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Articolo metodologico

Isolamento e coltura delle cellule endoteliali microvascolari del cervello del topo

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DOI:

10.3791/70909

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17 luglio 2026

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1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un protocollo per l'isolamento e la coltura primaria delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) dal tessuto cerebrale murino neonatale per generare un modello in vitro robusto per studiare la funzione della barriera emato-encefalica in condizioni fisiologiche e patologiche.

Abstract

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono il principale componente cellulare della barriera emato-encefalica (BBB) e svolgono un ruolo chiave nella regolazione del trasporto molecolare e nel mantenimento dell'omeostasi del sistema nervoso centrale. Modelli affidabili in vitro dell'endotelio cerebrale sono essenziali per studiare la fisiologia e la disfunzione della BBB nelle malattie neurologiche e sistemiche. Viene descritto un protocollo riproducibile per l'isolamento e la coltura primaria delle BMEC dalla corteccia cerebrale murina neonatale. Il metodo include la dissezione del tessuto corticale, la dissociazione meccanica ed enzimatica, la rimozione dei detriti di mielina tramite un gradiente di densità dell'albumina sierica bovina (BSA) e l'arricchimento delle cellule endoteliali tramite immunoselezione basata su CD31. Le cellule isolate vengono successivamente coltivate su piastre rivestite di collagene e caratterizzate tramite valutazioni morfologiche, rilevamento immunofluorescenze dei marcatori endoteliali, saggi sulla formazione del tubo angiogenico e misurazioni della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) per valutare le proprietà barriere. Questo protocollo fornisce un approccio affidabile per ottenere colture primarie BMEC adatte a studiare la biologia del BBB, la segnalazione endoteliale e le interazioni neurovascolari in condizioni fisiologiche e patologiche.

Introduzione

La barriera ematoencefalica (BBB) è una struttura altamente specializzata che regola rigorosamente lo scambio di sostanze tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la circolazionesistemica 1. La BBB è formata principalmente da cellule endoteliali microvascolari cerebrali collegate da giunzioni strette. Queste cellule endoteliali funzionano all'interno di un sistema multicellulare noto come unità neurovascolare (NVU), che include anche astrociti, periciti, neuroni, cellule gliali e la membranabasale 2. Tra questi componenti, le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) svolgono un ruolo centrale formando uno strato continuo con giunzioni strette, migliaia di sistemi di trasporto selettivo, traffico vescicolare limitato e limitando l'infiltrazione delle cellule immunitarie attraverso una bassa espressione di molecole di adesione che limitano il passaggio di soluti e cellule nel parenchimacerebrale 3,4.

Oltre al loro ruolo di barriera fisica e selettiva, i BMEC sono attivamente coinvolti in processi essenziali, tra cui la segnalazione neurovascolare, la regolazione del flusso sanguigno cerebrale, le risposte immunitarie locali e, in particolare, l'angiogenesicerebrale 5. Quest'ultimo processo è fondamentale durante lo sviluppo embrionale, ma viene anche riattivato in condizioni patologiche come ictus, ischemia o infiammazione. I BMEC rispondono a segnali proangiogeni come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e il fattore di crescita placentare (PLGF), coordinando la formazione e la maturazione di nuovivasi 6,7. Pertanto, una disfunzione endoteliale cerebrale comprometterebbe gravemente l'integrità della BBB e l'omeostasi cerebrale.

Studiare le BMEC in vitro ci permette di modellare sia la fisiologia della BBB sia i meccanismi che regolano l'angiogenesi cerebrale. Tuttavia, isolare queste cellule dal tessuto cerebrale comporta importanti sfide tecniche a causa della complessità del tessuto neurale, dell'abbondanza di mielina e della necessità di ottenere colture con alta purezza endoteliale. Sebbene siano disponibili linee cellulari immortalate, esse presentano limitazioni significative in termini di rappresentatività fenotipicae funzionale.

