Method Article

Identificazione degli istoni modificati come substrati di legame del membro della famiglia spindlina umana 4 (SPIN4) tramite array peptidici e pulldown dei nucleosomi nativi

DOI:

10.3791/70934

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March 27th, 2026

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1Division of Cellular and Molecular Pathogenesis, Department of Pathology, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Center for Precision Medicine and Genomics Research, Children's National Research Institute, 3Department of Endocrinology, Children's National Hospital, 4Department of Pediatrics, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 5Massey Comprehensive Cancer Center, Virginia Commonwealth University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Varianti genetiche nel membro umano della famiglia Spindlin 4 (SPIN4) sono state recentemente identificate in pazienti con sovracrescita ossea, un nuovo disturbo dello sviluppo. Vengono presentati un protocollo e nuovi risultati che descrivono l'identificazione biochimica degli istones modificati nel contesto dei nucleosomi come substrati di legame allo SPIN4.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il Membro Umano della Famiglia Spindlin 4 (SPIN4) è appena emerso come un nuovo regolatore della crescita ossea. Varianti di perdita di funzione in SPIN4 sono state identificate in pazienti con sindrome da sovracrescita pre- e post-natale, ereditata in modo dominante legato al cromosoma X. SPIN4 contiene tre ripetizioni tandem di domini Tudor, ciascuna formando una gabbia aromatica individuale. Questi domini di Tudor sono considerati domini lettori epigenetici per i residui di arginina e lisina metilati degli istoni, basandosi sull'omologia delle sequenze. Tuttavia, i substrati di legame esatti di SPIN4 rimangono poco chiari. SPIN4 umano, sia nella sua forma selvatica che mutante causante di malattie, è stato generato con successo tramite un sistema di espressione cellulare di insetto. Attraverso un array peptidico di modifica degli istoni, sono state determinate le affinità di legame differenziali tra SPIN4 di tipo selvatico e mutante. Le validazioni funzionali hanno ulteriormente dimostrato che SPIN4 è un vero lettore della metilazione della lisina H3 dell'istone H3 (H3K4me), come dimostrato dal pulldown biochimico dei mononucleosomi nativi. Questo approccio integrato facilita l'identificazione rapida del bersaglio di legame delle proteine lettrici epigenetiche.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spindlin Family Member 4 (SPIN4) è un lettore epigenetico ed è stato recentemente implicato nella sindrome da sovracrescita, presentandosi con una costellazione di sovracrescita pre- e postnatale e staturaalta 1,2. I topi knockout (KO) Spin4 riprodussero esattamente il fenotipo umano, supportando la causalità. Ad oggi, SPIN4 è l'unico lettore epigenetico esclusivo identificato che regola negativamente la crescita ossea. Tuttavia, le proprietà biochimiche di SPIN4, un lettore epigenetico critico per la crescita, non sono state caratterizzate, lasciando un divario di conoscenza cruciale nella comprensione dei meccanismi fondamentali che causano la malattia in questo nuovo disturbo dello sviluppo. SPIN4 contiene tre ripetizioni tandem di domini Tudor, che sono generalmente considerati domini lettori di istoni di arginina metilatao lisina 3. Una variante missense SPIN4D82H è stata recentemente identificata in un paziente con sindrome di sovracrescita ossea prenatale e postnatale. Questa mutazione colpisce il primo dominio Tudor di SPIN4; tuttavia, i substrati di legame rilevanti di questi domini Tudor rimangono poco chiari, limitando la dissezione funzionale della regolazione dipendente da SPIN4 della cromatina e dell'espressione genica durante lo sviluppo osseo.

L'identificazione di nuovi substrati di legame delle istone dei domini delle proteine lettrici non si basa su un approccio unico e standardizzato. Le modifiche post-traduzionali (PTM) degli istoni avvengono principalmente nelle code degli istoni che sporgono verso l'esterno dalle particelle nucleosomiche centrali. Il riconoscimento delle PTM sulle code degli istoni da parte dei domini delle proteine lettrici è altamente variabile e spesso richiede interazioni multivalenti ed elettrostatiche che coinvolgono DNA nucleosomico, DNA di collegamento e/o altri domini istonici per stabilizzare collettivamente l'interazionelettore-bersaglio 4. Attualmente, i PTM dei peptidi della coda di istone sono stati costruiti sotto forma di microarray e commercializzati da diversi fornitori5. Sebbene lo screening PTM basato su peptidi della coda di istoni per i bersagli di legame dei domini delle proteine lettrici sia ad alto rendimento, spesso produce risultati falsi positivi in assenza di nucleosomi. Inoltre, le condizioni sperimentali per tali screening sono altamente empiriche e variano da una proteina all'altra, rendendole tecnicamente difficili da affrontare. Lo screening o pulldown PTM basato su nucleosomi sintetici fornisce una lettura molto più robusta, ma è molto più costoso e a basso rendimento, poiché ricostituire nucleosomi che trasportano combinazioni variabili di PTM è intrinsecamente difficile.

