Un metodo ottimizzato per isolare l'epitelio uretrale femmina di topo per analisi unicellulare e immunofluorescenza

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo ottimizzato per isolare il rivestimento epiteliale dell'uretra femmina adulta del topo per analisi a valle, inclusi citometria a flusso, immunocolorazione e coltura organoide. I metodi hanno prodotto cellule epiteliali uretrali arricchite e vitali, come dimostrato dall'analisi della citometria a flusso, dall'imaging a montaggio completo e dalla formazione efficiente di organoidi.

Abstract

L'uretra, rivestita da cellule epiteliali, funge da condotto per l'uscita delle urine dal corpo. Il rivestimento epiteliale dell'uretra comprende distinti tipi cellulari con firme geniche indicative di ruoli nella difesa antimicrobica e immunitaria. I macrofagi residenti incastonati nello strato epiteliale uretrale rappresentano un sottotipo trascrizionalmente distinto con ruoli presunti nella sorveglianza immunitaria e nella presentazione degli antigeni. I patogeni urinari risalgono lungo l'uretra fino alla vescica. Uno studio sul rivestimento epiteliale uretrale e sulle cellule immunitarie associate farà luce sui meccanismi di difesa dell'ospite nelle vie urinarie inferiori. Un obiettivo centrale di questo protocollo è fornire metodi ottimizzati per la dissezione dell'uretra femmina del topo e per l'isolamento del rivestimento epiteliale per analisi a valle. Il protocollo descrive un metodo ottimizzato per isolare il tessuto epiteliale dall'uretra femminile del topo tramite una separazione gentile enzimatica e meccanica. Dopo l'isolamento epiteliale, vengono descritti metodi per la digestione enzimatica delicata dell'epitelio uretrale isolato e delle cellule immunitarie associate per ottenere sospensioni monocellulari ad alta vitalità. Il protocollo dettaglia anche metodi per l'analisi della citometria a flusso delle cellule epiteliali uretrali isolate del muro e delle cellule immunitarie associate all'epitelio. Inoltre, qui vengono presentati metodi per generare organoidi epiteliali uretrali 3D stratificati da cellule epiteliali isolate. Il protocollo dettaglia anche un metodo ottimizzato per la tinzione immuno-montata completa delle lastre epiteliali uretrali, che può essere utilizzato per osservare la morfologia e le strutture molecolari dell'epitelio uretrale del topo e delle cellule immunitarie associate. Nel complesso, i metodi descritti qui per l'isolamento e la digestione a singola cellula delle cellule epiteliali uretrali del topo permettono analisi a valle, inclusi immunocolorazione, citometria a flusso, generazione di organoidi e sequenziamento dell'RNA a cellula singola.

Introduzione

Il tratto urinario inferiore del topo (LUT) è composto da due parti: la vescica e l'uretra. Durante le fasi embrionali, le strutture della LUT si sviluppano dalla cloaca, una struttura transitoria derivata dall'endoderma situata nell'intestino caudale. La porzione ventrale della cloaca, il seno urogenitale, forma la vescica anteriormente e l'uretra^{posteriormente 1}. Il rivestimento della vescica è ben studiato. Forma una barriera stretta contro i componenti urinari tramite placche cristalline apicali composte dalle proteine^{uroplaschine 2,3,4}. Sebbene il rivestimento vescicale sia un epitelio di transizione, l'uretra mostra differenze nell'architettura epiteliale dal collo della vescica all'apertura uretrale distale. Inoltre, l'uretra mostra dimorfismo sessuale nelle strutture epiteliali e nell'architettura cellulare. L'uretra maschile del topo è composta da epitelio transitorio al collo della vescica, seguito da epitelio colonnare e stratificato. L'uretra femminile del topo è rivestita da epitelio transitorio al collo della vescica ed epitelio stratificato, non squamoso, multistrato punteggiato da piccoli dotti che terminano in ghiandole secretorie verso l'estremità^{distale 5}.