In questo contesto, i protocolli per la coltura primaria di BMEC da modelli murini neonatali costituiscono uno strumento sperimentale potente, poiché preservano molte delle caratteristiche morfologiche, molecolari e funzionali dell'endotelio cerebrale in vivo. Tuttavia, diversi protocoli consolidati per l'isolamento murino BMEC si basano sulla dissociazione meccanica combinata con gradienti di densità (destrono o Percoll), spesso portando a un arricchimento endoteliale variabile e contaminazione residua da periciti, astrociti e detriti dimielina 9. La purificazione a base di antibiotici usando puromicina migliora la purezza endoteliale (fino al ~95%) ma può introdurre stress cellulare a causa dell'inibizione della sintesi proteica e dei potenziali effetti sul fenotipoendoteliale 10. In alternativa, gli approcci basati su Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) forniscono popolazioni altamente purificate ma richiedono attrezzature specializzate e lavorazioni estese, che possono ridurre la fattibilità e lascalabilità 11. I protocolli neonatali più recenti evitano gradienti di densità e riducono il numero di passaggi di centrifugazione, migliorando la resa e limitando lacontaminazione 12.

Partendo da questo contesto, questo lavoro descrive un protocollo ottimizzato per l'isolamento e la coltivazione delle cellule endoteliali dalla microvascolatura cerebrale neonatale del topo. Questo metodo combina una dissezione anatomica precisa, una digestione enzimatica efficiente, la rimozione della mielina tramite un gradiente di albumina sieroica bovina (BSA) e l'arricchimento tramite immunoselezione con microsfere magnetiche coniugate al marcatore CD31. Il protocollo consente l'ottenimento di colture primarie vitali, riproducibili e arricchite, adatte per studi sull'angiogenesi cerebrale, l'interazione neurovascolare, la segnalazione endoteliale e la disfunzione della BBB sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

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Protocollo

Il Comitato di Bioetica e Biosicurezza dell'Università di Bío-Bío ha approvato questo progetto (finanziamento Fondecyt 1240925). Il lavoro con gli animali è stato svolto in conformità con i principi cardinali delle tre R nell'uso degli animalisperimentali 13 e in conformità con le raccomandazioni delle Linee Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio pubblicate dai National Institutes of Health degliStati Uniti 14. Gli animali venivano tenuti in ambienti appropriati presso il Bioterium dell'Università di Bío-Bío in condizioni abitative standard (ciclo chiaro/buio di 12 ore, temperatura controllata di 22 ± 2 °C, con accesso ad libitum a mangime e acqua).

Per ottenere le cellule sono state utilizzate topi gravidi di tipo selvatico (WT) (C57BL/6), di età compresa tra 4 e 6 mesi. Dopo il parto, i cuccioli sono rimasti con la madre fino al giorno postnatale 5 (P5). A questo punto, la prole veniva profondamente anestetizzata con isoflurano fino alla perdita dei riflessi prima dell'eutanasia. L'ipotermia veniva usata solo come complemento per minimizzare i movimenti ed era immediatamente seguita dalla decapitazione. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le Linee Guida per l'Eutanasia degli Animali (2020)15 dell'American Veterinary Medical Association (AVMA) e con le normative internazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (NIH)14. La corteccia cerebrale è stata isolata e utilizzata per sviluppare questo protocollo sperimentale (vedi Protocollo Passo 3). La Tabella dei Materiali elenca i materiali e gli anticorpi utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione del mezzo di coltura endoteliale

  1. Per preparare 500 mL di mezzo di coltura per cellule endoteliali cerebrali murine, in un contenitore sterile, si mescolano 250 mL di DMEM integrati con siero bovino fetale al 10% (FBS), 250 mL di mezzo di coltura cellulare endoteliale integrato con FBS al 10%.
    NOTA: Il mezzo di coltura fornisce fattori essenziali di crescita endoteliale e supporta la proliferazione cellulare. Se il prodotto citato (vedi la Tabella dei Materiali) non è disponibile, integratori equivalenti per cellule endoteliali (ad esempio, ECGS, idrocortisone e L-glutamina) possono essere aggiunti a DMEM + FBS per ottenere condizioni di crescita simili16.
  2. Filtrare sterile l'intero mezzo (10% FBS) attraverso un filtro da 0,22 μm per garantirne la sterilità.
  3. Conserva il mezzo preparato a 4 °C fino all'uso. Prepara il substrato fresco ogni 2–4 settimane per mantenere l'attività del fattore di crescita.

