Generazione e differenziazione degli organoidi epiteliali olfattivi umani a partire da cellule staminali adulte

Sommario

Questo protocollo delinea un approccio consolidato per isolare le cellule progenitrici olfattive dal tessuto superiore dei turbinati umani adulti al fine di generare organoidi epiteliali olfattivi. Dettaglia inoltre una strategia di induzione chimica per guidare la differenziazione di questi organoidi in neuroni sensoriali olfattivi maturi, consentendo così la modellazione della neurogenesi olfattiva umana.

Abstract

L'epitelio olfattivo umano possiede una notevole capacità neurogenica, sostenuta da una popolazione residente di cellule staminali basali; Tuttavia, stabilire un modello dinamico in vitro che ricapitoli fedelmente questo processo rigenerativo si è rivelato una sfida. Qui presentiamo un protocollo consolidato per generare organoidi olfattivi da cellule progenitrici isolate da tessuto superiore di turbinati umani adulti. Questi organoidi mantengono la stemiformità, come dimostrato dall'espressione di SOX2, e mostrano un modello di differenziazione spazialmente organizzato, caratterizzato da un'espressione uniforme del marcatore neuronale immaturo GAP43 e dalla localizzazione periferica del marcatore sensoriale olfattivo maturo OMP. Una successiva differenziazione mirata con il LY411575 inibitore di Notch, l'attivatore Wnt CHIR-99021 e l'acido retinoico ha generato cellule sensoriali sensoriali simili a un neurone olfativo positivo a marcatori che co-esprimevano OMP e il marcatore neuronale Tuj1 (classe III β-tubulina). Questo modello di origine umana aggira i limiti dei sistemi murini e fornisce una solida piattaforma in vitro per lo studio della neurogenesi olfattiva, dell'anosmia associata al COVID-19 e di altri disturbi neurodegenerattivi correlati all'olfatto.

Introduzione

Il sistema olfattivo umano supporta la neurogenesi ^continua,1 un processo principalmente guidato da cellule staminali basali nell'epitelio olfattivo, in particolare dalle cellule basale orizzontali (HBC) e dalle cellule basale globose (GBC). ^2,3 GBC si differenziano costitutivamente in neuroni sensoriali olfattivi (OSN), mentre gli HBC rimangono immobili fino a quando non si attivano da un infortunio. ^4,5 La percezione olfattiva inizia quando le molecole odoranti si legano ai recettori sulle ciglia degli OSN, innescando una cascata di trasduzione del segnale che trasmette informazioni al bulbo olfattivo e alla corteccia. ⁶ Lo sviluppo e il mantenimento di questa funzione sensoriale sono regolati dall'epitelio olfattivo.

La disfunzione olfattiva causata da insulti fisici, chimici o biologici spesso si risolve spontaneamente. ⁷ Tuttavia, colpisce dall'1,5% al 25% della popolazione^{mondiale 8} e può derivare da diverse eziologie, tra cui traumi,9 infezioni,10 e disturbi neurodegenerativi come Alzheimer e morbo di Parkinson¹¹; In questi casi, il recupero spontaneo è spesso incompleto o assente. Gli approcci terapeutici attuali, come l'allenamento olfattivo e la somministrazione di corticosteroidi, mostrano un'efficacia limitata. ^12,13 Questa lacuna terapeutica deriva da una comprensione incompleta dei meccanismi che governano la sopravvivenza e la rigenerazione del neuroepitelio olfattivo dopo un infortunio, una lacuna di conoscenza ulteriormente aggravata dall'inadeguatezza dei modelli in vitro esistenti per lo studio della biologia olfattiva umana.

Negli ultimi anni, lo sviluppo di diversi modelli di organoidi umani ha creato nuove piattaforme tecnologiche per lo studio delle malattie umane. ¹⁴ organoidi derivati da cellule staminali adulte (AdSC), noti anche come cellule staminali residenti nel tessuto, sono stati generati con successo per una serie di tessuti derivati dall'endoderma, inclusi stomaco, fegato, pancreas, polmoni e vescica. 15,16,17,18,19 Al contrario, stabilire organoidi epiteliali olfattivi umani a partire dalla placode olfattiva derivata dall'ectoderma rimane tecnicamente difficile. Una grande sfida pratica è la difficoltà di ottenere costantemente tessuto epiteliale olfattivo vitale dal turbinato superiore umano. La posizione e l'estensione della regione olfattiva variano notevolmente tra gli individui e subiscono una degenerazione marcata legata all'età. L'accumulo involontario di epitelio respiratorio piuttosto che olfattivo compromette gli esiti della coltura. Per affrontare questo problema, abbiamo perfezionato il protocollo del 2021 di Ren et al., che hanno coltivato con successo cluster cellulari dalla mucosa olfattiva ^umana,20 per generare in modo affidabile organoidi epiteliali olfattivi umani. Il nostro approccio genera organoidi epiteliali olfattivi umani con un'architettura tridimensionale e gerarchicamente organizzata e ne supporta la differenziazione in neuroni sensoriali olfattivi. Questo modello fornisce una preziosa piattaforma sperimentale per indagare i meccanismi che determinano il destino delle cellule staminali epiteliali olfattive e per lo screening di potenziali agenti terapeutici per i disturbi olfattivi.

