Un protocollo semplificato per la microscopia di localizzazione a singola molecola nei nuclei di Arabidopsis

Summary

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro efficiente per l'imaging microscopico di localizzazione a singola molecola di nuclei isolati di Arabidopsis, utilizzando isolamento, fissazione e marcatura ottimizzati per ottenere una visualizzazione affidabile su scala nanometrica della cromatina e della RNA Polimerasi II. Questo approccio può essere facilmente adattato ad altre proteine associate alla cromatina o modifiche agli istoni per immagini ad alta risoluzione.

Abstract

Sebbene la microscopia a fluorescenza confocale abbia fornito preziose intuizioni sull'organizzazione della cromatina nei nuclei delle piante, la sua risoluzione limitata dalla diffrazione limita l'indagine sull'architettura della cromatina, motivando l'uso di tecniche di super-risoluzione come la Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM). Tra questi approcci, la microscopia di ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) fornisce risoluzione su scala nanometrica nelle singole cellule, consentendo una visualizzazione precisa dei domini della cromatina, delle modifiche degli istoni e dell'organizzazione nucleare. Sebbene tali metodi vengano sempre più applicati nei sistemi mammiferi, il loro impiego nella biologia vegetale rimane limitato, principalmente a causa di sfide tecniche nella preparazione del campione.

Qui presentiamo un flusso di lavoro semplificato e riproducibile per l'imaging SMLM di nuclei isolati da Arabidopsis thaliana. Questo protocollo inizia con la fissazione delle piantine per preservare la morfologia nucleare, seguita da taglio delicato dei tessuti e centrifugazione per arricchire i nuclei intatti. I nuclei isolati vengono poi marcati con fluorofori in mezzo liquido e immobilizzati su cuscinetti di agarosio a bassa fusione, una strategia che migliora la stabilità durante sessioni prolungate di imaging con singola molecola. Questi passaggi minimizzano collettivamente la fluorescenza di fondo, migliorano la coerenza dell'etichettatura e aumentano la riproducibilità tra repliche biologiche.

Le preparazioni risultanti offrono una maggiore chiarezza per visualizzare le modifiche della cromatina e l'architettura nucleare negli impianti. Abbassando le barriere tecniche all'implementazione dell'imaging SMLM in Arabidopsis, questo protocollo fornisce un mezzo versatile per indagare la regolazione epigenetica, l'organizzazione della cromatina e le variazioni topologiche nucleari su scala nanometrica. Questo lavoro stabilisce una base metodologica per l'applicazione della SMLM alle piante, colmando il divario con la biologia cellulare dei mammiferi e aprendo nuove opportunità per studiare come l'architettura nucleare contribuisca alla regolazione del genoma in risposta a segnali di sviluppo e ambientali nei sistemi vegetali.

Introduction

La microscopia è da tempo una pietra angolare per lo studio dell'organizzazione della cromatina e dell'architettura nucleare, rivelando come il DNA e le proteine associate all'istona si dispongano nello spazio nucleare 3D e influenzino la regolazione^{genica 1,2}. La microscopia a fluorescenza convenzionale ha fornito preziose informazioni su domini di cromatina su larga scala come territori cromosomici, cromocentrici e corpi^{nucleari 3,4}, fattibili in situ, in particolare nei tessuti radicali delle^{piante 3,5,6}. Tuttavia, queste tecniche sono fondamentalmente limitate dalla barriera di diffrazione della luce, limitando la risoluzione spaziale a circa 200 nm lateralmente e 500 nm^{assialmente 7}. Questa limitazione oscura i dettagli su scala nanometrica del ripiegamento della cromatina, i modelli di modifica degli istones e la compartimentazione trascrizionale che stanno alla base della regolazione epigenetica. Per superare questa barriera, sono stati sviluppati approcci di microscopia a super-risoluzione (SRM) come la microscopia a illuminazione strutturata (SIM⁾⁸, la stimolata emissione a esaurimento (STED^)9,10 e la microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM^)11,12, per raggiungere risoluzioni che vanno da 100 nm fino a pochi^{nm 13}.

