Isolamento robusto e identificazione multiplexata di cellule rare circolanti tramite microfluidica centrifuga continua e immunocitochimica idrogel

Sommario

Questo studio presenta un flusso di lavoro centrifugo microfluidico continuo per l'isolamento e l'identificazione efficiente delle cellule rare circolanti. Il sistema consente un controllo preciso dei liquidi e minimizza la perdita cellulare, consentendo un'analisi simultanea di più sottotipi di CRC, inclusi CTC e cCAF, per una migliore accuratezza diagnostica.

Abstract

Le cellule rare circolanti (CRC), incluse le cellule tumorali circolanti (CTC) e i fibroblasti associati al cancro circolante (cCAF), sono biomarcatori promettenti per la diagnosi e la prognosi del cancro. Tuttavia, la loro abbondanza estremamente bassa e l'eterogeneità fenotipica rendono l'isolamento efficiente e l'analisi multiparametrica tecnicamente impegnative. Qui presentiamo un flusso di lavoro centrifugo microfluidico continuo per l'isolamento e l'identificazione sequenziale dei CRC dal sangue intero. La cartuccia è composta da cinque camere interconnesse con valvole controllabili che consentono una gestione precisa del gradiente di densità, del mezzo e degli strati di sangue durante la centrifugazione. Basandosi su una piattaforma di arricchimento precedentemente validata, il flusso di lavoro attuale integra l'immobilizzazione cellulare a base di idrogel con immunocitochimica multiplexata per supportare l'identificazione a valle e la caratterizzazione di più sottotipi di CRC, inclusi CTC e cCAF. Dopo l'isolamento, le cellule vengono immobilizzate all'interno di una matrice idrogel per supportare la ritenzione cellulare durante immunocolorazioni ripetute e analisi basate su imaging. Utilizzando questo flusso di lavoro, sia i CTC che i cCAF sono stati identificati dallo stesso campione, dimostrando la fattibilità di un'analisi integrata di più popolazioni di cellule rare circolanti all'interno di un unico flusso di lavoro di biopsia liquida. Questa piattaforma offre un approccio pratico e riproducibile per la caratterizzazione a valle di cellule rare in applicazioni di biopsia liquida.

Introduzione

Le cellule rare circolanti (CRC) sono definite come cellule che esistono nel flusso sanguigno a frequenze estremamente basse rispetto ai componenti sanguigni normali come i globuli rossi, i globuli bianchi e le piastrine. I CRC hanno origine da fonti diverse, come sottoprodotti di processi biologici, rimodellamento dei tessuti, guarigione di ferite o lesioni vascolari. Esempi rappresentativi includono cellule endoteliali circolanti, cellule fetali circolanti, megacariociti, eritrotastri e varie cellule progenitrici o^{staminali 1,2}. Sebbene la sola esistenza delle CRC non rifletta necessariamente uno stato patologico, livelli elevati indicano frequentemente condizioni fisiologiche o patologiche^{anomale 3,4}. Di conseguenza, la rilevazione e la caratterizzazione sensibile dei CRC forniscono preziose informazioni sui processi fisiologici e patologici dinamici che avvengono all'interno del corpo.

Tra i sottotipi di CRC, le cellule tumorali circolanti (CTC) e i fibroblasti associati al cancro circolante (cCAF) sono biomarcatori principali del cancro. Le CTC forniscono prove dirette della diffusione delle cellule tumorali e sono ampiamente^{studiate 5}. I cambiamenti nell'enumerazione della CTC sono spesso associati a una diagnosi precoce, alla prognosi e al monitoraggio della risposta^{terapeutica 6}. Parallelamente, i cCAF rappresentano componenti stromali rilasciate nel flusso sanguigno, riflettendo le interazioni tra microambiente tumorale e la formazione della nicchia^{premetastatica 7}. Tuttavia, rispetto ai CTC, la ricerca sui cCAF rimane limitata e la loro utilità clinica sta solo iniziando^{a essere esplorata.}

