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Siti sperimentali
Le prove sono state condotte in due siti distanziati 7 km di distanza; I siti sono stati inoculati con trattamenti diversi. Nel primo tentativo, è stata allestita una struttura di net-house con il 40% di ombra presso la Molelwane, North-West University (NWU) Research Farm (25,810°S, 25,630°E, 1276 m) nella Provincia Nord-Occidentale del Sudafrica. Il terreno argilloso rosso era classificato come forma Hutton e conteneva il 75% di sabbia, il 4% di limo e il 21% diargilla. Il secondo esperimento è stato condotto presso la struttura di rete del campus NWU Mafikeng (25.8278 °S, 25.6079 °E, 1276 m). I suoli del secondo sito avevano limoso sabbioso con 82% sabbia, 3% limo, 15% argilla e precedentemente classificati come Arcadia form25. I NP ibridi verdi CuO/ZnO sono stati sintetizzati nel laboratorio del Dipartimento di Chimica, Scuola di Scienze Fisiche e Chimiche, Facoltà di Scienze Naturali e Agricole, NWU, in Sudafrica.
Sintesi di NP ibridi verdi CuO/ZnO
Dieci (10) g di substrato essiccato di fungo esausto di Pleurotus ostreatus (SMS) sono stati aggiunti a 100 mL di acqua deionizzata, riscaldati a 70 °C e mescolati per 2ore e 26. La miscela veniva poi raffreddata a temperatura ambiente, filtrata e 30 mL del filtrato venivano aggiunti a una soluzione contenente 2,5 g di acetato di rame e 2 g di acetato di zinco in 30 mL di acqua distillata. Il pH di questa soluzione è stato regolato a 8 usando idrossido di sodio (NaOH), riscaldato a 80 °C per 2 ore, centrifugato dopo la reazione, asciugato durante la notte in forno e calcinato a 650 °C per 2ore e 26. I NP sintetizzati sono stati caratterizzati e confermati come ibridi ibridi CuO/ZnO verdi.
Campionamento e analisi del suolo
Sono stati raccolti campioni di suolo presso la University Farm di Molelwane e dal sito di sperimentazione del campus a profondità di 0–15 cm e 15–30 cm. Successivamente furono classificati ed esaminati per le loro proprietà fisiche e chimiche, come descritto dal27.
Progettazione sperimentale
Lo studio utilizzò un esperimento fattoriale disposto in un disegno randomizzato a blocchi completi (RCBD) con tre repliche. Per valutare l'efficacia dei NP ibridi CuO-ZnO sintetizzati in verde in diversi scenari di contaminazione, sono state stabilite due modalità di esposizione indipendenti in siti separati: il Sito 1 (North-West University Campus) rappresentava un modello di contaminazione esogena in cui il suolo veniva spruzzato con AFB1 estratto a una velocità di 160 ppb/kg per valutare le capacità dirette di adsorbimento e schermatura traslocazione dei NP. Sito 2 (Molelwane Research Farm): Rappresentava un modello di infezione biologica in cui il suolo veniva inoculato con spore di A. flavus a 160 spore/kg per indagare l'impatto antifungino degli NP sulla produzione de novo di micotossine e sulla successiva assorbimento delle piante. I NP polveriosi sono stati pesati e miscelati uniformemente con 1 kg di terra in un sacchetto di plastica per la piantagione dopo l'inoculazione (sporeAFB 1 o A. flavus ). Ogni trattamento veniva eseguito separatamente e le mani venivano sanificate tra un trattamento e l'altro. Successivamente, furono inizialmente piantati quattro semi di mais in ogni vaso (9 cm di diametro superiore, 6,5 cm di diametro inferiore). Per mantenere tre piantine sane per ogni vaso, le piantine venivano potate una settimana dopo la loro emersione. In conformità con le raccomandazioni per una produzione ottimale di mais derivate dall'analisi del suolo, il suolo è stato fertilizzato. I vasi erano posizionati a spazi inter- e intra-file di 0,75 m × 0,3 m, per un totale di 216 vasi. Il terreno nei vasi veniva annaffiato al 60% della capacità del campo dopo la semina. Campioni di suolo e piante sono stati raccolti in tre fasi di sviluppo: V10 (sviluppo), R1 (fioritura) e R6 (maturità). I campioni venivano poi portati in laboratorio in una ghiaccio riempita di ghiaccio e mantenuti a -20 °C per ulteriori esami. Sacchetti di carta marrone venivano utilizzati per conservare e congelare in profondità i campioni rimanenti di piante per le concentrazioniAFB 1 e altri saggi. I campioni vegetali rimanenti per le concentrazioniAFB 1 e altre analisi sono stati conservati in sacchetti di carta marrone e congelati in profondità fino all'analisi.