2. Rivestimento delle piastre di coltura

NOTA: Per favorire l'adesione cellulare e mantenere il fenotipo endoteliale, le placche di coltura devono essere pre-rivestite con collagene di tipo I. I passaggi di questo processo sono i seguenti:

  1. Prepara la soluzione di pre-rivestimento mescolando collagene di tipo I (0,1 mg/mL), M di acido acetico per solubilizzare il collagene e un mezzo basale sterile per raggiungere un volume totale di 15 mL. Mescola delicatamente finché il collagene non è completamente sciolto e regola la soluzione a pH 4.0 se necessario. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 μm e lasciarla sul ghiaccio fino all'uso per preservare la stabilità del collagene.
    NOTA: Il collagene di tipo I imita la membrana basale, sostiene l'attacco delle cellule endoteliali e aiuta a mantenere il fenotipo cellulare.
  2. Omogeneizzare la soluzione in condizioni sterili. Applica la soluzione in modo uniforme per coprire l'intera superficie delle piastre di coltura.
    NOTA: Viene utilizzato solo il volume necessario per coprire la superficie.
  3. Incubare le placche a 37 °C durante la notte (12–16 ore) per permettere al collagene di adsorbere correttamente. Prima di seminare le cellule, rimuovere la soluzione di rivestimento in eccesso e lavare le piastre due volte con soluzione salina sterile 1x tamponata con fosfato (1x PBS, pH 7,4) per rimuovere acidi residui e collagene non legato.

3. Isolamento della coltura mista di cellule cerebrali

NOTA: Questo protocollo si basa su precedenti rapporti 9,17 che miravano a isolare i BMEC dalla corteccia cerebrale dei topi P5.

  1. Sacrificare cinque cuccioli di P5 usando anestesia profonda con isoflurano; Usa solo l'ipotermia come complemento, seguita dalla decapitazione cervicale.
    NOTA: Da questo passaggio in poi, tutte le procedure devono essere eseguite in un armadietto di sicurezza biologica a flusso laminare.
  2. Raccogli i cervelli (Figura 1A) e mettili in PBS freddo sterile (1x) in un tubo conico da 50 mL finché tutti i cervelli non saranno processati.
  3. Separare le meningi arrotolando con cura ogni cervello su una membrana di nitrocellulosa sterilizzata. Trasferire i cervelli su una piastra da 100 mm contenente PBS freddo (1x). Utilizzando un bisturi sterile, rimuovere il tronco encefalico, il cervelletto, il talamo e il bulbo olfattivo (Figura 1B, C).
  4. Raccogli le cortecce cerebrali risultanti senza meningi e conservale in PBS freddo (1x). Trasferire immediatamente tutta la corteccia cerebrale in un tubo conico da 50 mL contenente 5 mL di PBS 1x su ghiaccio (Figura 1D).
  5. Dissociare meccanicamente il tessuto usando forbici sterili, seguita da una pipetta da 1 mL finché non si osservano pezzi e la sospensione è omogenea (Figura 1E).
    NOTA: La punta della pipetta può essere tagliata per ridurre lo stress meccanico durante la triturazione. La dissociazione tissutale si ottiene tramite aspirazione controllata e pipetamento delicato, mentre un'apertura più ampia della punta minimizza le forze di taglio e la lisi cellulare meccanica, preservando così la vitalità cellulare.
  6. Raccogli tutti i tessuti e mettili in tubi da 15 mL.
  7. Per digerire il tessuto, trasferire il campione in un tubo conico sterile da 15 mL contenente 2 mL di soluzione di collagenasi (2 mg/mL nel DMEM) e incubare per 2 ore a 37 °C su uno shaker orbitale a 180 giri al minuto.
  8. Dopo la digestione, aggiungere 5 mL di DMEM integrato con il 10% di FBS alla sospensione e centrifugare a 3.000 × g . per 10 minuti (vedi Figura 1F). Scartate il soprannatante.
  9. Per rimuovere la mielina, risospendere il pellet in 4 mL di BSA al 20% in PBS (p/v) e centrifugare a 3.000 × g . per 20 minuti (Figura 1G). Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura lo strato latteoso superiore contenente mielina utilizzando una pipetta Pasteur e scartare eventuali soprantanti residui (Figura 1H).
  10. Sospendere il pellet in 2 mL di DMEM contenente il 10% di FBS, poi centrifugare nuovamente a 3.000 × g per 10 minuti. Scartare il surnatante, poi sospendere delicatamente l'ultimo pellet in 1 mL di DMEM contenente il 10% di FBS.
    NOTA: A questo stadio, la risospensione finale contiene una popolazione eterogenea di cellule derivate dal cervello derivanti dalla dissociazione tissutale. Questa miscela può includere cellule endoteliali microvascolari cerebrali, astrociti, periciti e altre cellule neurali. Sono necessarie successive fasi di purificazione e coltura per arricchire selettivamente i BMEC.
  11. Prima di impiattare le cellule isolate, rimuovere la soluzione di rivestimento dalle piastre di coltura preparate (vedi Passo 2.3) e risciacquare ogni pozzo due volte con PBS sterile (1x).
  12. Semina le celle risospese (passo 3.10) sulle lastre rivestite (consigliato: piastre da 60 mm).
    NOTA: Tipicamente, l'intera sospensione cellulare ottenuta da un'isolazione viene distribuita in uno o due piatti rivestiti, ciascuno contenente 5 mL di mezzo endoteliale.
  13. Mantenere le colture in un mezzo cellulare endoteliale a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. Sostituisci il mezzo ogni 2–3 giorni. Quando le colture raggiungono una confluenza del 90–100%, si procede con l'immunoselezione utilizzando perle rivestite di CD31 per arricchire le cellule endoteliali.
    NOTA: Dopo l'isolamento e la costruzione iniziale della coltura, la procedura produce tipicamente circa 5 × 106 cellule per preparazione, che aderiscono alle piastre rivestite di collagene e sviluppano la caratteristica morfologia di ciottoli dei monostrati endoteliali.