Questo protocollo descrive un approccio rapido per identificare le PTM degli istoni nei nucleosomi come bersagli di legame di SPIN4. Il ricombinante SPIN4 è stato ricostituito e sottoposto a screening con un array peptidico PTM di istoni commerciale per identificare potenziali bersagli di legame. Successivamente sono stati generati mononucleosomi nativi contenenti diversi PTM endogeni di istoni da cellule vive. Il pulldown SPIN4 dei mononucleosomi ha permesso la validazione mirata basata su anticorpi delle PTM degli istoni dopo lo screening iniziale. Questa strategia biochimica integrata dimostra un approccio di prova di principio per la scoperta di bersagli efficiente in termini di tempo e costi e può essere facilmente applicata per identificare substrati di legame di altre proteine lettrici epigenetiche poco caratterizzate.

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Protocol

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Tutte le procedure sperimentali che coinvolgevano HEK293FT cellule sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Biosicurezza (IBC) della Virginia Commonwealth University.

1. Purificazione dello SPIN4 umano ricombinante

  1. Clonare SPIN4 oSPIN4 D82H di tipo selvatico a lunghezza intera con un tag epitopo N-terminale 1× FLAG in un vettore baculovirale 6,7.
  2. Preparare il baculovirus trasfettando cellule Sf9 con vettori baculovirali, prelevare i virus quando le cellule scoppiano, aliquotare e immagazzinare il virus a −80 °C 6,7.
  3. In una fiaschetta Erlenmeyer da 500 mL, aggiungi 100 mL di mezzo di crescita, 1,5 × 108 cellule Sf9 e 1 mL di baculovirus P1.
  4. Incubare la coltura a 27,5 °C in un incubatore shaker orbitale impostato a 125 giri/min per 72 ore al buio.
  5. Purificare FLAG-SPIN4 usando gel di affinità FLAG in un tampone di lisi BC150 contenente inibitori della proteasi ed eluire la proteina usando il peptide 1× FLAG a 0,1 mg/mL.
  6. Per rimuovere completamente il peptide 1× FLAG, dializzare FLAG-SPIN4 eluzionato contro il buffer di stoccaggio proteico BC150 a 4 °C nel seguente ordine:
    1. Prima dialisi: 1 L, 1 ora.
    2. Seconda dialisi: 2 L, durante la notte.
    3. Terza dialisi: 1 L, 1 ora.
  7. Concentrare la proteina dialitica al volume desiderato (per SPIN4, da 600 μL a 150 μL).
  8. Determina la concentrazione proteica utilizzando un saggio sull'Acido Bicinhoninico (BCA) e calcola di conseguenza la concentrazione molare.
  9. La quantità di proteina grezza recuperata a ogni fase di purificazione e le corrispondenti rese stimate sono riassunte nella Tabella Supplementare 1. La purificazione è stata eseguita da 250 mL di coltura Sf9 utilizzando 400 μL di gelo di affinità anti-FLAG.
  10. Diluire SPIN4 concentrato del 10× nel tampone di stoccaggio proteico BC150 (Tabella Supplementare 2). Carica 1, 2, 5, 10 e 20 μL su un gel SDS–PAGE al 15% e visualizza con colorazione blu Coomassie (Figura 1A).
  11. Quantificare l'intensità delle bande utilizzando un software di analisi delle immagini per determinare l'intensità relativa del segnale tra corsie cariche con volumi uguali.
  12. Dividere il rapporto di intensità per il peso molecolare di ciascuna proteina per ottenere il rapporto molare.
  13. Usa questo rapporto molare per correggere la concentrazione molare stimata nel Passo 1.8.
  14. Aliquota purifica proteine, congela subito in azoto liquido e conserva a −80 °C. Per un uso a breve termine, conservare a 4 °C durante la notte prima di procedere con il prossimo esperimento.

