Articolo metodologico

Isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscolo scheletrico murino e midollo osseo tramite cromatografia a esclusione di dimensioni

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DOI:

10.3791/70894

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23 giugno 2026

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1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscoli scheletrici murini e midollo osseo tramite digestione enzimatica e cromatografia a esclusione di dimensioni, consentendo il recupero riproducibile di frazioni arricchite da vescicole da tessuti strutturalmente complessi e a basso rendimento per l'analisi molecolare a valle.

Abstract

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono particelle nanodimensionate e legate ai lipidi che mediano la comunicazione intercellulare attraverso il trasferimento di proteine, lipidi e acidi ribonucleici (RNA). L'isolamento delle sEV da tessuti solidi come il muscolo scheletrico (SkM) e il midollo osseo (BM) rimane difficile a causa della bassa resa e della contaminazione da componenti non vescicolari. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro riproducibile per isolare le sEV da SkM e BM del topo. SkM viene digerito enzimaticamente, mentre BM viene processato direttamente e successivamente sottoposto a centrifugazione differenziale e cromatografia a esclusione di dimensione (SEC). Per SkM, il volume vuoto (~2,5 mL) viene scartato e i successivi ~1,6 mL vengono raccolti come frazioni arricchite da EV, tipicamente suddivise in frazioni sequenziali da 400 μL (F1–F4). Per BM, viene scartato un volume vuoto di 700 μL, seguito dalla raccolta di una frazione arricchita da EV da ~850 μL, che può essere suddivisa in frazioni sequenziali di ~170 μL (F1–F5) e aggregata in base all'arricchimento dei marcatori EV. Con questo approccio, le sEV possono essere isolate da piccoli volumi tissutali (circa 500 μL da un singolo quadricipite e 150 μL da una fascia madre di femore e tibia aggregate), ottenendo ~108 particelle·mL−1·mg−1 tessuto con diametri delle particelle prevalentemente <200 nm. L'integrità e la purezza delle vescicole vengono validate tramite microscopia elettronica a trasmissione, analisi del tracciamento delle nanoparticelle e Western blotting per i marcatori EV canonici, con ulteriore caratterizzazione tramite rilevamento interferometrico a singola particella per quantificare le sottopopolazioni di vescicole definite dalla tetraspanina. Questo metodo consente l'isolamento riproducibile di sEV ad alta purezza da tessuti strutturalmente complessi utilizzando materiale input minimo, supportando analisi molecolari e funzionali a valle delle vescicole derivate dal tessuto.

Introduzione

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono particelle nanodimensionate e legate ai lipidi che mediano la comunicazione intercellulare attraverso il trasferimento di proteine, lipidi e acidinucleici 1. Sono rilasciati da tutti i tipi cellulari e sono presenti praticamente in tutti i fluidi biologici, dove fungono da portatori chiave di carichi bioattivi, inclusi peptidi e microacidi ribonucleici (RNA)2. Il loro carico è selezionato in modo selettivo, consentendo la consegna precisa di segnalispecifici 3, e la loro struttura vescicolare consente loro di bypassare i tipici vincoli di gradiente e diluizione dei fattori liberamente secreti consegnando carichi molecolari concentrati su lunghedistanze 4. Sebbene i veicoli elettrici provenienti da biofluidi (ad esempio, plasma, siero e saliva) forniscano una comoda istantanea della segnalazione sistemica, rappresentano una popolazione altamente mista proveniente da moltitessuti 5. Questo rende difficile determinare quale organo stia generando un segnale biologico specifico o come la comunicazione EV venga regolata a livello tissutale. Poiché i veicoli elettrici circolanti sono raggruppati insieme, i cambiamenti specifici del tessuto possono essere diluiti o mascherati, limitando la capacità di identificare la vera fonte deisegnali 6.

Il muscolo scheletrico (SkM) e il midollo osseo (BM) sono tessuti principali attivi metabolicamente e funzionalmente con composizioni cellulari distinte e ruoli disegnalazione 7,8. Entrambi i tessuti possono rilasciare popolazioni di EV arricchite con carichi unici specifici per tessuto; tuttavia, questi segnali possono essere facilmente oscurati nel plasma dagli EV provenienti da tessuti ad alto ricambio come le celluleimmunitarie 8,9. Isolare direttamente le EV dal muscolo o dalle evacuazioni cerebrali aumenta la sensibilità e permette di individuare sottili adattamenti specifici per tessuto che potrebbero non essere osservabili in circolazione. Le EV derivate dai tessuti forniscono quindi informazioni complementari essenziali, rivelando quando un organo specifico rilascia EV, quanto a lungo quei segnali persistono e quali adattamenti sono acuti o cronici. Nonostante il crescente interesse per i veicoli elettrici, la maggior parte dei metodi di isolamento consolidati è stata sviluppata per i biofluidi (ad esempio, plasma e siero) o sistemi di coltura cellulare. In questi contesti, i veicoli elettrici possono essere ottenuti con una resa relativamente elevata e una minima interruzione strutturale. Tuttavia, isolare direttamente i veicoli elettrici da tessuti solidi come SkM e BM presenta notevoli sfide tecniche. Questi tessuti sono strutturalmente complessi ed eterogenei, richiedendo passaggi meccanici o enzimatici, che possono introdurre artefatti, inclusi alti livelli di proteine solubili, frammenti di organello e nanoparticelle non vescicolari, rendendo difficile ottenere preparazioni EV ad alta purezza.

