L'aconitina induce danni miocardici nei ratti associati all'attivazione della via di segnalazione JNK1/2

Sommario

Questo studio ha indagato il potenziale ruolo della segnalazione JNK1/2 nel danno miocardico indotto da aconitina nei ratti. L'aumento della fosforilazione JNK1/2 è stato associato a danni miocardici, mentre l'inibizione farmacologica della via JNK ha parzialmente alleviato il danno miocardico, suggerendo che la segnalazione JNK possa partecipare alla cardiotossicità indotta da aconitina.

Abstract

L'avvelenamento acuto da Aconitina (Acon) può causare aritmie e danni miocardici; tuttavia, i meccanismi sottostanti rimangono poco chiari. Questo studio ha indagato il meccanismo della lesione miocardica indotta dall'avvelenamento acuto da Acon. Un modello su ratto (n = 51) di avvelenamento acuto da Acon è stato stabilito tramite somministrazione intragastrica. Sono stati utilizzati ritracciamenti elettrocardiografici per registrare i cambiamenti del ritmo cardiaco. Sono state eseguite colorazioni di ematossilina ed eosina (HE) e colorazione di Masson per valutare la lesione patologica miocardica e la deposizione di collagene. I livelli di espressione di enzimi cardiaci e proteine nel sangue venoso sono stati rilevati utilizzando kit di immunosorbimento legato agli enzimi (ELISA). La relazione struttura-attività tra Acon e la via JNK è stata studiata tramite docking molecolare. I livelli di espressione delle proteine fosforilate della c-Jun N-terminale chinasi 1/2 (JNK1/2) sono stati rilevati tramite Western blotting. In questo studio, sono state osservate aritmie ventricolari nei ratti dopo la somministrazione intragastrica di Acon. Il tessuto miocardico mostrava una disposizione disordinata delle fibre e delle cellule miocardiche, accompagnata da una deposizione anomala di collagene. I risultati dell'aggancio molecolare indicavano potenziali interazioni tra Acon e JNK1/2. Nel frattempo, i livelli di espressione di enzimi e proteine cardiache, così come di JNK1/2 fosforilato, sono stati significativamente aumentati. Ulteriori studi hanno dimostrato che il trattamento con l'inibitore JNK SP600125 parzialmente invertito la lesione miocardica indotta da Acon nei ratti. Questi risultati indicano che la fosforilazione di JNK1/2 è coinvolta nello sviluppo di lesioni miocardiche indotte da avvelenamento acuto da aconitina. I risultati suggeriscono che l'attivazione della via di segnalazione JNK1/2 contribuisce al danno miocardico indotto dall'aconitina, e che l'inibizione della via JNK1/2 possa alleviare la lesione miocardica causata da un'intossicazione acuta da Aconitina.

Introduzione

L'acon è un estratto naturale di alcaloide diterpenico della pianta Aconitum della famiglia delle Ranunculacee. Ha effetti antinfiammatori ^1,2, analgesici, antitumorali, antireumatici, sul metabolismo immunitario e sulla promozione della circolazione^{sanguigna 3,4,5}. Tuttavia, l'uso inappropriato o eccessivo di preparazioni contenenti Acon può portare a gravi episodi di avvelenamento. I sintomi causati dall'avvelenamento da Aconitina includono sintomi^{cardiaci 6}, sintomi^{neurologici 7} e sintomi^{gastrointestinali 8}. Negli ultimi anni, ci sono stati frequenti rapporti in tutto il mondo di casi di avvelenamento da Aconite o^{morte 9,10,11}. L'avvelenamento da Acon si manifesta principalmente nel sistema cardiovascolare, nervoso e digestivo. Tra queste, la principale causa di morte per avvelenamento è la cardiotossicità. I danni al cuore causati da Acon sono molto gravi; In particolare, la breve esordio della sindrome rende difficile svolgere il trattamento clinico in modo tempestivo. Di solito, l'avvelenamento acuto da Acon provoca nausea, diarrea, vertigini, dolore al petto, dispnea e altri primi sintomi entro poche^ore. Attualmente, il meccanismo dettagliato del danno miocardico causato dall'avvelenamento acuto da Acon è ancora poco chiaro, e non esistono farmaci clinicamente efficaci che possano alleviare efficacemente i danni miocardici causati dall'avvelenamento da^{Acon 12,13}.

Un danno nell'avvelenamento acuto da Acon che potrebbe permettere di esplorare il meccanismo del danno miocardico potrebbe fornire un mezzo significativo per un'indagine dipendente dal tempo. Un tale modello potrebbe avere il potenziale per il trattamento futuro di pazienti con condizioni acute da avvelenamento da Acon e potrebbe prevenire precocemente lo sviluppo precoce della sindrome. Studi hanno ipotizzato il ruolo della via di segnalazione della chinasi n-terminale c-Jun (JNK) nella risposta immunitaria ai veleni. La via di segnalazione JNK è una delle vie di segnalazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK). La famiglia JNK ha tre geni (JNK1/MAPK8, JNK2/MAPK9 e JNK3/MAPK10). JNK1 e JNK2 possono essere espressi nella maggior parte dei tessuti, incluso il cuore, mentre JNK3 si trova principalmente nel^{cervello 14}, ed è principalmente correlato allo stress ossidativo e alla risposta infiammatoria delle^{cellule 15}. Gli studi hanno rilevato che la via di segnalazione mediata dalla JNK svolge un ruolo importante nell'ischemia/reperfusione cerebrale e^{miocardica 16,17}. La somministrazione di C66 allevia l'infiammazione miocardica indotta dalla dieta ad alto contenuto di grassi intubando l'attivazione del JNK nei cuori^{di topo 18}. L'acido clorogenico allevia il danno cardiomiocitario indotto dal TNF-α intubando la segnalazione^{JNK 19}. Pinocembrin allevia i danni miocardici e la risposta infiammatoria indotti dalla LPS inibindo la via di segnalazione p38/JNK MAPK, e allevia la disfunzione cardiaca e l'aritmia²⁰. Questi studi indicano che i cambiamenti nella segnalazione JNK, principalmente JNK1/2, sono strettamente correlati al danno miocardico. Nel frattempo, JNK è anche un bersaglio a valle di Acon per una serie di attività. Uno studio ha rilevato che alte dosi di esposizione ad Acon possono mediare la via di attivazione dell'enzima JNK, causando tossicità dello sviluppo negli embrioni di pesci zebra (giovani) come riduzione della lunghezza del corpo, forma curva e difetti nello sviluppo^{cerebrale 21}. Questo studio suggerisce che Acon possa attivare la via di segnalazione JNK. Tuttavia, il ruolo della via di segnalazione JNK nei danni miocardici causati da avvelenamento acuto da Aconitina non è chiaro.