4. Isolamento delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) utilizzando sfere magnetiche CD31

  1. Preparazione e distacco delle celle
    1. Quando le colture raggiungono il 90–100% di confluenza, lavare le cellule 3 volte con PBS (1 volta) per rimuovere il residuo del substrato.
    2. Aggiungere 1 mL di tripsina (0,5% 1x) alla piastra e incubare per 3–5 minuti a 37 °C per staccare le cellule.
    3. Neutralizza la tripsina aggiungendo 1 mL di mezzo endoteliale con FBS al 10%. Trasferire la sospensione della cella (~2 mL) in un tubo microcentrifuga sterile e centrifugare a 220 × g per 10 minuti a 4 °C. Scartate il soprannatante.
  2. Preparazione delle perle magnetiche CD31
    1. Inserire 8 μL di sfere magnetiche CD31 in un nuovo tubo da 15 mL. Lava le sfere con 1 mL di soluzione di Hank all'1%, risospendendole delicatamente muovendo il tubo.
    2. Metti il tubo su un magnete per 2 minuti per precipitare le sfere. Rimuovi con attenzione il surnante senza disturbare le perline. Ripeti il passaggio del lavaggio 3 volte.
      NOTA: Lavora sempre vicino al magnete per evitare di perdere le sfere e esegui questo passaggio in condizioni sterili per evitare la contaminazione della coltura cellulare primaria.
  3. Incubazione delle cellule con perle
    1. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di soluzione di Hank all'1% contenente FBS (per ridurre il legame aspecifico).
    2. Trasferire le cellule nel tubo contenente le sfere prelavate utilizzando una pipetta da 1.000 μL. Incuba la miscela sul ghiaccio con una lieve agitazione per 20 minuti.
  4. Separazione magnetica delle cellule endoteliali
    1. Posizionare il tubo su un magnete per 3 minuti per precipitare le cellule endoteliali legate a perle.
    2. Rimuovi con attenzione il soprantantante.
      NOTA: In questa fase, due tipi cellulari isolati possono essere purificati: una cellula endoteliale (vedi passo 4.5) e un mix di diversi tipi di cellule cerebrali. A questo punto, sono disponibili due opzioni.
      1. Rimuovere e scartare il soprandanante (cioè la miscela di cellule cerebrali) mantenendo il tubo sul magnete. Lavare le celle legate alla perla (cioè celle CD31+ ) con 2 mL di soluzione di Hank e ripetere 3 volte.
      2. Utilizzare il soprantantante contenente detriti cellulari per generare una nuova coltura contenente cellule non selezionate (ad esempio, fibroblasti, astrociti, microglia, neuroni, periciti, tra gli altri).
  5. Coltivazione dei BMEC purificati
    1. Risospendere le cellule endoteliali legate a perle in 7 mL di mezzo endoteliale completo (10% FBS).
    2. Semina le cellule su una piastra da 60 mm precedentemente rivestita di collagene durante la notte (vedi sezione 2). Incubare in condizioni standard (37 °C, 5% CO₂).
      NOTA: Il fenotipo endoteliale è preservato fino al passaggio (p) 3 nelle condizioni di coltura descritte. Per mantenere le proprietà correlate alla barriera emato-encefalica, si raccomanda di eseguire saggi sperimentali utilizzando i passaggi precoci (p0–p3).