Un'altra sfida importante nell'isolamento degli EV derivati dal tessuto è la mancanza di flussi di lavoro standardizzati per la definizione e separazione delle frazioni10. La centrifugazione differenziale da sola spesso porta al co-isolamento di aggregati proteici e grandi vescicole di grandi dimensioni, mentre i metodi basati su ultracentrifugazione, sebbene ampiamente utilizzati, possono portare all'aggregazione, alla deformazione e al recupero variabile delle vescicole a seconda del tipo di rotore e delle condizioni sperimentali. Gli approcci a gradiente di densità migliorano la purezza ma richiedono molto tempo, richiedono bassa produttività e sono difficili da standardizzare nei laboratori11. Di conseguenza, attualmente non esiste un metodo ampiamente adottato e riproducibile ottimizzato per isolare piccoli EV da tessuti solidi ad alta purezza e rendimentocostante 10.

La cromatografia a esclusione di dimensione (SEC) si è emersa come un'alternativa promettente all'isolamento EV perché separa le particelle in base alla dimensione senza sottoporre le vescicole a forti forze centrifughe. La SEC consente una separazione efficiente di piccoli EV da proteine solubili e contaminanti a basso peso molecolare, preservando al contempo l'integrità della vescicola e la funzione biologica. È importante sottolineare che la SEC consente una definizione chiara delle frazioni di eluzione, consentendo l'identificazione riproducibile delle frazioni arricchite da EV e una maggiore consistenza tra gliesperimenti 12. Tuttavia, i flussi di lavoro SEC richiedono un'attenta ottimizzazione per i campioni derivati dal tessuto, in particolare per quanto riguarda l'elaborazione a monte, la rimozione dei detriti e la raccolta delle frazioni. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un protocollo riproducibile e standardizzato per isolare i sEV da SkM e BM. Questo metodo integra una digestione enzimatica controllata per i tessuti fibrosi, centrifugazione differenziale per la rimozione dei detriti e purificazione basata su SEC per isolare vescicole ad alta purezza. Il flusso di lavoro è specificamente ottimizzato per minimizzare la contaminazione da componenti intracellulari, preservando l'integrità della vescicola e consentendo un recupero costante da tessuti a basso rendimento.

Questo protocollo colma una lacuna metodologica critica fornendo un approccio pratico e scalabile per isolare le SVE derivate dal tessuto con frazionamento definito e purezza validata, ottenuto tramite analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), Western blotting dei marcatori EV canonici, microscopia elettronica per la valutazione morfologica e analisi EV a particella singola tramite cattura di anticorpi, dimensionamento interferometrico e imaging a fluorescenza multicanale. È particolarmente adatto per studi che richiedono analisi EV specifica per tessuto, dove le vescicole derivate da biofluidi sono insufficienti per risolvere l'origine cellulare dei segnali. I ricercatori dovrebbero utilizzare questo metodo quando l'obiettivo è ottenere sEV ad alta purezza da tessuti solidi con contaminazione minima e integrità della vescicola preservata. Al contrario, i metodi basati su ultracentrifugazione possono essere preferiti per applicazioni ad alto rendimento dove la purezza è meno critica, e si possono selezionare approcci basati sul gradiente di densità nell'isolare specifiche sottopopolazioni EV nonostante una portata inferiore. Insieme, questo protocollo fornisce un quadro standardizzato per l'isolamento e la caratterizzazione delle sEV derivate dal tessuto, consentendo analisi molecolari, biochimiche e funzionali riproducibili a valle.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la Cura degli Animali dell'Università McGill (DOUG10029) e condotte in conformità con le linee guida del Consiglio Canadese per la Cura degli Animali.

