta) formati da RNA superiore e inferiore sotto condizioni di co-folding (i) e separazione (ii) in presenza di DFHBI-1T (verde). Per i pannelli D ed E, gli RNA sono stati marcati con Cy5 in modo che, in media, circa un terzo degli RNA contiene un singolo uracile marcato con Cy5, mentre i restanti due terzi sono non marcati. Le immagini rappresentano proiezioni Z medie di 27 fette acquisite con un passo di 150 nm, utilizzando la stessa esposizione e potenza laser per ogni canale in tutte le condizioni. La fluorescenza del DFHBI-1T è stata normalizzata allo stesso intervallo di intensità in diverse condizioni. Barre di scala: 2 μm. (F) L'intensità di DFHBI-1T è stata normalizzata in abbondanza di RNA, misurata dalla fluorescenza Cy5. I dati sono presentati come media ± SEM. Valori p per il test t a due code (**** vs. co-folding): 1,0 × 10⁻²² (solo colorante), 2,3 × 10⁻²² (alto), 4,9 × 10⁻²³ (inferiore) e 7,0 × 10⁻²³ (piegamento separato). n = 30 regioni per la condizione solo di colorante e 30–31 cluster di RNA per tutte le altre condizioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative e quantificazione dell'accoppiamento intermolecolare di basi per shu e ^{shu anti-portanti} top e bottom. (A) Immagini di DFHBI-1T da solo (controllo solo con colorante) e cluster di RNA in vitro (magenta) formati da RNA shu-top, shu-bottom, ^{shu anti-top} e shu^anti-bottom in presenza di DFHBI-1T (verde). Gli RNA sono stati marcati con Cy5 in modo che, in media, tre uracilli UTP-Cy5 sono stati incorporati durante la trascrizione in vitro. Le immagini rappresentano proiezioni Z medie di 27 fette acquisite con un passo di 150 nm, utilizzando la stessa esposizione e potenza laser per ogni canale in tutte le condizioni. La fluorescenza del DFHBI-1T è stata normalizzata allo stesso intervallo di intensità in diverse condizioni. Scale bar: 2 μm. (B) L'intensità di DFHBI-1T è stata normalizzata in abbondanza di RNA, misurata dalla fluorescenza Cy5. I dati sono presentati come media ± SEM. n.s., non significativo. Valori p per il test t a due code (rispetto a solo colorante): 3,1 × 10⁻³ (**; shu-top), 1,7 × 10⁻¹ (n.s.; shu-bottom), 2,9 × 10⁻³⁵ (***; Shu anti-top), e 2.2 × 10⁻² (; Shu^anti-bottom). n = 30 regioni per la condizione di solo colorante e 30–32 cluster di RNA per tutte le altre condizioni. (Ci, ii) Immagini di cluster di RNA in vitro (magenta) formati mescolando shu-top con shu-bottom, shu^anti-top con shu^anti-bottom, shu-top con shu^anti-bottom, e shu^anti-top con shu-bottom in presenza di DFHBI-1T (verde) sotto co-folding (i) e separato ( ii) condizioni. Le immagini rappresentano proiezioni Z medie di 27 fette acquisite con un passo di 150 nm, utilizzando la stessa esposizione e potenza laser per ogni canale in tutte le condizioni. Per la gamma bassa, la fluorescenza DFHBI-1T è stata normalizzata alla stessa gamma di intensità della Figura 1D–Eii e della Figura 2A. Per l'intervallo alto, la fluorescenza DFHBI-1T è stata normalizzata a un intervallo di intensità più alto ma costante in tutte le condizioni nei pannelli Ci e Cii. Barre di scala: 2 μm. (Di, ii) L'intensità di DFHBI-1T è stata normalizzata prima all'intensità dell'RNA e poi ai controlli negativi, definiti come il segnale medio normalizzato del DFHBI-1T da ogni RNA da solo. I dati sono presentati come media ± SEM. n.s., non significativo. (i) Valori P per il test t a due code (**** vs. shu-top + shu-bottom): 1,1 × 10⁻³¹ (^{shu anti-top} + ^{shu anti-bottom}), 1,1 × 10⁻²² (shu-top + ^{shu anti-bottom}) e 4,3 × 10⁻²⁷ (^{shu anti-top} + shu-bottom). (ii) Valori P per il test t a due code (vs. shu-top + shu-bottom): 2.2 × 10⁻¹ (n.s.; shu anti-top + shu anti-bottom), 1.9 × 10⁻9 (; shu-top + ^{shu anti-bottom}), e 1,3 × 10⁻¹⁵ (; shu anti-top + shu-bottom). n = 29–32 cluster di RNA per tutte le condizioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome	Sequenze (5′-3′)
Promotore T7	TAATACGACTCACTATAG
In cima	GGATGATGGAGACGTCGGGTC CAGGATCATTCATGGCAAGAGAC GGTCGGGTCCAGATGATGCGGAT
In basso	GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGC TCCATCATCC
Attaccante top T7	TAATACGACTCACTATAG GGATGGAGACGGTCG
Invertimento superiore	ATCCGCATCATCCCCCCCCCCC
Attaccante bottom-T7	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCATCTGTCGA
Inferiore-Reverse	GGATGATGGAGCCCACACT
I primer anteriori contengono una sporgenze di sequenza promotrice T7 (in grassetto), seguita da sequenze che mirano all'estremità 5′ dell'RNA.