2. Array peptidico di istone

  1. Prepara il tampone bloccante peptide array dissolvendo 5 g di albumina sieroica bovina (BSA) in BC150 Protein Storage Buffer in un volume finale di 100 mL.
  2. Opzionalmente, delinea l'area di reazione sull'array peptidico usando una penna marcatrice idrofobica per minimizzare il consumo di reagenti.
  3. Metti diversi fogli di carta filtro in una piastra di Petri da 15 cm e inumiditeli con acqua.
  4. Posiziona gli array peptidici sulle carte filtro umidite.
  5. Aggiungi con attenzione un buffer bloccante da 300 μL per coprire completamente ogni area dell'array.
  6. Copri la piastra di Petri e incuba a temperatura ambiente per 1–3 ore.
  7. Preparare FLAG-SPIN4 in buffer di blocco a una concentrazione finale di 1 μM.
  8. Preparare 1× peptide FLAG in un tampone bloccante a una concentrazione finale di 1 μM.
  9. Per migliorare il rapporto segnale-rumore e ridurre il sottofondo indesiderato, esegui i seguenti passaggi in una stanza fredda. Sposta le matrici bloccate (con la piastra di Petri) nella stanza fredda prima di aggiungere proteine.
  10. Rimuovi il buffer di blocco in eccesso dagli array.
  11. Aggiungi con attenzione la proteina FLAG-SPIN4 desiderata o il peptide FLAG come controllo su ogni blocco.
  12. Copri la piastra di Petri e incuba durante la notte nella stanza fredda.
  13. Aggiungi circa 50 mL di tampone di lavaggio peptidico a una scatola di lavaggio Western blot e portala nella camera fredda.
  14. Scartare la soluzione proteica e trasferire immediatamente gli array nel wash buffer, lato reazione verso l'alto.
  15. Lava le matrici cinque volte come segue: le prime due lavaggi per 1 minuto ciascuno, e i restanti tre lavaggi per 5 minuti ciascuno.
  16. Risciacquare le matrici con un tampone bloccante peptidico per rimuovere il detersivo residuo, poi riportarle nella piastra di Petri.
  17. Prepara la soluzione di anticorpi anti-FLAG in diluizione 1:2000 e aggiungi 300 μL per blocco.
  18. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  19. Ripeti i passaggi 2.14 a 2.16 per lavare gli array.
  20. Prepara una soluzione anti-anti-anticorpi secondari per capra coniugata con HRP in diluizione 1:6000 e aggiungi 300 μL per blocco.
  21. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  22. Ripeti i passaggi 2.14 a 2.16 per lavare gli array.
  23. Posiziona le matrici all'interno di un protettore trasparente.
  24. Aggiungere circa 1 mL di substrato a Chimioluminescenza Potenziata (ECL), garantendo una copertura uniforme della superficie di reazione.
  25. Rimuovere le bolle d'aria e catturare immagini chemiluminescenti e in campo chiaro utilizzando un sistema di imaging appropriato (ad esempio, fotocamere digitali o film autoradiografici) (Figura 1B).
  26. Analizzare l'intensità del segnale secondo il software di peptide array e gli strumenti online associati (Figura 2A–C).

3. Espressione su larga scala di FLAG-SPIN4 per il test pulldown

  1. In una fiaschetta Erlenmeyer da 500 mL, aggiungere 125 mL di mezzo ESF921, 1,8 × 108 cellule Sf9 e 1,2 mL di baculovirus P1 che esprime FLAG-SPIN4 o FLAG-SPIN4D82H.
  2. Incubare a 27,5 °C in un incubatore oscillatore orbitale (125 giri al minuto) per 72 ore.
  3. Aliquota la cultura come segue:
    1. 4 mL di coltura in un tubo da 15 mL per la titolazione.
    2. 30 mL di coltura in quattro tubi da 50 mL.
  4. Centrifuga i tubi a 600 × g per 15 minuti e scarta il soprantantante.
  5. Congelare rapidamente i pellet in azoto liquido e conservarli a −80 °C fino all'uso.