1. Protocollo di isolamento sEV (SkM-sEV) derivato da SkM

  1. Raccolta di campioni e dissociazione dei tessuti
    1. Prelievo e conservazione dei tessuti
      1. Congelare subito il tessuto SkM dopo l'escissione immergendolo in metilbutano preraffreddato.
        NOTA: Per preparare il metilbutano preraffreddato, metti un contenitore di metilbutano in un bagno di ghiaccio secco e aggiungi gradualmente piccoli pezzi di ghiaccio secco direttamente nel liquido. Lascia raffreddare la soluzione, la temperatura è tipicamente compresa tra −70°C e −80°C. Mantenere il metilbutano nel bagno di ghiaccio secco durante l'uso per preservare la temperatura. Immergi il tessuto per circa 3–4 secondi fino a quando non è completamente congelato, come indicato dall'indurimento totale e dalla perdita di flessibilità.
      2. Trasferisci il tessuto ai cryoviali.
      3. Metti i campioni su ghiaccio secco.
        NOTA: Conservare i campioni a −80°C fino a ulteriori lavorazioni. Evita cicli ripetuti di congelamento-disgelo. Il rapido congelamento rapido preserva efficacemente i veicoli elettrici quando i campioni sono sigillati correttamente. La disidratazione o il danno alla vescicola possono verificarsi se i tessuti restano esposti o subiscono più cicli dicongelamento-disgelo 13.
    2. Dissociazione tissutale
      NOTA: Esegui tutti i passaggi in un armadio di biosicurezza utilizzando strumenti sterili e guanti per prevenire contaminazioni, che altrimenti potrebbero compromettere la purezza degli EV.
      1. Pesi il tessuto
        1. Sterilizza le pinzette con etanolo al 70% e lasciale asciugare all'aria.
        2. Trasferire il tessuto congelato su una ciotola di coltura per la sospensione pre-pesata.
        3. Pesa il tessuto usando un bilancio di milligrammi (tipicamente ~80–120 mg per campione, a seconda dell'età e del sesso del topo).
          NOTA: Il protocollo è validato per masse tissutali di input di ~80–120 mg. Per campioni all'interno di questo intervallo, utilizzare i volumi di reagenti specificati nei Passaggi 1.2.3.1, 1.3.1.3 e 1.3.2.1 senza modifiche. Per campioni al di fuori di questo intervallo, si scala proporzionalmente tutti i volumi dei reagenti alla massa tissutale mantenendo il rapporto validato di RPMI-1640, collagenasi D e DNasi I (1000:40:4 μL per tessuto da 100 mg). Questo corrisponde a circa 10 μL RPMI-1640, 0,4 μL di collagenasi D (stock 100 mg/mL) e 0,04 μL di DNasi I (stock di 20.000 U/mL) per mg di tessuto. Mantieni queste proporzioni per preservare le concentrazioni enzimatiche finali durante la reazione. L'efficienza digestione e la resa EV dovrebbero essere validate empiricamente quando si lavora sostanzialmente al di fuori dell'intervallo 80–120 mg.
        4. Riporta il campione in un tubo già raffreddato e lascialo in ghiaccio.
      2. Prepara enzimi
        1. Scongelare aliquote di collagenasi D (stock da 100 mg/mL) e DNase I (stock da 20.000 U/mL) su ghiaccio (vedi File Supplementare 1, Passo 1.4 per la preparazione del stock enzimatico). Questi enzimi vengono aggiunti nello Passo 1.3.2.1 per raggiungere concentrazioni finali in reazione di 3,8 mg/mL di collagenasi D e 77 U/mL di DNasi I. Il volume finale di digestione è di 1,044 mL.
        2. Mescola DNasi I delicatamente per inversione. Non fare vortice.
      3. Preparazione dei tessuti per la digestione
        1. Aggiungere 800 μL di RPMI-1640 a una piastra sterile di coltura della sospensione posta sul ghiaccio.
        2. Trasferisci il tessuto nel piatto.
        3. Taglia il tessuto in 6–8 pezzi di dimensioni approssimativamente uniformi (2–3 mm per lato) usando un bisturi sterile usa e getta. Stabilizzare il tessuto con pinze sterili durante il taglio per garantire una frammentazione uniforme. Completate questo passaggio entro 1 minuto per campione per mantenere la coerenza tra i campioni.
        4. Tieni la ciotola sul ghiaccio durante tutta la procedura per minimizzare il degrado.
    3. Trasferimento tissutale e digestione enzimatica
      1. Trasferimento di tessuto
        1. Taglia l'estremità di una punta sterile di pipetta P1000 usando una lama sterile per produrre un'apertura di 2–3 mm di diametro, sufficiente a permettere il libero passaggio dei frammenti di tessuto generati nello Passo 1.2.3.3.
          NOTA: In alternativa, utilizzare punte di pipetta a foro largo (orifizio) da 1 mL disponibili in commercio, che forniscono un'apertura standardizzata (tipicamente ~2–3 mm di diametro interno) ed eliminano la variabilità associata alla rifinitura manuale.
