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Articolo di ricerca
Le emulsioni lipidiche a base di olio d'oliva mitigano la miocardite indotta da inibitori del checkpoint immunitario mirando alla via NF-κB/NLRP3/IL-1β, dimostrando il loro potenziale nel sopprimere le cascate infiammatorie. Questi risultati ne evidenziano il potenziale come terapia aggiuntiva per lesioni cardiache legate al sistema immunitario.
Il presente studio mirava a indagare l'efficacia terapeutica e il meccanismo sottostante delle emulsioni lipidiche a base di olio d'oliva (OOLE) nella mitigazione della miocardite indotta da inibitori del checkpoint immunitario (ICI) scatenate da ipilimumab (IPI) e nivolumab (NIVO). Un modello in vitro dei cardiomiociti infiammatori è stato stabilito co-coltivando cellule HL-1 con cellule T CD4⁺/CD8⁺ isolate da topi trattati con ICI. Le cellule sono state trattate con OOLE al 10%, seguite da citometria di flusso per l'apoptosi, ELISA per il profiling delle citochine (TNF-α, IL-1β, IL-6) e Western blot/qPCR per l'analisi delle vie (NF-κB, NLRP3, IL-1β). In vivo, la miocardite è stata indotta nei topi tramite somministrazione IPI/NIVO (IPI/NIVO ). La funzione cardiaca è stata valutata tramite ecocardiografia e i marcatori infiammatori sono stati valutati nei tessuti sierici e miocardici. I risultati hanno mostrato che OOLE ha ridotto significativamente l'apoptosi indotta dalle cellule T e ha soppresso la produzione di citochine infiammatorie nelle cellule HL-1, mentre l'espressione di NF-κB, NLRP3 e IL-1β è stata sottoregolata. In vivo, OOLE ha migliorato i parametri funzionali del ventricolo sinistro e attenuato l'infiammazione sistemica. Le analisi molecolari hanno confermato che questi effetti protettivi erano mediati dall'inibizione dell'asse di segnalazione NF-κB/NLRP3/IL-1β. In conclusione, OOLE mitiga la miocardite acuta indotta da ICI mirando alla via NF-κB/NLRP3/IL-1β, dimostrando il suo potenziale nel sopprimere le prime cascate infiammatorie e fornire una rapida cardioprotezione. Questi risultati ne evidenziano il potenziale come terapia aggiuntiva per lesioni cardiache legate al sistema immunitario.
Gli inibitori dei checkpoint immunitari (ICI), come quelli che mirano alla morte cellulare programmata 1 (PD-1) e la proteina citotossica associata ai linfociti T 4 (CTLA-4), hanno rivoluzionato il panorama terapeutico di varie neoplasie. Tuttavia, l'applicazione clinica diffusa delle ICI è spesso complicata dagli eventi avversi correlati al sistema immunitario (IRAE). Tra queste, la miocardite indotta da ICI è una complicanza rara ma potenzialmente fatale, caratterizzata da un rapido decorso clinico e alti tassi di mortalità che variano dal 25% al 50%1,2. Nonostante la sua gravità, le attuali opzioni terapeutiche per la miocardite indotta da ICI rimangono in gran parte limitate a corticosteroidi ad alto dosaggio e immunosoppressoriaspecifici 3,4. Questi interventi tradizionali spesso producono risposte subottimali e possono compromettere l'efficacia antitumorale degliICI 1, creando una lacuna di conoscenza critica nella ricerca di strategie cardioprotettive più sicure e mirate che possano mitigare l'infiammazione cardiaca senza immunosoppressione sistemica.
L'inflamosoma della proteina recettore simile a NOD 3 (NLRP3), attivata tramite la via di segnalazione NF-κB, è emersa come motore centrale della tempesta di citochine osservata nella miocardite indotta daICI 5,6. Una produzione eccessiva di citochine pro-infiammatorie, in particolare IL-1β e IL-6, porta a gravi lesioni cardiomiocitariche e insufficienzacardiaca 7. Sebbene siano stati esplorati diversi interventi a base di lipidi nelle malattie cardiovascolari, il potenziale delle emulsioni lipidiche a base di olio d'oliva (OOLE) in questo contesto specifico rimane inesplorato. L'OOLE è ricco di acido oleico, un acido grasso monoinsaturi noto per la sua capacità unica di modulare la fluidità della membrana e sopprimere le cascateinfiammatorie 8,9. Tuttavia, non è stato stabilito se l'OOLE possa migliorare specificamente lo stato iper-infiammatorio caratteristico della miocardite indotta da ICI.