Le CTC e i cCAF possono fornire informazioni biologiche complementari nella biopsia liquida, poiché i CTC riflettono la diffusione delle cellule tumorali e i tratti metastatici, mentre i cCAF possono rappresentare segnali di progressione stromali e microambienti tumorali associati. L'analisi simultanea di queste due popolazioni circolanti di cellule rare può quindi supportare una comprensione più integrata della progressione del cancro rispetto all'analisi di entrambe le popolazioni da sola. Tuttavia, la loro utilità clinica e traslazionale è sostanzialmente limitata dalla loro estrema rarità nel sangue periferico, dall'assenza di marcatori universalmente accettati dei cCEF e dalla significativa eterogeneità dell'espressione dei marcatori tra le sottopopolazioni cellulari, che insieme ostacolano un'identificazione affidabile. Pertanto, minimizzare la perdita cellulare durante l'arricchimento e l'identificazione è fondamentale per garantire un'analisi solida e affidabile. Inoltre, la caratterizzazione completa della diversità funzionale e dei marcatori di CTC e cCAF è essenziale per chiarire i loro ruoli nella metastasi e per sviluppare biomarcatori clinicamente^{significativi 8,9}.

Qui presentiamo un metodo per l'isolamento simultaneo di cCAF e^{CTC 10,11}, combinato con l'identificazione multi-marcatore tramite l'incapsulamento con idrogel di immunocitochimica (ICC)¹² con idrogel. Gli attuali metodi di isolamento CRC spesso affrontano limitazioni tecniche, tra cui la perdita cellulare durante il processo a più fasi, la cattura limitata di cellule fenotipicamente eterogenee e il bias di selezione associato a strategie di arricchimento dipendenti dai marcatori. Al contrario, la piattaforma microfluidica centrifuga continua utilizzata in questo studio si basa su un quadro completo di arricchimento, riducendo così la dipendenza dai marcatori convenzionali di selezione positiva. Le prestazioni analitiche e di flusso di lavoro della piattaforma di arricchimento sottostante sono state descritte nei nostri studi^{precedenti 9}.

Basandosi su questa piattaforma validata, il presente studio si concentra sull'integrazione dell'immobilizzazione cellulare a base di idrogel e dell'immunocitochimica multiplexata per consentire l'isolamento e l'identificazione completa di più popolazioni di cellule rare circolanti, inclusi CTC e cCAF, all'interno di un flusso di lavoro unificato. Combinando arricchimento, ritenzione cellulare stabile e analisi ripetuta compatibile con colorazione, questo protocollo fornisce un quadro pratico per l'analisi integrata di cellule rare da campioni di biopsia liquida.

Protocollo

Tutte le procedure che hanno coinvolto campioni di sangue umano da pazienti e donatori sani sono state condotte in conformità con le linee guida del Consiglio di Revisione Istituzionale (IRB) del Severance Hospital. Il protocollo dello studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del Severance Hospital (IRB n. 4-2013-0059). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del dispositivo

1. Premi l'interruttore di accensione per accendere lo strumento.
2. Attiva l'interruttore di blocco laser , poi accendi l'interruttore di alimentazione laser .
3. Avvia il software operativo e conferma che il sistema si inizializza normalmente.
4. Dall'interfaccia software principale, seleziona Operazione dispositivo e scegli il protocollo preimpostato per i campioni standard di sangue intero EDTA.

2. Funzionamento del dispositivo - 1^° passo

NOTA: I dettagli delle posizioni dell'ingresso e della struttura delle cartucce sono mostrati nella Figura 1A.

1. Dall'ingresso 6, aggiungere 2 mL di Reagente A (mezzo del gradiente di densità) alla camera iniziale.
2. Dall'ingresso 8, aggiungere 875 μL di Reagente A alla camera di esaurimento (depletion tube).
3. Monta la cartuccia sul rack dischi, assicurando un giusto equilibrio per la centrifugazione.
4. Premi il pulsante Porta sul CTCeptor per aprire il supporto, poi monta il rack dei dischi sul CTCeptor e fissalo usando le viti di fissaggio.
5. Premi il pulsante Porta per chiudere il supporto e esegui il passo Spin Down usando il software CTCeptor (circa 30 s).
6. Dopo aver verificato che il Reagente A è stato trasferito nella parte inferiore della camera iniziale, rilascia le viti di fissaggio e rimuovi il rack del disco dallo strumento mantenendo la cartuccia montata.