        2. Trasferire i frammenti di tessuto e il mezzo RPMI-1640 in tubi pre-etichettati da 1,5 mL utilizzando una pipetta P1000 dotata della punta modificata. Eseguire 2–3 aspirazioni successive per recuperare frammenti residui e il mezzo. Ispezionare visivamente la piastra e la punta della pipetta dopo il trasferimento e utilizzare pinze sterili per trasferire eventuali frammenti rimanenti, assicurandosi che non rimangano tessuti visibili.
        3. Aggiungi 200 μL di RPMI-1640 a ciascun tubo.
      2. Digestione enzimatica
        1. Aggiungere 40 μL di collagenasi D stock (100 mg/mL) e 4 μL di DNase I stock (20.000 U/mL) a ciascun tubo proveniente da aliquote scongelate sul ghiaccio. Questo produce concentrazioni finali durante la reazione di 3,8 mg/mL di collagenasi D e 77 U/mL di DNasi I. Per campioni al di fuori dell'intervallo di tessuto 80–120 mg, regolare proporzionalmente i volumi enzimatici, come descritto nella NOTA successiva al Passo 1.2.1.3.
          NOTA: Questi volumi sono calibrati per masse tissutali nell'intervallo tipico di 80–120 mg. Per masse tissutali fuori da questo intervallo, scalare proporzionalmente tutti i volumi dei reagenti come descritto nella NOTA successiva Passo 1.2.1.3 (0,4 μL collagenasi D stock e 0,04 μL DNasi I stock per mg di tessuto), preservando così le stesse concentrazioni finali di enzimi in reazione indipendentemente dalla massa tissutale.
        2. Aggiungi gli enzimi a tutti i campioni contemporaneamente quando si elaborano più campioni.
        3. Tieni i tubi sul ghiaccio durante l'aggiunta di enzimi.
        4. Inverti delicatamente i tubi per mescolarli. Non fare vortice.
        5. Incubare i tubi a 37°C per 30 minuti su un miscelatore nutante (24 giri/min, angolo di inclinazione di 20°; vedi Tabella dei Materiali). Assicurati di mescolare in modo uniforme durante l'incubazione.
          NOTA: Digerire ogni campione in un volume totale di 1,044 mL (1000 μL RPMI-1640, 40 μL collagenasi D e 4 μL DNasi I per campione; equivalente a ~25:1 rapporto tampon-collagenasi).
    4. Rimozione dei detriti
      NOTA: Avviare l'equilibrio della colonna SEC all'inizio della prima centrifugazione (Passo 1.4.1.1). La colonna SEC richiede 20–25 minuti per il lavaggio e l'equilibrio. Iniziare l'equilibrio in questo punto garantisce che la colonna sia pronta per il carico del campione immediatamente dopo il completamento del passaggio di filtrazione (Passo 1.4.3).
      1. Prima centrifugazione
        1. Centrifugare i campioni a 300 × g per 10 minuti a 4°C per pelletare detriti non digeriti, cellule intatte e frammenti di tessuto residui.
        2. Trasferire con attenzione il surnatante in nuovi tubi sterili da 1,5 mL per microcentrifuga senza disturbare il pellet.
      2. Seconda centrifugazione
        1. Centrifugare i campioni a 2.000 × g per 15 minuti a 4°C per pelletare detriti grandi, cellule morte, corpi apoptotici e vescicole grandi.
        2. Trasferire con attenzione il surnatante in nuovi tubi sterili da 1,5 mL per microcentrifuga senza disturbare il pellet.
          NOTA: La seconda centrifugazione è opzionale e dovrebbe essere inclusa quando è necessaria la rimozione di ulteriori detriti. Esegui questo passaggio se il surnatante appare visibilmente torbido o contiene residui di particolato dopo la prima centrifugazione. Questo passaggio è inoltre raccomandato se preparati precedenti hanno mostrato contaminazione da marcatori intracellulari (ad esempio, Calnexin o BiP) in frazioni SEC arricchite da EV o la presenza di particelle non vescicolari tramite microscopia elettronica a trasmissione. La necessità di questo passaggio dovrebbe essere convalidata durante l'ottimizzazione iniziale del protocollo per ciascun tipo di tessuto.
      3. Filtrazione
        1. Pre-umidificare i filtri cellulari sterili da 30 μm risciacquandoli con RPMI-1640 per bilanciare la membrana e minimizzare la perdita di campioni. Getta il risciacquo.
        2. Filtrare ogni campione attraverso il colino cellulare pre-bagnato da 30 μm in tubi microcentrifughe sterili a basso legame proteico da 1,5 mL per rimuovere residui cellulari e particelle grandi prima della SEC.
        3. Lascia che i campioni passino attraverso il filtro per gravità.
        4. Lascia filtrare 10–15 minuti per campione.
          NOTA: La filtrazione è completa quando non rimane alcun liquido visibile sopra la membrana filtrante e il volume del filtrato nel tubo di raccolta si è stabilizzato. Se la filtrazione è più lenta o si stalla, ciò può indicare un ostruzione dovuta a detriti residui; In tali casi, si considera di ripetere il passaggio di chiarificazione o di ridurre il carico del campione.