Per riassumere esplicitamente, l'obiettivo principale di questo metodo è stabilire un flusso di lavoro standardizzato per generare e differenziare organoidi epiteliali olfattivi umani dalle cellule progenitrici adulte. La motivazione di questo approccio è affrontare il divario critico creato dall'assenza di modelli in vitro fisiologicamente rilevanti del sistema olfattivo umano. Rispetto alle tradizionali colture monostrato bidimensionali (2D) o ai modelli murini, questo sistema tridimensionale (3D), derivato dall'uomo, offre il vantaggio distintivo di ricapitolare fedelmente la complessa organizzazione spaziale e il contesto genetico specifico dell'uomo della mucosa olfattiva. Affinché i ricercatori possano considerare questo protocollo, è essenziale riconoscere che l'isolamento preciso dell'epitelio olfattivo vitale dal turbinato superiore umano, evitando la contaminazione da epitelio respiratorio, è estremamente difficile e fortemente influenzato dall'età del paziente e dalla variazione anatomica individuale. Di conseguenza, questo protocollo è particolarmente adatto ai ricercatori che hanno accesso costante a campioni clinici umani e cercano di modellare la neurogenesi olfattiva umana, l'anosmia indotta da virus o i deficit olfattivi associati a disturbi neurodegenerativi.

Protocollo

Questo studio è stato condotto con l'approvazione del Consiglio di Revisione Istituzionale (IRB) dell'Ospedale della Cina Occidentale dell'Università del Sichuan (Approvazione n. 2024 (31)). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti partecipanti prima della raccolta dei tessuti e della pubblicazione dei dati. Campioni di tessuto del turbinato superiore sono stati prelevati da pazienti sottoposti a interventi endoscopici alla base cranica o interventi di sinusis etmoidei per rinorrea del liquido cerebrospinale.

1. Elaborazione e trasporto dei campioni di tessuto

1. Immediatamente dopo la prelieva, si collocano i campioni di tessuto in un mezzo di trasporto preraffreddato e sterile, composto da mezzo basale DMEM/F12/HEPES integrato con siero bovino fetale al 10% e soluzione al 5% di penicillina–streptomicina, e trasportarli in laboratorio a 4 °C.
   NOTA: Il siero aiuta a mantenere la vitalità cellulare, mentre la miscela antibiotica previene potenziali contaminazioni microbiche durante il trasporto. Tieni il tempo di trasporto sotto le 2 ore per mantenere la vitalità cellulare.

2. Pre-lavorazione dei tessuti (eseguita su ghiaccio)

1. Trasferire il campione in una piastra di coltura sterile preraffreddata, rimuovere il mezzo di trasporto e lavare il tessuto con un tampone PBS modificato contenente soluzione al 5% di penicillina--streptomicina. Esegui il lavaggio come segue: aggiungi 5 mL di soluzione di lavaggio preraffreddata al piatto, batti delicatamente il fazzoletto 5–7 volte, poi aspira completamente il liquido. Ripeti questo ciclo di lavaggio 3 volte per rimuovere cellule sanguine e detriti tissutori.
2. Utilizzando microforbici sterili, tritate il tessuto in frammenti di circa 1–2^{mm 3}.
   NOTA: Durante questo passaggio, mantenere l'idratazione dei tessuti, fissare la struttura con una pinza a punta smussata e ridurre al minimo il tempo di taglio per preservare la vitalità cellulare.

3. Digestione enzimatica

1. Trasferire il tessuto dissociato meccanicamente in un tubo centrifuga da 15 mL e aggiungere 3 mL di tampone digestione composto preriscaldato (37 °C) (contenente 0,125% di tripsina e 10 U/mL di DNasi I), mantenendo un rapporto enzima-volume tessutale di 3:1. Incuba il tubo in un bagno d'acqua a 37 °C con una delicata agitazione per 20 minuti. Ispeziona il campione ogni 5 minuti per monitorare il progresso della digestione e prevenire l'aggregazione dei tessuti.
2. Interrompere la digestione aggiungendo un volume uguale di soluzione di terminazione, DMEM/F12/HEPES tramite base integrato con siero bovino fetale al 10%. Pipetta delicatamente la miscela su e giù 10 volte per garantire un mix completo e un contatto efficace tra enzimi e componenti inibitori.
   NOTA: L'α1-antitripsina presente nel siero neutralizza efficacemente l'attività della tripsina.