3. Funzionamento del dispositivo - 2^° passo

1. Prima di maneggiare campioni di sangue, esegui tutte le procedure in un armadietto di sicurezza biologica certificato e indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi, in conformità con le linee guida istituzionali per la biosicurezza.
2. Con la cartuccia rimossa dallo strumento, iniettare 3 mL di sangue nella camera iniziale attraverso l'ingresso 6.
3. Monta il rack dischi sul CTCeptor e fissalo usando le viti di fissaggio.
4. Esegui il passaggio di rimozione dei globuli rossi usando il software CTCeptor (circa 40 minuti). Durante questa fase, la centrifugazione separa plasma, globuli rossi e cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) all'interno della cartuccia, e la frazione contenente PBMC viene trasferita nella camera successiva per la successiva depurtazione dei leucociti.
5. Dopo aver completato il passaggio di rimozione dei globuli rossi, rimuovere il rack del disco dallo strumento.

4. Funzionamento del dispositivo - 3^° passo

1. Disinfetta con cura l'area di lavoro per mantenere la sterilità.
2. Vortice il Reagente B (perle di isolamento leucocitari) per garantire una sospensione omogenea.
3. Prepara il tampone di lavaggio mescolando Ca²⁺/^{Mg 2}⁺-free DPBS con 0,1% di BSA e 2 mM EDTA (pH 7,4).
4. Trasferire il volume desiderato del Reagente B in un tubo da 1,5 mL (ad esempio, 50 μL per cartuccia).
5. Aggiungi il buffer di lavaggio a cinque volte il volume del Reagente B e mescola delicatamente pipettando.
6. Posiziona il tubo su un supporto magnetico per 1 minuto per permettere alle sfere nel Reagente B di raccogliersi, poi scartare con cura il soprantantante.
7. Sospezione delle perline nel buffer di lavaggio a un volume pari al volume iniziale delle perline.
8. Conserva le perline a 4 °C fino all'uso.
9. Immediatamente prima dell'uso, mescola 50 μL delle sfere preparate con 50 μL di DPBS e carica 100 μL della miscela nell'ingresso 7.
10. Monta il rack dischi sul CTCeptor e fissalo usando le viti di fissaggio.
11. Esegui il passaggio di rimozione dei globuli branco usando il software CTCeptor (circa 50 minuti). In questo passaggio programmato, le sfere di isolamento dei leucociti cariche vengono miscelate con la frazione contenente PBMC per scuotere per favorire il legame sfera–WBC, seguita dalla rimozione tramite centrifugazione della frazione di globuli WBC legata alla perla.
12. Dopo aver completato il passaggio di rimozione dei WBC, rimuovere il rack del disco dallo strumento.

5. Recupero del campione

1. Inserire una punta di pipetta nell'uscita 9 della camera finale e sospendere il contenuto, poi trasferire il campione raccolto in un tubo da 15 mL.
2. Inietta 2 mL di DPBS nell'uscita 9, risciacqua accuratamente la camera pipettando e trasferisci il lavaggio nello stesso tubo da 15 mL.
3. Ripeti il passaggio di lavaggio due volte.
4. Regola il volume del liquido raccolto nel tubo da 15 mL a 14 mL con DPBS, chiudi il tubo e mescola delicatamente per inversione.
5. Centrifuga il tubo a 380 × g per 4 minuti a temperatura ambiente.
6. Rimuovere con attenzione il surnatante, lasciando circa 1 mL, e utilizzare la sospensione rimanente per l'analisi a valle.