4. Titolazione del rapporto perla-lisato per FLAG-SPIN4 e FLAG-SPIN4D82H

  1. Aggiungere 1 mL di buffer di lisi BC150 a ciascuno dei pellet Sf9 da 5 mL di coltura Sf9 descritta nella Sezione 3, Passo 3.1.
  2. Sonicare i lisati per garantire una completa interruzione: 30% di ampiezza, 5 s accesi/5 s di spento, per un tempo totale di sonicazione di 15 s.
  3. Centrifugare a 20.000 × g, 4 °C, per 10 minuti, e trasferire il sovrandante in tubi freschi da 1,5 mL.
  4. Preparare una suspense di gel di affinità anti-FLAG da 20 μL per ogni reazione di pulldown (60 μL per 3 titolazioni)
  5. Lava le perline con il buffer di lisi BC150:
    1. Aggiungere brevemente 1 mL di buffer di lisi BC150 e vortice.
    2. Centrifuga a 3.000 × g per 1 minuto.
    3. Aspira e scarta il soprantantante.
  6. Risospendere le sfere in un tampone di lisi BC150 da 40 μL per ogni 1 reazione di pulldown (120 μL per 3 titolazioni).
  7. Combinare il lisato in tubi da 1,5 mL contenenti buffer di lisi BC150 e sospensione a perle (Tabella Supplementare 3)
  8. Incubare i tubi su un rotatore a tubo impostato a 15 giri al minuto a 4 °C per 1,5 ore.
  9. Centrifugare a 3.000 × g per 1 minuto e aspirare il soprantantante.
  10. Lava le perline tre volte come segue:
    1. Sospendere brevemente le sfere in un buffer di lisi BC150 a 500 μL e vortice.
    2. Centrifuga a 3.000 × g per 1 minuto.
    3. Aspira il soprandante.
  11. Risospensa le sfere in un tampone di Laemmli da 20 μL 1× e incuba a 95 °C per 5 minuti.
  12. Centrifuga a 3.000 × g per 1 minuto.
  13. Eseguire il sovrantante su un gel SDS–PAGE al 15% e colorare con blu Coomassie per stimare la resa proteica.
  14. Sulla base dei dati, si seleziona un rapporto lisato-perla che saturi i siti di legame degli anticorpi sulle sfere. Negli esperimenti, ≥300 μL di lisato per 20 μL di perle erano sufficienti per raggiungere la piena capacità di legame.
    NOTA: "Saturazione dei siti di legame degli anticorpi" è definita come il punto in cui aumentare il volume del lisato non porta più a un maggiore recupero della proteina bersaglio.
    NOTA: Alla stessa molarità, SPIN4D82H mostra un'affinità di legame inferiore al gel di affinità FLAG rispetto alla controparte di tipo selvatico.
    NOTA: In questo contesto sperimentale, 1 mL di lisato è stato ricavato da 6 milioni di celle Sf9 (calcolato come 1,5 × 106 cellule/mL × 4 mL), indicando che SPIN4 espresso da ~6 milioni di celle Sf9 è sufficiente a saturare 20 μL di slurry di gel di affinità anti-FLAG.

5. Preparazione su larga scala del gel di affinità anti-FLAG-SPIN4 legato come esca

  1. Per ogni proteina da testare, si prelevano due pellet da colture da 30 mL. Risospendere ogni pellet in un buffer di lisi BC150 da 6 mL, trasferire in un tubo centrifuga da 15 mL e regolare il volume totale a 13 mL con il buffer di lisi BC150.
  2. Sonica ogni campione sul ghiaccio con ampiezza del 100%, 15 secondi accesi e 30 secondi di distanza, per un tempo totale di sonicazione di 2 minuti.
  3. Trasferire i lisati in tubi centrifughe ad alta velocità pre-raffreddati e centrifugare a 20.000 × g, 4 °C, per 15 minuti.
  4. Aggiungere 200 × (numero di campioni + 1) × 1,1 μL di pasta di gel di affinità anti-FLAG a un tubo centrifuga da 1,5 mL.
  5. Lava le perline con >5 volumi di colonne (CV) di tampone di lisi BC150 una volta.
  6. Risospendere le sfere in 400 × (numero di campioni + 1) × 1,1 μL di buffer di lisi BC150.
  7. Trasferire i soprannatanti ottenuti nello Passo 4 a tubi centrifughe da 15 mL.
  8. Aggiungi 500 μL della sospensione a talone Step 5.7 a ciascun tubo.
  9. In un tubo, aggiungere 3 mL di tampone di lisi BC150 e 60 μL di 1× peptide FLAG (100 mM) come controllo negativo.
  10. Incubare i campioni su un rotatore a tubo impostato a 120 giri/min a 4 °C per 1,5 ore.
  11. Centrifugare a 2.000 × g per 5 minuti e scartare il soprantantante.
  12. Sospezione delle sfere in una quantità adeguata di sovrantantante e trasferisci in tubi da 1,5 mL.
  13. Centrifugare a 3.000 × g per 1 minuto e aspirare il soprandante.
  14. Lava le perline cinque volte con il tampone di lisi BC150 come segue:
    1. Risospezione delle perle in un buffer di lisi di 1 mL di BC150.
    2. Per il quarto e il quinto lavaggio, posiziona i campioni su un rotatore a tubo impostato a 20 giri/min a 4 °C per 10 minuti.
    3. Centrifugare a 3.000 × g per 1 minuto e aspirare il soprandante.
  15. Risospendere le sfere in un buffer di lisi BC150 da 200 μL.
  16. Prendi 9 μL della sospensione di perle/tampone e analizza il contenuto proteico con il 15% di SDS–PAGE seguito dalla colorazione blu Coomassie.
  17. Poiché l'apporto proteico supera la capacità di legame delle sfere di sfera, la quantità di proteine legate per volume di sfere dovrebbe essere simile tra i campioni. Quantificare semi-l'intensità delle bande tramite analisi digitale delle immagini e regolare le quantità delle sfere per le reazioni successive.

