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Articolo di ricerca

La propentofillina allevia l'iperalgesia incisionale regolando la fosforilazione di ERK1/2 negli astrociti e nella microglia spinale

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DOI:

10.3791/70927

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14 agosto 2026

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1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

In questo articolo

Sommario

Questo studio analizza l'effetto della propentofillina somministrata per via intratecale nell'attenuare l'iperalgia da incisione e se tale effetto sia associato a modifiche nei marcatori gliali spinali e nella fosforilazione della chinasi 1 e 2 regolata dal segnale extracellulare nei ratti.

Abstract

Si è ipotizzato che gli astrociti spinali, la microglia e la chinasi extracellulare regolata dal segnale 1 e 2 (ERK1/2) siano coinvolti nell'elaborazione del dolore. Questo studio ha indagato se la propentofillina (PPF) intratecale somministrata prima dell'intervento attenui l'iperalgesia acuta da incisione nei ratti e se tale effetto sia associato ai marcatori gliali spinali e alla fosforilazione di ERK1/2. Sessantasei ratti maschi Sprague–Dawley sono stati assegnati casualmente ai gruppi controllo, dolore da incisione, soluzione salina fisiologica, dimetilsolfossido, PPF e U0126. L'iperalgesia meccanica e termica è stata valutata al basale e a 2, 4, 8, 24 e 72 h dopo l'incisione. I marcatori neuronali e gliali spinali, p-ERK1/2 e i mediatori infiammatori sono stati analizzati mediante immunoblotting e immunofluorescenza. Sono stati inoltre condotti esperimenti su astrociti spinali primari per esaminare il rilascio di mediatori infiammatori dipendente da ERK1/2. La PPF intratecale preoperatoria ha attenuato l'iperalgesia meccanica e termica per l'intero periodo di osservazione di 72 ore, mentre l'U0126 ha attenuato l'iperalgesia principalmente durante il periodo post-incisione precoce. A 4 ore dall'incisione, entrambi i trattamenti si sono associati a una ridotta espressione spinale di GFAP, Iba-1 e p-ERK1/2 e a una ridotta immunoreattività per TNF-α e COX-2. In astrociti coltivati, la PPF ha ridotto il rilascio di mediatori infiammatori indotto dal LPS, mentre l'ERK1/2 costitutivamente attivo ha attenuato tale effetto. Questi risultati supportano un'associazione tra l'effetto anti-iperalgesico della PPF e la modulazione delle risposte gliali spinali, di ERK1/2 e infiammatorie successive all'incisione.

Introduzione

Il dolore incisionale, un tipo comune di dolore acuto che segue interventi chirurgici, in genere non persiste per più di 7 giorni, ma presenta meccanismi patologici complessi diversi da quelli del dolore infiammatorio e neuropatico1,2. Se il dolore incisionale non viene adeguatamente controllato durante la sua evoluzione, può progredire ulteriormente verso una sindrome da dolore cronico, e la sua natura può passare da un dolore da lesione tissutale acuta a un dolore neuropatico o misto3. Generalmente, la somministrazione di analgesici, come oppioidi e farmaci anti-infiammatori non steroidei, rappresenta la forma più comune di analgesia dopo un'incisione. Tuttavia, possono verificarsi numerosi effetti collaterali con l'uso continuo o a dosi elevate di questi farmaci, una circostanza che evidenzia la necessità di strategie analgesiche più sicure ed efficaci.

Evidenze affidabili indicano che la propentofillina (PPF) allevia l'iperalgesia in diversi processi dolorosi4,5. Inoltre, l'effetto analgesico della PPF può essere in parte attribuito all'inibizione dell'espressione spinale delle chinasi attivate da mitogeni (MAPK), come p38 e le chinasi N-terminali di c-Jun (JNK)6. Sebbene gli effetti della PPF sui percorsi di p38 e JNK siano stati stabiliti, la sua eventuale modulazione del percorso della chinasi regolata da segnale extracellulare 1 e 2 (ERK1/2), un'altra sottofamiglia fondamentale di MAPK implicata nella trasmissione del segnale del dolore, non è ancora stata esplorata nel dolore incisionale acuto. Questa lacuna conoscitiva è particolarmente rilevante considerando che l'attivazione di ERK1/2 mostra schemi temporali e cellulari distinti rispetto a p38 e JNK, suggerendo potenziali opportunità terapeutiche uniche.

Si riteneva inizialmente che le cellule gliali, tra cui astrociti, microglia e oligodendrociti, costituissero la struttura di collegamento e di sostegno del tessuto nervoso. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che astrociti e microglia svolgono un ruolo importante nella regolazione della plasticità sinaptica e nella trasmissione delle informazioni relative al dolore7. Essendo i macrofagi residenti del cervello e del midollo spinale, la microglia può essere attivata da diversi segnali stimolanti extracellulari in una fase molto precoce del processo del dolore, per poi proliferare e rilasciare grandi quantità di citochine infiammatorie, che aumentano la conduzione dei segnali del dolore dal midollo spinale al cervello8,9. Contemporaneamente, gli astrociti attivati possono aumentare il rilascio del neurotrasmettitore eccitatorio glutammato e inviare informazioni direttamente ai neuroni sensoriali potenziando la comunicazione intercellulare10.

Studi hanno dimostrato che l'attivazione degli astrociti avviene nella fase iniziale (entro le prime 24 h) del dolore indotto da incisione, mentre l'attivazione dei microglia appare molto più tardi11,12. Inoltre, uno studio ha indicato che i microglia attivati hanno un effetto limitato sull'iperalgia meccanica nel dolore indotto da incisione13. Questi risultati evidenziano questioni ancora aperte riguardo ai ruoli distinti di astrociti e microglia nel dolore acuto. La propentofillina, un agente modulatore della glia, è stata riportata alleviare l'iperalgia regolando l'attivazione di astrociti e microglia successivamente a lesioni croniche da costrizione nervosa, lesioni nervose acute e lesioni acute dei tessuti4,5. Tuttavia, per quanto noto attualmente, nessuno studio ha esaminato gli effetti della PPF sull'attivazione di astrociti o microglia nel dolore acuto indotto da incisione.

La chinasi extracellulare regolata da segnale 1 e 2, una principale sottofamiglia di MAPK attivata a valle della chinasi mitogen-attivata 1 e 2 (MEK1/2), è stata ampiamente associata all'elaborazione del segnale nocicettivo e alla plasticità neuronale14,15. Studi precedenti hanno dimostrato che la ERK1/2 fosforilata (p-ERK1/2) può essere indotta nei neuroni spinali da stimolazione nocicettiva e può essere rilevata anche negli astrociti e nelle microglia in condizioni di dolore infiammatorio o neuropatico16,17,18,19. Inoltre, è stato riportato che l'inibizione farmacologica della via di segnalazione MEK1/2–ERK1/2 attenua l'iperalgia meccanica e termica in diversi modelli di dolore20,21,22,23,24,25.

Tuttavia, la distribuzione cellulare della ERK1/2 spinale, in particolare negli astrociti e nella microglia, attivata da un'incisione acuta e il suo ruolo nel dolore indotto dall'incisione rimangono insufficientemente definiti. Studi precedenti del gruppo di ricerca indicano che il PPF allevia l'iperalgia acuta da incisione nei ratti riducendo la segnalazione spinale di JNK e p38, ma non è chiaro se il PPF moduli anche la segnalazione correlata a ERK1/2 nelle cellule gliali spinali durante il dolore indotto dall'incisione. Pertanto, lo studio attuale dovrebbe essere considerato un'estensione dei modelli gliali e MAPK esistenti nella ricerca sul dolore, piuttosto che un paradigma meccanicistico completamente indipendente. La sua principale differenza rispetto ai lavori precedenti risiede nel focus specifico sul dolore acuto da incisione, nell'esame di ERK1/2 piuttosto che di p38/JNK come componente MAPK di interesse e nella valutazione della distribuzione cellulare spinale precoce di p-ERK1/2 in relazione al trattamento con PPF.

Questo studio è stato progettato per verificare se la somministrazione intratecale preoperatoria di PPF attenua l'iperalgia da incisione in un modello di incisione plantare nel ratto e se tale effetto sia associato alla fosforilazione di ERK1/2 o a variazioni nell'espressione di marcatori neuronali e gliali spinali e di mediatori infiammatori, come il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) e la cicloossigenasi-2 (COX-2). Più specificamente, questo studio si distingue dai precedenti rapporti per la combinazione di valutazione comportamentale con analisi temporale mediante Western blot; per il confronto farmacologico con l'inibitore MEK1/2 U0126; e per la localizzazione qualitativa mediante immunofluorescenza di p-ERK1/2 nei neuroni spinali, negli astrociti e nella microglia all'interno di un modello di dolore da incisione acuta. Sebbene il suo quadro meccanicistico si basi su letteratura precedente che associa la modulazione gliale e il segnale MAPK al dolore, il presente lavoro intende fornire ulteriori evidenze circa il possibile coinvolgimento delle risposte gliali spinali correlate a ERK1/2 nella fase iniziale dell'iperalgia da incisione.

Rispetto agli analgesici postoperatori convenzionali, gli approcci mirati a specifici percorsi possono verificare un componente di segnalazione definito ma possono offrire benefici solo temporanei e richiedere una somministrazione invasiva; l'inibizione di MEK1/2–ERK1/2 ha mostrato effetti antiallodinici in diversi modelli sperimentali di dolore20,21,22,23,24,25. Il PPF differisce da un inibitore di un singolo percorso poiché modula le risposte gliali ed è stato associato a più di un processo associato alla MAPK4,5,6. La traduzione pratica rimane limitata dal disegno preclinico, dalla somministrazione intratecale preoperatoria, dall'uso esclusivo di ratti maschi e dall'assenza di studi sulla titolazione del dosaggio e sulla sicurezza in modelli chirurgici più grandi.

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Protocollo

Gli esperimenti condotti sono stati approvati dal Comitato Etico del Secondo Ospedale Affiliato dell'Università di Lanzhou, Provincia di Gansu, Cina (numero di approvazione etica 2017-070). Tutte le procedure hanno seguito le linee guida dell'International Association for the Study of Pain26. Sono stati utilizzati complessivamente 66 ratti maschi adulti Sprague–Dawley, ottenuti da un centro accreditato per animali da laboratorio, del peso di 200–250 g. Nel presente studio sono stati inclusi esclusivamente ratti maschi per ridurre la variabilità potenziale legata a influenze ormonali dipendenti dal sesso. Tutti i protocolli sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'International Association for the Study of Pain26, adottando le misure necessarie per minimizzare la sofferenza. Informazioni dettagliate sui reagenti, materiali di consumo, strumenti e software utilizzati nello studio sono riportate nella Tabella dei Materiali.

Animali

I ratti sono stati alloggiati a coppie prima dell'intervento e singolarmente dopo l'incisione, con cibo e acqua ad libitum. La stanza è stata mantenuta con un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio e a temperatura controllata di 24 °C ± 2 °C.

Iniezione intratecale e modello di dolore post-operatorio

Per la somministrazione intratecale di soluzioni, i ratti sono stati anestetizzati con sevoflurano al 1,5%–3% (erogato attraverso un cono nasale) e posizionati in decubito prono con la colonna vertebrale flessa. Il pelo sulla regione lombare è stato rasato e la cute corrispondente allo spazio intervertebrale L5–L6 è stata disinfettata. Una microsiringa è stata inserita per via percutanea nello spazio intervertebrale L5–L6. L’ingresso corretto nello spazio subaracnoideo è stato indicato da un improvviso movimento della coda o da un guizzo della coda durante l’avanzamento dell’ago ed è stato ulteriormente confermato dalla comparsa di liquido cerebrospinale in seguito ad aspirazione delicata. Se questi segni non erano osservabili, la posizione dell’ago è stata regolata prima dell’iniezione. L’iniezione è stata eseguita solo dopo che entrambi i criteri di conferma erano stati soddisfatti, e gli animali che presentavano segni neurologici anomali dopo l’iniezione sono stati esclusi. La rispettiva soluzione è stata quindi iniettata lentamente e la cute è stata nuovamente pulita al termine dell’iniezione. L’intervento chirurgico è durato circa 3 minuti e i ratti in genere si sono ripresi dall’anestesia entro 5–10 minuti.

Il modello di dolore da incisione nel ratto è stato realizzato come precedentemente descritto27. Dopo l'anestesia, la superficie plantare della zampa posteriore è stata disinfettata con iodopovidone al 10%. È stata eseguita un'incisione longitudinale di 1 cm sulla cute plantare, a partire da circa 0,5 cm dal tallone e prolungata in direzione delle dita. L'incisione ha interessato la cute e la fascia. Il muscolo plantare è stato delicatamente sollevato con pinze oftalmiche ed inciso longitudinalmente, preservando la continuità generale del tessuto. Successivamente, il muscolo è stato riposizionato, è stata applicata una leggera pressione per ottenere l'emostasi e la ferita è stata chiusa con due punti a materasso in nylon 3-0. Il sito d'incisione è stato nuovamente disinfettato al termine della chiusura. Dopo l'intervento chirurgico, i ratti sono stati alloggiati singolarmente e lasciati riprendere in un ambiente caldo e tranquillo, protetti dalla luce intensa e con libero accesso a cibo e acqua. Gli animali sono stati monitorati nel postoperatorio e quelli che non soddisfacevano i criteri predeterminati sono stati esclusi tempestivamente. La presenza di infezione della ferita è stata valutata in base a rossore, gonfiore e aumento della temperatura locale intorno alla ferita, essudato purulento giallo-verde anomalo con cattivo odore, ritardo nella guarigione della ferita con persistente apertura, necrosi e aumento delle dimensioni, nonché segni sistemici come temperatura corporea elevata, letargia e rifiuto del cibo. Altri criteri di esclusione includevano mancato risveglio dall'anestesia entro 30 minuti, sezione intraoperatoria del muscolo o lesione neurovascolare, automutilazione postoperatoria, fallimento nella realizzazione del modello e deficit neurologici, come paralisi dell'arto posteriore o incapacità di sostenere il peso non correlati al dolore da incisione. I ratti con infezione o deiscenza della ferita sono stati esclusi dallo studio.

Misurazione del comportamento

La soglia meccanica del riflesso di ritrazione della zampa (PWMT) e la latenza termica del riflesso di ritrazione della zampa (PWTL) sono state misurate da un ricercatore in cecità rispetto all'assegnazione al gruppo. I test sono stati eseguiti in una stanza tranquilla, sempre alla stessa ora della giornata, dopo almeno 10 minuti di acclimatazione; l'ambiente, il pavimento a rete o in vetro, l'illuminazione ambientale e l'intensità della sorgente di calore sono stati mantenuti costanti tra i gruppi. Per il test della PWMT, filamenti calibrati di von Frey (0,4 g, 0,6 g, 1,0 g, 1,4 g, 2,0 g, 4,0 g, 6,0 g, 8,0 g, 10,0 g e 15,0 g) sono stati applicati perpendicolarmente alla superficie plantare adiacente alla ferita fino a quando il filamento si piegava di circa 1–2 mm. Le stimolazioni consecutive erano separate da 2 minuti, e la PWMT al 50% è stata determinata mediante il metodo ascendente-discendente28. Per il test della PWTL, i ratti sono stati posizionati in contenitori trasparenti individuali su un pavimento di vetro, e la sorgente di calore radiante è stata allineata con la superficie plantare accanto alla ferita. Un tempo limite di 30 s ha evitato lesioni ai tessuti, le esposizioni consecutive erano separate da 2 minuti, e la media di tre misurazioni è stata registrata29. Il sollevamento, scuotimento o leccamento della zampa è stato considerato una risposta positiva di ritrazione; le prove influenzate da grooming, locomozione o perdita di allineamento della sorgente termica sono state ripetute dopo una nuova acclimatazione.

Analisi di Western blot

Nei tempi prestabiliti, i ratti sono stati soppressi mediante dislocazione cervicale e il midollo spinale lombare L4–L6 è stato rapidamente prelevato in un buffer di lisi per saggio di immunoprecipitazione radioattiva integrato con inibitore delle proteasi in un rapporto di 100:1. I tessuti sono stati omogeneizzati, mantenuti sul ghiaccio per 20 minuti e centrifugati a 15.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Il sopranatante è stato mescolato con buffer di caricamento 4× in un rapporto di 3:1, riscaldato in acqua bollente per 5 minuti e conservato a −80 °C. I campioni proteici (30 µg per corsia) sono stati separati su gel di elettroforesi in poliacrilammide contenenti dodecilsolfato di sodio al 10% e trasferiti su membrane di fluoruro di polivinilidene da 0,45 o 0,22 µm. Il trasferimento riuscito è stato verificato controllando la migrazione attesa del marcatore di peso molecolare precolorato e l’assenza di aree di trasferimento evidenti disomogenee o interrotte. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% e albumina sierica bovina al 3% per 2 ore a temperatura ambiente e incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi primari contro NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) o GAPDH (1:2.000). Dopo lavaggio in soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween 20 allo 0,05% (pH 7,4), le membrane sono state incubate con l’anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (1:5.000) per 1 ora a temperatura ambiente. I segnali sono stati rivelati mediante chemiluminescenza migliorata e registrati su pellicola utilizzando lo stesso intervallo di esposizione per ciascun bersaglio. Un ricercatore cieco rispetto all’assegnazione dei gruppi ha analizzato la densità delle bande mediante software di analisi delle immagini. Le immagini sono state convertite in scala di grigi a 8 bit, una regione rettangolare identica di interesse è stata applicata a ciascuna banda, il fondo locale proveniente da una regione vuota adiacente è stato sottratto e la densità integrata è stata registrata. Le stesse dimensioni della regione e la stessa procedura di sottrazione del fondo sono state utilizzate per tutte le corsie su ciascun blot. NeuN, GFAP, Iba-1 e t-ERK1/2 sono stati normalizzati rispetto a GAPDH; p-ERK1/2 è stato normalizzato rispetto a t-ERK1/2; i valori sono stati quindi espressi in rapporto al gruppo controllo.

Immunofluorescenza

Nei tempi prestabiliti, i ratti sono stati anestetizzati con pentobarbital sodico al 3% (1,5 mL/kg) e perfusi attraverso il cuore con 300 mL di soluzione salina tamponata al fosfato 0,01 mol/L (PBS; pH 7,4) pre-raffreddata, seguiti da 250 mL di paraformaldeide al 4% pre-raffreddata. Il midollo spinale L4–L6 è stato post-fissato in paraformaldeide al 4% per 6 h, protetto dal congelamento in soluzione di saccarosio 20%–30% in PBS a 4 °C per tutta la notte e tagliato in sezioni da 10 µm a −22 °C. Le sezioni sono state lavate in PBS 0,01 mol/L, bloccate nel siero di capra al 10% per 1 h a temperatura ambiente e incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi primari contro NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) o COX-2 (1:50). Dopo tre lavaggi in PBS, le sezioni sono state incubate con l'anticorpo secondario coniugato con fluoroforo verde o rosso (1:400) per 1 h a temperatura ambiente, lavate ulteriormente tre volte in PBS e montate con mezzo antiossidante e un coprivetrino. In ogni serie di colorazione sono state incluse sezioni di controllo negativo processate senza anticorpo primario. Le immagini sono state acquisite da un ricercatore in cieco mediante microscopio a fluorescenza. Le immagini di panoramica a basso ingrandimento sono state acquisite utilizzando un obiettivo 10×, mentre le immagini di immunoreattività cellulare e di co-localizzazione sono state acquisite utilizzando obiettivi 20× o 40× in base al pannello della figura corrispondente. Per confronti all'interno della stessa figura e della stessa serie di colorazione, l'ingrandimento dell'obiettivo, l'intensità dell'illuminazione, il tempo di esposizione, il guadagno del rivelatore, le impostazioni della fotocamera e i parametri di elaborazione delle immagini sono stati mantenuti fissi dopo l'ottimizzazione al di sotto della saturazione. I canali di fluorescenza separati sono stati acquisiti in modo sequenziale per minimizzare l'overlap tra canali. Per ogni animale sono state acquisite tre campiture non sovrapposte nel corno dorsale controlaterale. L'intensità della fluorescenza è stata quantificata mediante software di analisi delle immagini dopo conversione a 8 bit, sottrazione del fondo utilizzando una regione priva di cellule e applicazione di una regione di interesse e di una soglia identiche all'interno di ciascuna serie di colorazione; i valori delle campiture sono stati mediati per ottenere un singolo valore per animale. Le campiture con sovraesposizione, piegature del tessuto, lacerazioni, scarsa messa a fuoco o fondo non uniforme sono state escluse e riacquisite con le stesse impostazioni non saturanti. La colorazione è stata considerata accettabile quando l'architettura del tessuto era integra, il segnale specifico superava quello del controllo senza anticorpo primario e non erano presenti pieghe, lacerazioni o aree saturate che potessero influenzare l'analisi.

In vitro esperimenti con astrociti spinali primari

Gli astrociti spinali primari di ratto sono stati coltivati in condizioni sterili standard in un mezzo di coltura completo a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO2. Le cellule sono state utilizzate quando hanno raggiunto una confluenza di circa 70%–80% e sono state assegnate ai gruppi controllo, stimolati con LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 e recupero di ERK1/2. PPF e U0126 sono stati aggiunti alla concentrazione di 10 µM. La stimolazione con LPS, il trattamento farmacologico e le condizioni di raccolta sono stati mantenuti identici tra pozzetti paralleli all'interno di ciascun esperimento. Per l'analisi della selettività della via di segnalazione, i lisati cellulari sono stati raccolti per la blotting di p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, p38 totale, p-JNK, JNK totale e del corrispondente controllo di caricamento. I supernatanti di coltura provenienti da pozzetti paralleli sono stati raccolti, chiarificati mediante centrifugazione e analizzati per TNF-α, PGE2 e IL-6 mediante saggio immunoenzimatico (ELISA) secondo le istruzioni del produttore. La densitometria dei blotting occidentali ha seguito gli stessi principi di analisi dell'immagine descritti in precedenza. Per gli esperimenti di recupero, l'ERK1/2 endogeno è stato soppresso mediante trasfezione con siRNA e un costrutto esprimente ERK1/2 costitutivamente attivo (CA-ERK1/2) è stato introdotto prima del trattamento. L'efficienza di silenziamento e sovraespressione è stata confermata mediante blotting occidentale prima dell'interpretazione dei dati relativi alle citochine. Le cellule esposte al reagente di trasfezione senza siRNA attivo o costrutto hanno funto da controlli procedurali quando applicabile.

Progettazione sperimentale

Suddivisione in sottogruppi degli animali sperimentali

I ratti sono stati assegnati a sei gruppi mediante un metodo basato su una tabella di numeri casuali, e l'assegnazione ai gruppi è stata completata prima dei test comportamentali e del prelievo dei tessuti. I sei gruppi comprendevano un gruppo bianco (n = 6), un gruppo con dolore da incisione (IP) (n = 18), un gruppo con soluzione salina normale (NS) (NS allo 0,9%, 10 µL; n = 9), un gruppo PPF (10 µg in 10 µL; n = 12), un gruppo dimetilsulfossido (DMSO) (DMSO al 10%, 10 µL; n = 9) e un gruppo U0126 (10 µg in 10 µL; n = 12). I ratti del gruppo bianco non hanno ricevuto né incisione plantare né iniezione intratecale e sono serviti come controlli non trattati. I ratti del gruppo IP hanno subito un'incisione plantare senza pretrattamento mediante iniezione intratecale. I ratti dei gruppi NS, PPF, DMSO e U0126 hanno ricevuto la somministrazione intratecale dei rispettivi agenti 30 minuti prima dell'incisione plantare. Il gruppo NS ha funto da controllo del veicolo per PPF, mentre il gruppo DMSO ha funto da controllo del veicolo per U0126.

Dosi di propentofillina e U0126

La propentofillina è un modulatore gliale e una dose di 10 µg è stata scelta perché aveva alleviato l'iperalgesia acuta in precedenti studi condotti dal gruppo di ricerca. U0126 è un inibitore non competitivo nei confronti dell'adenosina trifosfato della MEK1/2 utilizzato per bloccare la fosforilazione dell'ERK1/2. Dosi intratecali efficaci comprese tra 1 e 10 µg sono state riportate in diversi modelli di dolore30,31,32; nel presente studio è stata utilizzata la dose di 10 µg. U0126 è stato disciolto nel 10% di dimetilsulfossido, mentre PPF è stato disciolto in soluzione salina normale allo 0,9%. Le concentrazioni finali erano di 1 µg/µL. Farmaci e veicoli sono stati preparati prima dell'intervento chirurgico, mantenuti a 4 °C e utilizzati entro 12 ore.

Effetto della somministrazione intratecale preoperatoria di propentofillina o U0126 sull'iperalgia

Sei ratti di ciascun gruppo sono stati selezionati casualmente per la misurazione comportamentale 24 h prima dell'intervento, e i valori risultanti di PWMT e PWTL sono stati considerati come valori basali. Le iniezioni intratecali sono state somministrate 30 min prima dell'intervento. Per valutare gli effetti dell'amministrazione intratecale preoperatoria di PPF e U0126 sull'iperalgia meccanica e termica, PWMT e PWTL sono stati valutati a 2 h, 4 h, 8 h, 24 h e 72 h dopo l'incisione.

Progettazione sperimentale per la valutazione degli effetti di propentofillina o U0126 somministrati per via intratecale prima dell'intervento chirurgico sull'espressione dei marcatori neuronali e gliali spinali dopo incisione

Per determinare il punto temporale post-incisione più appropriato per la valutazione dell'effetto del trattamento, è stata inizialmente eseguita un'analisi preliminare in funzione del tempo nel gruppo IP. In particolare, i ratti del gruppo IP sono stati sacrificati a 2 h, 4 h, 24 h e 72 h dopo l'incisione, e i livelli di espressione dei marcatori cellulari NeuN, GFAP e Iba-1 nel midollo spinale sono stati misurati mediante Western blot (n = 3 per ogni punto temporale). Sulla base di questa analisi preliminare, le prime 4 h post-incisione sono state selezionate come finestra di osservazione precoce poiché l'espressione di NeuN ha raggiunto il livello massimo al tempo di 4 h e poiché si è ritenuto che i cambiamenti molecolari precoci fossero i più rilevanti per lo sviluppo iniziale dell'iperalgia post-incisionale. Tuttavia, il punto temporale di 4 h non era inteso a rappresentare tutti i cambiamenti molecolari nel tempo successivi all'incisione.

In questo punto temporale selezionato, i ratti che avevano ricevuto un'iniezione intratecale sono stati soppressi per l'analisi mediante Western blot di diversi marcatori cellulari (n = 3 per gruppo) e per la valutazione mediante immunofluorescenza della morfologia di diversi tipi cellulari (n = 3 per gruppo). Nel gruppo controllo, i ratti sono stati soppressi casualmente per determinare i livelli basali di espressione di diversi marcatori cellulari (NeuN, GFAP e Iba-1) nel midollo spinale mediante Western blot (n = 3) e la morfologia di diverse cellule (neuroni, astrociti e microglia) mediante immunofluorescenza (n = 3). Pertanto, il gruppo controllo ha funto da controllo di base non inciso e non trattato.

Effetti del trattamento sulla p-ERK1/2 spinale e sui mediatori infiammatori

Per determinare il punto temporale post-incisione appropriato per valutare gli effetti del trattamento sull'espressione di p-ERK1/2 e sui livelli di citochine infiammatorie, è stata inizialmente eseguita un'analisi preliminare in funzione del tempo nel gruppo IP. In particolare, i ratti del gruppo IP sono stati sacrificati a 2 h, 4 h, 24 h e 72 h dopo l'incisione, e l'espressione di p-ERK1/2 nel midollo spinale è stata misurata mediante Western blot (n = 3 per ogni punto temporale). Sulla base di questo esperimento cinetico e del punto temporale in cui l'espressione di NeuN risultava massima dopo l'incisione, è stato scelto il tempo di 4 h dopo l'incisione come punto fisso per la successiva valutazione degli effetti dell'amministrazione intratecale preoperatoria di PPF o U0126 sull'espressione di p-ERK1/2 nel midollo spinale e sulle citochine infiammatorie. Tale punto temporale è stato selezionato come finestra osservativa precoce di tipo meccanicistico, piuttosto che come rappresentazione completa di tutti i cambiamenti temporali successivi all'incisione.

In questo punto temporale selezionato, i ratti che avevano ricevuto un'iniezione intratecale sono stati soppressi per l'analisi mediante Western blot dell'espressione di p-ERK1/2 (n = 3 per gruppo) e per la valutazione mediante immunofluorescenza dei citochine infiammatorie (n = 3 per gruppo). Nel gruppo controllo, i ratti sono stati soppressi casualmente per determinare i livelli basali di espressione di p-ERK1/2 nel midollo spinale mediante Western blot (n = 3) e dei citochine infiammatorie (TNF-α e COX-2) mediante immunofluorescenza (n = 3). Pertanto, il gruppo controllo ha funto da controllo di base non inciso e non trattato.

Localizzazione cellulare della p-ERK1/2 spinale nei neuroni, astrociti e microglia

Per ulteriore valutazione della distribuzione cellulare della p-ERK1/2 spinale dopo l'incisione, è stata eseguita una colorazione immunofluorescente nei gruppi Blank e IP a 4 h dall'incisione (n = 3).

Analisi statistica

I dati sono espressi come media ± deviazione standard. La dimensione del campione è stata determinata in base a studi precedenti del gruppo di ricerca e a esperimenti preliminari. I dati comportamentali sono stati analizzati mediante analisi della varianza (ANOVA) a due vie con misure ripetute, utilizzando il gruppo come fattore tra i soggetti e il tempo come fattore entro i soggetti. I dati di Western blot in funzione del tempo sono stati valutati mediante ANOVA a un fattore seguita da confronti multipli a coppie corretti con il metodo di Bonferroni. I dati fissi di Western blot e di immunofluorescenza sono stati valutati mediante ANOVA a un fattore con confronti pianificati corretti con Bonferroni; i confronti tra due gruppi sono stati valutati con il test t di Student. La normalità e l'omogeneità della varianza sono state verificate rispettivamente con i test di Shapiro–Wilk e di Levene. È stato considerato significativo un valore p bilaterale < 0,05. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software di analisi statistica indicato nella Tabella dei Materiali. Per gli esperimenti in vitro con astrociti, gli esperimenti indipendenti di coltura sono stati considerati come unità di analisi; la densitometria di Western blot e le concentrazioni di citochine sono state confrontate mediante ANOVA a un fattore seguita da confronti pianificati corretti con Bonferroni o con il test t di Student per confronti predefiniti tra due gruppi, secondo opportunità.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I dati a sostegno dei risultati di questo studio sono forniti nel File Supplementare 1.