        5. Raccogliere 550–600 μL di sovrandanzante filtrato per il caricamento successivo sulla colonna SEC. Per coerenza tra i campioni, normalizzare il volume di carico a 500 μL per colonna (vedi Passaggio 2.2.1), indipendentemente dal volume totale recuperato.
  2. Cromatografia a esclusione di dimensione (SEC)
    1. Colonna SEC di equilibrio
      NOTA: Esegui questo passaggio durante la centrifugazione se possibile.
      1. Risciacquare la colonna SEC con 17 mL di 1× PBS (0,22 μm-filtrato).
      2. Lascia passare l'intero volume attraverso la colonna per gravità a una portata attesa di 0,75 mL/min (20–25 min totali per il volume di lavaggio di 17 mL). Portate più rapide o più lente possono indicare un bilanciamento improprio della colonna o un blocco della colonna.
      3. Mantieni la colonna e il PBS a temperatura ambiente (RT, 21°C ± 2°C) durante l'equilibrio per garantire una portata costante e prestazioni ottimali della colonna.
      4. Preparare tubi microcentrifuga a basso legame proteico da 1,5 mL per la raccolta di tutte le frazioni.
      5. Prepara un tubo aggiuntivo per la raccolta del volume vuoto se necessario.
    2. Carico del campione ed eluzione
      1. Carica 500 μL di sovrandante filtrato sulla colonna SEC.
      2. Lascia che il campione entri completamente nella resina. Il punto finale si raggiunge quando il menisco liquido raggiunge la superficie del letto di resina, senza che rimanga alcun liquido visibile sopra la resina mentre la resina rimane visibilmente umida.
      3. Non permettere che il menisco scenda sotto la superficie della resina o che la colonna si prosciughi, poiché ciò introduce aria nel letto di resina e interrompe l'eluzione. Quando il menisco liquido raggiunge la superficie della resina (come definito nello Passo 2.2.2), procedere immediatamente al Passo 2.2.4 senza ritardi.
      4. Aggiungi immediatamente 2 mL di PBS per iniziare l'eluzione.
      5. Raccogli il volume vuoto (~2,5 mL).
      6. Scartare il volume vuoto o trattenerlo come frazione non EV.
      7. Inizia a raccogliere la frazione arricchita da EV immediatamente dopo che il volume vuoto di 2,5 mL è eluzionato.
      8. Raccogliere un totale di 1,6 mL di eluato arricchito con EV seguendo il volume vuoto, sia come una singola frazione continua in un unico tubo sia come frazioni sequenziali che vengono successivamente aggregate.
      9. In alternativa, raccogliere frazioni sequenziali di 0,4 mL per ottimizzare la purezza rispetto alla ressa. Si raccomandano volumi di frazione più piccoli quando è richiesta una purezza più elevata (ad esempio, per analisi proteomiche o applicazioni sensibili a valle), mentre frazioni più grandi possono essere utilizzate per massimizzare la resa complessiva dell'EV.
      10. Valutare le frazioni per l'arricchimento EV utilizzando metodi di caratterizzazione (ad esempio, Western blot per marcatori EV e contaminanti, e NTA) e pool frazioni arricchite EV come definite nella sezione di caratterizzazione.
        NOTA: Mantieni la rubrica in flusso continuo. Quando una frazione sta terminando, aggiungi PBS per mantenere un liquido costante sopra il letto di resina e evitare che la colonna si prosciughi. Utilizzare tubi a basso legame proteico e senza nucleasi per la raccolta.
    3. Concentrazione
      1. Concentrare i campioni EV utilizzando filtri centrifugi (cutoff di peso molecolare di 100 kDa [MWCO]) per applicazioni a valle (ad esempio, sequenziamento RNA, proteomica o Western blot).
      2. Risciacqua i filtri con PBS prima di usarlo.
      3. Centrifugare i campioni a 4.000 × g a 4°C, controllando ogni 2–3 minuti fino a raggiungere il volume finale desiderato (tipicamente 50–100 μL). Utilizzare volumi finali più bassi (ad esempio, ~50 μL) per applicazioni che richiedono concentrazioni e volumi più elevati (ad esempio, ~100 μL) quando si preferisce massimizzare il recupero.
        ATTENZIONE: Evitare la sovraconcentrazione fermando la centrifugazione una volta raggiunto il volume target.
      4. Recupera la retenta con una pipetta delicata.
      5. Registrare i volumi di campioni pre e post concentrazione per stimare il recupero, se necessario. L'NTA può essere utilizzato per valutare la concentrazione delle particelle prima e dopo la concentrazione, se disponibile.
    4. Stoccaggio
      1. Mantenere le frazioni arricchite da EV sul ghiaccio o a 4°C per analisi immediate (ad esempio, NTA e microscopia elettronica a trasmissione [TEM]) e processare entro 24 ore per TEM e entro 48 ore per NTA.
      2. Campioni di EV aliquoti in tubi a basso legame proteico per l'immagazzinaggio.
      3. Conservare i campioni a −80°C per un uso a lungo termine.
      4. Evita cicli ripetuti di congelamento-disgelo.

