La propentofillina allevia l'iperalgesia incisionale regolando la fosforilazione di ERK1/2 negli astrociti e nella microglia spinale

Xu Jin; Na Zhou; Lixiong Tuo; Yisa Shi

doi:10.3791/70927

Articolo di ricerca

La propentofillina allevia l'iperalgesia incisionale regolando la fosforilazione di ERK1/2 negli astrociti e nella microglia spinale

DOI:

10.3791/70927

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14 agosto 2026

Xu Jin¹ , Na Zhou² , Lixiong Tuo¹ , Yisa Shi³

¹Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, ²Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, ³Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

In questo articolo

Sommario

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Questo studio analizza l'effetto della propentofillina somministrata per via intratecale nell'attenuare l'iperalgia da incisione e se tale effetto sia associato a modifiche nei marcatori gliali spinali e nella fosforilazione della chinasi 1 e 2 regolata dal segnale extracellulare nei ratti.

Abstract

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Si è ipotizzato che gli astrociti spinali, la microglia e la chinasi extracellulare regolata dal segnale 1 e 2 (ERK1/2) siano coinvolti nell'elaborazione del dolore. Questo studio ha indagato se la propentofillina (PPF) intratecale somministrata prima dell'intervento attenui l'iperalgesia acuta da incisione nei ratti e se tale effetto sia associato ai marcatori gliali spinali e alla fosforilazione di ERK1/2. Sessantasei ratti maschi Sprague–Dawley sono stati assegnati casualmente ai gruppi controllo, dolore da incisione, soluzione salina fisiologica, dimetilsolfossido, PPF e U0126. L'iperalgesia meccanica e termica è stata valutata al basale e a 2, 4, 8, 24 e 72 h dopo l'incisione. I marcatori neuronali e gliali spinali, p-ERK1/2 e i mediatori infiammatori sono stati analizzati mediante immunoblotting e immunofluorescenza. Sono stati inoltre condotti esperimenti su astrociti spinali primari per esaminare il rilascio di mediatori infiammatori dipendente da ERK1/2. La PPF intratecale preoperatoria ha attenuato l'iperalgesia meccanica e termica per l'intero periodo di osservazione di 72 ore, mentre l'U0126 ha attenuato l'iperalgesia principalmente durante il periodo post-incisione precoce. A 4 ore dall'incisione, entrambi i trattamenti si sono associati a una ridotta espressione spinale di GFAP, Iba-1 e p-ERK1/2 e a una ridotta immunoreattività per TNF-α e COX-2. In astrociti coltivati, la PPF ha ridotto il rilascio di mediatori infiammatori indotto dal LPS, mentre l'ERK1/2 costitutivamente attivo ha attenuato tale effetto. Questi risultati supportano un'associazione tra l'effetto anti-iperalgesico della PPF e la modulazione delle risposte gliali spinali, di ERK1/2 e infiammatorie successive all'incisione.

Introduzione

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Il dolore incisionale, un tipo comune di dolore acuto che segue interventi chirurgici, in genere non persiste per più di 7 giorni, ma presenta meccanismi patologici complessi diversi da quelli del dolore infiammatorio e neuropatico¹^,². Se il dolore incisionale non viene adeguatamente controllato durante la sua evoluzione, può progredire ulteriormente verso una sindrome da dolore cronico, e la sua natura può passare da un dolore da lesione tissutale acuta a un dolore neuropatico o misto³. Generalmente, la somministrazione di analgesici, come oppioidi e farmaci anti-infiammatori non steroidei, rappresenta la forma più comune di analgesia dopo un'incisione. Tuttavia, possono verificarsi numerosi effetti collaterali con l'uso continuo o a dosi elevate di questi farmaci, una circostanza che evidenzia la necessità di strategie analgesiche più sicure ed efficaci.

Evidenze affidabili indicano che la propentofillina (PPF) allevia l'iperalgesia in diversi processi dolorosi⁴^,⁵. Inoltre, l'effetto analgesico della PPF può essere in parte attribuito all'inibizione dell'espressione spinale delle chinasi attivate da mitogeni (MAPK), come p38 e le chinasi N-terminali di c-Jun (JNK)⁶. Sebbene gli effetti della PPF sui percorsi di p38 e JNK siano stati stabiliti, la sua eventuale modulazione del percorso della chinasi regolata da segnale extracellulare 1 e 2 (ERK1/2), un'altra sottofamiglia fondamentale di MAPK implicata nella trasmissione del segnale del dolore, non è ancora stata esplorata nel dolore incisionale acuto. Questa lacuna conoscitiva è particolarmente rilevante considerando che l'attivazione di ERK1/2 mostra schemi temporali e cellulari distinti rispetto a p38 e JNK, suggerendo potenziali opportunità terapeutiche uniche.

Si riteneva inizialmente che le cellule gliali, tra cui astrociti, microglia e oligodendrociti, costituissero la struttura di collegamento e di sostegno del tessuto nervoso. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che astrociti e microglia svolgono un ruolo importante nella regolazione della plasticità sinaptica e nella trasmissione delle informazioni relative al dolore⁷. Essendo i macrofagi residenti del cervello e del midollo spinale, la microglia può essere attivata da diversi segnali stimolanti extracellulari in una fase molto precoce del processo del dolore, per poi proliferare e rilasciare grandi quantità di citochine infiammatorie, che aumentano la conduzione dei segnali del dolore dal midollo spinale al cervello⁸^,⁹. Contemporaneamente, gli astrociti attivati possono aumentare il rilascio del neurotrasmettitore eccitatorio glutammato e inviare informazioni direttamente ai neuroni sensoriali potenziando la comunicazione intercellulare¹⁰.

Studi hanno dimostrato che l'attivazione degli astrociti avviene nella fase iniziale (entro le prime 24 h) del dolore indotto da incisione, mentre l'attivazione dei microglia appare molto più tardi¹¹^,¹². Inoltre, uno studio ha indicato che i microglia attivati hanno un effetto limitato sull'iperalgia meccanica nel dolore indotto da incisione¹³. Questi risultati evidenziano questioni ancora aperte riguardo ai ruoli distinti di astrociti e microglia nel dolore acuto. La propentofillina, un agente modulatore della glia, è stata riportata alleviare l'iperalgia regolando l'attivazione di astrociti e microglia successivamente a lesioni croniche da costrizione nervosa, lesioni nervose acute e lesioni acute dei tessuti⁴^,⁵. Tuttavia, per quanto noto attualmente, nessuno studio ha esaminato gli effetti della PPF sull'attivazione di astrociti o microglia nel dolore acuto indotto da incisione.

La chinasi extracellulare regolata da segnale 1 e 2, una principale sottofamiglia di MAPK attivata a valle della chinasi mitogen-attivata 1 e 2 (MEK1/2), è stata ampiamente associata all'elaborazione del segnale nocicettivo e alla plasticità neuronale¹⁴^,¹⁵. Studi precedenti hanno dimostrato che la ERK1/2 fosforilata (p-ERK1/2) può essere indotta nei neuroni spinali da stimolazione nocicettiva e può essere rilevata anche negli astrociti e nelle microglia in condizioni di dolore infiammatorio o neuropatico¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Inoltre, è stato riportato che l'inibizione farmacologica della via di segnalazione MEK1/2–ERK1/2 attenua l'iperalgia meccanica e termica in diversi modelli di dolore²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵.

Tuttavia, la distribuzione cellulare della ERK1/2 spinale, in particolare negli astrociti e nella microglia, attivata da un'incisione acuta e il suo ruolo nel dolore indotto dall'incisione rimangono insufficientemente definiti. Studi precedenti del gruppo di ricerca indicano che il PPF allevia l'iperalgia acuta da incisione nei ratti riducendo la segnalazione spinale di JNK e p38, ma non è chiaro se il PPF moduli anche la segnalazione correlata a ERK1/2 nelle cellule gliali spinali durante il dolore indotto dall'incisione. Pertanto, lo studio attuale dovrebbe essere considerato un'estensione dei modelli gliali e MAPK esistenti nella ricerca sul dolore, piuttosto che un paradigma meccanicistico completamente indipendente. La sua principale differenza rispetto ai lavori precedenti risiede nel focus specifico sul dolore acuto da incisione, nell'esame di ERK1/2 piuttosto che di p38/JNK come componente MAPK di interesse e nella valutazione della distribuzione cellulare spinale precoce di p-ERK1/2 in relazione al trattamento con PPF.

Questo studio è stato progettato per verificare se la somministrazione intratecale preoperatoria di PPF attenua l'iperalgia da incisione in un modello di incisione plantare nel ratto e se tale effetto sia associato alla fosforilazione di ERK1/2 o a variazioni nell'espressione di marcatori neuronali e gliali spinali e di mediatori infiammatori, come il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) e la cicloossigenasi-2 (COX-2). Più specificamente, questo studio si distingue dai precedenti rapporti per la combinazione di valutazione comportamentale con analisi temporale mediante Western blot; per il confronto farmacologico con l'inibitore MEK1/2 U0126; e per la localizzazione qualitativa mediante immunofluorescenza di p-ERK1/2 nei neuroni spinali, negli astrociti e nella microglia all'interno di un modello di dolore da incisione acuta. Sebbene il suo quadro meccanicistico si basi su letteratura precedente che associa la modulazione gliale e il segnale MAPK al dolore, il presente lavoro intende fornire ulteriori evidenze circa il possibile coinvolgimento delle risposte gliali spinali correlate a ERK1/2 nella fase iniziale dell'iperalgia da incisione.