6. Identificazione dei CRC

1. Per preparare il polimero pre-idrogel, si miscela DPBS 2^⁺/Mg^2⁺-libero, soluzione A (HypICC) di immunocitochimica idrogel (HypICC) e Photoinitiator in un rapporto 80:20:1.
2. Mescola 870 μL di sospensione CRC con polimero pre-idrogel da 270 μL.
3. Trasferire la miscela nella camera HypICC e centrifugare a 500 × g per 5 minuti per permettere alle celle di depositarsi sulla piattaforma.
4. Inserire il controller di spessore nella camera HypICC per impostare lo spessore dell'idrogel.
5. Irradiare il campione con luce UV (365 nm) per 20–30 secondi dal fondo per reticolare lo strato di idrogel.
6. Rimuovere il regolatore di spessore e lavare le cellule incapsulate in idrogel tre volte con DPBS.
7. Fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente, poi lavare i campioni tre volte con DPBS, 10 minuti ciascuno.
8. Permeabilizza le cellule con il 0,05% di Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente. Poi lava i campioni tre volte con DPBS, 10 minuti ciascuno.
9. Blocca i campioni con il 2% di BSA per 1 ora a temperatura ambiente.
10. Incubare i campioni con anticorpi primari durante la notte a 4 °C.
11. Lava i campioni cinque volte con DPBS, 20 minuti per lavaggio.
12. Tingi i nuclei con Hoechst per 10 minuti a temperatura ambiente, poi lava i campioni tre volte con DPBS, 10 minuti ciascuno.
13. Se necessario, l'incubazione secondaria degli anticorpi può essere eseguita nelle stesse condizioni notturne dell'incubazione primaria degli anticorpi.
14. Eseguire immagini microscopiche a fluorescenza e identificare i CRC.

7. Immunocolorazione multiplex dei CRC

1. Dopo l'immunocolorazione e l'imaging di immagini, i CRC possono sottoporsi a un ulteriore ciclo di colorazione con anticorpi dopo l'estinzione.
2. Prepara una soluzione di tempra composta da 4,5% di_H2O2 e 24 mM di NaOH in PBS.
3. Rimuovi il DPBS dalla camera HypICC e aggiungi la soluzione di tempra.
4. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente sotto luce bianca con scuotere.
5. Sostituire la soluzione di tempra e incubare per un'ulteriore ora alle stesse condizioni.
6. Lava i campioni quattro volte con DPBS per 10 minuti a ogni lavaggio.
7. Riavvia la procedura di immunocolorazione dalla fase di blocco usando il 2% di BSA.

Risultati

La Figura 1A mostra un'immagine di una singola cartuccia utilizzata per l'isolamento di celle rare. La cartuccia è composta da cinque camere individuali collegate da microcanali e valvole controllabili che regolano il flusso del liquido. La struttura della cartuccia è la seguente: (1) una camera di plasma che raccoglie il plasma separato dal sangue intero; (2) una camera iniziale in cui il sangue intero viene separato in plasma, globuli rossi e strati PBMC; ...

Discussione

I CRC sono biomarcatori importanti con potenziale valore sia per la diagnosi che per la prognosi del cancro. Per migliorare l'utilità clinica dell'analisi CRC, tuttavia, è importante cogliere una gamma più ampia di popolazioni di CRC fenotipicamente diverse e supportare la caratterizzazione multiparametrica^{parallela 13}. Inoltre, crescenti evidenze nell'oncoimmunologia indicano che i componenti immunitari e il microambiente tumorale svolgono ruoli fondamentali nell...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
15 mL Conical Tube	SPL	50015
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovine Serum Albumin	GenDepot	A0100-010
CD45 antibody	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Disc cartridge
CTCD rack	CTCELLS	CTDR-CM3	Disc rack
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagent A	CTCELLS	CTR-S1001	density gradient media
CTR-S Reagent B	CTCELLS	CTR-S1002	leukocyte isolation beads
FAP antibody	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Solution A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Unit	CTCELLS	CTH-V01	HypICC chamber
Latex glove	Ansell	93743080
Magnetic stand			Fabricated in-house using a 3D printer
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
pancytokeratin antibody	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Welegene	LB001-02
SMA antibody	Invitrogen	PA5-18292
Tip, 10 µL	TipOne	9104020333
Tip, 1250 µL	TipOne	9104020740
Tip, 200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA
β actin antibody	abcam	ab8226