6. Preparazione di mononucleosomi da HEK293FT cellule

  1. Coltivare HEK293FT cellule in piastre di coltura tissutale da 15 cm fino a circa il 90% di confluenza utilizzando siero bovino fetale al 10% (FBS) in un substrato DMEM a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 .
  2. Le cellule HEK293FT passaggio precoce vengono ottenute commercialmente e autenticate tramite profilazione STR.
    NOTA: Un piatto da 15 cm produce ~27 milioni di cellule, sufficienti per 1–2 reazioni pulldown. Per sei reazioni (inclusi i controlli negativi), prepara almeno tre piatti da 15 cm. Se la modifica post-traduzionale (PTM) degli istoni target è rara o instabile, aumentare il numero cellulare da 2 a 10× di conseguenza.
  3. (Opzionale) A seconda della modifica degli istoni di interesse, aggiungere gli inibitori PTM appropriati (Tabella Supplementare 2) al mezzo di coltura e incubare per 24 ore.
    NOTA: Questo passaggio può essere omesso se sono presenti abbondanti PTM di istoni.
  4. Quando le cellule raggiungono una confluenza vicina al 100%, raccoglietele come segue:
    1. Aspira il mezzo di coltura.
    2. Risciacquare delicatamente le cellule con 10 mL di PBS ghiacciato, poi aspirare.
    3. Aggiungi 5 mL di PBS ghiacciato.
    4. Raschiare le celle sul ghiaccio e trasferirle in un tubo da 50 mL (tutti i piatti possono essere combinati).
    5. Centrifugare a 13.000 × g, 4 °C, per 10 minuti.
    6. Scartate il soprannatante.
  5. (Opzionale) Procedi subito o congela il pellet cellulare per un uso successivo:
    1. Stima il volume dei pellet.
    2. Risospendere il 9× volume di pellet del tampone G per raggiungere una concentrazione finale di glicerolo del 20%.
    3. Congelare rapidamente in azoto liquido e conservare a −80 °C.
  6. Se si procede con il pellet congelato, scongelare il pellet sul ghiaccio, centrifugare a 1.300 × g, 4 °C, per 5 minuti e scartare il supernatente.
  7. Risospendere il pellet (fresco o scongelato) in un volume di 10× pellet di tampone TMSD (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mMMgCl 2, 250 mM saccarosio, 1 mM DTT) contenente inibitori proteasi utilizzando una pipetta sierologica.
  8. Preparare il 10% di NP-40 nel tampone TMSD e aggiungere lo 0,11× volume totale di reazione per ottenere una concentrazione finale di NP-40 di ~1%.
  9. Incuba la sospensione su un rotatore a tubo impostato a 120 giri/min a 4 °C per 5 minuti.
  10. Miscela 10 μL della sospensione con 10 μL di blu tripano e osserva al microscopio per monitorare la colorazione nucleare. Assicurarsi che i nuclei siano completamente isolati dal citosolo (Figura 3A).
  11. Quando circa il 95% dei nuclei è tripano blu-positivo, si procede al passo successivo. Per HEK293FT cellule, un'incubazione NP-40 al 1% per 5 minuti è tipicamente sufficiente. Per altri tipi di cellule, verifica e regola il tempo di incubazione.
  12. Centrifugare a 1.300 × g, 4 °C, per 5 minuti, e scartare il soprantantante.
  13. Risospendere il pellet in un volume del 10× del tampone TMSD.
  14. Ripeti i passaggi 6.12 a 6.13 cinque volte per rimuovere completamente il residuo di NP-40.
  15. Sospendere il pellet in un volume di 5× pellet del Buffer B.
  16. Aggiungere 1 unità di nucleasi micrococcica (MNasi) ogni 10.000 nuclei e incubare in un bagno d'acqua a 37 °C. Agita occasionalmente il tubo durante l'incubazione per mantenere i nuclei sospesi uniformemente
  17. Nei momenti indicati (0,5, 1 e 2,5 h), preleva 50 μL della reazione in tubi da 1,5 mL, aggiungi immediatamente 1 μL di 0.5 M EDTA-Na (pH 8.0) e vortice.
  18. Estrai il DNA da ogni punto temporale seguendo la procedura seguente:
    1. Aggiungere 80 μL di H₂O, 30 μL di SDS al 10% e 20 μL di 5 M NaCl; vortice.
    2. Aggiungere 200 μL di fenolo/cloroformio; Vortice a fondo.
    3. Centrifuga a 20.000 × g, RT, 3 min.
    4. Trasferire con attenzione il soprantantante su un nuovo tubo da 1,5 mL.
    5. Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% e 20 μL di acetato di sodio 3 M (pH 5,2); vortice.
    6. Centrifuga a 20.000 × g, RT, 5 min.
    7. Rimuovere il soprantantante, aggiungere 1 mL di etanolo al 70%.
    8. Centrifuga a 20.000 × g, RT, 1 minuto.
    9. Rimuovi il soprandanante e asciuga il pellet a 55 °C con il tappo aperto per 10 minuti.
    10. Risospendere il pellet in un buffer TE da 50 μL.
  19. Analizza campioni su un gel di agarosio TBE all'1% per confermare la dimensione del DNA mononucleosomico (147 pb) (Figura 3B).
  20. (Opzionale) Le efficienze digertive della Micrococcal Nucleasi (MNasi) variano a seconda dei tipi cellulari; ulteriore MNasi può essere aggiunta a metà reazione se necessario per rimuovere completamente i polinucleosomi. Ad esempio, se i campioni di 1 h e 2 h sembrano simili, aggiungi più MNase a 3 ore.
  21. Quando si osserva una banda predominante di ~147 bp, o quando un'incubazione aggiuntiva di MNasi/estesa non altera più la dimensione del frammento, si interrompe la reazione aggiungendo 0,5 M EDTA-Na (pH8,0) a una concentrazione finale di 2 mM.
  22. Centrifugare a 1.300 × g, 4 °C, per 5 minuti. Raccogli il soprannatante (S1).
  23. Risospendere il pellet in un volume di 10× pellet di TE buffer + inibitori proteasi e incubare il campione su un rotatore a tubo impostato a 20 giri/min a 4 °C per almeno 30 minuti.
    NOTA: Le efficienze di estrazione dei mononucleosomi variano a seconda dei tipi cellulari. Il NaCl da 0 a 300 mM può essere utilizzato per estrarre efficacemente i nucleosomi.
  24. Centrifugare a 1.300 × g, 4 °C, per 5 minuti. Raccogli il soprantantante (S2).
  25. Trasferire 50 μL ciascuno di S1 e S2 a tubi separati da 1,5 mL.
  26. Analizzare tutte le frazioni tramite elettroforesi su gel di agarosio (Passaggi 6.17-6.18) per valutare la distribuzione della dimensione del DNA e l'efficienza dell'estrazione. La maggior parte dei mononucleosomi si trova nella frazione S2 (Figura 3C).
  27. Trasferire S2 in tubi centrifughe ad alta velocità e centrifugare a 20.000 × g, 4 °C, per 10 minuti per rimuovere materiale insolubile.
  28. Raccogliere il soprandanante e dialisi contro il buffer di lisi BC150 (senza inibitori):
    1. Prima dialisi: 1 L, 1 ora.
    2. Seconda dialisi: 2 L, durante la notte.
  29. Dopo la dialisi, centrifugare nuovamente a 20.000 × g, 4 °C, per 10 minuti per rimuovere eventuali residui insolubili.
  30. Raccogli l'ultimo soprantantante.
  31. Miscelare 5 μL del sovrantante con 35 μL di tampone di lisi BC150 e 10 μL di tampone di Laemmli 5× riscaldare a 95 °C per 5 minuti e caricare 1, 2, 5, 10 e 20 μL su un gel SDS–PAGE al 15%.
  32. Carica 1, 2 e 5 μL di 0,1 mg/mL di BSA nel tampone di Laemmli come riferimento per la stima della ressa.
  33. Colorare con il blu di Coomassie e stimare il rendimento dei nucleosomi in modo semi-quantitativo utilizzando un software di analisi delle immagini (Figura 3D).