Analisi delle aflatossine del mais
I componenti di sviluppo del mais (radice, stelo, foglia e chicco) in varie fasi di crescita venivano raccolti in sacchetti di plastica sterili, etichettati con cura e trasportati in laboratorio. Per mantenere l'integrità dei dati di crescita e garantire osservazioni indipendenti per ogni fase dello sviluppo, è stato implementato un protocollo di campionamento distruttivo. Per eliminare la contaminazione incrociata tra concentrazioni di nanoparticelle e tipi di inoculazione, strumenti di raccolta e guanti sono stati puliti con etanolo al 70% e risciacquati con acqua deionizzata tra ogni gruppo di trattamento. Utilizzando un mortaio e pestello, 10 g di materiale vegetale e 1 g di cloruro di sodio (NaCl) sono stati polverizzati per 10 minuti in 25 mL di metanolo all'80% e acqua distillata al 20%. Per il grano di mais e il nucleo di mais, 25 g di campione macinata e 2,5 g di NaCl sono stati miscelati con 100 mL di acqua distillata all'80% metanolo:20 ad alta velocità per 10 minuti. Successivamente, l'estratto omogeneizzato è stato filtrato attraverso un filtro in microfibra di vetro, seguito da un lavaggio con 20 mL di Tween-2 al 20% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Le aflatossine sono state estratte dalla colonna di affinità immunitaria dopo l'eluzione a una portata di una goccia al secondo, e il sovrantantante (citoplasma) è stato raccolto in una fiala ambrata. Successivamente,AFB 1 e altre aflatossine sono state misurate seguendo il metodo di cromatografialiquida 28 , che prevedeva la derivatizzazione delle aflatossine con una soluzione di o-ftaldialdeide e l'iniezione dei composti derivatizzati in un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Il sistema HPLC era dotato di un rivelatore di fluorescenza Jasco FP-920 impostato su eccitazione a 362 nm e emissione di 425 nm. L'AFB1 era intrinsecamente strutturato fisiologicamente per essere rilevato a una lunghezza d'onda di eccitazione di 362 nm. Fu utilizzata una colonna Hichrom (4,6 mm × 150 mm) con particelle da 5 μm, e il reattore di derivatizzazione fu un programma KOBRA Cell a 100 μA. Le separazioni dei picchi cromatografici furono effettuate in una colonna Hichrom su cui era stata montata una precolonna di fase stazionaria simile. L'Inertsil ODS-3 e l'ODS-3 V venivano utilizzati rispettivamente come cartucce di guardia e analitica, mentre l'iniettore consisteva in un autocampionatore con valvola reodyne. La fase mobile era composta da acqua: metanolo (65:35, v/v), bromuro di potassio (119 mg) e 4 M di acido nitrico (350 μL) per litro, e veniva pompata a una portata di 1,0 mL/min in un programma isocratico. La rilevazione di aflatossine è stata considerata positiva per ogni picco a un tempo di ritenzione simile a ciascun standard e a un'altezza cinque volte superiore al rumore di base29.
I limiti di rilevamento (LOD), limiti di quantificazione (LOQ) e recupero percentuale (%) sono stati calcolati per confermare l'approccio analitico dell'HPLC, utilizzando rispettivamente le equazioni 1, 2 e 3. Il LOD è la concentrazione più bassa di aflatossina che può essere distinta in modo affidabile dal rumore di fondo, mentre il LOQ è la concentrazione più bassa di aflatossina che può essere misurata quantitativamente con una precisione e una precisioneaccettabili 30. AFB 1 e i suoi metaboliti sono stati recuperati aggiungendo 10 μL di standard totali di aflatossine (AFB1,AFB 2, AFG1 e AFG2) ai campioni di mais controllati negativi in triplice. I campioni sono stati poi estratti utilizzando l'HPLC utilizzando le procedure sopra menzionate.
LOD = X + 3s 1
LOQ = X + 10s 2
3
Secondo cui: "X" è la concentrazione media dei valori di campioni in bianco fortificato, e "s" è la deviazione standard del campione.
Stima dell'esposizione AFB1
I livelli medi di aflatossina nella dieta del mais, l'assunzione giornaliera di mais e il peso corporeo medio (bambini, adulti, bovini da carne, mucche da latte e pulcini) sono stati utilizzati per calcolare l'apporto giornaliero stimato (EDI). L'EDI media per le aflatossine è stata calcolata secondo l'equazione 2 ed espressa in (ng/kg peso corporeo/giorno); per il calcolo dell'indice di rischio (HI), i valori EDI sono stati convertiti in ng/kg di peso corporeo/giorno (1 ppb/kg/giorno = 1.000 ng/kg peso corporeo/giorno) per corrispondere alle unità di TD503231.
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Valutazione del rischio e caratterizzazione
L'indice di pericolo (HI) è stato calcolato dividendo l'EDI per il TD50 e moltiplicando per un fattore di sicurezza pari a 50.000. La dose tossica mediana (TD) 50 è la dose necessaria (ng/kg/peso corporeo/giorno) per causare tumori nel 50% degli animali di prova che non avrebbero sviluppato tumori a dosezero 31,32.
Analisi dei dati
L'analisi della varianza è stata effettuata sui dati raccolti sulla crescita e sulla resa utilizzando la procedura RCBD in SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Confronti multipli delle medie dei minimi quadrati sono stati effettuati utilizzando il test33 di Tukey per differenze onestamente significative (HSD).