Le femmine sono più suscettibili alle infezioni delle vie urinarie (IVU), causate prevalentemente da batteri uropatogeni che salgono dall'intestino attraverso l'uretra per infettare la^{vescica 6}. L'uretra è la prima superficie della LUT che entra in contatto con patogeni urinari ascendenti. La funzione delle cellule epiteliali uretrali, in particolare il loro ruolo di barriera immunologica attiva, è stata poco studiata. Lavori recenti dello stesso gruppo hanno fornito una mappa spaziale a risoluzione di una singola cellula dell'uretra⁵ femmina adulta. Ha identificato un rivestimento uretrale a triplo strato con cellule basali, intermedie e apicali. Intervallate nel rivestimento epiteliale ci sono rare cellule^{neuroendocrine 5,7}. Verso la parte centrale dell'uretra, piccoli dotti si diramano dal tronco principale dell'uretra, terminando in gruppi di ghiandole secretorie, incastonate nel compartimento stromale dell'uretra. I dati trascrittomici hanno rivelato che le cellule epiteliali nell'uretra esprimono geni immunomodulatori e antimicrobici che possono influenzare la difesa^{dell'ospite 5}. Studiare le proprietà e le caratteristiche delle cellule epiteliali uretrali legate al loro potenziale di difesa e alle funzioni immunomodulatrici può fornire nuove strategie per combattere le IVU.

L'uso del topo per studiare l'epitelio uretrale permette studi temporali e indagini sul dimorfismo sessuale. Date le somiglianze del topo con l'umano in termini di architettura cellulare della vescica e^{dell'uretra 1}, il topo è stato ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo embrionale delle vie urinarie^{inferiori 1,8,9}. I topi sono stati inoltre utilizzati in modelli di instillazione transuretrale per studiare le IVU causate da patogeni^urinari 10,11,12. Il tessuto delle vie urinarie inferiori è difficile da raggiungere nei pazienti a meno che non si sottoponga a resezione per cancro o altri disturbi. È difficile accedere a una fonte di tessuto umano sano e costante e il topo fornisce un modello utile per indagare i tessuti delle vie urinarie inferiori per studi sull'omeostasi tissutale, la riparazione e la risposta agli insulti infiammatori. Il rivestimento uretrale femmina del topo e quello umano sono entrambi composti da epitelio di transizione al collo della vescica e da epitelio stratificato, non squamoso e non cheratinizzato verso l'estremità distale. L'epitelio squamoso si osserva all'estremità distale dell'uretra femminile umana, anche se la variabilità si osserva nel rivestimento uretrale femminile umano a partire dai ^5,13 anni. Sebbene non siano stati effettuati confronti del rivestimento uretrale a livello di trascricomia tra l'uretra umana e quella del topo, il topo rappresenta un modello utile per catturare il pattern epiteliale, le interazioni epiteliali-immunitarie e la risposta alle infezioni nell'uretra.

In questo studio, gli autori descrivono metodi per la dissezione dell'uretra femmina adulta di topo a lunghezza intera, l'isolamento dell'epitelio uretrale e la digestione enzimatica gentile per preparare sospensioni monocellulari. Questo è il primo protocollo dettagliato per l'isolamento e la digestione del tessuto epiteliale uretrale femminile del topo. Il protocollo ottimizzato produce una popolazione arricchita di cellule epiteliali unicellulari che può essere utilizzata per varie analisi a valle. Come presentato nello studio, gli autori hanno eseguito citometria di flusso su una sospensione unicellulare di isolati epiteliali uretrali, che dimostra la presenza di singole cellule vitali, prevalentemente di natura epiteliale. Inoltre, queste cellule epiteliali sono in grado di generare organoidi in coltura 3D, che somigliano al rivestimento uretrale stratificato del topo. Gli autori dimostrano inoltre la colorazione a montaggio intero delle lastre epiteliali uretrali per studiare l'associazione delle cellule immunitarie associate all'epitelio, in particolare i macrofagi, con le cellule epiteliali uretrali. I metodi descritti in questo articolo aiuteranno nella ricerca sul rivestimento uretrale e sul suo ruolo nella difesa immunitaria.

Protocollo

Tutti gli studi sui topi sono stati condotti con l'approvazione del Comitato Etico Istituzionale degli Animali (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) e del Comitato per la Biosicurezza Istituzionale (inStem/G-141(3)-22/DBJ) presso il BRIC - Istituto per la Scienza delle Cellule Staminali e la Medicina Rigenerativa di Bengaluru. Per questo studio sono state utilizzate femmine di topi CD-1 o C57BL6/J di età compresa tra 6 e 12 settimane, ospitate presso l'Animal Care and Resource Centre (ACRC) presso il National Centre for Biological Sciences (NCBS), Bangalore Life Sciences Cluster (BLiSC). I topi sono stati ospitati in condizioni specifiche prive di patogeni in un ciclo di 12 ore luce e buio con cibo e acqua ad libitum.