Tra le tecniche SRM, la SMLM — inclusa la FotoScopia di Localizzazione ^{Attivata (PALM)13} e la Microscopia a Ricostruzione Ottica Stocastica Diretta (dSTORM) — offre una risoluzione spaziale eccezionale combinata con una specificità molecolare¹⁴. Rilevando le posizioni dei singoli fluorofori nel tempo, SMLM ricostruisce immagini ad alta precisione su scala nanometrica di domini di cromatina, segni di istoria e strutture nucleari in singole^{cellule 15,16}. Questa capacità ha trasformato la ricerca sulla cromatina nei sistemi mammiferi, dove SMLM è stato applicato per visualizzare il clustering dei nucleosomi, la compattazione della cromatina e i modelli di modifica degli istoni con dettagli senza^precedenti 15,16,17. Al contrario, l'applicazione della SMLM ai nuclei vegetali rimane limitata, principalmente a causa di sfide tecniche associate alle proprietà del tessuto vegetale—come l'elevata autofluorescenza, la rigidità della parete cellulare e la presenza di composti che diffondono la luce come l'amido e la^{clorofilla 18}. Inoltre, la natura delicata dei nuclei durante l'isolamento e l'etichettatura richiede flussi di lavoro ottimizzati per mantenere l'integrità strutturale e minimizzare la fluorescenza di fondo durante sessioni di imaging prolungate.

Il protocollo descritto qui è stato originariamente sviluppato da Elizabeth Kracik-Dyer e Célia Baroux per la microscopia a espleimento di emissione stimolata (STED^{) 19}. Successivamente è stato ottimizzato e adattato per soddisfare i requisiti specifici dell'imaging STORM con l'integrazione di conoscenze provenienti da applicazioni microbiologiche^pubblicate 20,21,22. L'obiettivo generale è fornire un flusso di lavoro snello e riproducibile per l'imaging SMLM dei nuclei isolati di Arabidopsis thaliana. Integrando fissazione ottimizzata, delicata interruzione meccanica e marcatura dei fluorofori in sospensione, questo metodo preserva la morfologia nucleare rimuovendo efficacemente i contaminanti citoplasmatici che spesso compromettono la qualità dell'imaging. L'immobilizzazione dei nuclei marcati su pad di agarosio a bassa fusione garantisce stabilità meccanica durante l'acquisizione, consentendo l'imaging a lungo termine su singola molecola con precisione nanometrica. Rispetto ai protocolli SRM descritti in precedenza per i nuclei delle piante — in particolare quelli basati sulla microscopia^{STED 19,23} — questo flusso di lavoro utilizza fluorofori fotocommutabili (ad esempio AF647, JF549), riduce la fluorescenza di fondo grazie a passaggi di lavaggio che eliminano clorofilla e detriti tissuti, e migliora l'omogeneità dell'etichettatura aggiungendo direttamente le molecole di marcatura ai nuclei fissi e permeabilizzati. Di conseguenza, consente una visualizzazione coerente delle modifiche della cromatina, dei compartimenti nucleari e dei pattern epigenetici nei singoli nuclei. Abbassando le barriere tecniche all'implementazione della SMLM nelle piante, questo metodo amplia l'accessibilità dell'imaging su scala nanometrica e fornisce una base per studiare come l'organizzazione della cromatina e l'architettura nucleare contribuiscano alla regolazione genica in risposta a segnali di sviluppo e ambientali.

Protocol

NOTA: Le informazioni dettagliate sui materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo sono disponibili nella Tabella dei Materiali. Salvo diversa specificazione, i tamponi vengono eliminati su filtri apirogenici da 0,2 μm. In tutto questo protocollo viene_{utilizzato H}2-puro ultra-puro doppio distillato (_{ddH 2}O). I passaggi di centrifugazione vengono eseguiti in microtubi da 1,5 mL utilizzando un rotore ad angolo fisso.