5. Caratterizzazione cellulare

  1. Osservazione microscopica di cellule catturate da perle
    NOTA: Nelle condizioni di coltura descritte in questo protocollo, i BMEC primari possono tipicamente essere mantenuti fino a tre passaggi (p3) preservando la loro caratteristica morfologia endoteliale e il loro fenotipo. A seconda della densità di semina e del tasso di crescita, le colture possono generalmente essere mantenute fino a circa 2–3 settimane in vitro prima che possano verificarsi cambiamenti fenotipici significativi.
    1. Dopo l'immunoselezione con sfere magnetiche CD31, osservare le cellule attaccate al microscopio a contrasto di fase (Figura 2A).
      1. Cerca cellule endoteliali CD31-positive che presentino una morfologia tipica di ciottoli e che formano monostrati omogenei entro 5–7 giorni.
        NOTA: Durante l'immunoselezione, le sfere magnetiche rivestite in CD31 si legano specificamente alle cellule endoteliali, arricchendo così la popolazione endoteliale. Dopo il processo di selezione, le sfere (circa 4,5 μm di diametro) possono ancora essere osservate associate o interiorizzate dalle cellule endoteliali durante i primi passaggi. Questi generalmente diminuiscono con i successivi lavaggi e la coltivazione e non interferiscono con la vitalità del BMEC o la crescita cellulare (Figura 2B).
      2. Utilizzare la morfologia uniforme e l'assenza di cellule allungate o simili a quelle degli astrociti per stimare la purezza della popolazione endoteliale.
  2. Immunofluorescenza per CD31 e GLUT1
    1. Semi 2 × 10,3 BMEC su slip rivestiti di collagene e coltura fino a raggiungere l'80–90% di confluenza.
    2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente (22–25 °C) e lavare con PBS.
    3. Permeabilizza con 0,1% di Triton X-100 per 5 minuti e blocca il legame non specifico con il 5% di BSA per 30 minuti.
    4. Incubare durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro CD31 e GLUT1 (trasportatore di glucosio specifico per l'endotelio cerebrale).
    5. Lavare con PBS e incubare per 1 ora con gli anticorpi secondari fluorescenti appropriati.
    6. Controcolorare i nuclei con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e montare i copertimenti con un mezzo di montaggio antifade.
    7. Visualizza sotto un microscopio a fluorescenza o confocale. Cerca CD31 localizzato ai confini cellulari (Figura 3A), mentre GLUT1 mostra la distribuzione citoplasmatica e di membrana, confermando l'identità endoteliale e il fenotipo dell'endotelio cerebrale (Figura 3B).