4. Preparazione della sospensione a cella singola

1. Posiziona un filtro a celle da 40 μm sopra un tubo centrifuga da 50 mL. Utilizzando una punta di pipetta tagliata da 1 mL, trasferisci il tessuto digerito e il liquido dal tubo da 15 mL sul colino. Fai girare delicatamente il materiale sul filtro con la punta della pipetta per facilitare il movimento, poi risciacqua il colino con un ulteriore 1–2 mL di soluzione di terminazione. Una volta che tutto il liquido è passato attraverso il colino, trasferire il filtrato dal tubo da 50 mL a un nuovo tubo centrifuga da 15 mL.
2. Centrifuga la sospensione a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Osserva la distinta pellet cellulare sul fondo del tubo e aspira con cura il surnatante, lasciando circa 100 μL per evitare di disturbare o perdere la pellet cellulare.

5. Istituzione di un sistema di coltura tridimensionale

1. Senza risospendere la pellet cellulare in mezzo di coltura, combinarla direttamente con Matrigel utilizzando una punta di pipetta preraffreddata e a basso legame per ottenere una densità precisa di 10.000 cellule/μL. Distribuire 40 μL di questa miscela cella–Matrigel in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzi e 20 μL in ogni piastra confocale con fondo di vetro. Incubare le placche a 37 °C per 30 minuti per permettere al Matrigel di polimerizzarsi e formare un impalcatura tridimensionale.
2. Dopo la solidificazione del Matrigel, aggiungere delicatamente 500 μL di mezzo di coltura olfattiva senza siero lungo la parete del pozzo per evitare di disturbare il gel. Mantenere le colture in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂, sostituendo il mezzo ogni 3 giorni con un mezzo fresco preriscaldato.
   NOTA: Il mezzo olfativo di coltura delle cellule staminali neurali è composto da DMEM/F12/HEPES integrato con i seguenti componenti: R-spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), un agente antimicrobico primario (100 μg/mL), integratore N2 (1%), integratore B27 (2%) e L-glutamina (1%).

6. Passaggio e differenziazione

1. Preraffreddare la soluzione di recupero organoide sul ghiaccio per 10 minuti prima dell'uso; aspirare il mezzo di coltura dai pozzi, poi aggiungere 1 mL di soluzione di recupero gelata in ciascun pozzo. Inclinare la piastra a un angolo di 45° e aspirare delicatamente e dispensare la soluzione 5–7 volte per spostare gli organoidi dalla matrice della membrana basale e trasferire la sospensione risultante su un tubo centrifuga da 15 mL. Incubare il tubo sul ghiaccio per 3–5 minuti, poi centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C, e rimuovere con cura il surnatante, lasciando circa 100 μL di liquido per evitare la perdita del pellet.
2. Aggiungi 1 mL di reagente di dissociazione organoide direttamente al pellet cellulare e incuba il tubo a 37 °C con lievi scuotiti a 220 giri al minuto per 5 minuti. Interrompi immediatamente la digestione aggiungendo un volume uguale di Soluzione Stop e pipetta delicatamente la miscela su e giù 5 volte per garantire l'omogeneità. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere le cellule dissociate.
3. Risospendere la pellet cellulare in Matrigel a un volume di 40 μL per pozzo per piastre da 24 pozzi o 20 μL per pozzo per piastre di coltura confocale a fondo di vetro; Mescola accuratamente utilizzando una punta di pipetta preraffreddata e a basso attacco per garantire una sospensione uniforme. Dopo aver seminato nelle piastre o piatti appropriati, incubare i costrutti a 37 °C per 30 minuti per consentire la polimerizzazione Matrigel e la formazione tridimensionale dell'impalcatura. Successivamente, aggiungere delicatamente 500 μL di mezzo specializzato di coltura sferoide senza siero per cellule staminali neurali olfattive lungo le pareti del pozzo per evitare di disturbare il gel. Mantenere le colture in incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ e il 95% di umidità relativa.
4. Circa 7 giorni dopo il passaggio, una volta che la nuova generazione di organoidi epiteliali olfattivi si è riformata in sferoidi, aspirare il mezzo di espansione dalle piastre confocali con fondo di vetro e sostituirlo con un mezzo di differenziazione. Sostituisci il mezzo di differenziazione con mezzo fresco, preriscaldato, ogni 3 giorni. I neuroni olfattivi morfologicamente distinti diventano tipicamente evidenti al microscopio dopo circa 7 giorni di differenziazione.
   NOTA: Il mezzo di differenziazione è composto da DMEM/F12/HEPES integrato con R-Spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), LY411575 (5 μM), CHIR99021 (3 μM), acido retinoico (RA, 1 μM), un agente antimicrobico primario (100 μg/mL), integratore N2 (1%), integratore B27 (2%) e L-glutamina (1%).

