Un protocollo semplificato per la microscopia di localizzazione a singola molecola nei nuclei di Arabidopsis

Summary

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro efficiente per l'imaging microscopico di localizzazione a singola molecola di nuclei isolati di Arabidopsis, utilizzando isolamento, fissazione e marcatura ottimizzati per ottenere una visualizzazione affidabile su scala nanometrica della cromatina e della RNA Polimerasi II. Questo approccio può essere facilmente adattato ad altre proteine associate alla cromatina o modifiche agli istoni per immagini ad alta risoluzione.

Abstract

Sebbene la microscopia a fluorescenza confocale abbia fornito preziose intuizioni sull'organizzazione della cromatina nei nuclei delle piante, la sua risoluzione limitata dalla diffrazione limita l'indagine sull'architettura della cromatina, motivando l'uso di tecniche di super-risoluzione come la Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM). Tra questi approcci, la microscopia di ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) fornisce risoluzione su scala nanometrica nelle singole cellule, consentendo una visualizzazione precisa dei domini della cromatina, delle modifiche degli istoni e dell'organizzazione nucleare. Sebbene tali metodi vengano sempre più applicati nei sistemi mammiferi, il loro impiego nella biologia vegetale rimane limitato, principalmente a causa di sfide tecniche nella preparazione del campione.

Qui presentiamo un flusso di lavoro semplificato e riproducibile per l'imaging SMLM di nuclei isolati da Arabidopsis thaliana. Questo protocollo inizia con la fissazione delle piantine per preservare la morfologia nucleare, seguita da taglio delicato dei tessuti e centrifugazione per arricchire i nuclei intatti. I nuclei isolati vengono poi marcati con fluorofori in mezzo liquido e immobilizzati su cuscinetti di agarosio a bassa fusione, una strategia che migliora la stabilità durante sessioni prolungate di imaging con singola molecola. Questi passaggi minimizzano collettivamente la fluorescenza di fondo, migliorano la coerenza dell'etichettatura e aumentano la riproducibilità tra repliche biologiche.

Le preparazioni risultanti offrono una maggiore chiarezza per visualizzare le modifiche della cromatina e l'architettura nucleare negli impianti. Abbassando le barriere tecniche all'implementazione dell'imaging SMLM in Arabidopsis, questo protocollo fornisce un mezzo versatile per indagare la regolazione epigenetica, l'organizzazione della cromatina e le variazioni topologiche nucleari su scala nanometrica. Questo lavoro stabilisce una base metodologica per l'applicazione della SMLM alle piante, colmando il divario con la biologia cellulare dei mammiferi e aprendo nuove opportunità per studiare come l'architettura nucleare contribuisca alla regolazione del genoma in risposta a segnali di sviluppo e ambientali nei sistemi vegetali.

Introduction

La microscopia è da tempo una pietra angolare per lo studio dell'organizzazione della cromatina e dell'architettura nucleare, rivelando come il DNA e le proteine associate all'istona si dispongano nello spazio nucleare 3D e influenzino la regolazione^{genica 1,2}. La microscopia a fluorescenza convenzionale ha fornito preziose informazioni su domini di cromatina su larga scala come territori cromosomici, cromocentrici e corpi^{nucleari 3,4}, fattibili in situ, in particolare nei tessuti radicali delle

Protocol

NOTA: Le informazioni dettagliate sui materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo sono disponibili nella Tabella dei Materiali. Salvo diversa specificazione, i tamponi vengono eliminati su filtri apirogenici da 0,2 μm. In tutto questo protocollo viene_{utilizzato H}2-puro ultra-puro doppio distillato (_{ddH 2}O). I passaggi di centrifugazione vengono eseguiti in microtubi da 1,5 mL utilizzando un rotore ad angolo fisso.

1. Fissazione dei nuclei e rilascio dei nuclei da parte delle piantine

1. Posizionare una piastra di coltura a 6 pozz....

Results

Il protocollo descritto sopra consente la preparazione di nuclei di alta qualità di Arabidopsis thaliana adatti per la SMLM. Sono stati condotti diversi cicli di ottimizzazione per migliorare l'integrità nucleare e ridurre i detriti citoplasmatici e cellulari che compromettono la qualità dell'immagine. Dopo ogni fase di ottimizzazione, la qualità delle preparazioni nucleari veniva valutata tramite imaging confocale utilizzando un microscopio a disco rotante Olympus IX81 prima di.......

Discussion

La preparazione dei nuclei di Arabidopsis thaliana per la microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) richiede diversi passaggi critici che influenzano fortemente la qualità finale del campione. Come descritto in^{precedenza 19,35}, è essenziale un taglio dei tessuti accurato e costante per massimizzare il recupero dei nuclei intatti. L'uso di lame microtomiche invece delle tradizionali lame da rasoio produce un.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo anti-RNA polimerasi II CTD ripetizione YSPTSPS (fosfo S2)	Abcam	AB5095	Anticorpo primario utilizzato a diluizione 1/200 nel tampone immunocolorante per visualizzare la forma attiva della polimerasi (anticorpo policlonale elevato nel coniglio)
Software di acquisizione	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Albumina Sirica Bovina	Sigma-Aldrich	A7906
Catalasi	Sigma-Aldrich	C40
Agarosio certificato a bassa fusione	Bio-Rad	1613111
Copertura spessore 1,5H round	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glucosio, anidro, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Specchio dicroico	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Specchio dicroico per separazione eccitazione/emissione
Dulbecco' s Fosfato Salino Tampizzato 10 & acuto;	BioWest	X0515 - 500	Lavoro in condizioni sterili
Lame Epredia Ultra Usa e Getta Microtome	FisherScientific	12191830	Profilo basso, monouso
Piastra di coltura cellulare multipozzetto trattata con TC a 6 pozzi e trasparente trasparente, con coperchio	Falcon	353046
Soluzione formaldeide 37%	Carl Roth	7398	Lavoro sotto la cappa
Glucosio ossidasi	Sigma-Aldrich	G2133
Glicerolo	VWR	24388.295
Anticorpo secondario altamente adsorbito incrociato per capre IgG (H+L), Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Usato a 1/200 come anticorpo secondario accoppiato ad AF647
Soluzione Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	94403	Usato a 1/500 per controcolorare il DNA, aggiunto al tampone di agarosio
Soluzione di acido cloridrico	Laboratorio di Chimica	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Laboratorio Lavis e team di Chimica Aperta (Janelia)	JF549-Hoechst	Usata per controcolorare il DNA, aggiunta al tampone di agarosio a una concentrazione finale di 1,5 nM
Set di tritaminuti KIMBLE Dounce	Sigma-Aldrich	D8938	Tubo da 2 mL con penetti sia grandi (0,0030-0,0050 pollici) che piccoli (0,0005-0,0025 pollici)
Unità laser	Oxxius	L6Cc	Equipaggiato con sei laser: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW e 730 nm - 30 mW
Cloruro di magnesio esaidrato	Carl Roth	HN03
Mercaptoetilamina (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sale di sodio 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Filtro di emissione multibanda	Semrock	FF01-446/523/600/677	Filtrazione a emissione multibanda per bloccare la luce a scattering laser
Nanodiamanti	Adamas Nanotecnologie	NDNV100nmHiWGA2ml	Scorta 1 mg/mL
Fotocamera CMOS digitale ORCA-Fusion	Hamamatsu	C14440-20UP
Placa di Petri, 100/20 mm, PS, trasparente, con prese d'aria, sterile	Greiner Bio-One	664161	Usato per coltivare piante su mezzo substrato MS
Piastra di Petri, quadrata, PS, trasparente, 120/120/17 mm, sterile	Greiner Bio-One	688161	Usata durante il taglio delle piantine
pluriStrainer Mini filtro a celle	pluriSelect	43-10030-50	Dimensione mesh 30 & micro; m, adatto per un tubo Eppendorf da 1,5 mL
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P9333
Filtro di emissione a banda singola	Semrock	FF01-698/70	Filtro di emissione specifico per il canale AF647
Filtro di emissione a banda singola	Chroma	ET600/50m	Filtro di emissione specifico per il canale JF549
Cloruro di sodio (99,5%)	Euromedex	1112-A
Slitte Star-Frost 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Filtro sterile per siringa e oslash; 33 mm porosità 0,2 & micro; m Cono di chiusa Luer	ClearLine	146560
Sistema a super-risoluzione	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 equipaggiato con obiettivo a immersione in olio 100x NA1.5
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Grado Tris Base in Biologia Molecolare	Promega	H5135
Tris(2-carbosxietil)fosfina cloridrato (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Preadolescenti 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodente	13001002	Sigillante in silicone
Forno UVOCS per il sistema di pulizia a ozono ultravioletto	UVOCS Inc.	T10X10	20 minuti di esposizione per la pulizia del coperto & nbsp;
Pompa a vuoto	Vacuubrand	VP 100C
Centrifuga Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific		Rotore TX-400 75003629. Centrifugazione eseguita con tubi di Eppendorf.