In questo studio, miriamo a colmare questa lacuna indagando sul potenziale terapeutico dell'OOLE. Ipotizziamo che OOLE eserciti un potente effetto cardioprotettivo inibindo l'asse di segnalazione NF-κB/NLRP3/IL-1β, sopprimendo così l'ondata infiammatoria e preservando la funzione cardiaca. Combinando un modello di co-coltura in vitro di cardiomiociti HL-1 e cellule T con un modello murino in vivo. di miocardite indotta da ICI, dimostriamo che l'intervento OOLE fornisce un rapido recupero funzionale e mitiga la lesione miocardica. Questo studio fornisce la prima evidenza dell'OOLE come nuovo approccio farmacologico nutrizionale mirato alla gestione della cardiotossicità correlata all'ICI.
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Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico Animale della Guangzhou Miles Biotechnology Co., Ltd., con il numero di approvazione IACUC-MIS2023076. L'azienda menzionata è un centro di sperimentazione animale; I nostri esperimenti sugli animali vengono condotti qui e sono quindi soggetti a revisione da parte del Comitato Etico del Centro.
Animali e progettazione sperimentale
Trenta topi BALB/c (maschi, 8 settimane, con un peso di 22 ± 2 g) sono stati acquistati commercialmente. Criteri di induzione e validazione del modello: Un modello di miocardite indotta da inibitore del checkpoint immunitario (ICI) è stato stabilito tramite iniezione endovenosa di ipilimumab (5 mg/kg) e nivolumab (10 mg/kg) per 2 settimane consecutive. La dosaggio avveniva ogni 3 giorni, per una durata totale di modellazione di 2 settimane. Questo protocollo è stato precedentemente dimostrato di indurre una significativa lesione cardiaca mediatadal sistema immunitario 10. A 24 ore dall'iniezione finale, i campioni di sangue venivano raccolti tramite il plesso retro-orbitale e centrifugati a 300 x g per 15 minuti a 4 °C per isolare il siero; successivamente, i livelli sierici di cTnT sono stati quantificati utilizzando uno specifico kit ELISA, che prevede passaggi sequenziali di carico del campione, incubazione di anticorpi coniugati con HRP, lavaggio automatico e reazione del cromogeno TMB, con la densità ottica misurata a 450 nm per calcolare le concentrazioni basandosi su una curva logistica a quattro parametri, e una concentrazione di cTnT di ≥10 ng/mL è stata considerata un modello di successo.
Sei topi modello con il peso corporeo e la concentrazione di cTnT più vicini sono stati divisi casualmente in due gruppi: un gruppo di controllo e un gruppo di trattamento (n=3 per entrambi, replicazione biologica). Il gruppo di controllo ricevette iniezioni endovenose giornaliere di soluzione fisiologica normale a una dose di 5 mL/kg. Il gruppo di trattamento ha ricevuto iniezioni endovenose giornaliere di emulsione lipidica (OOLE) al 5% di olio d'oliva a una dose di 5 mL/kg tramite la vena caudal per 6 giorni (questo rappresenta il dosaggio che utilizziamo per il trattamento clinico all'interno della nostra istituzione; è stato estrapolato per l'uso nei topi in base ai rapporti della superficie corporea). I seguenti test sono stati eseguiti in una finestra di osservazione di 6 giorni: la funzione cardiaca è stata valutata al punto di partenza (giorno 0) e dopo il trattamento (giorno 6) utilizzando un sistema di imaging fotoacustico a ultrasuoni. Il sangue è stato raccolto tramite la vena retroorbitale al giorno 6 e le citochine sieriche sono state quantificate da ELISA. Dopo l'eutanasia degli animali con un'overdose di anestesia, il tessuto cardiaco è stato congelato rapidamente per l'analisi proteica.
Isolamento delle cellule T
I topi del gruppo di controllo sono stati soppressi con un'overdose di anestesia. Le milze sono state espulse asetticamente dopo una sterilizzazione superficiale di 5 minuti con etanolo al 75%, e tutti i tessuti connettivi sono stati rimossi. Le milze sono state dissociate meccanicamente utilizzando un filtro cellulare da 70 μm con PBS integrato con FBS al 2% per creare una sospensione a singola cellula. Questa sospensione è stata poi centrifugata a 300 x g ., 4 °C per 5 minuti, e gli eritrociti sono stati lisati con 1 mL di ACK Lysing Buffer per 2 minuti a temperatura ambiente. Il processo di lisi è stato terminato lavando con PBS. Le cellule T sono state arricchite negativamente per prevenire l'attivazione utilizzando un kit di isolamento per cellule T del topo. Per ogni 10 milioni di cellule, sono stati aggiunti 50 μL di cocktail di selezione e incubati a temperatura ambiente per 10 minuti. A questo è seguito l'aggiunta di 75 μL di perle magnetiche di streptavidina ogni 10 milioni di celle, con un'incubazione di 5 minuti. Le cellule legate alla perla sono state trattenute tramite un magnete per 3 minuti, e le cellule T arricchite (con oltre il 94% di purezza) sono state prelevate dal soprandante. Per la selezione dei sottoinsiemi CD4⁺ e CD8⁺, le cellule arricchite sono state colorate con anticorpi anti-CD3ε-PE, anti-CD4-APC e anti-CD8-FITC per 15 minuti al buio, poi lavate 3 volte con PBS pre-raffreddato. L'ordinamento veniva eseguito su un citometro di flusso utilizzando la seguente strategia di gate: linfociti (FSC/SSC), poi sottoinsiemi CD3⁺, poi CD4⁺ o CD8⁺. Le celle sono state ordinate in modalità purezza in tubetti di raccolta pre-riempiti con 200 μL di PBS, ottenendo sottoinsiemi target con purezza superiore al 98%.