Questo studio ha stabilito un modello ratto di avvelenamento acuto da Acon per danni miocardici, impostando dosi intragastriche diverse e intervalli di tempo. Inoltre, abbiamo esplorato l'effetto di Acon sul livello di fosforilazione di JNK1/2 nel miocardio e sull'attivazione della via di segnalazione JNK in questo modello. Esplorare il ruolo della fosforilazione JNK1/2 nella lesione miocardica nei ratti indotta da avvelenamento acuto da Acon fornisce una base teorica per lo studio dei danni miocardici causati da avvelenamento acuto da Acon.

Protocollo

Il progetto sperimentale e il piano di implementazione sono stati approvati dal Comitato per l'Esperimento Animale dell'Università Medica di Kunming per l'approvazione (numero di approvazione: Kmmu20220652) il 06/2022. Tutti i piani sperimentali sono stati realizzati in conformità con le "Linee Guida per gli Esperimenti con Animali dell'Università Medica di Kunming". L'elenco di tutti i materiali utilizzati in questo studio è riportato nella Tabella dei Materiali.

ATTENZIONE: A causa dell'elevata tossicità di Acon, tutte le procedure di preparazione e somministrazione sono state condotte in conformità con le normative istituzionali sulla sicurezza dei laboratori. Il personale che ha gestito Acon indossava le attrezzature di protezione individuale appropriate, inclusi guanti, camici da laboratorio e mascherine, e le procedure che prevedevano la preparazione di Acon sono state eseguite con le dovute precauzioni per minimizzare il rischio di esposizione. Gli animali sono stati attentamente monitorati durante e dopo la somministrazione di Acon per segni di tossicità grave e disagio, e sono stati applicati parametri umani quando necessario per minimizzare la sofferenza. I rifiuti biologici e i materiali contaminati da Acon sono stati smaltiti in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza.

Trattamento animale

Maschi adulti di ratti Sprague-Dawley (SD) (2 mesi, 230 g) sono stati allevati nell'edificio sperimentale SPF sugli animali, centro sperimentale per animali della Kunming Medical University. Le condizioni di alimentazione di tutti i ratti SD sono state trattate in base alle esigenze alimentari dei ratti SPF. Sono stati allevati in modo adattativo per una settimana e hanno digiunto per 12 ore prima dell'esperimento. Acon è stato disciolto in un tampone di acetato di 0,05 M (Acet), e i ratti SD sono stati divisi in 4 gruppi secondo il principio del controllo casuale: Gruppo 1 (Acon-1 mg) somministrato 1mg/kg di Acon tramite gavage; Gruppo 2 (Acon-2 mg) somministrato 2mg/kg di Acon per via intragastrica; Gruppo 3 (Acet), somministrato 2 mL di acetato 0,05 M tamponato da intragastrico; e Gruppo 4 (Controllo, nessun trattamento applicato). I campioni sono stati prelevati a 1, 3 e 6 ore dopo la somministrazione intragastrica. Sono stati studiati in totale 36 ratti, di cui 3 per gruppo a 1 ora, 3 ore e 6 ore. Ad ogni momento designato, venivano eseguite per prime registrazioni ECG. Successivamente, i ratti furono anestetizzati e furono prelevati campioni di sangue per analisi biochimiche sieriche. Dopo la raccolta del sangue, i ratti venivano sacrificati e il tessuto cardiaco veniva rapidamente espulso. Porzioni di tessuto miocardico sono state fissate per l'analisi istologica (colorazione HE e Masson), mentre i tessuti rimanenti sono stati conservati per l'analisi dell'espressione proteica tramite Western blotting. Negli esperimenti che hanno testato gli attivatori e inibitori JNK1/2, i ratti SD saranno suddivisi in 5 gruppi secondo il principio del controllo casuale: il gruppo modello ha ricevuto 2 mg/kg di Acon intragastrico, mentre il gruppo inibitore ha ricevuto un'iniezione intraperitoneale di 6 mg/kg SP600125²² inizialmente, seguita da 2 mg/kg di Acon per Gavage 2 ore dopo. Il gruppo agonista ricevette inizialmente un'iniezione intraperitoneale di 0,1 mg/kg di anisomicina (Anis^)23,24, seguita da 2 mg/kg di Acon per via di gâvage due ore dopo. Il gruppo DMSO ha ricevuto un'iniezione intraperitoneale di 2 mL di soluzione mista con cosolvente DMSO allo 0,8%. Il gruppo di controllo non ha ricevuto alcun trattamento. Sono stati studiati in totale 15 ratti. Tutti i risultati della colorazione sono stati analizzati in modo cieco per minimizzare il bias osservazionale. Durante il periodo sperimentale, i ratti sono stati monitorati continuamente per lo stato di sopravvivenza e i segni di grave tossicità dopo la somministrazione di Aconitina. La mortalità veniva registrata in ogni punto temporale di osservazione designato (1 h, 3 h e 6 h). La morte era definita come la completa cessazione della respirazione e del battito cardiaco. Gli animali che mostravano gravi disagio, tra cui dispnea persistente, perdita del riflesso di raddrizzamento, incapacità di camminare o condizioni moribondi, erano considerati aver raggiunto obiettivi umani e venivano soppressi immediatamente sotto anestesia profonda per minimizzare la sofferenza. Il numero di decessi per ciascun gruppo di ratti (Tabella 1–4).

Tracciamento elettrocardiografico del topo (ECG)

I ratti di ciascun gruppo sono stati sottoposti a tracciamenti ECG. Il metodo specifico era il seguente: dopo anestesia tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio a una dose di 30 mg/kg. I ratti erano fissati in posizione supina sulla console dell'esperimento animale. Il computer era collegato al sistema di acquisizione e analisi del segnale biologico BL-420N, e il filo elettronico ECG veniva inserito nella porta di ingresso a 3 canali del sistema BL-420N. I perni venivano inseriti sottocutaneamente nel lato interno dell'arto anteriore destro, dell'arto posteriore destro e del ramo posteriore sinistro dei ratti. Le spille sono state imbevute e sterilizzate in alcol al 75% prima dell'operazione, e si è prestata attenzione a evitare di inserirli nei muscoli. Le clip elettrodi del filo di piombo ECG venivano quindi collegate ai pin di ciascun arto. L'interruttore di alimentazione e il software di sistema del sistema di acquisizione e analisi del segnale biologico BL-420N furono attivati. Il canale 3 fu selezionato per l'acquisizione del segnale e il tipo di segnale fu impostato come rat ECG. I parametri erano impostati come segue: frequenza di campionamento, 1 kHz; autonomia, 2,0 mV; costante di tempo (filtro passa-alto), 200 ms (0,80 Hz); filtraggio passa-basso, 100 Hz; velocità di scansione, 200,0 ms/div; e il filtro a tacca a 50 Hz è stato disattivato. È stato registrato l'ECG Lead II e sono stati osservati cambiamenti nell'ECG. Dopo che l'ECG si è stabilizzato, sono stati eseguiti monitoraggi e registrazioni per 3 minuti, e i dati sono stati salvati in gruppi per analisi successive. Dopo la registrazione ECG, le clip e i perni degli elettrodi venivano rimossi e i ratti tornavano nelle loro gabbie. I ratti venivano tenuti al caldo e la loro respirazione monitorata fino al completo recupero dall'anestesia per prevenire la morte da soffocamento. Le registrazioni ECG di base sono state eseguite il giorno 1 prima di qualsiasi trattamento. Al secondo giorno, ai ratti è stato somministrato Acon tramite gavage intragastrico, e le registrazioni ECG sono state eseguite successivamente a 1 ora, 3 ore e 6 ore dopo la somministrazione con la stessa procedura.