      NOTA: Immagini rappresentative da isolamenti BMEC indipendenti dimostrano la morfologia tipica e l'espressione dei marcatori dei BMEC coltivati. La presenza di proteine a giunzione stretta, come la claudina-5, può essere utilizzata anche per caratterizzare l'endotelio cerebrale. Per valutare ulteriormente la purezza delle colture endoteliali, è possibile effettuare ulteriori colorazioni immunofluorescenze utilizzando marcatori negativi per altri tipi di cellule neurali. Ad esempio, la proteina acida gliale fibrillare (GFAP) può essere utilizzata per rilevare gli astrociti, e la molecola adattatrice ionizzata di legame al calcio 1 (Iba1) per identificare le cellule microgliali. L'assenza di colorazione per questi marcatori conferma l'assenza di contaminazione da parte di queste popolazioni cellulari non endoteliali (Figura 3C,D).
  3. Analisi della formazione dei tubi
    NOTA: Le cellule endoteliali mostrano capacità proangiogenica nei saghi diMatrigel 18, e l'identità endoteliale può essere confermata utilizzando questo saggio.
    1. Pre-rivestire una lastra da 96 pozzi con Matrigel e lasciarla polimerizzare per 30 minuti a 37 °C.
    2. Seme 1 × 104 BMEC per pozzo in 100 μL di mezzo endoteliale completo (10% FBS). Incubare a 37 °C e monitorare la formazione del tubo per 4–8 ore utilizzando un microscopio a contrasto di fase (Figura 4A).
    3. Quantifica la lunghezza totale del tubo, il numero di giunzioni e le mesh usando ImageJ (plugin Angiogenesis Analyzer)19. (Figura 4B).
      NOTA: La capacità dei BMEC di formare strutture tubolari interconnesse conferma il loro potenziale angiogenico e la funzionalità endoteliale.
  4. Misurazione della resistenza elettrica transendoteliale (TEER)
    NOTA: Le cellule endoteliali cerebrali devono formare una barriera stretta, poiché sono una componente critica dellaBBB 20. È necessario confermare la capacità endoteliale di generare una barriera elettrica.
    1. Semina 20.000 BMEC su inserti Transwell rivestiti di collagene (dimensione poro 0,4 μm) nel compartimento superiore e coltura fino a raggiungere la confluenza.
    2. Misurare il TEER utilizzando un voltohmmetro epiteliale per valutare l'integrità del monostrato. Registrare i valori TEER quotidianamente fino alla stabilizzazione; un aumento della resistenza indica la formazione di giunzioni intercellulari strette, caratteristiche delle barriere endoteliali funzionali (Figura 4C).
      NOTA: I residui della miscela cellulare non selezionata, inclusi gli astrociti, possono essere utilizzati per generare un sistema di cocoltura. Questa configurazione richiede un'attenta ottimizzazione del rapporto cellulare tra i compartimenti superiori (BMEC) e inferiori (miscela cellulare non selezionata), che dovrebbe essere standardizzato in ciascun laboratorio. Questa configurazione di cocultura è stata adattata dai modelliBBB 21 descritti in precedenza.
    3. Semina la miscela cellulare non selezionata (passo 4.4.2.2) nel pozzo inferiore della piastra di coltura e i BMEC sul lato superiore della membrana di inserimento Transwell.
      NOTA: È stato incluso un esperimento rappresentativo che confronta le condizioni di monocoltura e cocultura per valutare la tenuta della barriera tramite misurazioni TEER (Figura 4C).

6. Espansione e manutenzione dei BMEC purificati

  1. Condizioni culturali
    1. Mantenere i BMEC purificati in un mezzo di coltura endoteliale completa (10% FBS) a 37 °C in un incubatore umidificato (95% di umidità) con 5% di CO₂. Cambia il mezzo di coltura ogni 2–3 giorni per fornire nutrienti freschi e mantenere la vitalità cellulare.
  2. Monitoraggio della crescita e morfologia cellulare
    1. Osserva quotidianamente le colture al microscopio a contrasto di fase per monitorare l'attacco, la crescita e la morfologia cellulari. Cerca la morfologia caratteristica dei ciottoli dei BMEC, che formano un monostrato confluente entro 5–7 giorni.
  3. Subcultura e passaggio
    1. Quando le colture raggiungono l'80–90% di confluenza, si staccano le cellule usando lo 0,05–0,1% di tripsina per 3–5 minuti a 37 °C.
    2. Neutralizza la tripsina con un volume uguale di mezzo completo, centrifuga a 220 × g per 10 minuti a 4 °C e risospenda la pellet in un nuovo mezzo endoteliale.
    3. Semina le cellule su piastre rivestite di collagene alla densità desiderata per una continua espansione.
      NOTA: Limitare i passaggi BMEC a 3–5 per mantenere il fenotipo endoteliale e l'integrità funzionale.
  4. Crioconservazione opzionale
    1. Per la conservazione a lungo termine, risospendere i BMEC in mezzo congelante (10% di DMSO in mezzo endoteliale completo). Congelare gradualmente fino a –80 °C in un congelatore a tasso controllato, poi trasferire in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

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Risultati

Il protocollo descritto qui consente l'isolamento e la coltura di BMEC primarie da topi neonatali (P5). Queste cellule sono il principale componente cellulare della BBB e sono quindi uno strumento sperimentale prezioso per lo studio della fisiologia e della fisiopatologia cerebrovascolare. L'isolamento e la coltura di successo delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono stati dimostrati attraverso valutazioni morfologiche, fenotipiche e funzionali.

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Discussione

L'isolamento delle BMEC è uno strumento fondamentale per studiare i meccanismi che regolano la fisiologia della BBB e la sua disfunzione in varie patologie del sistema nervoso centrale (SNC) 4,9, incluso l'ictus. A differenza delle linee cellulari immortalate, le colture primarie BMEC preservano caratteristiche fenotipiche e funzionali chiave dell'endotelio cerebrale, inclusa l'espressione di proteine strettamente legate e una ca...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Alcune parti di questo manoscritto sono state scritte con ChatGPT di OpenAI (GPT-4, versione luglio 2025) per migliorare chiarezza, linguaggio e coerenza. Gli autori hanno revisionato, modificato e approvato criticamente tutti i contenuti assistiti dall'IA. Non sono stati utilizzati strumenti di IA per l'analisi dei dati, l'interpretazione dei risultati o la generazione di conclusioni scientifiche.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare i ricercatori appartenenti a GRIVAS Health e NEUROVAS per il loro prezioso contributo. Questo studio è stato finanziato da Fondecyt Regular 1240295.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
60 mm culture platesCorning430166
96 Well culture platesCorning41122107
Acido aceticoSigma-AldrichA6283
Antibiotico-antimicetico (opzionale)Gibco15240062
Anti-CD31Santa Cruz sc-466941:100
Anti-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Anti-GLUT1Abcamab1157301:200
Anti-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Anti-mouse IgG Alexa Fluor (594 Dye)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor  (488 Dye)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
Pipette automatiche e serologiche Oxford LP  OXL.OXL.OSP-5C
Basal medium (per soluzione di collagene)Gibco (DMEM)11965092
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA9647
Collagenasa tipo IISigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 µg/mL
DMEM (glucosio alto)Thermo Fisher Scientific11965092
EndoGRO-MV Complete MediumMerck MilliporeSCME004Medium di crescita per cellule endoteliali
Falcon tubes (15 & 50 mL)Corning®352096 / 352070
Siero fetale bovino (FBS)Gibco (Thermo Fisher)16000044
Microscopio a fluorescenzaMoticBA410
Guanti, maschere, materiali di laboratorioVari fornitori—
Eparina (100 U/mL)Sigma-AldrichH3393
Microscopio invertitoOlympus CKX41
Magnete per separazione magneticaEasySep  NC9284020
Agitatore orbitale (37 °C)Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
ParafilmBemisPM996
PBS (1×)Thermo Fisher Scientific10010023
Centrifugatrice refrigerataHITACHICT5RE
ScalpelloFine Science ToolsVari
Forbici e pinzette fineFine Science ToolsVari
Membrana di nitrocellulosa sterileBIO-RAD1620094
Collageno di tipo ICorning 30394

Riferimenti

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