Costruzione e trattamento del modello cellulare della miocardite
Le cellule HL-1 sono state coltivate in mezzo DMEM/F12 integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (PS) in condizioni standard (37 °C, 5% CO₂). Le cellule sono state suddivise in tre gruppi: gruppo di controllo (non trattato), gruppo modello (cellule HL-1 trattate con cellule T CD4+/CD8+ per 24 ore) e gruppo OOLE (gruppo modello co-trattato con OOLE al 10% per 24 ore).
ELISA per la rilevazione sierica delle proteine correlate a lesioni miocardiche
Incubare 50 μL di campione di siero nei pozzi di micropiastre pre-rivestiti e ricchi di anticorpi del kit per 30 minuti, poi lavare tre volte con PBST per rimuovere i componenti non legati. Aggiungere la soluzione preparata di avidina marcata con peroxidasi di rafano (HRP) per una seconda incubazione. Lavare ancora tre volte con PBST, aggiungere 100 μL di substrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) per iniziare la reazione colorimetrica e terminare la reazione con 100 μL di soluzione di stop entro 30–45 minuti dall'inizio. Misurare l'assorbanza (OD) a 450 nm usando un lettore di micropiastre e quantificare la concentrazione dell'analita bersaglio usando una curva standard tracciata con standard di riferimento noti.
Tachia occidentale
I tessuti cardiaci venivano polverizzati utilizzando un omogeneizzatore tessutale con azoto liquido. Successivamente, sia i campioni di tessuto che quelli cellulari sono stati lisati in 200 μL di tampone RIPA su ghiaccio per 30 minuti. I lisati sono stati centrifugati a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C per raccogliere proteine supernagenti. Le concentrazioni proteiche sono state determinate utilizzando un kit di analisi proteica BCA. Dopo aver regolato la concentrazione proteica a 5 μg/μL, i campioni sono stati miscelati con tampone di carico 5× e denaturati riscaldando a 95 °C per 10 minuti. Le proteine sono state separate su gel SDS-PAGE al 10% (applicate a 100 V per 90 minuti) e successivamente trasferite nelle membrane PVDF tramite elettroblotting semi-secco a 15 V per 30 minuti. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% e poi sondate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari (inclusi IL-1β, NLRP3, MyD88, NF-κB p65 e Tubulina; diluizione 1:1.000)2. Dopo aver lavato le membrane tre volte per 10 minuti ciascuna con soluzione salina Tris-buffer contenente 0,1% di Tween 20 (TBST), sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (diluizione 1:10.000) per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche venivano visualizzate applicando un substrato a chemiluminescenza avanzata (ECL) e i segnali venivano catturati tramite un sistema di imaging chemiluminescenze. Infine, i livelli di espressione relativa sono stati analizzati quantitativamente normalizzando i valori densitometrici delle bande proteiche target al controllo interno della Tubulina tramite il software ImageJ.
Analisi dell'apoptosi cellulare tramite citometria di flusso
Le cellule HL-1 sono state lavate 2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Per la dissociazione cellulare, è stato aggiunto 1 mL di tripsina e incubato per 1 minuto, seguito immediatamente da una neutralizzazione con 2 mL di mezzo di coltura completo. La sospensione a celle veniva poi centrifugata a 250 x g per 5 minuti a 4 °C, e il sovrantantante veniva scartato. Il pellet cellulare raccolto è stato lavato 2 volte con PBS ghiacciato e risospeso in un tampone di legame 1x per ottenere una densità cellulare di 1 x 106 cellule/mL. Un'aliquota da 100 μL di questa sospensione cellulare è stata trasferita in un tubo di citometria a flusso, seguita dall'aggiunta di 5 μL di FITC-Annessin V e 5 μL di iodio propidio (PI). Dopo un vortice delicato, la miscela veniva incubata per 15 minuti a temperatura ambiente (25 °C) al buio. Infine, sono stati aggiunti 400 μL di buffer di legame 1x a ciascun tubo e l'apoptosi cellulare è stata successivamente analizzata utilizzando un citometro a flusso. Per la strategia di gating, gli eventi sono stati inizialmente programmati con scatter frontale (FSC) e side scatter (SSC) per escludere detriti subcellulari e isolare la popolazione intatta di cellule HL-1. All'interno di questa porta primaria, le cellule apoptotiche venivano quantificate tramite analisi dei quadranti, con le prime celle apoptotiche definite come FITC-Annessina V⁺/PI⁻ e quelle apoptotiche tarde definite come FITC-Annessina V⁺/PI⁺.