Colorazione con ematossilina ed eosina (HE) e colorazione di Masson

I cuori venivano tagliati al piano orizzontale dell'asse corto e il tessuto cardiaco dell'apice cardiaco dei ratti SD veniva raccolto e fissato in poliformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 24 ore. I tessuti fissi erano disidratati, puliti nello xilene e immersi nella cera di paraffina. Successivamente, le sezioni (spesse 4 μm) venivano colorate con colorazioni HE e Masson secondo la procedura standard. Nella colorazione HE, la colorazione con ematossilina è stata eseguita per 2 minuti, poi i campioni sono stati immersi in acqua tiepida per 1 minuto, e infine la colorazione con eosina per 30 secondi. Nella colorazione Masson, tingi con soluzione di ematossilina di ferro Weigert per 5 minuti, poi con soluzione blu Masson per 3–5 minuti, e infine con soluzione blu anilina per 1–2 minuti. Le vetri sono state osservate con un normale microscopio ottico. Per ogni sezione, cinque campi microscopici non sovrapposti sono stati selezionati casualmente con lo stesso ingrandimento, evitando grandi vasi e artefatti evidenti. La frazione volumetrica del collagene (CVF) è stata calcolata usando ImageJ, secondo l'Equazione (1):

(1)

Saggio immunoenzimatico legato (ELISA)

Dopo la registrazione dell'ECG, i ratti sono stati anestetizzati con pentobarbital sodico, e successivamente è stata eseguita una laparotomia della linea mediana per raccogliere sangue venoso. I campioni di sangue sono stati prelevati tramite perforazione della vena cava inferiore utilizzando un ago venoso usa e getta. Il sangue è stato incubato a 4 °C durante la notte, e il soprannatante è stato raccolto dopo la centrifugazione a 1000 × g per 20 minuti. Le concentrazioni di CK-MB, AST, LDH, cTn-1 e h-FABP sono state determinate utilizzando un kit di analisi ELISA. L'ELISA è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore. I valori di densità ottica (OD) di ciascun pozzo sono stati determinati a 450 nm, utilizzando un lettore di micropiastre.

Analisi del Western blotting

La proteina totale è stata estratta dai tessuti cardiaci utilizzando un kit di estrazione proteica. Un kit di analisi proteica BCA è stato utilizzato per determinare la concentrazione proteica. La proteina totale (il volume campione della proteina da testare era di 10 μL) è stata separata con elettroforesi in gel di dodecile solfato di sodio e poliacrilammide al 10% e trasferita nella membrana PVDF, bloccando il latte scremato al 5% per 30 minuti. Successivamente, la membrana è stata incubata durante la notte con anticorpi primari JNK1/2(1:500), p-JNK1/2 (1:1000) e GAPDH (1:4000). Il giorno successivo, tutte le membrane sono state lavate tre volte con PBST, poi incubate con l'anticorpo secondario appropriato (1:5000) per 1 ora. Infine, venivano utilizzati reagenti chemioluminescenzi potenziati per il rilevamento del segnale; la soluzione di sviluppo è stata applicata uniformemente a goccia sulle strisce di membrana PVDF e lasciata incubare per 10 secondi, seguita da esposizione, sviluppo e imaging. Le intensità delle bande western blot sono state misurate utilizzando il software ImageJ.

Validazione dell'aggancio molecolare

La struttura molecolare SDF 3D di Aconitine è stata scaricata dal database PubChem, e la struttura SDF è stata convertita in una struttura mol2 utilizzando il software OpenBabel. Le strutture proteiche PDB con la risoluzione più alta e le più lunghe di JNK1 e JNK2 sono state scaricate dai database Uniprot e Protein Data Bank. Idrogenazione, rimozione dei ligandi e aggiunta completa di idrogeno sono state effettuate sulle proteine macromolecolari, mentre l'aggiunta completa di idrogeno e il carico elettronico sono stati effettuati su piccoli composti molecole, e sono stati stabiliti legami di torsione. Sono stati condotti esperimenti di aggancio molecolare tramite AutoDock Vina, dove affinità di legame ≤ -7,0 kcal/mol sono state definite come indicative di forti interazioni ligando-proteina. PyMol è stato utilizzato per visualizzare la struttura 3D del complesso di attracco, e Discovery Studio è stato impiegato per visualizzare la struttura 2D del complesso di attracco.

Analisi statistica

Tutti gli esperimenti furono ripetuti tre volte indipendentemente. GraphPad Prism 8 veniva utilizzato per analizzare e graficizzare tutti i dati in modo statistico. I dati sono stati tutti mostrati come media ± deviazione standard (SD). Il test t di Student è stato utilizzato per confronti tra due gruppi. Per confronti tra più gruppi nello stesso momento o analisi temporali all'interno dello stesso gruppo, è stata utilizzata ANOVA unidirezionale. P < 0,05 è stato considerato indicativo di un²⁵ statisticamente significativo.

Risultati

Risultati ECG dei ratti dopo Acon Gavage

Studi precedenti hanno dimostrato che gli effetti tossici dell'Aconitina si manifestano nella fase iniziale, tipicamente entro poche ore dalla^{somministrazione. 26,27}. Pertanto, per catturare la prima occorrenza e progressione della cardiotossicità acuta entro questa finestra temporale, abbiamo selezionato tre punti temporali: 1 ora, 3 ore e 6 ore per gli esperimenti. I risultati dell'elettrocardiogramma hanno mostrato che dopo 1, 3 ore e 6 ore di azione Acon, non si sono verificate aritmie nel gruppo di controllo e nel gruppo Acet, e i cambiamenti ECG non erano evidenti. I ratti del gruppo Acon-1mg hanno avuto rispettivamente contrazioni ventricolari precoci e bigemina ventricolare precoce, triplo precoce del ventricolo, tachicardia ventricolare a breve scoppio, tachicardia ventricolare monomorfica, tachicardia ventricolare bidirezionale e una o più aritmie ventricolari. I ratti del gruppo Acon-2 mg hanno sviluppato contrazioni ventricolari precoci, una o più aritmie ventricolari, inclusa bigemina ventricolare prematura, tachicardia ventricolare a breve scoppio e tachicardia ventricolare bidirezionale (Figura 1, Figure supplementari 1–2). L'Acon promuove danni patologici miocardici e aumenta la colorazione del collagene nel tessuto miocardico del ratto.