7. Immunofluorescenza

1. Aspirare il mezzo di coltura e lavare delicatamente i campioni una volta con 500 μL di PBS. Rimuovere il PBS, poi aggiungere 500 μL di paraformaldeide al 4% e fissare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti. Aspirare e scartare il fissativo; poi lavare i campioni fissi con PBS (3 x 500 μL) e conservarli a 4 °C per un massimo di 48 ore.
2. Aspirare il PBS e aggiungere 500 μL di soluzione di permeabilizzazione (0,2% Triton X-100 in PBS), incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, poi aspirare e scartare la soluzione. Lavare i campioni con PBST allo 0,02% (0,02% Triton X-100 in PBS; 3 x 500 μL).
3. Aggiungi 500 μL di soluzione bloccante (3% di BSA in PBS) e incuba per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Aspirare la soluzione bloccante e sostituirla con 500 μL di soluzione primaria di anticorpi, preparata diluendo l'anticorpo primario appropriato (ad esempio, anti-GAP43 a 1:160, anti-OMP a 1:50 o anti-SOX2 a 1:50) in soluzione bloccante, e incubare durante la notte a 4 °C. Il giorno seguente, aspirare la soluzione primaria di anticorpi e lavare i campioni con PBST allo 0,02% (3 x 500 μL).
5. Aggiungere 500 μL di soluzione secondaria di anticorpi, contenente un anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 555 diluito 1:500 in soluzione bloccante, e incubare a temperatura ambiente al buio per 1 ora. Aspirare la soluzione secondaria di anticorpi ed eseguire ulteriori lavaggi con PBST allo 0,02% (3 x 500 μL).
6. Aggiungi 500 μL di soluzione lavorativa DAPI (DAPI diluita in PBS) e incuba al buio per 10 minuti per colorare i nuclei. Aspirare la soluzione DAPI e lavare i campioni con PBST allo 0,02% (3 x 500 μL). Conservare i campioni colorati a 4 °C per un massimo di 48 ore prima dell'immagini.

8. Microscopia confocale

1. Eseguire la microscopia confocale utilizzando una dimensione dell'asse Z di 1 μm per organoidi con diametro di ≤100 μm e 0,5 μm per organoidi superiori a 100 μm. Acquisire immagini in modalità sequenziale multicanale, scansionando nel seguente ordine: DAPI, FITC, TRITC e Cy5. Importare i file acquisiti della sequenza di immagini Z-stack nel software di rendering 3D (ad esempio, Imaris). Utilizzare la funzione di rendering volumetrico 3D per generare un modello tridimensionale completo dell'organoide. Osserva questo modello ricostruito per visualizzare la distribuzione spaziale di specifici marcatori cellulari (ad esempio, SOX2, GAP43 e OMP) e per confermare qualitativamente l'architettura gerarchica e lo stato di differenziazione neuronale degli organoidi epiteliali olfattivi come endpoint finale.

Risultati

Isolamento del tessuto epiteliale olfattivo e coltura degli organoidi epiteliali olfattivi primari
Per stabilire un sistema di coltura per organoidi epiteliali olfattivi, abbiamo isolato l'epitelio olfattivo dal tessuto superiore dei turbinati umani e lo abbiamo incorporato in una matrice tridimensionale di Matrigel (Figura 1). Basandoci sulle condizioni di coltura definite riportate da Ren et al., abbiamo validato e calibrato le concentr...

Discussione

Gli organoidi rappresentano un modello unico in vitro perché la loro architettura tridimensionale auto-organizzata riproduce fedelmente quella dei tessuti umani nativi e, in alcuni casi, può essere istologicamente indistinguibile dagli organi reali. ¹⁴ Stabilire modelli organoidi umani è quindi fondamentale per lo studio delle malattie umane. Qui presentiamo un protocollo per generare un sistema di coltura organoide da cellule epiteliali olfattive umane p...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ALEXA FLUOR 488 DONKEY	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEY	Thermo	A31572	1:500
Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810	1:160
Anti-OMP antibody	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
Anti-Sox-2 antibody	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27 Supplement	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax (L-glutamine supplement)	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel (basement membrane matrix)	Corning	356231	4% (Vol/Vol)
N-2 Supplement	Gibco	17502048	1%
Organoid Dissociation Reagent	Precedo	PRS-ODR	/
Organoid Recovery Solution	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin (primary antimicrobial agent)	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
Recombinant Human EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
Recombinant Human Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
Recombinant Human RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
Recombinant Human Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
Retinoic acid	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM