Questo metodo studia come i fibroblasti cutanei senescenti influenzino quelli sani. La senescenza viene indotta tramite esposizione agli UVB e il mezzo condizionato viene applicato ai fibroblasti normali. Aiuta a valutare i composti bioattivi che mirano alla comunicazione cellula a cellula alterata nell'invecchiamento della pelle.
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Articolo metodologico
Nuova combinazione di antiossidanti per ripristinare una comunicazione intercellulare sana in un modello in vitro utilizzando un mezzo condizionato da cellule senescenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'invecchiamento cutaneo è un processo multifattoriale guidato da alterazioni a livello molecolare e cellulare, note anche come segni distintivi dell'invecchiamento. Una di queste alterazioni consiste nella comunicazione intercellulare alterata, che contribuisce a disfunzioni del tessuto cutaneo e danni strutturali. Qui viene presentato un modello in vitro per imitare queste caratteristiche dell'invecchiamento cutaneo incubando fibroblasti sani con un mezzo condizionato a partire da fibroblasti senescenti. Innanzitutto, i fibroblasti irradiati UVB possono essere analizzati per individuare i cambiamenti nell'espressione genica associati al fotoinvecchiamento. In secondo luogo, un mezzo condizionato da fibroblasti senescenti indotti da UVB può essere raccolto e trasferito a fibroblasti sani, portando a una riduzione delle proteine della matrice extracellulare e all'aumento dell'espressione genica delle citochine proinfiammatorie. Questi cambiamenti sono contrastati utilizzando una nuova combinazione di antiossidanti (vitamina C + idebenone). Questi risultati dimostrano che il modello in vitro può essere utilizzato per valutare l'efficacia di nuovi composti sulle caratteristiche dell'invecchiamento delle cellule dermiche della pelle, e quindi per selezionare composti che possono modulare i processi cellulari rigeneranti e di ringiovanimento della pelle.
Introduzione
L'invecchiamento cutaneo è il processo naturale di riduzione delle funzioni e delle proprietà cutanee, inclusa perdita di fermezza ed elasticità e aumento del flasso. Questo è accelerato da fattori esterni, come l'esposizione agli ultravioletti (UV) e l'inquinamento, che danneggiano le cellule e causano cambiamenti a livellomolecolare 1. Questi cambiamenti sono stati ben caratterizzati da ricerche recenti e identificati come segni distintivi dell'invecchiamento, tra cui instabilità genomica, attrito dei telomeri, alterazioni epigenetiche, perdita di proteostasi, macroautofagia difettosa, rilevamento deregolato dei nutrienti, disfunzione mitocondriale, senescenza cellulare, esaurimento delle cellule staminali, alterazione della comunicazione intercellulare, infiammazione cronica edisbiosi 2. Queste caratteristiche spiegano come il danno subcellulare si traduca in disfunzione tissutale, favorendo così il processo di invecchiamento. Curiosamente, queste alterazioni non agiscono indipendentemente ma formano una firma di rete interdipendente. Il danno primario, come danni genomici o alterazioni epigenetiche, si accumula e alla fine causa la senescenza cellulare. Nel caso della pelle, ciò è causato principalmente da danni da raggi UV, con il fotoinvecchiamento che è il principale contributo ai tratti dell'invecchiamentocutaneo 3. Le cellule senescenti mostrano una produzione aumentata di citochine proinfiammatorie, metalloproteinasi della matrice e fattori di crescita, noto anche come fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP) e che include IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA o IL1A, tra glialtri 4,5,6. Questi fattori secreti non solo influenzano le proprietà strutturali della pelle, come la matrice extracellulare dermica, ma disturbano anche la funzione delle cellule circostanti. Ciò include il rilascio di citochine che stimolano l'attivazione dei melanociti per provocare l'iperpigmentazione cutanea associata all'età (come il fattore delle cellule staminali o IL18) o altre proteine dannose che alterano la funzione dei fibroblasti sani circostanti, compromettendone la funzione e contribuendo all'amplificazione aumentata del fenotiposenescente 7,8,9,10,11. Di conseguenza, l'infiammazione cronica e la comunicazione intercellulare alterata sono promotori chiave dello stato dannoso che traduce queste alterazioni molecolari in segni visivi dell'invecchiamento cutaneo, come rughe, cadenza, macchie di età o perdita di rigidità.
Le specifiche proteine che contribuiscono agli effetti dannosi del SASP possono essere studiate tramite tecniche ben note come il saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA), Luminex, la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) o Western Blot, tra lealtre 5,12. Tuttavia, questo approccio è utile per identificare proteine specifiche da una prospettiva individuale e caratterizzare un meccanismo d'azione specifico, ma non considera gli effetti del SASP completo sulle cellule vicine. Qui viene proposto un protocollo in vitro per studiare l'effetto del SASP prodotto dai fibroblasti dermici senescenti indotti da UVB sui fibroblasti vicini sani, imitando il segno alterato della comunicazione intercellulare dell'invecchiamento. Come detto prima, l'UV è il principale motore della senescenza cellulare nella pelle. Pertanto, il danno UV viene selezionato come fonte di danno rispetto alla senescenza replicativa o indotta da oncogeni per costruire il modello3 attuale. Per questo si utilizza il mezzo contenente i fattori secreti dai fibroblasti senescenti (mezzo condizionato) e i marcatori della funzione cellulare vengono quantificati in fibroblasti sani incubati con questo mezzo. Secondo questo protocollo, una volta che il mezzo condizionato è stato trasferito dalle cellule senescenti a quelle sane, i fibroblasti senescenti indotti da UVB vengono prelevati per quantificare caratteristiche molecolari, come i geni coinvolti nella segnalazione proinfiammatoria e paracrina. In secondo luogo, i fibroblasti sani trattati con mezzo condizionato da fibroblasti senescenti vengono prelevati per caratterizzare l'effetto del SASP sulle cellule vicine, quantificando i geni coinvolti nella matrice extracellulare, nei fattori di crescita e nell'attivazione dei fibroblasti. Pertanto, l'effetto dei composti di interesse (COI) viene analizzato sia inizialmente nei fibroblasti senescenti sia successivamente in fibroblasti sani trattati con il mezzo condizionato. Per quanto riguarda questi composti, ricerche precedenti hanno dimostrato che gli antiossidanti sono efficaci nel proteggere e correggere i segni dell'invecchiamento cutaneo indotto dal fotoinvecchiamento. Di conseguenza, la combinazione di due antiossidanti (vitamina C e idebenone) viene utilizzata per invertire alcune delle alterazioni indotte dagli UVB, sia nelle cellule senescenti che in quelle sane incubate con un mezzo condizionato da cellulesenescenti 13,14,15
Nel complesso, questo protocollo è progettato per studiare gli effetti della SASP sulle cellule della pelle e per identificare nuove molecole/interventi che ripristinano la comunicazione intercellulare alterata, essendo così adatti a prodotti rigenerativi e biostimolanti in medicina estetica e dermatologia rigenerativa.
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Protocollo
I fibroblasti dermici umani utilizzati in questo studio sono stati ottenuti da un fornitore commerciale di linee cellulari. Poiché non sono stati coinvolti campioni umani primari, dati dei pazienti o esperimenti in vivo , non è stata necessaria l'approvazione e il consenso informato dell'Institutional Review Board (IRB) per questo studio.
1. Induzione di senescenza nei fibroblasti dermici tramite UVB
- Placcare fibroblasti dermici umani a una densità di 6 × 104 cellule per pozzo in una piastra a 6 pozzi utilizzando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con siero fetale bovino (FBS) al 10%.
- Dopo 24 ore, rimuovere il mezzo di coltura cellulare e sostituirlo con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per pozzo.
- Irradia le cellule con luce UVB a 25 mJ/cm2.
NOTA: Questa energia è stata ottimizzata per il dispositivo di irradiazione UVB utilizzato in questo protocollo (vedi Tabella dei Materiali) per indurre danni sufficienti da innescare la senescenza evitando danni eccessivi che potrebbero portare all'apoptosi. Quando si utilizzano altri dispositivi, si deve regolare di conseguenza l'energia di irradiazione.
ATTENZIONE: Le radiazioni UVB sono pericolose. Utilizzare dispositivi protettivi e schermature adeguate per evitare l'esposizione. - Rimuovi PBS e aggiungi 2 mL di mezzo di coltura cellulare fresca per ogni pozzo.
- Dopo 72 ore, rimuovere il mezzo di coltura cellulare, aggiungere 1 mL di PBS per pozzo e ripetere l'irradiazione UVB come descritto nel passo 1.3.
- Dopo 72 ore, rimuovere il mezzo di coltura cellulare e aggiungere 0,5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% per pozzo. Incubare per 1–2 minuti a 37 °C, poi prelevare le cellule utilizzando 1,5 mL di mezzo di coltura cellulare fresco.
- Placcare le cellule a una densità di 8 × 104 cellule per pozzo in una piastra a 6 pozzi utilizzando un mezzo di coltura cellulare (DMEM integrato con FBS al 10%). La senescenza cellulare viene indotta dopo questo passaggio.
2. Trattamento delle cellule senescenti con composti di interesse
- Dopo 24 ore, rimuovere il mezzo di coltura cellulare e aggiungere 2 mL di mezzo di coltura cellulare contenente composti di interesse.
- Dopo ulteriori 24 ore, si implate un lotto separato di fibroblasti dermici umani (come descritto nel passo 1.1) in placche a 6 pozzi. Queste cellule fungeranno da fibroblasti dermici sani per il trasferimento del mezzo condizionato.
3. Trasferimento condizionato di mezzo dalle cellule senescenti a quelle sane
- A 48 ore dal trattamento composto delle cellule senescenti e a 24 ore dall'incapsulamento dei fibroblasti sani, raccogliere 2 mL di mezzo condizionato per pozzo dalle cellule senescenti e trasferirlo ai fibroblasti sani.
NOTA: Rimuovere immediatamente il substrato di coltura dai fibroblasti sani prima di aggiungere il substrato condizionato per garantire un trasferimento efficiente. - Aggiungi 1 mL di PBS alle cellule senescenti e prelevale usando tripsina come descritto nel passo 1.6. Usa queste cellule per l'analisi dei marcatori di senescenza o infiammazione utilizzando un kit ELISA o qPCR.
NOTA: I pellet cellulari possono essere conservati a −80 °C se i test a valle non vengono eseguiti immediatamente. - Incubare fibroblasti sani che ricevono un mezzo condizionato a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore.
4. Prelievo di cellule sane per l'analisi dell'attivazione dei fibroblasti tramite analisi dell'espressione genica
- Dopo 24 ore di incubazione con mezzo condizionato, prelevare fibroblasti sani utilizzando tripsina come descritto nel passo 1.6. Analizzare l'espressione genica della matrice extracellulare tramite qPCR.
- Esegui l'analisi qPCR.
- Estrai l'RNA dai pellet cellulari secondo le istruzioni del produttore (kit di estrazione RNA).
- Eseguire la trascrizione inversa di 200 ng di RNA secondo le istruzioni del produttore (kit di trascrizione inversa).
- Amplificare il cDNA secondo le istruzioni del produttore (qPCR master mix). Eseguire la qPCR nelle seguenti condizioni: 95 °C per 30 s, seguiti da 40 cicli a 95 °C per 5 s e 60 °C per 30 s. Gli innesco utilizzati sono elencati nella Tabella 1.