7. Pulldown dei nucleosomi modificati

  1. Preparare il buffer bloccante 2× di perle dissolvendo 1 g di BSA nel buffer di lisi BC150 a un volume finale di 10 mL, poi vortice fino a disciolto.
  2. Trasferire le sfere FLAG-SPIN4-WT e FLAG-SPIN4D82H contenenti quantità molari equivalenti di proteina (dalla Sezione 5, Passaggi 5.16 a 5.17) in tubi separati da 1,5 mL.
  3. Aggiungere un volume uguale di sfere di controllo negativo (dalla Sezione 5, Passo 10) al campione FLAG-SPIN4-WT.
  4. Regola il volume totale di tutti i campioni di perle per renderlo identico usando il buffer di lisi BC150.
  5. Aggiungi un volume uguale di 2× tampone bloccante le perline a ciascun tubo contenente sfere e il tampone di lisi BC150.
  6. Incubare i campioni su un rotatore a tubo impostato a 20 giri/min a 4 °C durante la notte (O/N).
  7. Scongelare una quantità appropriata di 1× nucleosoma estratto dalle cellule HEK293FT sul ghiaccio. Il volume richiesto dipende dal rapporto molare nucleosoma-SPIN4 desiderato. Per l'ottimizzazione iniziale, si utilizza un rapporto molare 1:1 tra nucleosomi e SPIN4.
  8. Mescola accuratamente 1× nucleosoma con un volume uguale di 2× buffer che blocca le sfere.
  9. Combina la miscela dello Step 7.8 con le perline pre-bloccate in un tubo da 15 mL.
  10. Incubare la miscela su un rotatore a tubo impostato a 20 giri/min a 4 °C per 4 ore o per tutta la notte.
  11. Centrifuga a 3.000 × g, 4 °C, per 3 minuti.
  12. Scartate con cura il soprandanante.
  13. Risospendere le sfere in un buffer di lisi BC150 da 1 mL e trasferire su tubi da 1,5 mL.
  14. Lava le perline tre volte come segue:
    1. Centrifugare a 3.000 × g, 1 minuto, e aspirare il soprantantante.
    2. Risospezione delle perle in un buffer di lisi di 1 mL di BC150.
    3. Agita occasionalmente il tubo per mantenere le perline sospese in modo uniforme durante il lavaggio.
  15. Lava le perline altre due volte come segue:
    1. Centrifuga a 3.000 × g, 1 minuto, e aspira il soprantantante.
    2. Risospendere le perline in un buffer di lisi BC150 da 1 mL.
    3. Ruota a 20 giri/min, 4 °C, per 10 minuti.
  16. Dopo il lavaggio, risospendere le perne in 9 volumi di colonna (CV) di buffer di lisi BC150.
  17. Prendi 160 μL da ogni campione, mescola con 40 μL 5× tampone Laemmli e riscalda a 95 °C per 5 minuti.
    NOTA: Si raccomanda un'eluzione peptidica flag del complesso proteina-nucleosoma, che produce risultati più puliti con meno background.
  18. Centrifuga a 3.000 × g, temperatura ambiente, per 5 minuti.
  19. Carica 5 μL del surnatante su un gel SDS–PAGE al 15% e esegui la colorazione con argento (Figura 4A).
  20. Carica altri 5 μL del sovrantante su un gel SDS–PAGE al 15%, trasferisci in una membrana PVDF e sonda con gli anticorpi primari e secondari appropriati specifici per le PTM degli istoni target (Figura 4B).