Il tessuto miocardico è stato valutato tramite colorazione HE. I risultati hanno mostrato che, rispetto al gruppo di controllo e al gruppo Acet, dopo 1 ora, 3 e 6 ore di trattamento con Acon, il tessuto miocardico dei ratti SD nel gruppo Acon-1 mg mostrava una rottura parziale delle fibre muscolari miocardiche, disordine delle cellule miocardiche, l'interstizio miocardico si allargava, si verifica edema nell'interstizio miocardico, La maggior parte delle cellule miocardiche è gonfia, i nuclei sono profondamente colorati e condensati, un gran numero di cellule miocardiche subisce degenerazione e vacuoli rotondi si formano nel citoplasma delle fibre miocardiche (indicate da frecce). Le striazioni delle fibre muscolari nel tessuto miocardico dei ratti SD nel gruppo Acon-2 mg erano poco chiare o scomparse; La disposizione dei fasci muscolari era sciolta e disordinata, gli spazi intermuscolari si allargavano, un gran numero di nuclei cellulari era profondamente colorato, la pignosi nucleare, l'edema intercellulare e le cellule miocardiche erano gonfie e degenerate. Il citoplasma delle fibre miocardiche mostrava vacuoli rotondi (mostrati da frecce) (Figura 2A, Figura supplementare 3A, Figura supplementare 4A).

È stata eseguita una colorazione di Masson per valutare la deposizione di collagene nel tessuto miocardico. Nei gruppi Control e Acet, i cardiomiociti hanno mostrato una morfologia normale, con una deposizione minima di collagene osservata nell'interstizio miocardico. Nel gruppo Acon-1 mg sono stati osservati lievi aumenti del collagene colorato di blu in alcune aree interstiziali. Nel gruppo Acon-2 mg, le regioni più estese colorate di blu erano diffuse in tutto il tessuto miocardico, accompagnate da una disposizione disorganizzata del miofilamento e da una rottura della struttura miocardica normale. L'entità della colorazione del collagene nel gruppo Acon-2 mg era maggiore rispetto a quella del gruppo Acon-1 mg. L'analisi quantitativa ha mostrato che la frazione volumetrica di collagene (CVF) era significativamente aumentata sia nei gruppi Acon-1 mg che Acon-2 mg rispetto ai gruppi Control e Acet (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05). In particolare, il valore di CVF ha raggiunto il livello più alto nel gruppo Acon-2 mg a 6 ore dopo la somministrazione intragastrica (Figura 2B, Figura Supplementare 3B, Figura Supplementare 4B). Considerando il breve periodo di osservazione (1–6 ore), questi riscontri sono più propensi a riflettere cambiamenti interstiziali acuti, come edema o alterazioni nei modelli di colorazione del collagene, piuttosto che fibrosi miocardica già stabilita. Inoltre, non è stata rilevante differenza significativa nel peso cardiaco tra i gruppi a 1 ora, 3 e 6 ore dopo il trattamento con Acon-1 mg o Acon-2 mg (Tabella 5).

L'acon promuove enzimi cardiaci e livelli di proteine cardiache nel sangue venoso dei ratti

Per valutare il danno miocardico indotto da Acon, abbiamo misurato i livelli sierici dei marcatori della lesione cardiaca, inclusi CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP. Rispetto ai gruppi Control e Acet, i gruppi Acon-1 mg e Acon-2 mg hanno mostrato livelli significativamente aumentati di CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP a 1 ora, 3 e 6 ore (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05). Inoltre, nello stesso momento, gli aumenti di questi marcatori sono stati più marcati nel gruppo Acon-2 mg rispetto a quello Acon-1 mg (p < 0,05) (Figura 3).

Risultati dell'agganciamento molecolare

Per esaminare ulteriormente l'effetto di Acon sulla via di segnalazione del danno miocardico nei ratti, abbiamo utilizzato il docking molecolare per identificare le proteine della via correlata all'Acon. I risultati dell'aggancio mostrarono che Acon poteva legarsi stabilmente alle sacche attive sia di JNK1 che di JNK2 attraverso molteplici interazioni non covalenti. In JNK1, l'aconitina ha formato due legami a idrogeno convenzionali con ALA267 e SER299, con distanze di legame rispettivamente di 2,0 Å e 2,1 Å, indicando forti interazioni direzionali che contribuiscono all'ancoraggamento dei ligandi. Inoltre, sono state osservate estese interazioni di van der Waals tra Aconitina e residui circostanti, facilitando una stretta complementarità spaziale all'interno della tasca di legame. Le interazioni idrofobe, incluse le interazioni Alchilo/π-Alchile con ILE304, hanno ulteriormente stabilizzato il ligando all'interno del microambiente idrofobico. Sono stati inoltre identificati legami carbonio-idrogeno, formando una rete di interazione cooperativa che supporta il legame dei liganti (Figura 4A–C). In JNK2, l'aconitina ha formato un legame a idrogeno convenzionale con LEU302 (2,1 Å), fungendo da interazione chiave di ancoraggio. Similmente a JNK1, le interazioni di van der Waals, le interazioni idrofobe e i legami carbonio-idrogeno hanno contribuito collettivamente alla stabilizzazione del complesso ligando–proteina (Figura 4D–F). I risultati dell'agganciamento per i composti testati sono riportati come punteggi di legame (kcal/mol) e presentati nella Tabella 6. Nel complesso, il legami a idrogeno ha fornito specificità e ancoragge, le interazioni idrofobiche hanno aumentato l'inglobamento dei liganti e l'affinità di legame, e le interazioni di van der Waals hanno contribuito alla stabilità complessiva complessiva. Questi risultati indicano che l'aconitina può formare complessi stabili sia con JNK1 che con JNK2, supportando il suo potenziale come agente di targeting.

Acon sovraregola il livello di fosforilazione del JNK

Per approfondire l'effetto di Acon sulla via di segnalazione JNK nel tessuto miocardico, l'espressione della fosforilazione di JNK1/2 è stata valutata tramite Western blotting. Rispetto ai gruppi Control e Acet, i gruppi Acon-1 mg e Acon-2 mg hanno mostrato livelli significativamente aumentati di p-JNK1/2 (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05). Inoltre, il livello di fosforilazione di JNK1/2 era significativamente più alto nel gruppo Acon-2 mg rispetto al gruppo Acon-1 mg (p < 0,05) (Figura 5A). All'interno del gruppo Acon-2 mg, confronti tra diversi momenti temporali hanno mostrato che i livelli di p-JNK1/2 sono aumentati significativamente a 1 ora, 3 ore e 6 ore, con il livello più alto osservato a 6 ore (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05) (Figura 5B). Sulla base di questi risultati, il gruppo Acon-2 mg a 6 ore è stato selezionato per gli esperimenti successivi.

L'inibitore JNK allevia i danni patologici miocardici e la colorazione del collagene nel tessuto miocardico del ratto

Per valutare ulteriormente il ruolo regolatore della via di segnalazione JNK, i livelli di espressione di p-JNK1 e p-JNK2 nel tessuto miocardico sono stati valutati tramite Western blotting. Rispetto ai gruppi di controllo e DMSO, il gruppo Acon ha mostrato livelli di espressione significativamente aumentati di p-JNK1 e p-JNK2 (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05). Rispetto al gruppo Acon, il gruppo Acon+SP600125 ha mostrato livelli significativamente diminuiti di p-JNK1 e p-JNK2 (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05). Al contrario, rispetto al gruppo Acon+SP600125, il gruppo Acon + Anis ha mostrato livelli di espressione significativamente aumentati di p-JNK1 e p-JNK2 (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05) (Figura 6).