1. Fissazione dei nuclei e rilascio dei nuclei da parte delle piantine

1. Posizionare una piastra di coltura a 6 pozzi sul ghiaccio sotto la cappa dei fumi, poi aggiungere a ciascun pozzo circa 4 mL di soluzione di fissazione ghiacciata preparata improvvisamente sotto una cappa (formaldeide stabilizzato con metanolo al 4% (v/v), 0,1% Triton X-100 in 1× soluzione salina tamponata con fosfato [PBS]).
2. Utilizzando una pinza pulita, rimuovere le piantine (tra 8 e 15 giorni dopo la germinazione) coltivate su sali solidi (0,8% agar) a mezza forza Murashige e Skoog Medium 2,2 g/L, 1% di saccarosio (p/v), pH 5,7, come descritto per le piantine di SM nel riferimento²⁴, e immergerle immediatamente nella soluzione di fissazione. Utilizzare un pozzo per circa 20 piantine (erano necessari 3 pozzi per ottenere materiale sufficiente per ogni campione).
3. Metti la piastra nella camera a vuoto riempita di ghiaccio e applica un vuoto a pressioni che oscillano tra 0,2 bar e 0,8 bar per 15 minuti per rimuovere l'aria intrappolata e permettere una penetrazione profonda del fissativo nei tessuti^{della pianta 25}. Rilascia lentamente il vuoto, mescola il campione e poi applica il vuoto per altri 15 minuti.
4. Sotto la cappa fumi, rimuovere la soluzione di fissazione con una pipetta e lavare ogni pozzo 3 volte per 10 minuti con una delicata agitazione, usando 5 mL di PBS ghiacciato.
5. Rimuovere PBS e usare le pinze per trasferire il tessuto fisso in una piastra di Petri da 120 mm × 120 mm. Aggiungere alle piantine fissate 50 μL di Nuclei Isolation Buffer (NIB), preparato come descritto da Kracik-Dyer e Baroux (45 mM MgCl₂, 20 mM MOPS, 30 mM citrato di sodio, 0,3% Triton X-100). Regola al pH 7 usando 1 N HCl)¹⁹. Scolpisci con una lama.
   NOTA: Le lame a microtomo si sono rivelate più efficienti delle lamette convenzionali per questo compito.
6. Raschia il tessuto tagliato su un bordo della piastra di Petri con la stessa lama e aggiungi 600 μL di puntino (NIB), assicurandoti di rimuovere anche eventuali tessuti attaccati alla lama.
7. Trasferire la suspense di tessuto nel tubo omogeneizzatore Dounce da 2 mL e strofinare 5–10 volte con il penello più piccolo, poi con il pestello più grande finché non si muove dolcemente all'interno del tubo (di solito servono anche 5–10 colpe).
8. Filtrare il campione omogeneizzato risultante attraverso un filtro a rete da 30 μm in un microtubo da 1,5 mL.
9. Centrifuga la sospensione per 10 minuti a 800 × g usando la rampa più bassa sia per l'accelerazione che per la decelerazione. Un piccolo pellet bianco è visibile tra i detriti di tessuto verde.
10. Scartare il sovrantato e risospendere il pellet a 150 μL di NIB.
11. Centrifuga di nuovo per 10 minuti a 800 × g e rimuovi il soprantantante. Se ci sono detriti verdi visibili, lava una seconda volta. Risospendere da 50 μL a 150 μL di NIB, in base alla dimensione del pellet.
12. Conservare la sospensione dei nuclei isolati risultante a 4 °C per un massimo di 1 settimana prima di eseguire la colorazione. Tuttavia, si consiglia di procedere immediatamente.

2. (Immuno)colorazione

NOTA: Nei passaggi seguenti, il protocollo viene applicato a un volume di 50 μL di sospensione dei nuclei, tipicamente corrispondente a 20 piantine. Salvo indicazione, i seguenti passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente.

1. Centrifuga la soluzione per 10 minuti a 800 × g e elimina il soprantantante. Fai attenzione a non toccare il pellet.
2. Risospendere i nuclei pipettando delicatamente 50 μL di tampone bloccante (143 mM NaCl, 4% BSA in PBS, immagazzinato a 4 °C). Incubare per 30 minuti con una delicata agitazione.
3. Centrifugare la soluzione per 10 minuti a 800 × g e scartare il surnatante senza toccare il pellet dei nuclei.
4. Risospendere i nuclei tramite pipetto delicato a 50 μL di 1× PBS. Centrifuga di nuovo per 10 minuti a 800 × g. Scartate il soprantantante come sopra.
5. Risospendere i nuclei in 50 μL di soluzione primaria di anticorpi preparata in tampone immunocolorante composto da 143 mM di NaCl, 1% di BSA, 0,05% Tween 20 in PBS (diluizioni di anticorpi e di lavoro sono dettagliate nella Tabella dei Materiali). Incubare i campioni per 60 minuti con una delicata agitazione.
6. Procedi con 2 lavaggi (ripeti i passaggi 2.3 e 2.4).
7. Risospendere i nuclei in 50 μL di anticorpo secondario anti-coniglio di capra AF647 a diluizione^{1/200 26}. Avvolgi i tubi in carta stagnola per proteggere il fluoroforo dalla luce. Incubare i tubi per 60 minuti con una delicata agitazione.
8. Procedi con 2 lavaggi (ripeti i passaggi 2.3 e 2.4).
9. Sospensa il pellet in 50 μL di NIB. Conserva la sospensione in microtubi da 1,5 mL avvolti in carta stagnola. L'etichettatura è stabile per diverse settimane a 4 °C.

3. Montaggio

1. Per l'imaging STORM, preparare una soluzione di agarosio a bassa fusione (LMA 1,5% p/v) sciogliendo la polvere in un tampone B 1,25× composto da 50 mM di Tris pH 8, 10 mM di NaCl, 10% di glucosio. Prepara 1,25× soluzione di scorzo e conserva a 4 °C.
2. Riscalda a 90 °C per 1 minuto per sciogliere la polvere e ottenere una soluzione trasparente. Raffreddare e mantenere la soluzione LMA fusa a 37 °C prima di passare al passo successivo per evitare la denaturazione termica del tampone glucosio ossidasi (GLOX) (preparare 10 soluzioni stock conservate a -20°C composte da 100 mM di pH Tris 7,5, 25 mM KCl, 1 mM di pH TCEP 7,0, 5 mg/mL di glucosio ossidasi e 0,4 mg/mL di Catalase, 50% contro Glicerolo).
3. Dopo che la soluzione LMA raggiunge i 37 °C, prepara il tampone STORM aggiungendo 100 mM di Mercaptoetilamina (MEA) e GLOX alla soluzione LMA calda per ottenere 1× concentrazione finale. Conserva la soluzione di macchino MEA 1 M fino a 1 mese a 4 °C, ma si consiglia l'uso di una soluzione fresca preparata. Mescola delicatamente.
   NOTA: Per la marcatura opzionale del DNA, aggiungere 1,5 nM (concentrazione finale, 1 mM di soluzione standard in DMSO) dell'Hoechst coniugato JF549. Mantieni la sospensione a 37 °C fino all'uso.
4. Mescola delicatamente la sospensione dei nuclei con nanodiamanti a 1/1500 di diluizione. Incubali con il campione per 5 minuti.
   NOTA: I nanodiamanti fungono da marcatori fiduciali per correggere la deriva del campione.
5. Deposa 10 μL della miscela su un copertura trattato con ozono da 1,5 ore (20 min nel sistema di pulizia con ozono Ultravioletto) e attendi 3 minuti per lasciare che i nuclei si depositino sul copertore.
6. Rimuovi l'eccesso di liquido, aspetta 2 minuti. Aggiungere 10 μL dell'LMA preparato al passo 3.3 alla copertura e coprire immediatamente con un vetrino microscopico.
7. Sigilla la copertura usando sigillante siliconico. Mescola quantità uguali di soluzione A e B in una piccola piastra di Petri usando una punta di micropipetta. Applica la miscela sui bordi della copertura per sigillare il campione. Il sigillante siliconico si indurisce entro 5 minuti.
8. Una volta montata, eseguire l'imaging dei vetrini senza ritardo, infine nelle successive 4–5 ore, per evitare la perdita delle proprietà di assorbimento dell'ossigeno del pad di montaggio.

4. Imaging

NOTA: I parametri di imaging devono essere ottimizzati con attenzione in base alla natura del campione, alle proprietà fotofisiche dei fluorofori e alla configurazione ottica del microscopio. È fondamentale garantire un alto rapporto segnale-rumore per ogni fluoroforo, minimizzando al contempo il flusso spettrale e l'eccitazione incrociata tra canali fluorescenti. I campioni sono stati osservati con un microscopio a fluorescenza invertita dotato di un obiettivo ad immersione in olio ad alto NA 100x, un'unità di mantenimento del fuoco e un LED bianco per l'imaging in campo chiaro. Le marcature fluorescenti AlexaFluor647 (AF647) sono state attivate a 640 nm e JF549-Hoechst a 561 nm. La luce emessa è stata filtrata con uno specchio dicroico compatibile e filtri passa-banda, e infine sono state raccolte immagini con una fotocamera scientifica Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (sCMOS).

1. Monta il vetrino campione e trova la messa a fuoco. Attiva un modulo di mantenimento del focus se il sistema ne ha uno (altamente consigliato per acquisizioni lunghe).
2. Trova e concentrati su un nucleo. È meglio avere uno o pochi nanodiamanti vicino al nucleo di interesse per correggere in modo più efficiente la deriva durante la ricostruzione.
3. (Opzionale) Cattura istantanee limitate dalla diffrazione del campo luminoso e di ogni canale fluorescente a bassa potenza laser.
4. Quando si effettua imaging a due colori, si inizia con l'acquisizione del canale a lunghezza d'onda più lunga e poi si passa al canale a lunghezza d'onda più corta (cioè acquisire il canale AF647 prima di JF549).
   NOTA: Esempio di parametri di acquisizione utilizzati in questo lavoro:
   Canale A - etichettatura epitopo - AF647
   Tempo di esposizione: 20 ms
   Intensità laser: 640 nm – 2,2 kW/^{cm 2}
   Modalità eccitazione: HiLo²⁷
   Canale B - Marcatura del DNA - JF549-Hoechst
   Tempo di esposizione: 50 ms
   Intensità laser: 561 nm - 1 kW/^{cm 2}
   Modalità eccitazione: Epi
   Numero di immagini registrate: 10.000-30.000 per canale, garantendo che la densità di fluorofori per fotogramma rimanga sufficientemente scarsa per una localizzazione accurata su singola molecola, mentre il numero cumulativo di localizzazioni è stato determinato empiricamente utilizzando Super-resolution QUANTITATIVE Image Rating and Reporting of Error Locations (SQUIRREL)²⁸, che indica anche il numero sufficiente di fotogrammi.

Results

Il protocollo descritto sopra consente la preparazione di nuclei di alta qualità di Arabidopsis thaliana adatti per la SMLM. Sono stati condotti diversi cicli di ottimizzazione per migliorare l'integrità nucleare e ridurre i detriti citoplasmatici e cellulari che compromettono la qualità dell'immagine. Dopo ogni fase di ottimizzazione, la qualità delle preparazioni nucleari veniva valutata tramite imaging confocale utilizzando un microscopio a disco rotante Olympus IX81 prima di procedere all'acquisizione a supe...

Discussion

La preparazione dei nuclei di Arabidopsis thaliana per la microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) richiede diversi passaggi critici che influenzano fortemente la qualità finale del campione. Come descritto in^{precedenza 19,35}, è essenziale un taglio dei tessuti accurato e costante per massimizzare il recupero dei nuclei intatti. L'uso di lame microtomiche invece delle tradizionali lame da rasoio produce un...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody	Abcam	ab5095	Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit )
Acquisition software	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Certified Low Melting Agarose	Bio-Rad	1613111
Coverslips thickness 1.5H round	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glucose, anhydrous, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Dichroic mirror	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Dichroic mirror for excitation/emission separation
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´	biowest	X0515 - 500	Work in sterile conditions
Epredia Ultra Disposable Microtome Blades	FisherScientific	12191830	Low profile, single use
Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	Falcon	353046
Formaldehyde solution 37%	Carl Roth	7398	Work under the fume hood
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Glycerol	VWR	24388.295
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Used at 1/200 as secondary antibody coupled to AF647
Hoechst 33258 solution	Sigma-Aldrich	94403	Used at 1/500 to counterstain the DNA, added to the agarose pad
Hydrochloric Acid Solution	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)	JF549-Hoechst	Used to counterstain DNA, added to the agarose pad at 1.5 nM final concentration
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	2 mL tube with both large (0.0030-0.0050 inch) and small (0.0005-0.0025 inch) clearance pestles
Lasers unit	Oxxius	L6Cc	Equipped with six lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW and 730 nm - 30 mW
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	HN03
Mercaptoethylamine (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sodium salt 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Multiband emission filter	Semrock	FF01-446/523/600/677	Multiband emission filtration to block laser scatter light
Nanodiamonds	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Stock 1 mg/mL
ORCA-Fusion Digital CMOS camera	Hamamatsu	C14440-20UP
Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterile	Greiner Bio-One	664161	Used to grow plants on 1/2 MS medium
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile	Greiner Bio-One	688161	Used when chopping the plant seedlings
pluriStrainer Mini cell strainer	pluriSelect	43-10030-50	Mesh size 30 µm, suitable for 1.5 mL Eppendorf tube
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Single band emission filter	Semrock	FF01-698/70	Specific emission filter for AF647 channel
Single band emission filter	Chroma	ET600/50m	Specific emission filter for JF549 channel
Sodium chloride (99,5%)	Euromedex	1112-A
Star-Frost slides 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Sterile syringe filterø 33 mm porosity 0.2 µm Luer Lock cone	ClearLine	146560
Super-resolution system	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 equipped with 100x NA1.5 oil-immersion objective
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001002	Silicone sealant
Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS oven	UVOCS Inc.	T10X10	20 min exposure for coverslip cleaning
Vacuum pump	Vacuubrand	VP 100C
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Scientific		Rotor TX-400 75003629. Centrifugation performed with Eppendorf tubes.