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Risultati

Gli effetti dell'incisione e della somministrazione intratecale preoperatoria di propentofillina o U0126 sull'iperalgia dopo incisione

Iperalgesia meccanica

Non sono state osservate differenze significative nei PWMT tra i sei gruppi a 24 h prima dell'intervento (p > 0,05; Figura 1A,B). Nel gruppo IP, il PWMT è diminuito dopo l'incisione ed è rimasto significativamente inferiore risp...

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Discussione

La maggior parte dei pazienti soffre di dolore acuto dopo un intervento chirurgico, non solo fisicamente ma talvolta anche mentalmente33, eppure molti aspetti dei meccanismi dettagliati del dolore postoperatorio acuto rimangono sconosciuti. Accanto agli effetti potenti dei farmaci analgesici vi sono gli inevitabili effetti collaterali, rendendo fondamentale l'esplorazione di analgesici più sicuri ed efficaci. Questo studio si è basato su un modello ratto di incisione precedentemente validato, semp...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi personali, finanziari, commerciali o accademici.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Haijiao Zhou e Ming Wang per il supporto tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tampone PBS 0,01 MSolarbioP1020
Tampone Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)SolarbioT1020
Tampone Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)SolarbioT1010
Sodio dodecilsolfato (SDS) al 10%SolarbioS1010
Soluzione madre TBST 10×SolarbioT1081
Acrilamide al 30%SolarbioA1010
Tampone di caricamento proteico 4×SolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
Persolfato di ammonioSolarbioA1030
Macchina automatica per ghiaccio a scaglieChangshu XuekeIMS-40
Albumina sierica bovina (BSA)SolarbioA8020
Criostato CM150LeicaCM150
Phmetro digitale—PHS-3C
Dietilsolfossido (DMSO)SolarbioD8371
Bilancia analitica elettronicaCany—
Reagente chemiluminescente potenziato (ECL)SolarbioPE0010
PellicolaKodak—
Microscopio a fluorescenza DP71OlympusDP71
Mezzo di inclusione per sezioni congelateSakura4583
Apparecchio per elettroforesi su gelBIO-RAD—
GliceroloSolarbioIG0910
GlicinaSolarbioG8200
Secondo anticorpo coniugato con Alexa Fluor 594 anti-topo capraProteintechSA00013-3
Secondo anticorpo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) anti-topo capraZSGB-BIOZB2305
Secondo anticorpo coniugato con Alexa Fluor 488 anti-coniglio capraProteintechSA00013-2
Secondo anticorpo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) anti-coniglio capraZSGB-BIOZB2301
Siero di capraSolarbioSL038
GraphPad PrismGraphPad Software5
Centrifuga refrigerata ad alta velocità 3K15Sigma3K15
Agitatore orbitale orizzontale TS-1000Haimen QilinbeierTS-1000
ImageJNational Institutes of Health1.51j8
MetanoloTianjin Guangfu—
Anticorpo primario anti-ratto GAPDH da mouseProteintech60004-1-Ig
Anticorpo primario anti-ratto p-ERK1/2 da mouseCST9101S
Na2HPO3Tianjin Beichen Fangzheng—
NaH2PO3Tianjin Damao—
ParaformaldeideBiosharpBL539A
Vetrini per patologiaShitai—
Fluoruro di fenilmetanosulfonile (PMSF)BeyotimeST506
Plantar Test 37370UGO BASILE37370
Membrana in fluoruro di polivinilideneSolarbio—
Propentofillina (PPF)TaosuT19812
Anticorpo primario anti-ratto COX-2 da coniglioAbcamAb179800
Anticorpo primario anti-ratto GFAP da coniglioProteintech16825-1-AP
Anticorpo primario anti-ratto Iba-1 da coniglioProteintech10904-1-AP
Anticorpo primario anti-ratto NeuN da coniglioAbcamAb279297
Anticorpo primario anti-ratto t-ERK1/2 da coniglioProteintech11257-1-AP
Anticorpo primario anti-ratto TNF-α da coniglioProteintech29652-1-AP
Tampone di lisi RIPASolarbioR0010
SDSSolarbioS8010
Latte in polvere scrematoSolarbioD8340
SPSSIBM22
Tetrametiletilendiammina (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
Triton X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
Congelatore a temperatura ultra-bassaHaier—
Congelatore a temperatura ultra-bassaSanyo—
Sistema di purificazione acqua ultrapuraHeal Force—
Filamenti di von FreyNorth Coast Medical—

Riferimenti

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