Gli effetti di Anis e SP600125 sul danno miocardico sono stati ulteriormente studiati. I risultati della colorazione con HE mostrarono che, rispetto al gruppo Acon, l'edema interstiziale del tessuto miocardico nel gruppo Acon+SP600125 era ridotto, il gonfiore di alcuni cardiomiociti scompariva e il citoplasma cellulare era uniforme. Lo spazio muscolare è pieno, lo spazio intermuscolare si assottiglia, alcune fibre miocardiche sono disposte in modo stretto e ordinato, un piccolo numero di nuclei cellulari è profondamente colorato e il citoplasma delle fibre miocardiche mostra piccole vacuole rotonde, alleviando il danno patologico miocardico. Rispetto al gruppo Acon+SP600125, il gruppo Acon + Anis presentava fibre miocardiche rotte, spazi muscolari allargati, fibre miocardiche disposte in modo lasco e disordinato, cellule miocardiche gonfie e degenerate, cromatina nucleare profondamente colorata e si è verificato edema intercellulare (Figura 7A).

La colorazione di Masson è stata eseguita per valutare la colorazione del collagene nel tessuto miocardico. Nel gruppo Acon+SP600125 sono state osservate aree moderatamente colorate di blu nell'interstizio miocardico. Rispetto al gruppo Acon, la frazione volumetrica di collagene (CVF) nel gruppo Acon+SP600125 era significativamente ridotta, indicando un'attenuazione dei cambiamenti interstiziali indotti dall'Aconitina. Al contrario, nel gruppo Acon + Anis sono state osservate aree di collagene colorate di blu più estese nell'interstizio miocardico rispetto al gruppo Acon+SP600125, accompagnate da un aumento significativo del CVF (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05) (Figura 7B). Inoltre, non c'è stata una differenza significativa nel peso cardiaco tra i gruppi (Tabella 5). Considerando il breve periodo di osservazione (1–6 ore), questi cambiamenti sono più propensi a riflettere alterazioni interstiziali acute, come edema o cambiamenti nei modelli di colorazione del collagene, piuttosto che fibrosi miocardica consolidata. Questi risultati suggeriscono che SP600125 allevia la lesione miocardica indotta da aconitina, mentre l'anisomicina aggrava ulteriormente i danni miocardici in queste condizioni sperimentali.

L'inibitore del JNK allevia l'espressione di enzimi cardiaci e proteine cardiache nel siero del ratto

I risultati di ELISA hanno mostrato che, rispetto al gruppo Acon, le espressioni di CK-MB, AST e LDH sono state significativamente ridotte nel gruppo Acon + SP600125, mentre le espressioni di CK-MB, AST e LDH sono aumentate dopo l'azione di Anis (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05). Inoltre, rispetto al gruppo Acon, l'espressione di cTn-I e h-FABP è stata significativamente ridotta nel gruppo Acon + SP600125 (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05). Rispetto al gruppo Acon + SP600125, l'espressione di cTn-I e h-FABP è aumentata significativamente nel gruppo Acon + Anis (n = 3 ratti per gruppo, ANOVA unidirezionale, p < 0,05) (Figura 8A–8B).

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

Tutti i dati grezzi utilizzati in questo studio sono disponibili nei file supplementari allegati al manoscritto.

Figura 1: Illustrazione elettrocardiografica dell'aritmia nei ratti (dopo 6 ore di azione Acon). Dall'alto verso il basso, il gruppo di controllo, il gruppo Acet, il gruppo Acon-1 mg e il gruppo Acon-2 mg. Tipi di aritmie in Acon-1mg-A-gavage e Acon-2 mg-A-gavage (in ordine di comparsa delle aritmie dall'alto verso il basso): Acon-1mg-A-gavage: contrazioni ventricolari precoce; bigemina ventricolare precoce; tachicardia ventricolare bidirezionale. Acon-2 mg-A-gavage: contrazioni ventricolari precoce; bigemina ventricolare precoce; breve scoppio di tachicardia ventricolare. Abbreviazioni; B-gavage = Prima di Acon gavage; A-gavage = Dopo Acon gavage. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Danni miocardici e colorazione al collagene nel tessuto miocardico del ratto indicati dalla colorazione HE e Masson. (A) I cambiamenti patologici nel tessuto miocardico del ratto sono stati rilevati tramite colorazione HE (la freccia gialla indica i vacuoli rotondi formati dai cardiomiociti danneggiati); barra di squama = 100 μm. (B) La colorazione del collagene nel tessuto miocardico del ratto è stata rilevata tramite colorazione di Masson; scala = 50 μm. Media ± DS, n = 3. Tutti i valori P sono stati calcolati utilizzando un'analisi indipendente unidirezionale della varianza. *p < 0,05, **p < 0,01. 40x e 400x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: I livelli di CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP nel siero dei ratti indicavano danni miocardici. (A–F). I livelli di CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP sono stati misurati utilizzando kit ELISA. Media±SD, n = 3. Tutti i valori p sono stati calcolati utilizzando un'analisi indipendente unidirezionale della varianza. *p < 0,05, **p < 0,01. Abbreviazioni; CK-MB = Creatina chinasi-MB; AST = Aspartato aminotransferasi; LDH = Lattato deidrogenasi; cTn-I = Troponina cardiaca I; H-FABP = proteina legante degli acidi grassi di tipo cardiaco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati dell'aggancio molecolare di Acon con la via JNK. (A–B) e (D–E) I diagrammi di interazione 2D di Acon con la proteina JNK1/2. (C) e (F) I diagrammi di interazione 3D di Acon con la proteina JNK1/2. Abbreviazioni; JNK = c-Jun N-terminale chinasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Acon aumenta il livello di fosforilazione del JNK. (A–B) I livelli di espressione di p-JNK1/2 e JNK1/2 nei tessuti miocardici dei ratti sono stati rilevati tramite Western blotting. Media ± DS, n = 3. Tutti i valori p sono stati calcolati utilizzando un'analisi indipendente unidirezionale della varianza. *p < 0,05, *p < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: L'inibitore del JNK inibisce la fosforilazione del JNK indotta dall'Acon. I livelli di espressione di p-JNK1/2 e JNK1/2 nei tessuti miocardici dei ratti sono stati rilevati tramite Western blotting. Media ± DS, n = 3. Tutti i valori p sono stati calcolati utilizzando un'analisi indipendente unidirezionale della varianza. *p < 0,05, **p < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: L'inibitore del JNK allevia i danni patologici miocardici e la colorazione del collagene nei ratti. (A) I cambiamenti patologici nei tessuti miocardici dei ratti sono stati rilevati tramite colorazione HE (la freccia gialla mostra i vacuoli rotondi formati dai cardiomiociti danneggiati); scala = 100 μm. (B) La colorazione al collagene nel tessuto miocardico del ratto è stata rilevata tramite colorazione di Masson; scala = 50 μm. Media±SD, n = 3. Tutti i valori p sono stati calcolati utilizzando un'analisi indipendente unidirezionale della varianza. *p < 0,05, **p < 0,01. 40 e 400x. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8: L'inibitore JNK regola al basso i livelli di CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP nel siero per ratti. (A–B) I livelli di espressione di CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP sono stati rilevati dai kit di analisi ELISA. Tutti i valori p sono stati calcolati utilizzando un'analisi indipendente unidirezionale della varianza. Media±SD, n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Abbreviazioni; CK-MB = creatina chinasi-MB; AST = aspartato aminotransferasi; LDH = lattato deidrogenasi; cTn-I = troponina cardiaca I; H-FABP = proteina legante degli acidi grassi di tipo cardiaco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	Controllo	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Ratti	9	9	9	9
Numero di morti di ratti	0	0	0	0

Tabella 1: Numero di morti di ratti dopo 1 ora di azione Acon. Un'ora dopo la somministrazione di Acon, nessun ratto è morto nel gruppo di controllo, gruppo Acet, gruppo Acon-1 mg e gruppo Acon-2 mg. (Il numero di animali infine inclusi nell'analisi per gruppo era 3, e i ratti morti non furono sostituiti).

	Controllo	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Ratti	9	9	9	9
Numero di morti di ratti	0	0	0	0

Tabella 2: Numero di morti di ratti dopo 3 ore di azione Acon. 3 ore dopo la somministrazione di Acon, nessun ratto è morto nel gruppo di controllo, gruppo Acet, gruppo Acon-1 mg e gruppo Acon-2 mg. (Il numero di animali infine inclusi nell'analisi per gruppo era 3, e i ratti morti non furono sostituiti).

	Controllo	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Ratti	9	9	9	9
Numero di morti di ratti	0	0	4	4

Tabella 3: Numero di morti di ratti dopo 6 ore di azione Acon. 6 ore dopo la somministrazione di Acon, 4 ratti su 9 sono morti nel gruppo Acon-1 mg, e 4 su 9 ratti sono morti nel gruppo Acon-2 mg. (Il numero di animali infine inclusi nell'analisi per gruppo era 3, e i ratti morti non furono sostituiti).

	Controllo	DMSO	Acon	Acon + SP600125	Acon + Anis
Ratti	9	9	9	9	9
Numero di morti di ratti	0	0	3	1	3

Tabella 4: Numero di morti di ratti dopo Anis e SP600125 azione. Il numero di morti di ratti variava tra i diversi gruppi di trattamento: nel gruppo Acon-2 mg, 3 ratti su 9 sono morti; nel gruppo Acon+SP600125, 1 ratto su 9 morì; e nel gruppo Acon + Anis, 3 ratti su 9 sono morti. (Il numero di animali infine inclusi nell'analisi per gruppo era 3, e i ratti morti non furono sostituiti).

Gruppo	Peso cardiaco (g)
Controllo	0,71 ± 0,03
Acet	0,73 ± 0,02
Acon-1mg (1 ora)	0,73 ± 0,06
Acon-2mg (1 ora)	0,75 ± 0,02
Acon-1mg (3 h)	0,71 ± 0,04
Acon-2mg (3 ore)	0,77 ± 0,03
Acon-1mg (6 h)	0,72 ± 0,03
Acon-2mg (6 h)	0,77 ± 0,02
DMSO	0,70 ± 0,03
Acon + SP600125	0,74 ± 0,03
Acon + Anis	0,75 ± 0,04

Tabella 5: Il peso del cuore dei ratti. Non c'è stata una differenza significativa nel peso cardiaco tra i gruppi.

Ligando	JNK1	JNK2
Acon	-7,8 Kcal/mol	-8,41 Kcal/mol

Tabella 6: Risultati degli studi di aggancio molecolare. I punteggi di aggancio tra Acon e JNK1 sono -7,8 Kcal/mol, e i punteggi di aggancio tra Acon e JNK2 sono -8,41 Kcal/mol.

Figura supplementare 1: Illustrazione elettrocardiografica dell'aritmia nei ratti (dopo 1 ora di azione Acon). Dall'alto verso il basso, il gruppo di controllo, il gruppo Acet, il gruppo Acon-1 mg e il gruppo Acon-2 mg. Tipi di aritmie in Acon-1mg-A-gavage e Acon-2 mg-A-gavage (in ordine di comparsa delle aritmie dall'alto verso il basso): contrazioni ventricolari precoci; bigemina ventricolare precoce; triplo ventricolare prematuro; tachicardia ventricolare a breve scoppio; tachicardia battito ventricolare monomorfico; tachicardia ventricolare bidirezionale. Acon-2 mg-A-gavage: Tachicardia ventricolare bidirezionale. Abbreviazioni; B-gavage = Prima di Acon gavage; A-gavage = Dopo Acon gavage. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Illustrazione elettrocardiografica dell'aritmia nei ratti (dopo 3 ore di azione di Acon). Dall'alto verso il basso, il gruppo di controllo, il gruppo Acet, il gruppo Acon-1 mg e il gruppo Acon-2 mg. Tipi di aritmie in Acon-1mg-A-gavage e Acon-2 mg-A-gavage (in ordine di comparsa delle aritmie dall'alto verso il basso): contrazioni ventricolari precoce; brevi scatti di tachicardia ventricolare; tachicardia ventricolare bidirezionale. Acon-2 mg-A-gavage: contrazioni ventricolari precoci; tachicardia ventricolare bidirezionale. Abbreviazioni; B-gavage = Prima di Acon gavage; A-gavage = Dopo Acon gavage. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Acon promuove danni miocardici e colorazione del collagene dopo 1 ora di azione di Acon. (A) I cambiamenti patologici nei tessuti miocardici del ratto sono stati rilevati tramite colorazione HE (Nota: la freccia gialla mostra i vacuoli rotondi formati dai cardiomiociti danneggiati); scala = 100 μm. (B) La fibrosi nel tessuto miocardico del ratto è stata rilevata tramite colorazione di Masson; scala = 50 μm. Media ± DS, n = 3. Tutti i valori p sono stati calcolati utilizzando un'analisi indipendente unidirezionale della varianza. *p < 0,05, **p < 0,01, 40x e 400x. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Acon favorisce danni miocardici e colorazione del collagene dopo 3 ore di azione Acon. (A) I cambiamenti patologici nei tessuti miocardici del ratto sono stati rilevati tramite colorazione HE (la freccia gialla mostra i vacuoli rotondi formati dai cardiomiociti danneggiati); scala = 100 μm. (B) La colorazione al collagene nel tessuto miocardico del ratto è stata rilevata tramite colorazione di Masson; scala = 50 μm. Media ± DS, n = 3. Tutti i valori p sono stati calcolati utilizzando un'analisi indipendente unidirezionale della varianza. *p < 0,05, **p < 0,01. 40x e 400x. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

L'acon può indurre aritmie e danni miocardici; tuttavia, i meccanismi sottostanti del danno miocardico indotto da Acon rimangono poco chiari. In questo studio è stato con successo stabilito un modello ratto di avvelenamento acuto da Acon con lesione miocardica. Questi risultati hanno dimostrato che l'attivazione della via di segnalazione JNK può rappresentare un meccanismo chiave a valle nel danno miocardico indotto dall'avvelenamento acuto da Acon. In particolare, i livelli di fosforilazione di JNK1/2 erano significativamente elevati nei ratti con aritmie e danni miocardici indotti da Acon. Inoltre, l'inibizione della via JNK ha parzialmente invertito il danno miocardico causato dall'avvelenamento acuto da Acon. Questi risultati suggeriscono che l'attivazione della via JNK svolge un ruolo importante nella patogenesi del danno miocardico indotto dall'aconitina.

La principale causa di morte per avvelenamento acuto da Acon è la cardiotossicità. Studi precedenti hanno dimostrato che dopo il trattamento con Acon, le fibre miocardiche nei ratti diventavano degenerate e disordinate, la colorazione nucleare si approfondiva, si verificava l'infiltrazione dei neutrofili e apparivano vacuoli^{rotondi 28}. È coerente con i risultati della ricerca. La colorazione con HE ha rivelato che il tessuto miocardico nel gruppo trattato con Acon mostrava cambiamenti patologici, tra cui disordine dell'organizzazione del fascio muscolare, allargamento degli spazi muscolari e rottura delle fibre muscolari. Inoltre, in condizioni normali, gli enzimi cardiaci CK-MB, AST, LDH e le proteine cardiache cTn-I e h-FABP si trovano in quantità molto piccole nel^{siero 29}. Quando le cellule miocardiche vengono danneggiate, questi marcatori verranno rilasciati nel sangue in grandi quantità 30,31,32,33.

I risultati di questo studio mostrano che CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP nel siero venoso dei ratti del gruppo Acon Gavage aumentarono in misura variabile a ogni momento di osservazione. Il livello di espressione è più alto dopo 6 ore nella somministrazione intragastrica. Questo risultato è coerente con studi^{precedenti 34}. Hanno riscontrato che Acon causava danni ai cardiomiociti H9C2 dei ratti e aumentava i livelli di AST. Nel frattempo, studi precedenti hanno utilizzato Acon per indurre danni miocardici nei ratti per studiare gli effetti degli antidoti sul danno^{miocardico 35}. Hanno riscontrato che i livelli di LDH e CK-MB nel siero dei ratti con danni miocardici erano elevati. In breve, i risultati sperimentali della rilevazione articolare dei marcatori di danno miocardico mostrano che il modello ratto di danno miocardico indotto da avvelenamento acuto da Acon può essere stabilito con successo 1, 3 e 6 ore dopo la somministrazione intragastrica di 1–2 mg/kg di Acon. L'effetto modellativo di 2 mg/kg di Acon dopo somministrazione intragastrica per 6 ore è il migliore, soddisfacendo i requisiti degli esperimenti successivi.

Gli studi hanno rilevato che l'effetto di Acon sui canali ionici Na⁺ e Ca²⁺ porta a un aumento della concentrazione intracellulare di ioni calcio, che attiva ulteriormente la via di segnalazione P38-MAPK e successivamente innesca la reazione a cascata^{JNK 36,37,38}. L'attivazione del JNK favorirà il danno^{miocardico 39,40}. Questo è coerente con i risultati di questo esperimento. In questo studio, abbiamo scoperto che Acon ha promosso la fosforilazione di JNK1/2 nei cardiomioci e attivato la via di segnalazione JNK. Ciò suggerisce che l'attivazione del JNK possa rappresentare una risposta di segnalazione a valle che contribuisce al danno miocardico indotto dall'aconitina. Tuttavia, i meccanismi molecolari e farmacocinetici alla base della stimolazione della fosforilazione JNK1/2 da parte di Acon richiedono ulteriori indagini.

Gli studi hanno dimostrato che quando una grande quantità di JNK1/2 viene fosforilata, la via di segnalazione JNK viene attivata, il che a sua volta media l'espressione incontrollata dei geni nel nucleo dei cardiomiociti e interrompe il ciclo cellulare. L'inibizione della via di segnalazione JNK può alleviare i danni miocardici ^41,42. Nei risultati dell'HE, l'inibitore della via JNK SP600125 può ridurre significativamente i cambiamenti patologici nel tessuto miocardico indotti dall'Acon. Nel frattempo, studi precedenti hanno dimostrato che, in un modello ratto di infarto acuto indotto da legatura coronarica, le fibre di collagene colorate di blu e la deposizione di collagene nel tessuto miocardico erano notevolmente aumentate, accompagnate dall'attivazione della via di segnalazione JNK. Il trattamento con granuli di medicina tradizionale cinese ha ridotto la deposizione miocardica di collagene tramite l'inibizione della via di segnalazione JNK^43,44.

Nei ratti con lesione miocardica diabetica, il contenuto di fibre di collagene (colorazione blu) e la frazione volumetrica di collagene (CVF) sono stati significativamente aumentati. Contemporaneamente, è stato attivato il percorso di segnalazione JNK. È stato riportato che l'etanolo a basso dosaggio inibisce l'attivazione della via JNK, attenuando così l'aumento della deposizione di fibre di collagene e della CVF nel tessuto miocardico del^{ratto 45}. Nel presente studio, l'analisi del docking molecolare ha indicato che l'aconitina potrebbe interagire con JNK1 e JNK2 attraverso molteplici interazioni non covalenti; tuttavia, questi risultati dovrebbero essere considerati prove a sostegno e non costituiscono una prova diretta di legame fisiologico. Inoltre, esperimenti in vivo hanno dimostrato che Acon, in quanto stressore, ha aumentato la fosforilazione di JNK1/2, attivando così la via di segnalazione JNK. Questa attivazione era associata a un aumento della deposizione di collagene (colorazione blu) e a un aumento del CVF nel tessuto miocardico del ratto, portando infine a danni miocardici. Tuttavia, l'aggiunta dell'inibitore JNK ha SP600125 inibito significativamente gli effetti tossici dell'Acon, riducendo l'aumento del valore di CVF nel tessuto miocardico. Il danno miocardico interrompe l'integrità normale della membrana miocitaria cardiaca e la perdita di contenuto intracellulare nello spazio extracellulare, che si manifesta come un aumento dei livelli di enzimi miocardici nel^{sangue 46,47}. Questi risultati hanno mostrato che l'aumento dei livelli di enzimi miocardici nel sangue dei ratti indicava anche che l'Acon causava danni miocardici. Allo stesso tempo, gli inibitori del JNK inibivano la secrezione degli enzimi miocardici, suggerendo che gli inibitori del JNK potessero alleviare parzialmente i danni miocardici causati dall'Acon.