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Results

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Per indagare i substrati di legame di SPIN4 umano, sono stati ricostituiti SPIN4 di tipo selvatico e un mutante derivato dal paziente associato alla sindrome da sovracrescita utilizzando un sistema di espressione cellulare di insetti Sf9. In particolare, si tratta di una mutazione missense da acido aspartico (D) in istidina (H) al residuo 82 (D82H), che risiede nel primo dominio Tudor di SPIN4, implicando il suo ruolo nella regolazione del legame al substrato di SPIN4. Un vettore baculov...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È stato presentato un metodo efficace in termini di tempo e costi per individuare biochimicamente specifici PTM di istoni come bersagli di una proteina poco caratterizzata, e per valutare come la sua mutazione associata alla malattia influenzi l'affinità di legame del bersaglio. Il vantaggio di questo metodo è che non richiede una ricostituzione costosa o dispendiosa in termini di tempo dei nucleosomi sintetici. Questo approccio sfruttava la comodità degli array commercializzati di pepti...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano tutti i membri passati e attuali del laboratorio Yu e Jee per il loro supporto tecnico. J.-R.Y. è stato sostenuto dal NIH NIGMS Maximizing Investigators' Research Award (MIRA) R35GM160046. SÌ. J è stato sostenuto dall'Ospedale Nazionale Pediatrico e dall'Istituto di Ricerca Pediatrica.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubi microcentrifughe da 1,5 mLSarstedt72.690.001Esperimenti generali
Piatto per coltura tissutale da 15 cmSarstedt83.3903.300Esperimenti generali
Tubi centrifughe conici da 15 mLSarstedt62.554.101Esperimenti generali
Tubi centrifughe conici da 50 mLSarstedt62.548.004Esperimenti generali
Fiaschetta Erlenmeyer da 500 mLStellar ScientificCT229809Coltura cellulare Sf9
Amersham ImageQuant 800 CCD ImagerCytivaIMQ800Sistema di imaging CCD
Gel di affinità anti-FLAG M2Sigma-AldrichA2220Pulldown biochimico
Anticorpo anti-FLAG M2Sigma-AldrichF1804Tachia occidentale
AprotininaMedChemExpressHY-P0017Inibitore della proteasi
Array Analizza SofrwareMotivo attivohttps://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zipAnalisi dei dati MODified peptide array
ASI Agarose LEAlkali ScientificA7700Gel per il DNA
Sistema di espressione del baculovirus Bac-to-BacThermo Scientific10359016Espressione baculovirale
Benzamidina cloridriduraMedChemExpressHY-W018781Inibitore della proteasi
Albumina Sirica Bovina (BSA)Sigma-AldrichA9647Standard di quantificazione delle proteine
Blu di bromofenoloThermo ScientificA18469.08Tampone di Lammeli
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Scientific20278Colorazione con gel Protien
Ditiotreitolo (DTT)Sigma-Aldrich D5545Buffer di lisi
EDTAProdotti di ricerca RPIE58100Buffer di lisi
Substrato a chemiluminescenza potenziata (ECL)CytivaRPN2232Tachia occidentale
Mezzo per colture cellulari di insetti ESF 921Sistemi di espressione96-001Coltura cellulare Sf9
Etanolo (200 proof)Spettro ChimicoET107Precipitazione del DNA
Sistema di imaging EVOS M5000InvitrogenM5000Imaging generale
Peptide FLAGMedChemExpressHY-P7006Eluzione a pulldown
GliceroloSigma-Aldrich G77893Buffer di archiviazione
Anticorpi H3K4me1  Motivo attivo39300Tachia occidentale
Anticorpo H3K4me2  Segnalazione cellulare9725TTachia occidentale
Anticorpi H3K4me3  Segnalazione cellulare9751TTachia occidentale
HEK293FT celleThermo ScientificR70007Linea cellulare fibroblastifera renale embrionale umana
HEPESSigma-Aldrich H3375Buffer di lisi
ImageJIstituti Nazionali di Salutehttps://imagej.net/ij/download.html  Programma di elaborazione immagini basato su Java
Emisolfato di leupeptinMedChemExpressHY-18234AInibitore della proteasi
Micronucleasi micrococcica (MNasi)NEB M0247SEndonucleasi per la digestione della cromatina
Modello 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110Sonicazione
Array di peptidi istonotici modificatiMotivo attivo13005Saggio di legame proteico
Pepstatina AMedChemExpressHY-P0018Inibitore della proteasi
Frazione di IgG di Perossidasi Monoclonale Anti-IgG di Capra del Topo, specifica della catena leggeraJackson ImmunoResearch115-035-174Tachia occidentale
pFastBac1-Flag-SPIN4Thermo Scientific10360014Vettore di espressione baculovirale
pFastBac1-Flag-SPIN4-D82HThermo Scientific10360014Vettore di espressione baculovirale
Fenolo:Cloroformio:Isoamil Alcol (25:24:1)Sigma-AldrichP2069Purificazione del DNA
Kit per il saggio proteico Pierce Rapid Gold BCAThermo ScientificPIA53226Quantificaiton proteico
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24612Rilevamento delle proteine
Inibitore della proteasi PMSFThermo Scientific36978Inibitore della proteasi
Gel di poliacrilammideRealizzati internamenteN/AGel proteico
Cellule di insetti Sf9ATCCCRL-1711Linea cellulare di insetti per l'espressione di baculovirus
Dispositivo di dialisi Slide-A-Lyzer MINI, MWCO 10KThermo Scientific69572Dialisi proteica
Acetato di sodioSigma-AldrichS8750Precipitazione del DNA
Cloruro di sodio  Fischer BP358-1Buffer generali
Solfato di Dodecile di Sodio (SDS)Sigma-Aldrich L3771Buffer generali
Soluzione Trippan Blu (0,4%)Thermo Scientific15250061Colorazione dei nuclei

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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SPIN4 ProteinHistone ModificationPeptide ArrayNative Nucleosome PulldownTudor DomainHistone ReaderH3K4 MethylationWestern BlotBone Growth RegulationPost Translational Modification

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