Tabella 1: Sequenze di promotori T7, reporter di broccoli divisi e primer utilizzati per amplificare i modelli di DNA per la trascrizione T7. I primer elencati sono stati utilizzati per generare modelli di DNA per la trascrizione in vitro degli RNA superiore e inferiore , che sono stati successivamente utilizzati negli saggi di clustering dell'RNA descritti in questo studio.

Nome	Sequenze (5′-3′)
Shu-top	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATTATCTTACTCAAAAAAGGATGATGAGE ACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGATGCGGA TAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAATTTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATT AGTTATTTTTCGATATTAGCAACATGAATATCGTAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTTTTTTAAAAAACCACAATAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
Shu-bottom	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATTCATCATC, aaaggatccccgcatcatc TGTCGAGTAGAGTGTGTGCTCTTGCCATGTGTGTGTGTGTCAACCCACATACTCTGATG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATTAGTTATTTTTCGATATTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTATTTAGAGCAACGTAGACTAGACCTTAAGTTTTTAA AAACCACAATAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
ShuAnti-Top	ATGTAGCTGCCGTGTGTTTACTTTTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTTTTTCATGTTTGGTATGTTTTTTTGGA TGATGGAGACGGTCGGGTCCGATCATCATTGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGAT GCGGATTTTTTGAGTAAGATATGAAATATGAAAACTGGGGCTTCTTAGTAAGC
ShuAnti-Bottom	ATGTAGCTGCCGTGTGTGTTTTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTA AATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGAACTAAATTTTCATGTTTGGTATGTTTTTTTT GGATCCCCCATCATCTGTCGAGTAGAGTGTGTGGTCTTGCTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGTGCTCCATCATCCTTTTTGAGTAA GATATGAAAATATGAAATATGGGGCTCTTCTTAGTAAGC
shu-top o shu-bottom-T7 attaccante	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCCCAGT
shu-top o shu-bottom-Retromarcia	ATGTAGCTGCCGTGCATTAC
shuanti-top o shu anti-bottom-T7 in avanti	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGCATTA
Shuanti-Top o ShuAnti-Bottom-Retromarcia	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
I primer anteriori contengono una sporgenze di sequenza promotrice T7 (in grassetto), seguita da sequenze che mirano all'estremità 5′ dell'RNA. Una o due G aggiuntive erano incluse tra il promotore T7 e rispettivamente shu-top e shu-bottom o shuanti-top e shuanti-bottom. Questo perché avere G nelle posizioni +2 e +3 può aumentare significativamente la resa ditrascrizione 19. Tuttavia, questi G aggiuntivi potrebbero potenzialmente influenzare l'interpretazione dell'accoppiamento di basi nei costrutti progettati. Vedi la nota al passo 1.1.

Tabella 2: Sequenze di shu-top, shu-bottom, ^shu anti-top, shu^anti-bottom e primer utilizzati per amplificare i template del DNA per la trascrizione T7. I primer elencati sono stati utilizzati per generare modelli di DNA per la trascrizione in vitro di ^{shu e shu anti-RNA} che trasportano i reporter superiore e inferiore, che sono stati successivamente utilizzati negli saggi di clustering dell'RNA descritti in questo studio.

Discussion

In questo studio, il sistema splittame di broccolo^{aptamer 18} è stato adattato per la visualizzazione diretta e la quantificazione dell'accoppiamento intermolecolare di basi in condizioni di clustering in vitro dell'RNA. Questo approccio consente la valutazione dell'accoppiamento intermolecolare delle basi attraverso diverse condizioni in vitro e integra i saghi biochimici a valle, come gli esperimenti di RNA pull-down utilizzando reticolatori a base 15,16,17 e l'elettroforesi gel ^4,6,7. A differenza di questi metodi biochimici, che mancano della risoluzione spaziale per distinguere l'accoppiamento di basi all'interno dei cluster di RNA da quello che si verifica all'esterno, questo approccio consente la visualizzazione spaziale diretta di queste interazioni all'interno dei cluster. In particolare, consente il monitoraggio dell'accoppiamento di basi tra RNA superiore e inferiore, o RNA che trasportano questi reporter, in condizioni definite di clustering RNA. Inoltre, fornisce una lettura quantitativa e in tempo reale dell'accoppiamento di basi tra RNA reporter senza richiedere reticolazione o estrazione di RNA, minimizzando così la perdita di campioni e l'incompatibilità del buffer.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza, l'accoppiamento intermolecolare delle basi tra le sequenze di aptamero di broccolo diviso è stato misurato quantitativamente tramite il segnale DFHBI-1T, dimostrando la compatibilità di DFHBI-1T con il protocollo di clustering in vitro RNA. L'estensione dell'accoppiamento intermolecolare delle basi variava a seconda delle condizioni di ripiegamento dell'RNA, come osservato in condizioni di co-folding e separate folding (Figura 1F e Figura 2Di–2Dii). Questi risultati indicano che le condizioni di ripiegamento dell'RNA influenzano criticamente le interazioni intermolecolari con l'RNA e dovrebbero essere attentamente considerate nell'interpretazione dei risultati sperimentali.

Questo saggio fornisce anche una piattaforma per valutare se le sequenze che affianchano i reporter superiore e inferiore migliorano l'accoppiamento intermolecolare di basi, come dimostrato con lo shu. La fluorescenza del DFHBI-1T era più alta per shu-top con shu^anti-bottom e shu^anti-top con shu-bottom rispetto a shu-top con shu-bottom o shu^anti-top con ^{shu anti-bottom}, indicando interazioni intermolecolari tra shu e ^{shu anti} potenziano ulteriormente il segnale Broccoli. Queste osservazioni suggeriscono che il segnale di fluorescenza DFHBI-1T ottenuto dal co-ripiegamento dei reporter superiore e inferiore da solo non rappresenta il limite superiore del saggio.

La fluorescenza del DFHBI-1T misurata in questi esperimenti ha coperto un ampio intervallo dinamico, da un aumento di 1,04 volte (shu-top con shu-bottom sotto piegamento separato) a un aumento di 82,60 volte (shu^anti-top con shu-bottom in condizioni di co-folding). Questo intervallo dinamico consente di rilevare differenze nelle interazioni intermolecolari degli RNA tra gli RNA che trasportano questi reporter.

Diversi passaggi di questo protocollo sono fondamentali per la rilevazione efficace dell'accoppiamento intermolecolare di basi di RNA tra gli RNA superiori e inferiori di broccoli divisi nei cluster di RNA. Nuove aliquote di PEG 8000 dovrebbero essere utilizzate per indurre in modo affidabile il clustering dell'RNA, e i cicli ripetuti di congelamento-disgelo dovrebbero essere minimizzati a causa dell'instabilità dei reagenti. DFHBI-1T deve essere allicitata e conservata a −20 °C per preservare le proprietà di fluorescenza. I prodotti della trascrizione in vitro devono essere analizzati su un gel di RNA denaturante prima del clustering per confermare la dimensione corretta del trascripto. Inoltre, mantenere condizioni prive di RNasi, inclusi un ambiente di lavoro pulito e una camera di imaging, è essenziale perché le gocce di RNA vengono incubate a temperatura ambiente per lunghi periodi prima dell'imaging clinico.

Una limitazione di questo saggio è che DFHBI-1T riporta specificamente l'accoppiamento intermolecolare di basi mediato dalle sequenze superiore e inferiore. Altri eventi di accoppiamento intermolecolare di basi che si verificano in diverse regioni di RNA non possono essere rilevati. Inoltre, la struttura di broccolo formata dall'accoppiamento di basi tra i filamenti superiore e inferiore è termodinamicamente^{stabile 26} e potrebbe non riflettere completamente interazioni più deboli o transitorie, come quelle formate da basi disperse esposte alla superficie, come osservato nei cluster 4 di mRNA dei granuli germinali di Drosophila^.

Inoltre, le interazioni intermolecolari RNA–RNA possono essere promiscue e aspecifiche, e sequenze che affianchano i reporter superiore e inferiore possono influenzare la fluorescenza del DFHBI-1T. Queste regioni laterali possono interagire direttamente con le sequenze dei reporter, inibindo la formazione dei broccoli o alterando la struttura dell'RNA, influenzando così le interazioni tra gli RNA che trasportano i reporter. Di conseguenza, il saggio riflette gli effetti combinati della struttura dell'RNA, dell'accoppiamento top-bottom base, delle interazioni tra sequenze di fiancheggiamento e delle interazioni tra sequenze di fiancheggiamento e i reporter.

Questo saggio offre opportunità per future indagini. Ad esempio, alterare sequenze di RNA che affianchano i reporter, introdurre elicasi o accompagnatori di RNA, o modificare le condizioni saline possono influenzare l'accoppiamento intermolecolare di basi nei cluster di RNA. Tali effetti possono essere valutati misurando il segnale DFHBI-1T in condizioni di co-folding e separato. Dato che aptameri a RNA simili sono stati utilizzati in cellule, batteri e^lieviti 26,27,28,29,30, questo approccio può essere esteso a sistemi cellulo-cellulo o organismi modello per esaminare l'accoppiamento intermolecolare di basi in cluster di mRNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Uomo MgCl2	Millipore Sigma	M1028	Utilizzato per la preparazione di 10 e volte; Buffer di ripiegamento dell'RNA.
2M KCl	Thermo Fisher Scientific	AM9640G	Utilizzato per la preparazione di 10 e volte; Buffer di ripiegamento dell'RNA.
50% PEG 8000	NEB	M0204S	Componente del kit di legasi di RNA T4; usata come reagente di affollamento molecolare per indurre il clustering dell'RNA. & nbsp;
Etanolo assoluto, 200 proof	Thermo Fisher Scientific	T038181000CS	Utilizzato per la preparazione del buffer di lavaggio di RNA.
Fenolo acido:cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)	Thermo Fisher Scientific	AM9722	Usato per la purificazione dell'RNA.
Aminoallile-UTP-Cy5	Jena Bioscienza	NU-821-CY5	Utilizzato per la marcatura dell'RNA durante la trascrizione in vitro.
Vetrata di copertura camerata	Thermo Fisher Scientific	155409PK	Camera di imaging per reazioni di clustering RNA.
Cloroformio	Thermo Fisher Scientific	C298-500	Usato per la purificazione dell'RNA.
DFHBI-1T	Lucerna	410	Utilizzato come fluoroforo per la rilevazione dell'aptamero dell'RNA del broccolo.
DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345	Anidro; grado biologia molecolare; utilizzato per la preparazione al DFHBI-1T.
DNA Pulito & Kit Concentratore	Zymo	D4014	Utilizzato per la pulizia dei prodotti a base di DNA prima della trascrizione di T7.
Kit per l'estrazione del gel di DNA	NEB	T1020L	Usato per l'estrazione del gel.
Bagno a secco	Benchmark Scientific	BSH1001	Utilizzato per riscaldare campioni di RNA in tubi microcentrifughe.
FIJI/ImageJ	NIH (Istituti Nazionali di Salute)	N/A	software open source per l'analisi delle immagini; utilizzato per la quantificazione dell'intensità di fluorescenza e l'analisi del ROI.
Sistema di elettroforesi su gel	Thermo Fisher Scientific	B2-BP	Usato per l'elettroforesi in gel del DNA.
Tintura di carico gel, viola (6 volte)	NEB	B7024S	Utilizzato come colorante di caricamento per l'elettroforesi del gel di DNA.
Microscopio a illuminazione istantanea strutturata	VisiTech internazionale	VT-iSIM	Un microscopio confocale in grado di visualizzare GFP e fluorescenza Cy5.
Isopropanolo	Thermo Fisher Scientific	327272500	Usato per la purificazione dell'RNA.
Kit di trascrizione MEGAscript T7	Thermo Fisher Scientific	AM1334	Utilizzato per la trascrizione in vitro T7. Il kit include soluzioni nucleotidiche (ATP, CTP, GTP, UTP) e DNasi.
Tubi microcentrifughe	Genesee Scientific	22-284	Tubo da 1,5 mL; utilizzata per memorizzare modelli di DNA per trascrizione in vitro, prodotti a RNA e aliquote di spermina e DFHBI-1T.
Mini centrifuga	Benchmark Scientific	Z763845	Usato per centrifugazioni brevi.
Spettrofotometro Nanodrop One	Thermo Fisher Scientific	13-400-518	Spettrofotometro di microvolume per misurare la concentrazione e la qualità di DNA e RNA.
Acqua priva di nucleasi	Thermo Fisher Scientific	AM9937	Utilizzato per la risospensione di pellet di RNA, la preparazione di lavaggio e ripiegamento di RNA buffer, e la diluizione di spermina e DFHBI-1T.
Calcolatore online di massa molare	New England Biolabs (NEB)	N/A	Strumento online utilizzato per calcolare la massa di RNA dalla quantità molare (ad esempio, pmol).
Tubi PCR in polipropilene	Corning	3745	200 & mu; Tubi L PCR utilizzati per PCR, trascrizione in vitro e reazioni di clustering dell'RNA
Alimentazione di base PowerPac	Bio-rad	1645050	Usato per l'elettroforesi in gel del DNA.
Ciclatore termico Proflex PCR	Thermo Fisher Scientific	44-840-73	Utilizzato per PCR, trascrizione in vitro e riscaldamento di campioni di RNA in tubetti PCR.
Q5 Alta Fedeltà 2 volte; Master Mix	NEB	M0492S	Usato come 2 volte; Master mix ad alta fedeltà.
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	5424R	Utilizzato per la purificazione e la pelletazione dell'RNA. & nbsp;
Soluzione di decontaminazione RNase	Thermo Fisher Scientific	AM9782	Utilizzato per pulire banchi di laboratorio e superfici per minimizzare la contaminazione da RNasi.
Spermina  Tetraidrocloruro	Sigma-Aldrich	S1141-1G	Utilizzato per indurre il clustering dell'RNA.
Tris Base	Millipore Sigma	T1503-1KG	Utilizzato per la preparazione del tampone Tris (pH 7,0).
Agarosio ultrapuro	Thermo Fisher Scientific	16500500	Utilizzato per l'elettroforesi del gel del DNA.