Devono essere riconosciute diverse limitazioni di questo studio. Innanzitutto, la dimensione del campione in ogni momento era relativamente piccola (n = 3 per gruppo), il che può limitare la potenza statistica delle analisi, e non è stata eseguita alcuna analisi formale di potenza prima della determinazione della dimensione del campione. Inoltre, sono stati valutati solo un singolo intervallo di dose di Aconitina e periodi di osservazione relativamente brevi (1–6 ore), il che ha limitato la valutazione dei cambiamenti patologici a lungo termine e delle relazioni di risposta alla dose. In secondo luogo, sebbene l'aumento della fosforilazione di JNK1/2 e l'intervento farmacologico suggerissero il coinvolgimento della via di segnalazione JNK nella lesione miocardica indotta da Aconitina, i meccanismi a monte che collegano l'esposizione all'Aconitina all'attivazione di JNK non sono stati completamente studiati. L'aconitina è nota per colpire principalmente i canali Na⁺ voltage-dipendenti e l'omeostasi intracellulare Ca²⁺, che può contribuire all'attivazione a valle del JNK. Tuttavia, eventi di segnalazione correlati, inclusi lo stress ossidativo e le vie di sovraccarico di calcio, non sono stati esaminati direttamente nel presente studio. In terzo luogo, l'analisi del docking molecolare ha fornito solo prove di supporto per potenziali interazioni tra Aconitina e JNK1/2 e non ha rappresentato un legame fisiologico diretto. Non è stata effettuata alcuna validazione sperimentale aggiuntiva, come la risonanza plasmonica superficiale o i saghi pull-down. Inoltre, sono stati studiati solo JNK1/2, mentre il ruolo potenziale di JNK3 nella cardiotossicità indotta da aconitina rimane incerto. Infine, non è stata effettuata una valutazione elettrocardiografica dopo SP600125 o intervento con anisina. Pertanto, è necessario approfondire ulteriori indagini se la regolazione della via JNK influenzi direttamente le aritmie ventricolari indotte dall'aconitine.

In sintesi, Acon attiva la via di segnalazione JNK, come dimostrato dall'aumento della fosforilazione di JNK1/2, che può contribuire a danni miocardici, come indicato da un aumento della deposizione di collagene e da un aumento del rilascio di enzimi cardiaci nel tessuto miocardico del ratto. Considerando che la cardiotossicità indotta dall'aconitina coinvolge molteplici eventi a monte, tra cui l'attivazione del canale Na⁺, il sovraccarico di Ca²⁺ e lo stress ossidativo, l'attivazione della via JNK può rappresentare un evento chiave di segnalazione a valle che contribuisce al danno miocardico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4% Paraformaldeide	Wuhan Service-bio Co., Ltd.	HJ203501	Fissazione dei tessuti
Aconitine (Acon)	Chengdu DeSiTe Biological Technology Co., Ltd.	DRK-0335-960330	Composto tossico per il modello gavage
Soluzione blu di anilina	Beijing Solarbio Co., Ltd.	G1350	Colorazione di massone
Anisomicina (Anis)	MedChemExpress Co., Ltd.	153154	Attivatore/controllo del percorso JNK
AST ELISA Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E13023r	Rilevamento degli enzimi cardiaci
AutoDock Vina	Open-source	N/A	Aggancio molecolare
Kit per il test proteico BCA	Sangon Biotech (Shanghai, Cina)	Non specificato	Quantificazione delle proteine
Centrifuga	Dongguan cnzcn Co., Ltd.	TD5M-WS	1000 e volte; Centrifugazione g
Chem3D Software	PerkinElmer	N/A	Minimizzazione dell'energia del ligando
CK-MB ELISA Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E14403r	Rilevamento degli enzimi cardiaci
Kit cTn-I ELISA	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E08594r	Rilevamento delle proteine cardiache
Ago usa e getta per la raccolta del sangue venoso	KINDLY Co., Ltd.	https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html	Raccolta del sangue
Reagente di Chimiluminescenza Potenziata (ECL)	Millipore Co., Ltd.	21302A4	Visualizzazione del western blot
Eosina	Beijing Solarbio Co., Ltd.	20200905	H& Colorazione E
GraphPad Prism 8	GraphPad Software, Inc.	N/A	Analisi statistica
Ematossilina	Wuhan Service-bio Co., Ltd.	CR2203066	H& Colorazione E
Kit h-FABP ELISA	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E16184r	Rilevamento delle proteine cardiache
ImageJ Software	Istituti Nazionali di Salute (NIH)	N/A	Quantificazione del Western blot
Anticorpo primario JNK1/2	HuaAn Biotechnology (Hangzhou, Cina)	ET1609-42	Anticorpo Western blot
LDH ELISA Kit	Biotecnologia Collegata agli Enzimi di Shanghai	ml003416	Rilevamento degli enzimi cardiaci
Soluzione Masson Blue	Beijing Solarbio Co., Ltd.	20220303	Colorazione di massone
Lettore di microplacche	Thermo Fisher Scientific	ME001000C	Misurazione dell'OD ELISA (450 nm)
Microscopio ottico (Olympus C33)	Olympus (Tokyo, Giappone)	C33	Imaging istologico
Cera di paraffina	Leica  Co., Ltd.	2110068	Incassamento dei tessuti
PBST Buffer	Meilunbio Co., Ltd.	MA0015-Apr-27G2	Tampone di lavaggio
anticorpo primario p-JNK1/2	HuaAn Biotechnology (Hangzhou, Cina)	ET1601-28	Anticorpo JNK fosforilato
Banca Dati Proteiche (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	Fonte della struttura proteica
Kit di estrazione proteica	Sangon Biotech (Shanghai, Cina)	C510003-0050	Estrazione delle proteine tissutali
PubChem Database	NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov	Sorgente della struttura del ligando
Membrana PVDF	Millipore Co., Ltd.	R1PB81493	Membrana di trasferimento Western blot
PyMOL	Schrö dinger, Inc.	https://pymol.org/	Visualizzazione dell'attracco
Gel SDS-PAGE (10%)	Beijing Solarbio Co., Ltd.	817X031	Elettroforesi proteica
Latte in polvere scremato	Beijing Solarbio Co., Ltd.	http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/	Reagente bloccante (5%)
Pentobarbital Sodio	Thermo Fisher Scientific Inc.	57-33-0	Anestetico per procedure animali
SP600125 (inibitore JNK)	MedChemExpress Co., Ltd.	112518	Inibitore della via JNK
Struttura di alloggio per animali SPF	Università Medica di Kunming	N/A	Condizioni di alloggio degli animali
Sprague-Dawley Rats (maschio, 2 mesi, ~230 g)	Beijing Huafukang Biological Technology Co., Ltd.	http://www.hfkbio.com/	Animali sperimentali (n = 51)
Weigert Iron Hematoxylin	Guangzhou Wexis Co., Ltd.	18092001	Colorazione di massone
Xylene	Tianjin Tjhxsj Co., Ltd.	20220208	Pulizia dei tessuti