Rispetto agli analgesici postoperatori convenzionali, gli approcci mirati a specifici percorsi possono verificare un componente di segnalazione definito ma possono offrire benefici solo temporanei e richiedere una somministrazione invasiva; l'inibizione di MEK1/2–ERK1/2 ha mostrato effetti antiallodinici in diversi modelli sperimentali di dolore²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵. Il PPF differisce da un inibitore di un singolo percorso poiché modula le risposte gliali ed è stato associato a più di un processo associato alla MAPK⁴^,⁵^,⁶. La traduzione pratica rimane limitata dal disegno preclinico, dalla somministrazione intratecale preoperatoria, dall'uso esclusivo di ratti maschi e dall'assenza di studi sulla titolazione del dosaggio e sulla sicurezza in modelli chirurgici più grandi.

Protocollo

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Gli esperimenti condotti sono stati approvati dal Comitato Etico del Secondo Ospedale Affiliato dell'Università di Lanzhou, Provincia di Gansu, Cina (numero di approvazione etica 2017-070). Tutte le procedure hanno seguito le linee guida dell'International Association for the Study of Pain²⁶. Sono stati utilizzati complessivamente 66 ratti maschi adulti Sprague–Dawley, ottenuti da un centro accreditato per animali da laboratorio, del peso di 200–250 g. Nel presente studio sono stati inclusi esclusivamente ratti maschi per ridurre la variabilità potenziale legata a influenze ormonali dipendenti dal sesso. Tutti i protocolli sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'International Association for the Study of Pain²⁶, adottando le misure necessarie per minimizzare la sofferenza. Informazioni dettagliate sui reagenti, materiali di consumo, strumenti e software utilizzati nello studio sono riportate nella Tabella dei Materiali.

Animali

I ratti sono stati alloggiati a coppie prima dell'intervento e singolarmente dopo l'incisione, con cibo e acqua ad libitum. La stanza è stata mantenuta con un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio e a temperatura controllata di 24 °C ± 2 °C.

Iniezione intratecale e modello di dolore post-operatorio

Per la somministrazione intratecale di soluzioni, i ratti sono stati anestetizzati con sevoflurano al 1,5%–3% (erogato attraverso un cono nasale) e posizionati in decubito prono con la colonna vertebrale flessa. Il pelo sulla regione lombare è stato rasato e la cute corrispondente allo spazio intervertebrale L5–L6 è stata disinfettata. Una microsiringa è stata inserita per via percutanea nello spazio intervertebrale L5–L6. L’ingresso corretto nello spazio subaracnoideo è stato indicato da un improvviso movimento della coda o da un guizzo della coda durante l’avanzamento dell’ago ed è stato ulteriormente confermato dalla comparsa di liquido cerebrospinale in seguito ad aspirazione delicata. Se questi segni non erano osservabili, la posizione dell’ago è stata regolata prima dell’iniezione. L’iniezione è stata eseguita solo dopo che entrambi i criteri di conferma erano stati soddisfatti, e gli animali che presentavano segni neurologici anomali dopo l’iniezione sono stati esclusi. La rispettiva soluzione è stata quindi iniettata lentamente e la cute è stata nuovamente pulita al termine dell’iniezione. L’intervento chirurgico è durato circa 3 minuti e i ratti in genere si sono ripresi dall’anestesia entro 5–10 minuti.

Il modello di dolore da incisione nel ratto è stato realizzato come precedentemente descritto²⁷. Dopo l'anestesia, la superficie plantare della zampa posteriore è stata disinfettata con iodopovidone al 10%. È stata eseguita un'incisione longitudinale di 1 cm sulla cute plantare, a partire da circa 0,5 cm dal tallone e prolungata in direzione delle dita. L'incisione ha interessato la cute e la fascia. Il muscolo plantare è stato delicatamente sollevato con pinze oftalmiche ed inciso longitudinalmente, preservando la continuità generale del tessuto. Successivamente, il muscolo è stato riposizionato, è stata applicata una leggera pressione per ottenere l'emostasi e la ferita è stata chiusa con due punti a materasso in nylon 3-0. Il sito d'incisione è stato nuovamente disinfettato al termine della chiusura. Dopo l'intervento chirurgico, i ratti sono stati alloggiati singolarmente e lasciati riprendere in un ambiente caldo e tranquillo, protetti dalla luce intensa e con libero accesso a cibo e acqua. Gli animali sono stati monitorati nel postoperatorio e quelli che non soddisfacevano i criteri predeterminati sono stati esclusi tempestivamente. La presenza di infezione della ferita è stata valutata in base a rossore, gonfiore e aumento della temperatura locale intorno alla ferita, essudato purulento giallo-verde anomalo con cattivo odore, ritardo nella guarigione della ferita con persistente apertura, necrosi e aumento delle dimensioni, nonché segni sistemici come temperatura corporea elevata, letargia e rifiuto del cibo. Altri criteri di esclusione includevano mancato risveglio dall'anestesia entro 30 minuti, sezione intraoperatoria del muscolo o lesione neurovascolare, automutilazione postoperatoria, fallimento nella realizzazione del modello e deficit neurologici, come paralisi dell'arto posteriore o incapacità di sostenere il peso non correlati al dolore da incisione. I ratti con infezione o deiscenza della ferita sono stati esclusi dallo studio.

Misurazione del comportamento

La soglia meccanica del riflesso di ritrazione della zampa (PWMT) e la latenza termica del riflesso di ritrazione della zampa (PWTL) sono state misurate da un ricercatore in cecità rispetto all'assegnazione al gruppo. I test sono stati eseguiti in una stanza tranquilla, sempre alla stessa ora della giornata, dopo almeno 10 minuti di acclimatazione; l'ambiente, il pavimento a rete o in vetro, l'illuminazione ambientale e l'intensità della sorgente di calore sono stati mantenuti costanti tra i gruppi. Per il test della PWMT, filamenti calibrati di von Frey (0,4 g, 0,6 g, 1,0 g, 1,4 g, 2,0 g, 4,0 g, 6,0 g, 8,0 g, 10,0 g e 15,0 g) sono stati applicati perpendicolarmente alla superficie plantare adiacente alla ferita fino a quando il filamento si piegava di circa 1–2 mm. Le stimolazioni consecutive erano separate da 2 minuti, e la PWMT al 50% è stata determinata mediante il metodo ascendente-discendente²⁸. Per il test della PWTL, i ratti sono stati posizionati in contenitori trasparenti individuali su un pavimento di vetro, e la sorgente di calore radiante è stata allineata con la superficie plantare accanto alla ferita. Un tempo limite di 30 s ha evitato lesioni ai tessuti, le esposizioni consecutive erano separate da 2 minuti, e la media di tre misurazioni è stata registrata²⁹. Il sollevamento, scuotimento o leccamento della zampa è stato considerato una risposta positiva di ritrazione; le prove influenzate da grooming, locomozione o perdita di allineamento della sorgente termica sono state ripetute dopo una nuova acclimatazione.

Analisi di Western blot

Nei tempi prestabiliti, i ratti sono stati soppressi mediante dislocazione cervicale e il midollo spinale lombare L4–L6 è stato rapidamente prelevato in un buffer di lisi per saggio di immunoprecipitazione radioattiva integrato con inibitore delle proteasi in un rapporto di 100:1. I tessuti sono stati omogeneizzati, mantenuti sul ghiaccio per 20 minuti e centrifugati a 15.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Il sopranatante è stato mescolato con buffer di caricamento 4× in un rapporto di 3:1, riscaldato in acqua bollente per 5 minuti e conservato a −80 °C. I campioni proteici (30 µg per corsia) sono stati separati su gel di elettroforesi in poliacrilammide contenenti dodecilsolfato di sodio al 10% e trasferiti su membrane di fluoruro di polivinilidene da 0,45 o 0,22 µm. Il trasferimento riuscito è stato verificato controllando la migrazione attesa del marcatore di peso molecolare precolorato e l’assenza di aree di trasferimento evidenti disomogenee o interrotte. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% e albumina sierica bovina al 3% per 2 ore a temperatura ambiente e incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi primari contro NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) o GAPDH (1:2.000). Dopo lavaggio in soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween 20 allo 0,05% (pH 7,4), le membrane sono state incubate con l’anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (1:5.000) per 1 ora a temperatura ambiente. I segnali sono stati rivelati mediante chemiluminescenza migliorata e registrati su pellicola utilizzando lo stesso intervallo di esposizione per ciascun bersaglio. Un ricercatore cieco rispetto all’assegnazione dei gruppi ha analizzato la densità delle bande mediante software di analisi delle immagini. Le immagini sono state convertite in scala di grigi a 8 bit, una regione rettangolare identica di interesse è stata applicata a ciascuna banda, il fondo locale proveniente da una regione vuota adiacente è stato sottratto e la densità integrata è stata registrata. Le stesse dimensioni della regione e la stessa procedura di sottrazione del fondo sono state utilizzate per tutte le corsie su ciascun blot. NeuN, GFAP, Iba-1 e t-ERK1/2 sono stati normalizzati rispetto a GAPDH; p-ERK1/2 è stato normalizzato rispetto a t-ERK1/2; i valori sono stati quindi espressi in rapporto al gruppo controllo.