Analisi statistica
Ogni esperimento è stato condotto in triplice e l'analisi statistica è stata condotta utilizzando software statistici. Le differenze tra i due gruppi sono state analizzate utilizzando il test t a campioni indipendenti; le differenze tra tre o più gruppi sono state analizzate utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test post-hoc di Bonferroni. I dati sono espressi come media ± errore standard (SEM). P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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La combinazione di ipilimumab e Novolumab induce la miocardite indotta da ICI in un modello animale
Per stabilire un modello di miocardite indotta da ICI, ai topi BALB/c sono state somministrate iniezioni endovenose di ipilimumab (5 mg/kg) e nivolumab (10 mg/kg) tramite la vena caudale. I livelli sierici di troponina cardiaca T (cTnT) sono stati successivamente misurati utilizzando un saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA). Un livello di cTnT ≥ 10 ng/mL è st...
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In questo studio, abbiamo dimostrato per la prima volta che le emulsioni lipidiche a base di olio d'oliva (OOLE) attenuano efficacemente la miocardite indotta dall'inibitore del checkpoint immunitario (ICI) sopprimendo la via di segnalazione IL-1β/NLRP3/NF-κB. I nostri risultati forniscono sia prove meccanicistiche che funzionali che OOLE non solo migliora la funzione cardiaca, ma allevia anche l'infiammazione miocardica sia in vivo che in vitro. modelli di miocardite i...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Questo lavoro è stato supportato dal Guangzhou Science and Technology Plan Project (Numero del fondo: 202201020040), dalla International Science Foundation dell'Ospedale del Cancro Fuda di Guangzhou (Numero del fondo: Y2023-ZD-05).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Membrane PVDF da 0,22um | Millipore | ISEQ00010 | |
| 4% di paraformaldeide | Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd. | BL539A | |
| Topi BALB/c | Guangdong Zhiyuan Biomedicine Technology Co., Ltd. | ||
| Kit per il test BCA | Dingguo Biotech | BCA02 | |
| Microscopia a campo chiaro | MSHOT | ml31 | |
| Kit elisa cTnT | lunchangshuobiotech | ED-28107 | |
| Apparecchiature di elettroforesi | WIX | miniPro4 | |
| Sistema di Analisi delle Immagini a Chimiluminescenza Completamente Automatizzato | FUJIFILM | LAS-3000 | |
| kit di ematossilina-eosina & nbsp; | Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd. | BL2236A | |
| IFN-γ Kit ELISA | Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, Cina). | ED-10284 | |
| IL-1 e beta; Anticorpo | Affinità | BF8021 | |
| IL-1 e beta; Kit ELISA | Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, Cina). | ED-10351 | |
| Kit IL-6 ELISA | Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, Cina). | ED-10377 | |
| Software ImageJ 1.54 | NIH | ||
| Ipilimumab | MCE | CAS: 477202-00-9 | |
| Anticorpo MyD88 | Affinità | AF5195 | |
| NF-& kappa; Anticorpo B p65 | Affinità | BF8005 | |
| Nivolumab | MCE | CAS: 946414-94-4 | |
| Anticorpo NLRP3 | Affinità | BF8029 | |
| Emulsione lipidica a base di olio d'oliva | il Dipartimento di Nutrizione dell'Ospedale Oncologico Fuda di Guangzhou | ||
| Apparecchiatura a pellicola rotante semi-secca rapida | Bio-Rad | 788BR04132 | |
| Sistema quantitativo qPCR a fluorescenza in tempo reale | YARUI | MA-6000 | |
| Buffer di lisi RIPA | Beyotime | P0013B | |
| Microtomo rotatorio | Leica | RM2235 | |
| Gel SDS-PAGE | Beyotime | P0052A, P0053A | |
| Il kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-FITC/PI | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd. | MA0220-1 | |
| il kit di isolamento delle cellule T Fluide CD4>< EasySep Mouse CD4+ | Stemcell | 19765 | |
| La linea cellulare di cardiomiociti di ratto HL-1 | Guangzhou All-perfect Biotechnology Co., Ltd. | TCM-C783 | |
| TNF-α Kit ELISA | Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, Cina). | ED-11776 | |
| Sistema di imaging fotoacustico a ultrasuoni | Fujifilm VisualSonics | VEvo3100 | |
| Sistema di test urodinamico | Techman | BL-420 |
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