Protezione delle cellule beta delle isole da danni indotti da sovraccarico di ferro da parte del gene 3 materno espresso maternamente a RNA non codificante

Sommario

Il sovraccarico di ferro ha ridotto l'espressione di MEG3 nel tessuto pancreatico. MEG3 potrebbe svolgere un ruolo protettivo contro l'apoptosi delle isolotte β-cellule indotta dal ferro, potenzialmente coinvolgendo la modulazione della via NF-ĸB. Questo meccanismo può contribuire alla disfunzione delle isolotte nei pazienti con β-TM con sovraccarico di ferro.

Abstract

I pazienti con beta-talassemia maggiore (β-TM) presentano comunemente un metabolismo anomalo del glucosio, e fattori come sovraccarico di ferro, anemia cronica, squilibri ormonali, disfunzione epatica e resistenza all'insulina associata all'infiammazione sono considerati contributori importanti alla disfunzione degli isolotti pancreatici. Gli acidi ribonucleici lunghi non codificanti (lncRNA) sono sempre più riconosciuti per i loro ruoli regolatori nell'apoptosi cellulare e nell'omeostasi del glucosio. Questo studio esplora la funzione dell'inncRNA, gene 3 espresso maternamente (MEG3), nella lesione delle isolotte β cellule indotte dal ferro. Un modello murino con sovraccarico di ferro è stato indotto tramite iniezione intraperitoneale di destrono di ferro. La deposizione di ferro e il danno tissutale nel pancreas sono stati valutati utilizzando blu di Prussia e colorazione di ematossilina ed eosina, e l'espressione di MEG3 è stata quantificata tramite reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa (RT-PCR). In vitro, le cellule MIN6 sono state trasfettate con piccolo RNA interferente MEG3 per esaminare l'apoptosi tramite citometria a flusso, e l'attività della via di segnalazione NF-kappa (ĸ)B è stata valutata tramite Western blotting. La colorazione istologica ha confermato una significativa deposizione di ferro e danni strutturali nel tessuto pancreatico dei topi sovraccaricati di ferro. L'analisi RT-PCR ha rivelato una netta riduzione dell'espressione di MEG3 nel pancreas (p<0,05). In vitro, il knockdown di MEG3 ha aumentato significativamente l'apoptosi delle cellule MIN6 rispetto ai controlli. L'analisi del Western blot ha mostrato un livello elevato di NF-ĸB, indicando l'attivazione della via di segnalazione di NF-ĸB nelle cellule silenziate da MEG3. Questi risultati suggeriscono che la ridimensionamento del MEG3 potrebbe potenziare l'apoptosi delle isolotte β-cellule tramite la segnalazione NF-ĸB in condizioni di sovraccarico di ferro. Il gene MEG3 potrebbe svolgere un ruolo protettivo contro l'apoptosi β-cellula delle isolotte indotta dal ferro, potenzialmente coinvolgendo la modulazione della via NF-ĸB. Questo meccanismo può contribuire alla disfunzione delle isolotte nei pazienti con β-TM con sovraccarico di ferro.

Introduzione

Le beta (β)-talassemie sono un gruppo di disturbi ematologici ereditari caratterizzati da una produzione ridotta o assente della catena di β-globina, che porta a anemia cronica e eritropoiesi^{inefficace 1}. Nei pazienti con β-talassemia maggiore (β-TM) dipendente da trasfusione, trasfusioni di sangue ripetute e emolisi spesso portano a sovraccarico sistemico di ferro, che può danneggiare più organi e contribuire a una serie di complicazioni endocrine, incluso un metabolismo anomalo^{del glucosio 2}. Inoltre, l'anemia cronica aumenta il carico sul pancreas, gli squilibri ormonali che influenzano la regolazione del glucosio, la disfunzione epatica che compromette il metabolismo del glucosio e la resistenza all'insulina indotta da processi infiammatori possono tutti contribuire all'iperglicemia nei pazienti con β-TM. Pertanto, i disturbi metabolici del glucosio nella β-TM sono di natura^{multifattoriale 2,3}. Una recente meta-analisi ha riportato che la prevalenza di glicemia a digiuno compromessa, tolleranza al glucosio (IGT) compromessa e diabete mellito (DM) nei pazienti con β-TM era rispettivamente del 17,21%, 12,46% e 6,54%, indicando un aumento del carico di disturbi metabolici del glucosio^{in questa popolazione 3}.