| Gene | Sequenza in avanti | Sequenza inversa |
| CDKN2A | 5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3' | 5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3' |
| CDKN1A | 5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3' | 5'-CCAGGACTGCAGGCTTCCT-3' |
| SCF | 5'-AATCCTCTCGTCAAAACTGAAGG-3' | 5'-CCATCTCGCTTATCCAACAATGA-3' |
| IL-18 | 5'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3' | 5'-GTTTGTTGCGAGAGGAAGGG-3' |
| ELN | 5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3' | 5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCA-3' |
| FBN1 | 5'-GGTGAATGTACAAACACAGTCAGCAG-3' | 5'-ATAGGAACAGAGCAGCTTGTTGA-3' |
| IL-6 | 5'-AGCCCTGAAAGGAGACATGTA-3' | 5'-TCTGCCAGTGCCTCTTTGC-3' |
| IL-8 | 5'-ATTTCTGCGCCTGTGTGTGTGAAGGT-3' | 5'-TTTTTTATGAATTCTCAGCCCTCT-3' |
| CTGF | 5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGTGT-3' | 5'-TGTCTTCCAGTCGGTAGGCAGCTA-3 |
| IGF1 | 5'-CAGAGCAGATAGAGCCTGCG-3' | 5'-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3' |
Tabella 1: Elenco degli innesco utilizzati per i test qPCR. Per ogni primer sono fornite sequenze dirette e inverse corrispondenti ai geni studiati e quantificati in questo modello.
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Risultati
Il protocollo attuale descrive un metodo per simulare il segno alterato della comunicazione intercellulare dell'invecchiamento in vitro. La Figura 1 presenta uno schema grafico che illustra i principali passaggi del protocollo, inclusa l'induzione della senescenza, la quantificazione dei marcatori e l'analisi della comunicazione intercellulare alterata nelle cellule della pelle in vitro.
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Discussione
Comprendere il processo di invecchiamento a livello molecolare è fondamentale per progettare nuovi approcci e interventi che ritardino le caratteristiche correlate all'invecchiamento e prolunghino la longevità e la funzionalità di cellule e tessuti. La definizione e l'identificazione dei segni distintivi dell'invecchiamento sono state essenziali per stabilire un quadro scientifico per lo sviluppo di questiinterventi 2,16. Tra i t...
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Dichiarazioni
Tutti gli autori erano impiegati per Mesoaesthetic Pharma Group, S.L.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i collaboratori per il loro aiuto e i consigli in questo progetto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 6-well plates | Fisher Scientific | 10578911 | Piatti multi-pozze per coltura cellulare da utilizzare durante il test (induzione senescenziale e trattamento con composti) |
| Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (dispositivo di irradiazione UVB) | Vilber Lourmat | VL-6111-1090-1 | Dispositivo utilizzato per produrre danni mediante irradiazione UVB e conseguente induzione di senescenza |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Merck Life science | D6046-500ML | Medium standard per la coltura cellulare dei fibroblasti dermici |
| Siero bovino fetale (FBS) | Fisher Scientific | 17593595 | Supplemento nutritivo utilizzato come fonte di fattori di crescita, ormoni, proteine e micronutrienti essenziali per la crescita cellulare |
| H3K27me3 ELISA kit | Epigentek | P-3014T-096 | Un immunodosaggio specifico per rilevare la modifica epigenetica di H3K27me3 nei campioni biologici |
| Fibroblasti dermici umani | Promocell | C-12302 | Principale cellula della pelle nel derma e regolatore dell'invecchiamento cutaneo da fotoesposizione |
| Soluzione tampone fosfato (PBS) | Merck Life science | D8537-500ML | Soluzione tampone che riproduce l'ambiente fisiologico. Utilizzata per lavare le cellule senza indurre stress o ridurre la vitalità cellulare |
| PrimeScript RT reagent kit (kit di reverse transcription) | Takara Bio | RR037A | Il kit per ottenere cDNA dall'RNA isolato dalle cellule. 2° passo per il test qPCR dopo la purificazione dell'RNA. |
| TB Green Premix Ex Taq (mix master per qPCR) | Takara Bio | RR420A | Il kit per produrre la reazione a catena della polimerasi dal cDNA per quantificare i livelli di espressione genica. 3° passo per il test qPCR dopo la reverse transcription. |
| Total RNA Purification Kit (kit di estrazione RNA) | Norgen | 17200 | Il kit per ottenere RNA dalle cellule raccolte. 1° passo per il test qPCR dopo la raccolta delle cellule. |
| Trypsin/EDTA 0,05% | Merck Life science | T2601-100ML | Soluzione enzimatica utilizzata nei passaggi di raccolta/passaggio per il distacco delle cellule dalle piastre di coltura cellulare |
Riferimenti
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