Tutti i materiali utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Dissezione e raccolta dell'uretra femmina adulta del topo

1. Eutanasia il topo usando CO₂ finché il topo non smette di respirare. Eseguire una lussazione cervicale come modalità di eutanasia secondaria.
2. Posiziona il topo in posizione supina e spruzza etanolo al 70% per bagnare i peli sull'addome (Figura 1A).
3. Sollevare la pelle sull'addome con una pinza e fare un'incisione verticale verso la parte inferiore del corpo, terminando all'apertura uretrale esterna (Figura 1B e 1C).
4. Identifica la vescica e sollevala delicatamente con una pinza. In alcuni casi, può essere riempito di urina. Comprimi delicatamente la vescica tra le pinze per svuotarla.
   NOTA: La vescica apparirà come una struttura bulbosa.
5. Tagliare il tessuto adiposo e connettivo intorno alla vescica usando piccole forbici a molla per esporre la struttura a forma di farfalla dove i due ossa pubiche si uniscono nella simfisi pubica (Figura 1D). L'uretra passa sotto la simfisi pubica.
6. Taglia la simfisi pubica sollevandola con la pinza e apri con piccole forbici a molla (Figura 1E). Rimuovere i frammenti dell'osso pubico in modo che l'uretra possa essere vista mentre scende dalla vescica (Figura 1F).
   NOTA: L'uretra apparirà come un sottile tubo rosso che si trova sulla superficie ventrale della parete vaginale (Figura 1G).
7. Tira delicatamente la vescica verso l'alto dalla cavità corporea usando pinze fini e fai passare piccole forbici a molla tra l'uretra e la parete vaginale per separare i tratti urinario e riproduttivo.
8. Mantieni una leggera tensione sulla vescica mentre tagli lungo la parte posteriore dell'uretra per separarla dalla parete vaginale (Figura 1H–J). Taglia fino all'apertura uretrale distale per ottenere l'uretra del topo a tutta lunghezza (1,2–1,5 cm di lunghezza) (Figura 1K e 1L).
9. Separa l'uretra dalla vescica facendo un unico taglio al collo della vescica.

2. Isolamento del tessuto epiteliale uretrale

NOTA: Il protocollo per isolare i fogli epiteliali dall'uretra è stato modificato e ottimizzato da un protocollo per isolare l'epitelio^{endometriale 14}. La Figura 2 mostra i passaggi per l'isolamento dei fogli epiteliali uretrali dal compartimento stromale circostante (Figura 2A).