2. Protocollo di isolamento sEV (BM-sEV) derivato da BM

  1. Raccolta di campioni e dissociazione dei tessuti
    1. Prelievo e conservazione dei tessuti
      1. Non congelare le ossa immediatamente dopo l'escissione, poiché questo indurisce il midollo e complica l'estrazione tramite il metodo del tubo pungente. Invece, mantenere le ossa sul ghiaccio o a 4°C durante brevi periodi di manipolazione prima della lavorazione o del congelamento come descritto nello Passo 3.1.1.4 (posizionamento su ghiaccio secco prima della conservazione a −80°C).
      2. Rimuovere i muscoli e i tessuti connettivi circostanti dalle ossa dissezionate.
      3. Trasferisci le ossa ai cryoviali.
      4. Metti i campioni su ghiaccio secco.
        NOTA: Conservare i campioni a −80°C fino a ulteriori lavorazioni.
    2. Elaborazione BM
      NOTA: Esegui tutti i passaggi in un armadio di biosicurezza utilizzando strumenti sterili e guanti per prevenire contaminazioni, che altrimenti potrebbero compromettere la purezza degli EV.
      1. Prepesa e etichetta i tubi centrifughe da 1,5 mL prima di aggiungere qualsiasi materiale. Calcola la massa del BM confrontando i pesi dei tubi prima e dopo l'estrazione.
      2. Prepara il sistema a tubo pungente inserendo un tubo PCR da 0,2 mL (tappo intatto) in un tubo centrifuga da 1,5 mL con un adattamento aderente. Perforare il fondo del tubo da 0,2 mL una volta con un ago sterile da 16 G tenuto perpendicolare alla base, ottenendo una singola perforazione uniforme di ~1,6 mm di diametro. Prepara un setup per ogni gamba e per topo.
      3. Posiziona la gamba, pulita da tutti i muscoli e i tessuti circostanti, in una piastra di Petri sterile.
      4. Separare femore e tibia tagliando lo spazio articolare.
      5. Taglia entrambe le estremità del femore e della tibia per esporre il midollo rosso. Inserire le ossa nel tubo PCR perforato posizionato all'interno del tubo da 1,5 mL e sigillare l'insieme con parafilm per garantire un sistema sicuro durante la centrifugazione.
      6. Centrifugare i campioni per 10 secondi in una microcentrifuga da banco a circa 8.000 × g, ovvero la posizione più vicina possibile sullo strumento utilizzato, a temperatura ambiente.
      7. Verificare l'estrazione riuscita del midollo con tre criteri: (i) le ossa appaiono visibilmente bianche senza residui di midollo rosso, (ii) il pellet nel tubo inferiore appare rosso scuro e compatto, tipicamente riempiente la punta conica del tubo da 1,5 mL, e (iii) la massa midollica misurata (Passo 3.1.2.9) rientra nell'intervallo atteso di ~15–30 mg per topo.
      8. Riposizionare o ritagliare le ossa e ripetere la breve rotazione se il midollo rosso visibile rimane all'interno dell'osso.
      9. Pesa nuovamente i tubi per determinare la massa del midollo estratto (tipicamente ~15–30 mg per campione, a seconda dell'età del topo, del sesso e dell'efficienza dell'estrazione).
        NOTA: Il protocollo è convalidato per resa midollica di ~15–30 mg per campione. Poiché il volume di risospensione RPMI-1640 è mantenuto costante a 250 μL indipendentemente dalla massa del midollo (Passo 3.1.2.10), la resa EV viene normalizzata alla massa midollosa iniziale misurata durante l'analisi a valle (tessuto particelle·mL−1·mg−1 ). Per campioni sostanzialmente inferiori a 15 mg, midollo di piscina di topi abbinati (stessa età, sesso e osso) prima della risospensione per mantenere un input sufficiente per la caratterizzazione a valle. Per campioni sostanzialmente superiori a 30 mg, si può suddividere il midollo su due risozioni separate da 250 μL ciascuna oppure scalare proporzionalmente il volume RPMI-1640 (~12,5 μL per mg di midollo) per evitare una risospensione incompleta; In entrambi i casi, applicare la stessa normalizzazione per massa durante l'analisi.