Nonostante la sua crescente rilevanza clinica, i meccanismi sottostanti del metabolismo anomalo del glucosio nella β-TM restano poco compresi. Studi precedenti hanno dimostrato che il sovraccarico cronico di ferro, principalmente dovuto a trasfusioni ripetute ed emolasi, può portare a un eccessivo deposito di ferro nel pancreas, in particolare all'interno delle cellule β dell'isolotto. Questo accumulo favorisce la generazione di specie reattive di ossigeno e aggrava lo stress ossidativo, scatenando disfunzioni mitocondriali, compromettendo la sintesi e la secrezione di insulina e, infine, inducendo apoptosi β-cellulare e carenza di insulina ^4,6. Inoltre, il sovraccarico di ferro può contribuire alla resistenza all'insulina periferica attraverso l'infiammazione mediata dallo stress ossidativo e l'interferenza con le vie di segnalazione dell'insulina. Tuttavia, le vie molecolari che collegano il sovraccarico di ferro al danno delle cellule β e alla disregolazione sistemica del glucosio sono complesse e devono ancora essere completamente chiarite. Gli acidi ribonucleici non codificanti lunghi (lncRNA) – una classe di trascrizioni più lunghe di 200 nucleotidi che non codificano proteine – sono emersi come importanti regolatori in diversi processi biologici, tra cui l'omeostasi del glucosio, la secrezione di insulina e le risposte allo stress ^{ossidativo 7,8,9}. Le cellule β delle isole pancreatiche sono note per esprimere oltre 1.000 lncRNA, suggerendo il loro potenziale ruolo regolatore nel mantenimento della funzione^{endocrina 10}.

Tuttavia, si sa poco sui profili di espressione degli inncRNA e sui loro ruoli funzionali nel contesto del danno alle β cellule degli isolotti indotto da sovraccarico di ferro, specialmente nella β-TM. Recenti progressi hanno rivelato che LncRNA MEG3 (MEG3) promuove la secrezione di insulina e inibisce l'apoptosi 11 delle cellule β^{pancreatiche.} Tuttavia, il suo effetto sulle cellule β pancreatiche in condizioni di sovraccarico di ferro rimane sfuggente. In altri contesti patologici, è stato dimostrato che gli lncRNA interagiscono con vie chiave di segnalazione come NF-kappa (ĸ)B, JNK e Nrf2, che sono anch'esse coinvolte nello stress ossidativo e nel danno cellulare correlato al sovraccarico^{di ferro} 12,13,14. In particolare, NF-ĸB è un fattore di trascrizione centrale attivato sotto stress ossidativo ed è stato implicato nell'apoptosi delle cellule β in condizioni di sovraccarico di ferro 15,16,17. Pertanto, questo studio indaga che la riduzione del MEG3 potrebbe potenziare l'apoptosi delle cellule β isolotti tramite segnalazione NF-ĸB in condizioni di sovraccarico di ferro. Questo lavoro potrebbe fornire nuove intuizioni sui meccanismi molecolari alla base del metabolismo anomalo del glucosio nella β-TM.

Protocollo

I protocolli sperimentali impiegati nel presente studio sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale Generale di Hainan (protocollo n. 2021-239). La Guida degli Istituti Nazionali di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio e la Dichiarazione di Helsinki sono state seguite rigorosamente in tutte le procedure sperimentali. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Modello animale e disegno sperimentale

In questo studio sono stati utilizzati trentasei maschi di topi C57BL/6J (4 settimane, circa 20 g). Tutti i topi sono stati alloggiati in condizioni standard di laboratorio (20–25 °C, 50%–65% di umidità relativa, ciclo luce/buio di 12 ore) con accesso ad libitum a cibo e acqua. Dopo un periodo di acclimatazione di 7 giorni, i topi sono stati divisi casualmente in due gruppi (n=18 per gruppo): il gruppo di sovraccarico di ferro (gruppo modello), che riceveva iniezioni intraperitoneali di destrono di ferro (0,2 g/kg) due volte a settimana per 4 settimane; e il gruppo di controllo, che riceveva volumi equivalenti di soluzione salina normale tramite iniezione intraperitoneale. Dopo 4 settimane, i topi sono stati soppressi e i tessuti pancreatici sono stati prelevati per analisi successive.

2. Misurazione del ferro sierico

Sono stati prelevati campioni di sangue dal seno retro-orbitale sotto anestesia pentobarbital all'1% durante il diestru. Dopo essere stato lasciato a temperatura ambiente per 1 ora, il sangue è stato centrifugato a 4 °C, 3.000 giri/min per 15 minuti. Il siero veniva separato e conservato a -80 °C. Le concentrazioni di ferro sirico sono state determinate utilizzando un kit di analisi colorimetrica sul ferro seguendo il protocollo del produttore.

3. Analisi istologica

I campioni di tessuto pancreatico sono stati immersi nel 4% di paraformaldeide per la fissazione, seguiti da un'incapsulazione di paraffina prima della preparazione della sezione. Sono state ottenute e processate sezioni seriali di tessuto con uno spessore compreso tra 4 e 5 μm tramite procedure standard di deparaffinizzazione e reidratazione. L'esame istomorfologico è stato successivamente eseguito utilizzando la colorazione di ematossilina ed eosina, mentre la deposizione di ferro nei tessuti pancreatici è stata valutata tramite colorazione blu di Prussia secondo protocolli di colorazione istologica convenzionali.

4. Coltura cellulare e trasfezione di piccoli acidi ribonucleici interferenti

Le cellule β pancreatiche MIN6 del topo sono state coltivate nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio, integrato con siero bovino fetale al 15%, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina, 10 mM HEPES, 50 mM piruvato di sodio e 50 μmol/L β-mercaptoetanolo. Tutti gli esperimenti sono stati condotti all'80% di confluenza cellulare. Ogni volta durante la coltura cellulare vengono prelevati 6–8 ml di mezzo di coltura. Le celle sono state mantenute a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂. Per studi funzionali, le cellule MIN6 nella fase di crescita logaritmica sono state trasfettate con piccoli (si)RNA interferenti specifici per lncRNA (che hanno preso di mira lncRNA selezionati basandosi sui risultati dei microarray); Gruppo inibitore) o siRNA di controllo negativo (gruppo inibitore NC) utilizzando Lipofectamina 2000, secondo le istruzioni del produttore. Dopo la coltura per 24 ore, le cellule sono state analizzate tramite reazione a catena quantitativa della polimerasi (qRT-PCR) o western blot per determinare l'efficienza del knockdown. Le sequenze target di questo siRNA erano le seguenti siMEG3: GCGUCUUCCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACACAGGAAGACGCTT; siNC: UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACGUUCGGAGAATT. Ogni esperimento è stato condotto in triplicata e ripetuto tre volte.

5. Saggio di reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa

L'RNA totale è stato estratto da campioni di tessuto pancreatico e da cellule MIN6 utilizzando un reagente di isolamento a base di fenolo disponibile commercialmente secondo le istruzioni del produttore. Il DNA complementare è stato sintetizzato utilizzando un kit di trascrizione inversa in un volume di reazione totale di 20 μL. Dopo la trascrizione inversa, la concentrazione di cDNA della maggior parte dei campioni era di circa 1 μg/μL secondo l'analisi di quantificazione del campione. Successivamente, 1 μL di modello di cDNA è stato utilizzato per l'amplificazione quantitativa in tempo reale tramite PCR. qRT-PCR è stato eseguito utilizzando un kit di rilevamento PCR SYBR Green-based nelle seguenti condizioni di ciclaggio: 95 °C per 30 s, 90 °C per 15 s, 60 °C per 34 s e 68 °C per 30 s. I livelli relativi di espressione genica sono stati determinati utilizzando il metodo del ciclo di soglia comparativo (metodo ^2-ΔCT ). Il GAPDH è stato utilizzato come gene di riferimento interno per la normalizzazione dei dati PCR in tempo reale. Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo i protocolli dei rispettivi produttori e ogni esperimento è stato ripetuto indipendentemente almeno tre volte. Le sequenze di primer utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella Supplementare 1 e nella Tabella 2.

6. Kit di conteggio cellulare Kit 8

La capacità di proliferazione cellulare è stata determinata utilizzando un test kit di conteggio cellulare 8 in conformità con le linee guida del produttore. In breve, le cellule MIN6 sono state impiegate in piastre di coltura da 96 pozzi a una densità di 5 x 10³ cellule per pozzo dopo la trasfezione con si-MEG3 o si-NC e mantenute per 24 ore. Nei momenti temporali designati, furono introdotti 10 μL di reagente di vitalità cellulare in ciascun pozzo e le piastre furono incubate a 37 °C per 2 ore. I valori di assorbanza sono stati successivamente misurati a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche. La vitalità cellulare è stata calcolata come percentuale rispetto al gruppo di controllo.

7. Rilevamento dell'apoptosi tramite citometria a flusso

I cambiamenti apoptotici nelle celle MIN6 sono stati esaminati utilizzando un kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-FITC/PI secondo le istruzioni del produttore. Dopo 48 ore di trasfezione di siRNA, le cellule venivano prelevate, lavate due volte con soluzione salina tamponata a freddo fosfato e risospese in tamponamento di legame. Successivamente, le cellule sono state incubate con 5 μL di Annexin V-FITC e 5 μL di iodio propidio per 15 minuti a temperatura ambiente in condizioni buie. Immediatamente dopo la colorazione, i campioni sono stati analizzati tramite citometria a flusso. Le popolazioni cellulari apoptotiche precoci e tarde sono state quantificate utilizzando software di analisi citometrica a flusso. La proporzione di cellule apoptotiche è stata successivamente calcolata per confronti intergruppi. Ogni esperimento è stato condotto indipendentemente tre volte.

8. Analisi del Western Blot

Esperimenti con Western Blot sono stati condotti secondo i protocolli precedentemente^{riportati 18}. Le cellule venivano prima digerite con tripsina, raccolte e lisate su ghiaccio utilizzando il tampone di lisi per il saggio di immunoprecipitazione radio-immunoprecipitazione. Le concentrazioni proteiche sono state quantificate e quantità equivalenti di proteine sono state sottoposte a separazione su gel di elettroforesi al 10% di solfato dodecile di sodio-poliacrilammide prima del trasferimento su membrane di fluoruro di polivinilidene. Dopo il blocco della membrana, i campioni sono stati incubati con anticorpi primari contro NF-κB (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), caspasi-3 (1:1000) e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) (1:2000) ai rapporti di diluizione indicati, seguiti dall'incubazione con anticorpi secondari legati alla perossidasi di rafano. I segnali proteici sono stati rilevati tramite un sistema di chemiluminescenza e quantificati con il software ImageJ. Il GAPDH è stato utilizzato come controllo del carico interno, mentre i livelli di espressione proteica sono stati espressi come variazioni di piegatura rispetto al gruppo di controllo.

9. Analisi statistica

I dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD). I confronti tra i gruppi sono stati effettuati utilizzando il test Mann–Whitney^{U 19} tramite analisi statistiche. Un p-valore <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Valutazione del modello murino con sovraccarico di ferro e misurazione dell'espressione materna del gene 3 nei tessuti pancreatici

Per indagare il ruolo del MEG3 in vivo, abbiamo stabilito un modello di sovraccarico di ferro nei topi tramite iniezione intraperitoneale di dextrano di ferro. Rispetto al gruppo di controllo, i livelli di ferro sierico nel gruppo modello erano significativamente aumentati (p<0,05) (Figura 1A). L'esame istologico ha...

Discussione

Il metabolismo anomalo del glucosio è una complicanza comune e grave nei pazienti con β-TM, spesso manifestandosi come IGT o DM. In questo studio, abbiamo scoperto che il sovraccarico di ferro ha causato lesioni pancreatiche e ha ridotto significativamente l'espressione di lncRNA MEG3 nel tessuto pancreatico, accompagnata da un aumento dell'apoptosi delle cellule β delle isoline. Inoltre, il knockdown di MEG3 nelle cellule MIN6 ha promosso l'apoptosi β-cellulare ed è stato associato all'...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1M Tris-HCL (pH=6.8)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	T1020
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
6×DNA Loading Buffer	TIANGEN	GH101-01
6×DNA Loading Buffer	TRANS	GH101-01
-80ºC refrigerator	BIOBASE	BDF-86V348
ABI 7500 real-time PCR system	Applied Biosystems, USA
Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit	MULTI SCIENCES	AP101-100-kit
BCA Protein Assay Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd.	E-BC-K318-M
Biopulverizer	biospec
BSA	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A8020
C57BL/6J male mice	Gempharmatech Co,Jiangsu,China
CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit	KeyGEN BioTECH	KGA317
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
DMEM	KeyGEN BioTECH
Flow cytometry	ACEA Biosciences, USA	NovoCyte 2060R
Fluorescence PCR instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai
Glycine	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	G8200
High-capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Servicebio	GB23301	1/2000
HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Servicebio	GB23303	1/2000
Human LncRNA Array V5.0	Arraystar,Rockville, Maryland, USA
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
Microarray scanner	Agilent Technologies,California, USA
MIN6 cell	procell	KGM12800N
Mini-Bead-Beater-16	biospec
Mouse Anti-GAPDH	TransGen Biotech	HC301	1/2000
NanoDrop spectrophotometer	NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA	ND-2000
PAGE Pre-Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A1010
Primers	Generay Biotech,Anhui, China
PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser	CWBIO,Jiangsu, China
PVDF	Millipore	IPVH00010
Rabbit Anti Bax	proteintech	50599-2-ig	1/5000
Rabbit Anti Bcl-2	abcam	ab194583	1/1000
Rabbit Anti Caspase3	abcam	ab184787	1/2000
Rabbit Anti P65	abcam	ab32536	1/8000
Rabbit Anti p-P65	Affinity	af2006	1/1000
TB Green Premix Ex Taq II	TaKaRa, Japan
TRIzol	Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA
TRIzol reagent	CWBIO,Jiangsu, China
Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai	Chemi DocTM XRS+
Ultraviolet spectrophotometer	NanoPhotometer	NP80