Immunofluorescenza

Nei tempi prestabiliti, i ratti sono stati anestetizzati con pentobarbital sodico al 3% (1,5 mL/kg) e perfusi attraverso il cuore con 300 mL di soluzione salina tamponata al fosfato 0,01 mol/L (PBS; pH 7,4) pre-raffreddata, seguiti da 250 mL di paraformaldeide al 4% pre-raffreddata. Il midollo spinale L4–L6 è stato post-fissato in paraformaldeide al 4% per 6 h, protetto dal congelamento in soluzione di saccarosio 20%–30% in PBS a 4 °C per tutta la notte e tagliato in sezioni da 10 µm a −22 °C. Le sezioni sono state lavate in PBS 0,01 mol/L, bloccate nel siero di capra al 10% per 1 h a temperatura ambiente e incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi primari contro NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) o COX-2 (1:50). Dopo tre lavaggi in PBS, le sezioni sono state incubate con l'anticorpo secondario coniugato con fluoroforo verde o rosso (1:400) per 1 h a temperatura ambiente, lavate ulteriormente tre volte in PBS e montate con mezzo antiossidante e un coprivetrino. In ogni serie di colorazione sono state incluse sezioni di controllo negativo processate senza anticorpo primario. Le immagini sono state acquisite da un ricercatore in cieco mediante microscopio a fluorescenza. Le immagini di panoramica a basso ingrandimento sono state acquisite utilizzando un obiettivo 10×, mentre le immagini di immunoreattività cellulare e di co-localizzazione sono state acquisite utilizzando obiettivi 20× o 40× in base al pannello della figura corrispondente. Per confronti all'interno della stessa figura e della stessa serie di colorazione, l'ingrandimento dell'obiettivo, l'intensità dell'illuminazione, il tempo di esposizione, il guadagno del rivelatore, le impostazioni della fotocamera e i parametri di elaborazione delle immagini sono stati mantenuti fissi dopo l'ottimizzazione al di sotto della saturazione. I canali di fluorescenza separati sono stati acquisiti in modo sequenziale per minimizzare l'overlap tra canali. Per ogni animale sono state acquisite tre campiture non sovrapposte nel corno dorsale controlaterale. L'intensità della fluorescenza è stata quantificata mediante software di analisi delle immagini dopo conversione a 8 bit, sottrazione del fondo utilizzando una regione priva di cellule e applicazione di una regione di interesse e di una soglia identiche all'interno di ciascuna serie di colorazione; i valori delle campiture sono stati mediati per ottenere un singolo valore per animale. Le campiture con sovraesposizione, piegature del tessuto, lacerazioni, scarsa messa a fuoco o fondo non uniforme sono state escluse e riacquisite con le stesse impostazioni non saturanti. La colorazione è stata considerata accettabile quando l'architettura del tessuto era integra, il segnale specifico superava quello del controllo senza anticorpo primario e non erano presenti pieghe, lacerazioni o aree saturate che potessero influenzare l'analisi.

In vitro esperimenti con astrociti spinali primari

Gli astrociti spinali primari di ratto sono stati coltivati in condizioni sterili standard in un mezzo di coltura completo a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂. Le cellule sono state utilizzate quando hanno raggiunto una confluenza di circa 70%–80% e sono state assegnate ai gruppi controllo, stimolati con LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 e recupero di ERK1/2. PPF e U0126 sono stati aggiunti alla concentrazione di 10 µM. La stimolazione con LPS, il trattamento farmacologico e le condizioni di raccolta sono stati mantenuti identici tra pozzetti paralleli all'interno di ciascun esperimento. Per l'analisi della selettività della via di segnalazione, i lisati cellulari sono stati raccolti per la blotting di p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, p38 totale, p-JNK, JNK totale e del corrispondente controllo di caricamento. I supernatanti di coltura provenienti da pozzetti paralleli sono stati raccolti, chiarificati mediante centrifugazione e analizzati per TNF-α, PGE2 e IL-6 mediante saggio immunoenzimatico (ELISA) secondo le istruzioni del produttore. La densitometria dei blotting occidentali ha seguito gli stessi principi di analisi dell'immagine descritti in precedenza. Per gli esperimenti di recupero, l'ERK1/2 endogeno è stato soppresso mediante trasfezione con siRNA e un costrutto esprimente ERK1/2 costitutivamente attivo (CA-ERK1/2) è stato introdotto prima del trattamento. L'efficienza di silenziamento e sovraespressione è stata confermata mediante blotting occidentale prima dell'interpretazione dei dati relativi alle citochine. Le cellule esposte al reagente di trasfezione senza siRNA attivo o costrutto hanno funto da controlli procedurali quando applicabile.

Progettazione sperimentale

Suddivisione in sottogruppi degli animali sperimentali

I ratti sono stati assegnati a sei gruppi mediante un metodo basato su una tabella di numeri casuali, e l'assegnazione ai gruppi è stata completata prima dei test comportamentali e del prelievo dei tessuti. I sei gruppi comprendevano un gruppo bianco (n = 6), un gruppo con dolore da incisione (IP) (n = 18), un gruppo con soluzione salina normale (NS) (NS allo 0,9%, 10 µL; n = 9), un gruppo PPF (10 µg in 10 µL; n = 12), un gruppo dimetilsulfossido (DMSO) (DMSO al 10%, 10 µL; n = 9) e un gruppo U0126 (10 µg in 10 µL; n = 12). I ratti del gruppo bianco non hanno ricevuto né incisione plantare né iniezione intratecale e sono serviti come controlli non trattati. I ratti del gruppo IP hanno subito un'incisione plantare senza pretrattamento mediante iniezione intratecale. I ratti dei gruppi NS, PPF, DMSO e U0126 hanno ricevuto la somministrazione intratecale dei rispettivi agenti 30 minuti prima dell'incisione plantare. Il gruppo NS ha funto da controllo del veicolo per PPF, mentre il gruppo DMSO ha funto da controllo del veicolo per U0126.

Dosi di propentofillina e U0126

La propentofillina è un modulatore gliale e una dose di 10 µg è stata scelta perché aveva alleviato l'iperalgesia acuta in precedenti studi condotti dal gruppo di ricerca. U0126 è un inibitore non competitivo nei confronti dell'adenosina trifosfato della MEK1/2 utilizzato per bloccare la fosforilazione dell'ERK1/2. Dosi intratecali efficaci comprese tra 1 e 10 µg sono state riportate in diversi modelli di dolore³⁰^,³¹^,³²; nel presente studio è stata utilizzata la dose di 10 µg. U0126 è stato disciolto nel 10% di dimetilsulfossido, mentre PPF è stato disciolto in soluzione salina normale allo 0,9%. Le concentrazioni finali erano di 1 µg/µL. Farmaci e veicoli sono stati preparati prima dell'intervento chirurgico, mantenuti a 4 °C e utilizzati entro 12 ore.

Effetto della somministrazione intratecale preoperatoria di propentofillina o U0126 sull'iperalgia

Sei ratti di ciascun gruppo sono stati selezionati casualmente per la misurazione comportamentale 24 h prima dell'intervento, e i valori risultanti di PWMT e PWTL sono stati considerati come valori basali. Le iniezioni intratecali sono state somministrate 30 min prima dell'intervento. Per valutare gli effetti dell'amministrazione intratecale preoperatoria di PPF e U0126 sull'iperalgia meccanica e termica, PWMT e PWTL sono stati valutati a 2 h, 4 h, 8 h, 24 h e 72 h dopo l'incisione.

Progettazione sperimentale per la valutazione degli effetti di propentofillina o U0126 somministrati per via intratecale prima dell'intervento chirurgico sull'espressione dei marcatori neuronali e gliali spinali dopo incisione

Per determinare il punto temporale post-incisione più appropriato per la valutazione dell'effetto del trattamento, è stata inizialmente eseguita un'analisi preliminare in funzione del tempo nel gruppo IP. In particolare, i ratti del gruppo IP sono stati sacrificati a 2 h, 4 h, 24 h e 72 h dopo l'incisione, e i livelli di espressione dei marcatori cellulari NeuN, GFAP e Iba-1 nel midollo spinale sono stati misurati mediante Western blot (n = 3 per ogni punto temporale). Sulla base di questa analisi preliminare, le prime 4 h post-incisione sono state selezionate come finestra di osservazione precoce poiché l'espressione di NeuN ha raggiunto il livello massimo al tempo di 4 h e poiché si è ritenuto che i cambiamenti molecolari precoci fossero i più rilevanti per lo sviluppo iniziale dell'iperalgia post-incisionale. Tuttavia, il punto temporale di 4 h non era inteso a rappresentare tutti i cambiamenti molecolari nel tempo successivi all'incisione.

In questo punto temporale selezionato, i ratti che avevano ricevuto un'iniezione intratecale sono stati soppressi per l'analisi mediante Western blot di diversi marcatori cellulari (n = 3 per gruppo) e per la valutazione mediante immunofluorescenza della morfologia di diversi tipi cellulari (n = 3 per gruppo). Nel gruppo controllo, i ratti sono stati soppressi casualmente per determinare i livelli basali di espressione di diversi marcatori cellulari (NeuN, GFAP e Iba-1) nel midollo spinale mediante Western blot (n = 3) e la morfologia di diverse cellule (neuroni, astrociti e microglia) mediante immunofluorescenza (n = 3). Pertanto, il gruppo controllo ha funto da controllo di base non inciso e non trattato.

Effetti del trattamento sulla p-ERK1/2 spinale e sui mediatori infiammatori

Per determinare il punto temporale post-incisione appropriato per valutare gli effetti del trattamento sull'espressione di p-ERK1/2 e sui livelli di citochine infiammatorie, è stata inizialmente eseguita un'analisi preliminare in funzione del tempo nel gruppo IP. In particolare, i ratti del gruppo IP sono stati sacrificati a 2 h, 4 h, 24 h e 72 h dopo l'incisione, e l'espressione di p-ERK1/2 nel midollo spinale è stata misurata mediante Western blot (n = 3 per ogni punto temporale). Sulla base di questo esperimento cinetico e del punto temporale in cui l'espressione di NeuN risultava massima dopo l'incisione, è stato scelto il tempo di 4 h dopo l'incisione come punto fisso per la successiva valutazione degli effetti dell'amministrazione intratecale preoperatoria di PPF o U0126 sull'espressione di p-ERK1/2 nel midollo spinale e sulle citochine infiammatorie. Tale punto temporale è stato selezionato come finestra osservativa precoce di tipo meccanicistico, piuttosto che come rappresentazione completa di tutti i cambiamenti temporali successivi all'incisione.

In questo punto temporale selezionato, i ratti che avevano ricevuto un'iniezione intratecale sono stati soppressi per l'analisi mediante Western blot dell'espressione di p-ERK1/2 (n = 3 per gruppo) e per la valutazione mediante immunofluorescenza dei citochine infiammatorie (n = 3 per gruppo). Nel gruppo controllo, i ratti sono stati soppressi casualmente per determinare i livelli basali di espressione di p-ERK1/2 nel midollo spinale mediante Western blot (n = 3) e dei citochine infiammatorie (TNF-α e COX-2) mediante immunofluorescenza (n = 3). Pertanto, il gruppo controllo ha funto da controllo di base non inciso e non trattato.

Localizzazione cellulare della p-ERK1/2 spinale nei neuroni, astrociti e microglia

Per ulteriore valutazione della distribuzione cellulare della p-ERK1/2 spinale dopo l'incisione, è stata eseguita una colorazione immunofluorescente nei gruppi Blank e IP a 4 h dall'incisione (n = 3).

Analisi statistica

I dati sono espressi come media ± deviazione standard. La dimensione del campione è stata determinata in base a studi precedenti del gruppo di ricerca e a esperimenti preliminari. I dati comportamentali sono stati analizzati mediante analisi della varianza (ANOVA) a due vie con misure ripetute, utilizzando il gruppo come fattore tra i soggetti e il tempo come fattore entro i soggetti. I dati di Western blot in funzione del tempo sono stati valutati mediante ANOVA a un fattore seguita da confronti multipli a coppie corretti con il metodo di Bonferroni. I dati fissi di Western blot e di immunofluorescenza sono stati valutati mediante ANOVA a un fattore con confronti pianificati corretti con Bonferroni; i confronti tra due gruppi sono stati valutati con il test t di Student. La normalità e l'omogeneità della varianza sono state verificate rispettivamente con i test di Shapiro–Wilk e di Levene. È stato considerato significativo un valore p bilaterale < 0,05. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software di analisi statistica indicato nella Tabella dei Materiali. Per gli esperimenti in vitro con astrociti, gli esperimenti indipendenti di coltura sono stati considerati come unità di analisi; la densitometria di Western blot e le concentrazioni di citochine sono state confrontate mediante ANOVA a un fattore seguita da confronti pianificati corretti con Bonferroni o con il test t di Student per confronti predefiniti tra due gruppi, secondo opportunità.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I dati a sostegno dei risultati di questo studio sono forniti nel File Supplementare 1.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli effetti dell'incisione e della somministrazione intratecale preoperatoria di propentofillina o U0126 sull'iperalgesia dopo l'incisione

Iperalgesia meccanica

Non sono state osservate differenze significative nei valori di soglia meccanica al tocco (PWMT) tra i sei gruppi a 24 h prima dell'intervento (p > 0,05; Figura 1A,B). Nel gruppo IP, il valore di PWMT è diminuito dopo l'incisione ed è rimasto significativamente inferiore rispetto al valore basale da 2 h a 72 h dopo l'incisione (p < 0,05 rispetto al basale; Figura 1A). Nei gruppi NS e DMSO, non sono state osservate differenze significative nei valori di PWMT tra i diversi tempi successivi all'incisione (p > 0,05 rispetto al gruppo IP; Figura 1B). Nel gruppo PPF, il valore di PWMT è risultato significativamente più alto rispetto a quello del gruppo IP da 2 h a 72 h dopo l'incisione (p < 0,05 rispetto al gruppo IP; Figura 1A); a 72 h dopo l'incisione, tuttavia, non differiva più in modo significativo dal valore basale (p > 0,05 rispetto al basale; Figura 1A). Nel gruppo U0126, i valori di PWMT sono risultati significativamente più alti rispetto a quelli del gruppo IP durante le prime 24 h dopo l'incisione (p < 0,05 rispetto al gruppo IP; Figura 1A), ma tale effetto non si è mantenuto a 72 h dall'incisione, momento in cui il valore di PWMT è rimasto significativamente inferiore al basale e non differiva più in modo significativo rispetto a quello del gruppo IP (p < 0,05 rispetto al basale; p > 0,05 rispetto al gruppo IP; Figura 1A).

Iperalgesia termica

Non sono state osservate differenze significative nei valori di PWTL tra i sei gruppi a 24 h prima dell'intervento (p > 0,05; Figura 1C,D). Nel gruppo IP, il valore di PWTL è diminuito da 24,85 s ± 1,06 s prima dell'intervento a 4,38 s ± 1,02 s a 4 h dall'incisione, per poi aumentare parzialmente fino a 18,37 s ± 1,38 s a 72 h dall'incisione, mantenendosi comunque significativamente inferiore al valore basale per tutto il periodo di osservazione (p < 0,05 rispetto al valore basale; Figura 1C). Nei gruppi NS e DMSO, non sono state riscontrate differenze significative nei valori di PWTL tra i diversi tempi successivi all'incisione (p > 0,05 rispetto al gruppo IP; Figura 1D). Nel gruppo PPF, il valore di PWTL è risultato significativamente più alto rispetto a quello del gruppo IP per l'intero periodo di osservazione di 72 h (p < 0,05 rispetto al gruppo IP; Figura 1C); a 72 h dall'incisione, il valore era tornato a un livello non significativamente diverso dal basale (p > 0,05 rispetto al basale; Figura 1C). Nel gruppo U0126, il valore di PWTL è risultato significativamente più alto rispetto a quello del gruppo IP nelle prime 24 h dopo l'incisione (p < 0,05 rispetto al gruppo IP; Figura 1C); tale effetto non si è mantenuto a 72 h dall'incisione, quando il valore di PWTL è rimasto significativamente inferiore al basale e non più significativamente diverso rispetto a quello del gruppo IP (p < 0,05 rispetto al basale; p > 0,05 rispetto al gruppo IP; Figura 1C).

Analisi mediante Western blot delle variazioni temporali nell'espressione dei marcatori cellulari del midollo spinale e della fosforilazione delle chinasi extracellular signal-regulated 1 e 2 dopo incisione

Sono state identificate diverse bande ai pesi molecolari esatti con un anticorpo specifico sulle membrane in PVDF, tra cui NeuN (48 e 50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD) e GAPDH (36 kD). La banda di GAPDH è stata utilizzata come controllo per NeuN, GFAP, Iba-1 e t-ERK1/2, mentre la banda di t-ERK1/2 è stata utilizzata come controllo per p-ERK1/2.

I dati di Western blot ottenuti dai midolli spinali del gruppo IP hanno mostrato aumenti di entità variabile dopo l'incisione (Figura 2A). L'espressione della proteina nucleare specifica dei neuroni ha raggiunto il valore massimo a 4 h dall'incisione (p < 0,001 rispetto al valore basale; Figura 2A) ed è rimasta significativamente elevata fino a 72 h dopo l'incisione (p < 0,001 rispetto al valore basale; Figura 2A). I livelli della proteina acida fibrillare gliale sono aumentati gradualmente durante il periodo di osservazione di 72 h (p < 0,001 rispetto al valore basale; Figura 2A), con il livello più alto osservato a 72 h tra tutti i tempi misurati. Analogamente, Iba-1 ha raggiunto un livello significativamente aumentato già a 4 h dall'incisione (p < 0,001 rispetto al valore basale; Figura 2A), mantenendosi poi oscillante entro un intervallo ristretto. In particolare, i dati di Western blot dei midolli spinali del gruppo IP hanno mostrato che l'attivazione di ERK1/2 è aumentata soltanto nelle prime 24 h dopo l'incisione (p < 0,05 rispetto al valore basale; Figura 2B), ma è risultata diminuita a 72 h dall'incisione (p < 0,05 rispetto al valore basale; Figura 2B), mentre l'espressione di t-ERK/2 non ha mostrato variazioni significative in nessun momento.

Analisi mediante Western blot degli effetti dell'amministrazione intratecale preoperatoria di propentofillina o U0126 sull'espressione di marcatori cellulari e della chinasi 1 e 2 regolata dal segnale extracellulare fosforilata nel midollo spinale

I dati di Western blotting hanno mostrato che l'espressione di NeuN raggiunge il livello massimo a 4 h dall'incisione, quando la misurazione comportamentale è al suo valore soglia minimo. Pertanto, gli effetti dell'amministrazione intratecale di PPF e U0126, somministrati 30 min prima dell'intervento, sull'espressione dei marcatori cellulari e sulla fosforilazione di ERK1/2 sono stati valutati a 4 h dall'incisione.

I dati del Western blot hanno mostrato che, rispetto al gruppo controllo, l'espressione spinale di tutti i marcatori cellulari era significativamente aumentata nel gruppo IP a 4 h dall'incisione (p < 0,05 rispetto al valore basale; Figura 3). Rispetto al gruppo IP, la somministrazione intratecale preoperatoria di PPF ha ridotto l'espressione spinale di NeuN (p < 0,05 vs il gruppo IP; Figura 3A), GFAP (p < 0,05 vs il gruppo IP; Figura 3B) e Iba-1 (p < 0,01 vs il gruppo IP; Figura 3C). Rispetto al gruppo IP, anche la somministrazione intratecale preoperatoria di U0126 ha ridotto l'espressione spinale di NeuN (p < 0,01 vs il gruppo IP; Figura 3D), GFAP (p < 0,05 vs il gruppo IP; Figura 3E) e Iba-1 (p < 0,01 vs il gruppo IP; Figura 3F). Tuttavia, rispetto al gruppo controllo, l'espressione di NeuN nel gruppo PPF rimaneva significativamente più elevata rispetto al valore basale (p < 0,01 vs basale; Figura 3A), mentre l'espressione di NeuN nel gruppo U0126 era significativamente inferiore rispetto a quella del gruppo controllo (p < 0,01 vs basale; Figura 3D). Per GFAP e Iba-1, il testo ora sottolinea il confronto con il gruppo IP, come mostrato in Figura 3. La somministrazione intratecale preoperatoria di NS e DMSO non ha avuto alcun effetto significativo sull'espressione di nessun marcatore cellulare.

I dati del Western blotting hanno mostrato che l'espressione spinale di t-ERK1/2 non differiva significativamente tra i gruppi Blank, IP, NS e PPF a 4 h dall'incisione (Figura 4A). Al contrario, rispetto al gruppo blank, l'espressione di p-ERK1/2 era significativamente aumentata nei gruppi IP e NS a 4 h dall'incisione (p < 0,001 rispetto al gruppo blank; Figura 4B). Rispetto al gruppo IP, la somministrazione intratecale preoperatoria di PPF riduceva significativamente l'espressione di p-ERK1/2 a 4 h dall'incisione (p < 0,001 vs il gruppo IP; Figura 4B). Rispetto al gruppo NS, l'espressione di p-ERK1/2 nel gruppo PPF era anch'essa significativamente più bassa (p < 0,01 vs il gruppo NS; Figura 4B). Tuttavia, rispetto al gruppo blank, l'espressione di p-ERK1/2 nel gruppo PPF rimaneva significativamente elevata a 4 h dall'incisione. Analogamente, l'espressione spinale di t-ERK1/2 non differiva significativamente tra i gruppi Blank, IP, DMSO e U0126 a 4 h dall'incisione (Figura 4C). Rispetto al gruppo blank, l'espressione di p-ERK1/2 era significativamente aumentata nei gruppi IP e DMSO a 4 h dall'incisione (p < 0,001 vs il gruppo blank; Figura 4D). Rispetto al gruppo IP, la somministrazione intratecale preoperatoria di U0126 riduceva significativamente l'espressione di p-ERK1/2 (p < 0,001 vs il gruppo IP; Figura 4D). Rispetto al gruppo DMSO, l'espressione di p-ERK1/2 nel gruppo U0126 era anch'essa significativamente più bassa (p < 0,001 vs il gruppo DMSO; Figura 4D). In modo notevole, rispetto al gruppo blank, l'espressione di p-ERK1/2 nel gruppo U0126 non differiva significativamente da quella del gruppo blank a 4 h dall'incisione. Il pretrattamento con NS o DMSO non aveva un effetto significativo sull'espressione di p-ERK1/2 rispetto al gruppo IP.

Osservazioni di immunofluorescenza dei marcatori cellulari del midollo spinale e dei mediatori infiammatori

I risultati dell'immunofluorescenza hanno mostrato in modo qualitativo una maggiore immunoreattività per NeuN nel corno dorsale controlaterale a 4 h dall'incisione rispetto al lato controlaterale (Figura 5). Nel gruppo controllo, le immagini rappresentative hanno mostrato un'immunoreattività di base per NeuN, GFAP e Iba-1 nel corno dorsale del midollo spinale controlaterale (Figura 6A–C). Nel gruppo IP, l'immunoreattività per NeuN è risultata qualitativamente più intensa rispetto al gruppo controllo (Figura 6D vs Figura 6A), l'immunoreattività per GFAP era anch'essa più forte (Figura 6E vs Figura 6B) e l'immunoreattività per Iba-1 era aumentata (Figura 6F vs Figura 6C). Contestualmente, negli astrociti e nelle microglia del gruppo IP si è osservata una ipertrofia, con corpi cellulari ingranditi e prolungamenti più spessi e maggiormente ramificati (Figura 6E,F).

Nel gruppo PPF, le immagini rappresentative indicavano una immunoreattività più debole per NeuN rispetto al gruppo IP (Figura 6G vs Figura 6D), una immunoreattività più debole per GFAP (Figura 6H vs Figura 6E) e una immunoreattività più debole per Iba-1 (Figura 6I vs Figura 6F). Nel gruppo U0126, le immagini rappresentative indicavano in modo simile una immunoreattività più debole per NeuN rispetto al gruppo IP (Figura 6J vs Figura 6D), una immunoreattività più debole per GFAP (Figura 6K vs Figura 6E) e una immunoreattività più debole per Iba-1 (Figura 6L vs Figura 6F). In entrambi i gruppi PPF e U0126, gli astrociti e le microglia apparivano meno ipertrofici, con corpi cellulari più piccoli e processi più sottili e meno numerosi (Figura 6H,I,K,L). L'analisi corrispondente dell'intensità della fluorescenza per NeuN, GFAP e Iba-1 era coerente con le osservazioni rappresentative di immunofluorescenza (Figura 6M–O, rispettivamente).

A 4 h dall'incisione, l'immunoreattività e l'intensità di fluorescenza relativa di TNF-α e COX-2 erano aumentate nel corno dorsale controlaterale del gruppo IP rispetto al gruppo controllo. Entrambe le misure erano ridotte dopo il trattamento intratecale preoperatorio con PPF o U0126 (Figura 7A–C).

Localizzazione cellulare della p-ERK1/2 spinale mediante immunofluorescenza

I risultati dell'immunofluorescenza hanno mostrato che nel gruppo controllo l'immunoreattività di p-ERK1/2 era debole nel midollo spinale ed era osservata soltanto nei neuroni positivi per NeuN (Figura 8A–C). Al contrario, a 4 h dall'incisione, l'immunoreattività di p-ERK1/2 era notevolmente aumentata nel corno dorsale del midollo spinale controlaterale e co-localizzata non solo con i neuroni, ma anche con astrociti positivi per GFAP e microglia positivi per Iba-1 (Figura 8D–I). Questo risultato indica che l'incisione ha indotto una distribuzione cellulare più ampia di p-ERK1/2, passando dai soli neuroni nelle condizioni basali a neuroni, astrociti e microglia dopo la lesione.

Validazione in vitro del meccanismo dipendente da ERK1/2 negli astrociti spinali

Per valutare ulteriormente se il PPF potesse inibire il rilascio di mediatori infiammatori attraverso il segnale correlato a ERK1/2 a livello cellulare, gli astrociti spinali primari di ratto sono stati stimolati con LPS e trattati con PPF o U0126 (10 µM). L'analisi mediante Western blot ha mostrato che il PPF riduceva l'espressione di p-ERK1/2 indotta da LPS, mentre la fosforilazione di p-p38 e p-JNK non era chiaramente modificata (Figura 9A), suggerendo una selettività relativa per la via ERK1/2 in queste condizioni. Parallelamente, il PPF riduceva i livelli di TNF-α, PGE2 (un prodotto a valle dell'attività di COX-2) e IL-6 nel sopranatante di coltura rispetto al gruppo Stim; U0126 induceva effetti inibitori simili (Figura 9B).

Per verificare se un'attivazione persistente di ERK1/2 potesse ridurre l'effetto antinfiammatorio di PPF, sono stati eseguiti esperimenti di recupero. ERK1/2 endogeno è stato silenziato mediante siRNA, e successivamente è stato introdotto un costrutto di ERK1/2 costitutivamente attivo (CA-ERK1/2) (Figura 9C). Negli astrociti che esprimono CA-ERK1/2, PPF non riduceva più i livelli di TNF-α, PGE2 o IL-6 allo stesso grado (Figura 9D), indicando che l'inibizione della fosforilazione di ERK1/2 contribuisce all'effetto antinfiammatorio di PPF in questo sistema in vitro di astrociti.

Nel complesso, questi risultati in vitro forniscono un supporto meccanicistico a livello cellulare dimostrando che il PPF attenua il rilascio di mediatori infiammatori attraverso un meccanismo dipendente da ERK1/2 negli astrociti spinali, integrando i dati osservazionali in vivo.

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Figura 1: Effetti della somministrazione intratecale preoperatoria di PPF o U0126 sull'iperalgia meccanica e termica indotta dall'incisione. (A) Soglia meccanica al tocco doloroso (PWMT) nei gruppi controllo, IP, PPF e U0126. (B) Soglia meccanica al tocco doloroso (PWMT) nei gruppi IP e controllo con veicolo. (C) Latenza termica al tocco doloroso (PWTL) nei gruppi controllo, IP, PPF e U0126. (D) Latenza termica al tocco doloroso (PWTL) nei gruppi IP e controllo con veicolo. I dati sono espressi come media ± DS (n = 6 ratti per gruppo) e sono stati analizzati mediante ANOVA a due vie con misure ripetute. ***p < 0,001 rispetto al valore basale; #p < 0,05, ##p < 0,01 e ###p < 0,001 rispetto al gruppo IP. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Andamento temporale dell'espressione dei marcatori cellulari del midollo spinale e della fosforilazione di ERK1/2 dopo l'incisione. (A) Quantificazione e immunoblot rappresentativi di NeuN, GFAP e Iba-1 nel gruppo IP dal valore basale fino a 72 h dopo l'incisione. (B) Quantificazione e immunoblot rappresentativi di t-ERK1/2 e p-ERK1/2 nello stesso periodo. I valori sono stati normalizzati rispetto al gruppo controllo (100%) e sono espressi come media ± DS (n = 3 ratti per ciascun punto temporale). Le differenze complessive sono state analizzate mediante ANOVA a un fattore con i confronti a coppie indicati. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto al valore basale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Effetti della somministrazione intratecale preoperatoria di PPF o U0126 sui marcatori neuronali e gliali spinali a 4 h dall'incisione. (A–C) NeuN, GFAP e Iba-1 nei gruppi controllo, IP, soluzione salina normale e PPF. (D–F) NeuN, GFAP e Iba-1 nei gruppi controllo, IP, dimetilsulfossido e U0126. A destra sono mostrati esempi rappresentativi di immunoblotting. I valori sono stati normalizzati rispetto al gruppo controllo (100%) e sono espressi come media ± DS (n = 3 ratti per gruppo). *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto al gruppo controllo; #p < 0,05 e ##p < 0,01 rispetto al gruppo IP; Δp < 0,05, ΔΔp < 0,01 e ΔΔΔp < 0,001 rispetto al rispettivo gruppo trattato con veicolo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Effetti della somministrazione intratecale preoperatoria di PPF o U0126 sulla fosforilazione di ERK1/2 a livello spinale a 4 h dall'incisione. (A,B) t-ERK1/2 e p-ERK1/2 nei gruppi controllo, IP, soluzione salina normale e PPF. (C,D) t-ERK1/2 e p-ERK1/2 nei gruppi controllo, IP, dimetilsulfossido e U0126. A destra sono mostrati esempi rappresentativi di Western blot. I valori sono stati normalizzati rispetto al gruppo controllo (100%) e sono espressi come media ± DS (n = 3 ratti per gruppo). **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto al gruppo controllo; ###p < 0,001 rispetto al gruppo IP; ΔΔp < 0,01 e ΔΔΔp < 0,001 rispetto al rispettivo gruppo trattato con veicolo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 5: Immunoreattività spinale ipsilaterale e controlaterale per NeuN dopo incisione. Una sezione trasversale rappresentativa del midollo spinale lombare dal gruppo IP a 4 h dopo l'incisione mostra la colorazione per NeuN nei corni dorsali controlaterali e ipsilaterali. L'immagine è rappresentativa di n = 3 ratti ed è fornita per un confronto anatomico qualitativo. Barra della scala = 500 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 6: Effetti di PPF e U0126 sull'immunoreattività neuronale e gliale del midollo spinale a 4 h dall'incisione. (A–C) NeuN, GFAP e Iba-1 nel gruppo controllo. (D–F) Colorazioni corrispondenti nel gruppo IP. (G–I) Colorazioni corrispondenti dopo trattamento con PPF. (J–L) Colorazioni corrispondenti dopo trattamento con U0126. (M–O) Intensità di fluorescenza relativa di NeuN, GFAP e Iba-1, rispettivamente. Le barre indicano la media ± DS (n = 3 ratti per gruppo); *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 per i confronti indicati. Barre della scala = 200 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 7: Immunoreattività spinale a TNF-α e COX-2 dopo incisione e trattamento. (A) Immagini rappresentative di TNF-α e COX-2 dai gruppi controllo, IP, PPF e U0126 a 4 h dall'incisione. (B) Intensità relativa della fluorescenza per TNF-α. (C) Intensità relativa della fluorescenza per COX-2. Le barre indicano la media ± DS (n = 3 ratti per gruppo); ***p < 0,001 per i confronti indicati. Le barre della scala = 200 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 8: Localizzazione cellulare della p-ERK1/2 spinale a 4 h dall'incisione. (A–C) Co-immunomarcatura della p-ERK1/2 con NeuN, GFAP e Iba-1, rispettivamente, nel gruppo controllo. (D–F) Co-immunomarcatura corrispondente nel gruppo IP; le frecce indicano cellule rappresentative con co-localizzazione. Il rosso indica la p-ERK1/2, il verde indica il marcatore cellulare e il giallo indica la co-localizzazione. (G–I) Intensità di fluorescenza relativa associate alle regioni positive per NeuN, GFAP e Iba-1, rispettivamente. Le barre mostrano la media ± DS (n = 3 ratti per gruppo); **p < 0,01 e ***p < 0,001 per i confronti indicati. Barre della scala = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 9: Effetti antinfiammatori dipendenti da ERK1/2 della PPF in astrociti spinali primari di ratto. (A) Immunoblot rappresentativi che mostrano come la PPF abbia ridotto la p-ERK1/2 indotta da LPS senza un effetto evidente sulla p-p38 o sulla p-JNK. (B) Concentrazioni di TNF-α, PGE2 e IL-6 nei supernatanti di coltura dopo trattamento con LPS, PPF o U0126. (C) Immunoblot che confermano il silenziamento di ERK1/2 mediato da siRNA e l'espressione di ERK1/2 costitutivamente attivo (CA-ERK1/2). (D) Concentrazioni di TNF-α, PGE2 e IL-6 dopo l'espressione di CA-ERK1/2 con o senza PPF. Le barre indicano la media ± DS di esperimenti in vitro indipendenti; ***p < 0,001 per i confronti indicati; ns, non significativo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: Dati a supporto dei risultati di questo studio.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maggior parte dei pazienti soffre di dolore acuto dopo un intervento chirurgico, non solo fisicamente ma talvolta anche mentalmente³³, eppure molti aspetti dei meccanismi dettagliati del dolore postoperatorio acuto rimangono sconosciuti. Accanto agli effetti potenti dei farmaci analgesici vi sono gli inevitabili effetti collaterali, rendendo fondamentale l'esplorazione di analgesici più sicuri ed efficaci. Questo studio si è basato su un modello ratto di incisione precedentemente validato, semplice e fattibile da preparare, per simulare il dolore postoperatorio acuto²⁷. Lo studio attuale ha valutato le variazioni dei marcatori neuronali e gliali spinali, della fosforilazione di ERK1/2 e dei mediatori infiammatori dopo l'incisione, esaminando se l'effetto antiallodinico dell'amministrazione intratecale preoperatoria di PPF fosse associato a modifiche parallele nella fosforilazione spinale di ERK1/2 e nell'espressione delle citochine infiammatorie.

Dopo l'incisione, i ratti nel gruppo IP hanno sviluppato una marcata iperalgesia meccanica e termica, mentre il pretrattamento con veicolo non ha avuto alcun effetto rilevabile né sul comportamento né sui risultati molecolari. Questi risultati confermano la stabilità del modello e indicano che gli effetti osservati nei gruppi PPF e U0126 difficilmente sono attribuibili alla procedura di iniezione o al veicolo stesso. Inoltre, sebbene l'espressione di NeuN sia aumentata dopo l'incisione, tale variazione deve essere interpretata con cautela come un cambiamento nell'espressione del marcatore neuronale piuttosto che come una prova diretta di attivazione neuronale. Nel complesso, queste osservazioni costituiscono la base per lo studio delle risposte gliali e di quelle correlate a ERK1/2 nello sviluppo precoce del dolore post-incisionale.

È stato dimostrato che le cellule gliali svolgono un ruolo importante nella formazione sinaptica, nella trasmissione e integrazione delle informazioni sinaptiche e nella regolazione della plasticità sinaptica. Le funzioni immunologiche e pro-infiammatorie delle cellule gliali nell'elaborazione del dolore, e in particolare degli astrociti spinali e della microglia attivati, possono potenziare la sensibilizzazione centrale coinvolta nella mediazione dell'iperalgia e dei cambiamenti comportamentali postoperatori⁷^,³⁴. Cambiamenti neurologici maladattivi nel midollo spinale possono portare a un aumento della risposta a stimoli nocicettivi o non nocicettivi. Numerose evidenze indicano che l'attivazione degli astrociti spinali e della microglia è coinvolta nello sviluppo e nel mantenimento dell'iperalgia in modelli di lesione del nervo spinale³⁵, dolore indotto dall'attivatore del plasminogeno tissutale¹⁶, dolore da incisione¹¹^,¹² e dolore da cancro osseo¹⁹^,³¹. Pertanto, l'attivazione della glia spinale sembra essere una caratteristica comune di diversi stati dolorosi, e un'ulteriore indagine sul suo ruolo nel dolore da incisione potrebbe ampliare l'attuale comprensione dei meccanismi del dolore postoperatorio.

I risultati attuali sostengono l'ipotesi che gli astrociti e la microglia spinali partecipino alla risposta neuroinfiammatoria precoce successiva all'incisione¹². Piuttosto che mostrare identici andamenti temporali, GFAP, Iba-1 e p-ERK1/2 hanno mostrato cinetiche parzialmente distinte, suggerendo che diversi processi legati alla glia possano contribuire a fasi differenti dello sviluppo del dolore postoperatorio³¹^,³⁵. I risultati dell'immunofluorescenza hanno ulteriormente confermato questa interpretazione, evidenziando cambiamenti morfologici ipertrofici negli astrociti e nella microglia dopo l'incisione. Insieme all'aumento dell'immunoreattività per TNF-α e COX-2, queste osservazioni sono compatibili con l'idea che la segnalazione infiammatoria associata alla glia contribuisca all'iperalgia acuta da incisione⁷^,³⁶.

La propentofillina, un derivato della metilxantina, è stata inizialmente studiata come farmaco attivo sul sistema cerebrovascolare grazie alla sua attività antiaggregante piastrinica e al supporto del mantenimento della memoria a lungo termine³⁷. Tuttavia, l'effetto regolatorio della PPF sulle cellule gliali la rende potenzialmente preziosa anche come farmaco analgesico. Studi indicano che la PPF può ostacolare l'attivazione della microglia inibendo la degradazione dell'adenosina monofosfato ciclica intracellulare e riducendo il reuptake dell'adenosina extracellulare⁴^,⁵. In uno studio in vitro, la PPF ha inibito la proliferazione degli astrociti ostacolando la via di segnalazione mTOR (mammalian target of rapamycin) indotta dal TNF-α⁶. È quindi l'effetto regolatorio della PPF sulle cellule gliali che ne rende possibile il coinvolgimento nella modulazione dei processi del dolore.

L'effetto antiallodinico prolungato del PPF nel presente studio, insieme alla riduzione dell'espressione di GFAP e Iba-1, sostiene l'interpretazione secondo cui la modulazione gliale rappresenta un componente importante dell'azione analgesica del PPF in questo modello. Studi precedenti hanno inoltre suggerito che il PPF potrebbe sopprimere la segnalazione infiammatoria associata alle cellule gliali nelle condizioni di dolore⁵^,³¹. Inoltre, la riduzione parallela di TNF-α e COX-2 indica che il PPF potrebbe attenuare il dolore post-incisionale in parte riducendo le risposte infiammatorie associate alle cellule gliali. Tuttavia, poiché i dati attuali sono di tipo associativo e non meccanicistico, questi risultati dovrebbero essere interpretati come un sostegno al coinvolgimento delle cellule gliali, piuttosto che come prova di un percorso causale diretto.

È stato dimostrato che ERK1/2, una coppia di importanti chinasi regolate dal segnale intracellulare, è coinvolta nello sviluppo e nel mantenimento di diversi processi dolorosi (mediando l'eccitabilità neuronale e la plasticità sinaptica nel cervello e nel midollo spinale)²¹. Ad esempio, uno studio ha mostrato che l'iniezione di capsaicina o formalina induce un rapido e breve aumento di p-ERK1/2 nel midollo spinale, ma l'attivazione di ERK1/2 a livello spinale persiste molto più a lungo dopo l'iniezione dell'adjuvante completo di Freund o del veleno d'ape (dopo una breve latenza)³⁸^,³⁹. Al contrario, un altro studio ha evidenziato che l'attivazione spinale di ERK1/2 indotta da lesione nervosa raggiunge un picco estremamente precoce e persiste per un certo periodo, con lo sviluppo di iperalgesia successivo al picco di p-ERK1/2³⁵. Pertanto, la fosforilazione di ERK1/2 potrebbe verificarsi in fasi diverse nei diversi processi dolorosi, e l'aumento di p-ERK1/2 nel midollo spinale potrebbe essere importante sia per l'induzione immediata sia per la risposta genica a lungo termine.

Nel presente studio, la fosforilazione dell'ERK1/2 indotta dall'incisione è aumentata significativamente nelle prime 24 ore dopo l'incisione rispetto al gruppo controllo, e l'espressione di p-ERK1/2 ha raggiunto il picco a 4 ore dall'incisione (come descritto in precedenza)²⁴, coincidendo con il momento in cui l'espressione di NeuN era massima. Contestualmente, come rivelato dai risultati dell'immunofluorescenza, la fosforilazione dell'ERK1/2 indotta dall'incisione era contemporaneamente presente nei neuroni, negli astrociti e nelle microglia del corno dorsale del midollo spinale controlaterale, sostenendo l'ipotesi che il segnale associato all'ERK1/2 sia particolarmente rilevante per la fase iniziale dell'iperalgia post-incisionale. Inoltre, la somministrazione intratecale preoperatoria di U0126 ha ridotto l'espressione dei marcatori gliali spinali, di NeuN e di p-ERK1/2 a 4 ore dall'incisione e ha attenuato sia l'iperalgia meccanica che termica durante il periodo post-incisionale iniziale, suggerendo che il p-ERK1/2 spinale possa essere coinvolto nella fase iniziale dell'iperalgia acuta dopo l'incisione. Tuttavia, poiché GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 e gli esiti comportamentali hanno mostrato profili temporali diversi, l'interpretazione meccanicistica attuale dovrebbe essere limitata alla fase post-incisionale iniziale rappresentata dal tempo di 4 ore, piuttosto che essere generalizzata all'intero periodo postoperatorio.

Inoltre, nel presente studio, la somministrazione preoperatoria intratecale di PPF ha ridotto anche la fosforilazione di ERK1/2 a 4 h dall'incisione, suggerendo che le modifiche osservate nell'espressione di NeuN, GFAP e Iba-1 a livello spinale potrebbero essere associate, almeno in parte, a un segnale dipendente da ERK1/2. La somministrazione preoperatoria intratecale di U0126 ha inoltre ridotto l'immunoreattività di TNF-α e COX-2, sostenendo una possibile associazione tra fosforilazione di ERK1/2 ed espressione dei mediatori infiammatori in seguito all'incisione. Gli ulteriori esperimenti in vitro sugli astrociti mostrati nella Figura 9 hanno fornito un supporto a livello cellulare per un componente antinfiammatorio dipendente da ERK1/2, poiché un'attivazione persistente di ERK1/2 ha indebolito la capacità del PPF di ridurre il rilascio di TNF-α, PGE2 e IL-6. Tuttavia, poiché questi esperimenti di recupero sono stati condotti su astrociti coltivati piuttosto che sul midollo spinale integro, e poiché non sono stati effettuati esperimenti di recupero in vivo né manipolazioni selettive per tipo cellulare, le conclusioni in vivo dovrebbero essere considerate ancora come un supporto piuttosto che una prova definitiva di un meccanismo causale dipendente da ERK1/2.

Per approfondire le possibili relazioni tra l'attivazione delle cellule gliali, l'espressione di p-ERK1/2 e il rilascio di citochine infiammatorie, sono stati considerati i modelli di localizzazione spaziale osservati mediante immunofluorescenza. Dopo l'incisione, p-ERK1/2 era co-espresso in astrociti positivi per GFAP e microglia positiva per Iba-1 nel corno dorsale del midollo spinale a 4 h dall'incisione. Insieme ai risultati ottenuti con Western blot e immunofluorescenza che mostrano come sia PPF che U0126 fossero associati a una ridotta espressione di p-ERK1/2, TNF-α e COX-2, questi dati suggeriscono che la fosforilazione di ERK1/2 nelle cellule gliali spinali possa essere coinvolta nella risposta infiammatoria successiva all'incisione. I dati in vitro ottenuti con astrociti primari supportano ulteriormente un collegamento cellulare diretto tra il trattamento con PPF, la soppressione di ERK1/2 e il rilascio di mediatori infiammatori. Tuttavia, le evidenze in vivo dimostrano associazioni e cambiamenti paralleli legati al trattamento, mentre gli esperimenti cellulari integrano ma non sostituiscono la validazione causale specifica per tipo cellulare in vivo. Poiché l'analisi mediante immunofluorescenza si è basata su un numero limitato di animali e campi, queste osservazioni devono essere interpretate con cautela e in combinazione con i risultati del Western blot e degli esperimenti in vitro.

Diversi passaggi procedurali hanno un effetto sproporzionato sulla riproducibilità. L'iniezione intratecale richiede sia una risposta caratteristica della coda sia la conferma del liquido cerebrospinale; resistenza durante l'iniezione, mancata conferma o comparsa di un nuovo deficit neurologico dovrebbero portare all'esclusione piuttosto che a una reiniezione nello stesso sito. I test comportamentali sono sensibili all'acclimatazione, alle condizioni dell'ambiente, alla posizione dello stimolo e alle aspettative dell'operatore; pertanto, è essenziale l'uso dell'accecamento, di intervalli fissi e di condizioni ambientali costanti. Anche i tempi di raccolta dei tessuti, il trasferimento uniforme delle proteine, l'incubazione con gli anticorpi e le impostazioni identiche di microscopia all'interno di ogni serie di colorazione sono altrettanto importanti. I problemi più comuni includono soglie variabili di ritrazione dovute a un'acclimatazione inadeguata, bande deboli o irregolari nei Western blot causate da un trasferimento incompleto o da un'eccessiva esposizione, e un fondo fluorescente elevato dovuto a lavaggi insufficienti, a una concentrazione eccessiva di anticorpi o a impostazioni di acquisizione saturate.

Il protocollo può essere modificato in base alla domanda scientifica. È possibile utilizzare un intervallo temporale più ampio quando si è interessati alle risposte gliali tardive, e si possono aggiungere studi di titolazione del dosaggio o di vie alternative di somministrazione qualora si voglia privilegiare la fattibilità traslazionale. Rispetto ai modelli di dolore infiammatorio o neuropatico, il modello di incisione plantare è relativamente rapido e pratico e riproduce una lesione postoperatoria ben definita²⁷. La combinazione di test comportamentali, immunoblotting e immunofluorescenza associata alle cellule fornisce informazioni complementari a livello funzionale, molecolare e spaziale; tuttavia, risulta più dispendiosa in termini di risorse rispetto a un saggio con un singolo punto finale e di per sé non stabilisce una causalità specifica per tipo cellulare. Il confronto farmacologico con U0126 migliora l'interpretazione del percorso d'azione, ma rimane meno specifico rispetto a manipolazioni genetiche o selettive per tipo cellulare²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵.

Applicazioni future includono la sperimentazione su entrambi i sessi, lesioni chirurgiche di dimensioni maggiori, vie di somministrazione clinicamente praticabili, ulteriori punti temporali postoperatori e interventi mirati a specifiche popolazioni gliali. Il flusso di lavoro è pratico per lo screening di trattamenti analgesici o modulatori della glia in quanto il modello di incisione è breve, gli endpoint comportamentali sono ripetibili e i saggi molecolari utilizzano metodi di laboratorio standard. Tuttavia, la riproducibilità dipende da criteri di esclusione predeterminati, dalla valutazione in cieco degli esiti, da un'acquisizione delle immagini costante e da una completa descrizione dei dati grezzi e delle impostazioni di analisi.

Limitazioni

Questo studio presenta diverse limitazioni. Innanzitutto, il modello di incisione plantare sulla zampa rappresenta un intervento chirurgico relativamente modesto e potrebbe non rispecchiare pienamente procedure chirurgiche più estese, come toracotomia o laparotomia. Pertanto, è necessario prestare cautela nel trasporre i risultati attuali ad altre forme di dolore postoperatorio. Inoltre, sono stati inclusi soltanto ratti Sprague–Dawley maschi, il che limita la generalizzabilità di questi risultati tra i sessi. Considerate le note differenze legate al sesso nelle risposte al dolore, negli effetti analgesici e nei modelli di attivazione gliale, sono necessari ulteriori studi che includano animali di sesso femminile.

Le principali osservazioni molecolari e istologiche si sono concentrate sul punto temporale a 4 h dall'incisione. Poiché diversi endpoint, inclusi GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 e gli esiti comportamentali, hanno mostrato profili temporali distinti dopo l'incisione, l'interpretazione meccanicistica dei risultati attuali dovrebbe essere limitata principalmente alla fase iniziale post-incisione. Inoltre, gli esperimenti molecolari qui descritti sono stati eseguiti con un numero relativamente limitato di campioni, il che potrebbe ridurre la robustezza statistica di queste osservazioni.

La valutazione della chinasi regolata da segnale extracellulare 1 e 2 è stata effettuata complessivamente come p-ERK1/2; i rispettivi contributi individuali non sono stati esaminati separatamente. Pertanto, i ruoli specifici di ERK1 ed ERK2 nell'elaborazione del dolore indotto da incisione non possono essere determinati nel presente studio. Inoltre, la quantificazione dell'intensità della fluorescenza si è basata su un numero limitato di animali e campi osservati e non ha incluso conteggi cellulari stereologici né coefficienti formali di co-localizzazione. Queste osservazioni devono quindi essere interpretate con cautela, insieme ai risultati ottenuti con il Western blot.

Infine, sebbene gli esperimenti di recupero degli astrociti in vitro abbiano fornito un supporto meccanicistico alla regolazione dei mediatori infiammatori dipendente da ERK1/2, gli eventi regolatori a monte successivi all'incisione e gli eventi a valle nei tessuti spinali integri non sono stati indagati approfonditamente. Inoltre, il sistema di coltura in vitro non riesce a riprodurre completamente le interazioni tra neuroni, astrociti, microglia e cellule immunitarie infiltranti nel corno dorsale del midollo spinale. Di conseguenza, lo studio attuale supporta un meccanismo correlato a ERK1/2, ma non stabilisce una causalità completa e specifica per cellula in vivo.

Conclusione

Lo studio attuale dimostra che l'amministrazione intratecale preoperatoria di PPF attenua l'aumento indotto dall'incisione dell'espressione di NeuN, GFAP e Iba-1 a livello spinale. Questo effetto è accompagnato dall'attenuazione dell'iperalgia meccanica e termica acuta e da riduzioni nella fosforilazione di ERK1/2 e nell'espressione di TNF-α e COX-2 a seguito dell'incisione. Tuttavia, questi risultati supportano (piuttosto che dimostrare in modo definitivo il meccanismo) un'associazione tra l'effetto antiallalgico del PPF e la ridotta fosforilazione di ERK1/2 nelle cellule gliali spinali (in associazione con una ridotta espressione di mediatori infiammatori). L'effetto antiallalgico del PPF persiste per tutto il periodo di osservazione successivo all'incisione, mentre l'effetto dell'inibitore MEK1/2 U0126 è principalmente limitato al periodo post-incisione iniziale. Questi risultati suggeriscono che la via di segnalazione ERK1/2 possa essere particolarmente rilevante durante le fasi iniziali dello sviluppo del dolore post-incisionale. L'effetto più duraturo del PPF indica che il suo meccanismo d'azione potrebbe coinvolgere ulteriori vie oltre all'inibizione di ERK1/2. Pertanto, il PPF potrebbe rappresentare un possibile intervento terapeutico, piuttosto che un bersaglio biologico, per migliorare la gestione del dolore postoperatorio acuto.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi personali, finanziari, commerciali o accademici.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Haijiao Zhou e Ming Wang per il supporto tecnico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo
Tampone PBS 0,01 M	Solarbio	P1020
Tampone Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)	Solarbio	T1020
Tampone Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)	Solarbio	T1010
Sodio dodecilsolfato (SDS) al 10%	Solarbio	S1010
Soluzione madre TBST 10×	Solarbio	T1081
Acrilamide al 30%	Solarbio	A1010
Tampone di caricamento proteico 4×	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
Persolfato di ammonio	Solarbio	A1030
Macchina automatica per ghiaccio a scaglie	Changshu Xueke	IMS-40
Albumina sierica bovina (BSA)	Solarbio	A8020
Criostato CM150	Leica	CM150
Phmetro digitale	—	PHS-3C
Dietilsolfossido (DMSO)	Solarbio	D8371
Bilancia analitica elettronica	Cany	—
Reagente chemiluminescente potenziato (ECL)	Solarbio	PE0010
Pellicola	Kodak	—
Microscopio a fluorescenza DP71	Olympus	DP71
Mezzo di inclusione per sezioni congelate	Sakura	4583
Apparecchio per elettroforesi su gel	BIO-RAD	—
Glicerolo	Solarbio	IG0910
Glicina	Solarbio	G8200
Secondo anticorpo coniugato con Alexa Fluor 594 anti-topo capra	Proteintech	SA00013-3
Secondo anticorpo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) anti-topo capra	ZSGB-BIO	ZB2305
Secondo anticorpo coniugato con Alexa Fluor 488 anti-coniglio capra	Proteintech	SA00013-2
Secondo anticorpo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) anti-coniglio capra	ZSGB-BIO	ZB2301
Siero di capra	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	GraphPad Software	5
Centrifuga refrigerata ad alta velocità 3K15	Sigma	3K15
Agitatore orbitale orizzontale TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	National Institutes of Health	1.51j8
Metanolo	Tianjin Guangfu	—
Anticorpo primario anti-ratto GAPDH da mouse	Proteintech	60004-1-Ig
Anticorpo primario anti-ratto p-ERK1/2 da mouse	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
Paraformaldeide	Biosharp	BL539A
Vetrini per patologia	Shitai	—
Fluoruro di fenilmetanosulfonile (PMSF)	Beyotime	ST506
Plantar Test 37370	UGO BASILE	37370
Membrana in fluoruro di polivinilidene	Solarbio	—
Propentofillina (PPF)	Taosu	T19812
Anticorpo primario anti-ratto COX-2 da coniglio	Abcam	Ab179800
Anticorpo primario anti-ratto GFAP da coniglio	Proteintech	16825-1-AP
Anticorpo primario anti-ratto Iba-1 da coniglio	Proteintech	10904-1-AP
Anticorpo primario anti-ratto NeuN da coniglio	Abcam	Ab279297
Anticorpo primario anti-ratto t-ERK1/2 da coniglio	Proteintech	11257-1-AP
Anticorpo primario anti-ratto TNF-α da coniglio	Proteintech	29652-1-AP
Tampone di lisi RIPA	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
Latte in polvere scremato	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
Tetrametiletilendiammina (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
Congelatore a temperatura ultra-bassa	Haier	—
Congelatore a temperatura ultra-bassa	Sanyo	—
Sistema di purificazione acqua ultrapura	Heal Force	—
Filamenti di von Frey	North Coast Medical	—

Riferimenti

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La propentofillina allevia l'iperalgesia incisionale regolando la fosforilazione di ERK1/2 negli astrociti e nella microglia spinale

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