      10. Aggiungi 250 μL di RPMI-1640 a ciascun tubo. Mantenere un volume costante tra i campioni indipendentemente dalla massa del midollo per consentire la normalizzazione della resa EV alla massa iniziale del midollo. Tieni i campioni sul ghiaccio.
      11. Risospendere il midollo pipettando delicatamente su e giù 10–15 volte con una pipetta P1000 finché la sospensione appare visivamente omogenea, senza grumi visibili o frammenti di tessuto intatti rimasti. Evitare la pipettura forzata o la formazione di bolle, che potrebbero compromettere l'integrità delle vescicole.
  2. Rimozione dei detriti
    1. Prima centrifugazione
      1. Centrifugare i campioni a 300 × g per 10 minuti a 4°C per pelletare detriti non digeriti, cellule intatte e frammenti di tessuto residui.
      2. Trasferire con attenzione il surnatante in nuovi tubi sterili da 1,5 mL per microcentrifuga senza disturbare il pellet.
    2. Seconda centrifugazione
      1. Centrifugare i campioni a 2.000 × g per 15 minuti a 4°C per rimuovere detriti grandi.
      2. Trasferire con attenzione il surnatante in nuovi tubi sterili da 1,5 mL per microcentrifuga senza disturbare il pellet.
    3. Terza centrifugazione
      1. Centrifugare i campioni a 10.000 × g per 30 minuti a 4°C per rimuovere corpi apoptotici e grandi vescicole di grandi dimensioni.
      2. Trasferire con attenzione il surnatante in nuovi tubi sterili da 1,5 mL per microcentrifuga senza disturbare il pellet.
      3. Assicurarsi che si ottenga un volume finale di 200 μL di soprantantante.
  3. Cromatografia a esclusione di dimensione (SEC)
    1. Preparazione della colonna
      1. Bilanciare la colonna SEC riscafinando con 6 mL di 1× PBS (0,22 μm-filtrato).
        NOTA: Il volume di equilibrio è specifico per colonna e dovrebbe corrispondere al tipo di colonna indicato nella Tabella dei Materiali. Questa colonna richiede un volume di equilibrio di 6 mL, che differisce dalla colonna utilizzata per i campioni SkM.
      2. Lascia passare l'intero volume per gravità.
      3. Mantieni la colonna e il PBS a RT durante l'equilibrio per garantire la portata ottimale e le prestazioni della colonna.
    2. Carico del campione ed eluzione
      1. Carica 150 μL di soprantantante filtrato sulla colonna SEC.
      2. Lascia che il campione entri completamente nella resina. Il punto finale si raggiunge quando il menisco liquido raggiunge la superficie del letto resinico senza alcun liquido visibile sopra la resina mentre la resina rimane umida (come descritto nello Passo 2.2.2).
      3. Non permettere che il menisco scenda sotto la superficie della resina o che la colonna si prosciughi (vedi punto finale definito nel Passaggio 3.3.2.2), poiché ciò introduce aria nel letto di resina e interrompe l'eluzione. Quando il menisco liquido raggiunge la superficie della resina, procedere immediatamente al Passo 3.3.2.4 senza ritardi.
      4. Aggiungi immediatamente 550 μL PBS per iniziare l'eluzione.
      5. Raccogli il volume vuoto (700 μL).
      6. Scartare il volume vuoto o trattenerlo come frazione non EV.
      7. Inizia a raccogliere la frazione arricchita da EV immediatamente dopo che il volume vuoto di 700 μL è eluito.
      8. Raccogli 850 μL di eluato arricchito con EV seguendo il volume vuoto di 700 μL.
      9. In alternativa, raccogliere frazioni sequenziali di circa 170 μL per ottimizzare la purezza rispetto alla ressa.
        NOTA: Sono raccomandati volumi di frazione più piccoli quando è richiesta una purezza più elevata (ad esempio, per analisi proteomiche o applicazioni sensibili a valle), mentre frazioni più grandi possono essere utilizzate per massimizzare la resa complessiva di EV.
      10. Valutare le frazioni per i marcatori EV e le frazioni arricchite da EV in pool secondo necessità.
        NOTA: Mantieni la rubrica in flusso continuo. Quando una frazione sta terminando, aggiungi PBS per mantenere un liquido costante sopra il letto di resina e evitare che la colonna si prosciughi.

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Risultati

Per valutare l'efficacia di questo protocollo nell'isolare le sEV derivate dal tessuto, vengono presentati risultati rappresentativi da campioni di SkM e BM. L'isolamento riuscito è stato definito da (i) l'arricchimento dei marcatori canonici EV (TSG101, CD63, CD81 e CD9) nelle prime frazioni SEC, (ii) la minima rilevazione di contaminanti intracellulari (ad esempio, Calnexin e BiP), (iii) una distribuzione unimodale delle dimensioni delle particelle con la maggior parte delle particelle...

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Discussione

Questo protocollo descrive un approccio robusto e riproducibile per isolare le preparazioni arricchite con sEV direttamente da SkM e BM, due tessuti a basso rendimento e altamente eterogenei. Sebbene l'isolamento EV sia ben consolidato per i biofluidi e i sistemi di coltura cellulare, i metodi standardizzati per i veicoli elettrici derivati dai tessuti restano limitati a causa delle sfide associate alla dissociazione tissutale, alla contaminazione da materiale intracellulare e alla varia...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo Jennie Yang, Dariusz Żurawek e Volodymyr Yerko per l'assistenza tecnica e le discussioni utili. Siamo grati alla piattaforma Center for Applied Nanomedicine, in particolare a Nadim Tawil e Laura Montermini, per il supporto nella caratterizzazione delle vescicole extracellulari e nell'acquisizione dei dati. Ringraziamo anche il personale della struttura per animali, Guylaine Gadoury e Tara Thomson, per il loro aiuto nella gestione dei topi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1.5 mL centrifuge tubeSarstedt72.690.300General microcentrifuge tube used throughout protocol
1.5 mL low-protein-binding tubeSarstedt72.706.600Used for EV handling, SEC fraction collection, and storage
0.2 mL PCR tubeFisher Scientific14-222-262Used for poked-tube bone marrow extraction setup
16 G needleBD305197Used to puncture the 0.2 mL PCR tube
30 µm cell strainerMiltenyi Biotec 130-098-458Used for skeletal muscle sample filtration
70% ethanolSigma-Aldrich1.11727Used to sterilize tweezers
Biosafety cabinetNANAUsed for sterile tissue handling
Bone cutting instrumentFisher Scientific10-001-976Used to separate femur and tibia and expose marrow
Bovine serum albumin (BSA)BioShopALB001Used for Western blot blocking and antibody dilution
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302Used for HEPES buffer preparation
Carbon-coated copper grid, 200-meshSigma-Aldrich930342Used for TEM sample preparation
Centrifugal filter, 100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096Used for EV concentration
Collagenase DRoche11088858001Used for skeletal muscle enzymatic digestion
CryovialSarstedt72.690.300Used for tissue and bone storage
Deionized water (ultrapure)NANAUsed for buffer preparation and TEM washing steps
DNase IRoche11284932001Used for skeletal muscle enzymatic digestion
Dry iceNANAUsed for sample cooling and transport
Enhanced chemiluminescence substrateBiorad1705061Used for Western blot detection
Filter unit, 0.22 µmSarstedt83.3941.501Used to filter PBS where applicable
Forceps / tweezersMilliporeSigmaF3892Used for tissue handling
GlutaraldehydeNANAUsed for TEM fixation
GlycineNANAUsed in TEM grid washing steps
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095Used for DNase I stock preparation
HEPESBioShopHEP001.500Used for HEPES-NaOH buffer preparation
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidinThermo FisherS911Used for Western blot detection
Imaging system for chemiluminescenceBiorad12003153Used to image Western blot membranes
KClBioShopPOC308Used for HEPES buffer preparation
Magnesium chloride (MgCl2)BioShopMAG510.500Used for HEPES buffer preparation
2-MethylbutaneThermo Fisher78-78-4Used for skeletal muscle snap-freezing
Milligram balanceMilliporeSigmaZ741359Used for tissue and marrow weighing
NaClBioShopSOD004.1Used for HEPES buffer preparation
Nano-particle tracking analysis instrumentMalvern PanalyticalNanoSight NS300NanoSight NS300 used for particle sizing and counting
NaOHBioShopSHY500.500Used for pH adjustment
Nitrocellulose membraneBioRad1704271Used for Western blot transfer
Nutating mixerLabnet S0500Used during enzymatic digestion
P1000 pipetteMilliporeSigmaFA10006M-1EAUsed for tissue transfer
Pipette tip, 1 mLSarstedt70.3050.275Tip is trimmed to widen opening for tissue fragment transfer
Phosphate-buffered saline (PBS)WisentINC 811.012-FLUsed throughout protocol; also used for SEC equilibration and elution
Phosphatase inhibitorMilliporeSigma4906845001Used for Western blot lysate preparation
Petri dishMilliporeSigmaCLS351146Used for bone marrow preparation
Polyacrylamide gel, 4–20% gradient stain-freeBioRad4561094Used for Western blot separation
Protease inhibitorMilliporeSigma11697498001Used for Western blot lysate preparation
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR7388-500MLUnsupplemented; no FBS or antibiotics
RIPA buffer, 10×Merck20-188Used for protein extraction for Western blotting
Scalpel, sterile disposableUltident Paragon02-90000-10Used to mince skeletal muscle tissue
SEC column, original 70 nmIZONICO70PUsed for skeletal muscle SEC
SEC column, single 70 nmIZONICS70PUsed for bone marrow SEC
Sodium azideSigma-AldrichS2002Added to PBS for washing the column
Sodium cacodylate bufferNANAUsed for TEM fixation buffer
Luer Slip Single Use Syringe without Needle MedlineSYR101020Used during NTA acquisition if applicable
Transmission electron microscopeFEINATecnai G2 Spirit Twin 120 kV Cryo-TEM used for TEM imaging
Tween-20BioShopTWN508.1Used in PBS-T for Western blotting
Uranyl acetateNANAUsed for TEM negative staining
Whatman filter paperMilliporeSigmaWHA1003055Used to wick excess TEM stain

Riferimenti

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