1. Trasferire l'uretra dissezionata in una piastra di Petri sterile contenente una soluzione salina bilanciata di Hanks fresca 1x (HBSS, Ca e Mg liberi, dettagli riportati nella Tabella Supplementare 1).
   NOTA: Si raccomanda di aggregare 4–5 uretra in questa fase per la separazione epiteliale e la digestione delle singole cellule.
2. Al microscopio dissezionante, tagliare il tessuto adiposo e connettivo intorno all'uretra usando pinze a punto fine e piccole forbici a molla (Figura 2B).
3. Taglia ogni uretra in due pezzi di uguale dimensione trasversali e posizionati sopra un colino a rete di nylon da 100 micron (Figura 2C–G).
4. Lava i tessuti passando 1 mL di 1x HBSS (senza Ca e Mg) sui tessuti.
5. Trasferire i pezzi di tessuto in un tubo microcentrifuga (MCT) da 1,5 mL (Figura 2H) contenente 1 mL di tripsina all'1% (1% di tripsina, w/v a 1x sHBSSa, dettagli riportati nella Tabella Supplementare 2).
6. Digerire il tessuto incubando per 15–30 minuti su un rotatore campione (30 rpm) a 4 °C.
7. Dopo l'incubazione, rimuovere i tubi da 4 °C. Aggiungere MgCl₂ (1 M MgCl₂, stock preparato in 1x HBSS) a una concentrazione finale di 10 mM e DNasi I (10 mg/mL DNasi I, stock preparato in 1x PBS) a una concentrazione finale di 10 μg/mL nello stesso tubo con i pezzi di tessuto.
8. Trasferire il tubo in un forno ibrido a 37 °C su un rotatore di campione per incubare per 15–30 minuti.
   NOTA: I tempi di incubazione della tripsina a 4 °C e 37 °C possono essere regolati in base all'applicazione a valle. È preferibile utilizzare tempi di incubazione di 15 minuti per la colorazione intera e incubazione di 30 minuti per la digestione a singola cellula.
9. Trasferire i tessuti in un MCT da 1,5 mL contenente il 10% di siero di pecora in 1x HBSS (Ca e Mg liberi) per ridurre l'attività della tripsina.
10. Trasferire i tessuti uretrali in un nuovo tubo contenente 1x HBSS (senza Ca e Mg) freddo come il gelo. Poi trasferisci in una piastra di Petri sterile contenente HBSS gelato 1x.
11. Utilizzando due pinze a punto fine, spremere l'epitelio dall'uretra. Tieni un'estremità del pezzo uretrale usando una coppia di pinze.
12. Con l'altra mano, stringi il pezzo uretrale tra le punte della pinza, passando lungo tutta la lunghezza del pezzo per schiacciare l'epitelio. Ripeti questo per i frammenti uretrali rimanenti nel vaso per isolare l'epitelio (Figura 2I–J).
    NOTA: Al momento della separazione meccanica, un sottile strato di tessuto epiteliale trasparente verrà estruso dal lumen dell'uretra. L'epitelio uretrale può essere identificato come frammenti sottili, simili a lastre, che appaiono di colore più chiaro (trasparenti) rispetto al tessuto stromale. Gli isolati epiteliali dovrebbero essere pezzi di tessuto trasparenti e sottili che possono essere trasferiti in una piastra di Petri per la tritura. Gli isolati tissutali non dovrebbero essere completamente degradati. Se i pezzi di tessuto vengono completamente degradati, il tempo di incubazione della tripsina può essere ridotto.

3. Digestione alla sospensione a singola

1. Trasferire pezzi isolati di epitelio in una piastra di Petri sterile usando una piccola pipetta di trasferimento in plastica o una punta da 200 μL. Triturare l'epitelio in piccoli frammenti usando piccole forbici a molla in una goccia di 1x HBSS aggiunta direttamente ai frammenti (Figura 2K).
   NOTA: I pezzi di tessuto stromale rimasti dopo la separazione epiteliale possono essere digeriti utilizzando lo stesso metodo dell'epitelio isolato.
2. Trasferire i pezzi tritati usando una pipetta su un MCT da 2 mL contenente 1,5 mL di soluzione digestionale di Accutasi preriscaldata (37 °C). La soluzione digestionale Accutasi contiene i seguenti elementi: Accutasi, 10 μM Rocki Y-27632 e 100 μg/mL DNasi I.
3. Trasferire il tubo contenente il tessuto e la soluzione digertiva a un rotatore campione in un forno di ibridazione a 37 °C. Incubare per 1 ora.
   NOTA: Il contenuto del tubo può essere controllato per una digestione efficace prima di procedere. Digestione efficace: Il tessuto tritato è ben disperso nella soluzione di Accutasi con solo pochi pezzi visibili dopo l'incubazione. Digestione fallita: Grandi pezzi di tessuto sono ancora presenti dopo l'incubazione nella soluzione di Accutasi. I tessuti devono essere tritati il più fine possibile per una digestione efficace.
4. Dopo 1 ora, trasferisci tutto il contenuto dei 2 mL di MCT in un tubo centrifuga da 5 mL e aggiungi 2 mL di tampone di lavaggio (1x PBS senza Ca e Mg, con albumina sierica bovina all'1%).
5. Fai girare la sospensione a 600 x g per 5 minuti in una centrifuga a 4 °C con un rotore a secchio oscillante.
6. Aspira il surnante usando un vuoto delicato e risospendi il pellet in 1 mL di tampone di lavaggio usando una pipetta da 1 mL con punta filtrante.
7. Usando la punta della pipetta, rompi il pellet pipettando su e giù finché i grumi diventano più piccoli. Fai passare la sospensione con 4 corse attraverso un ago calibro 23 1/2 attaccato a una siringa da 1 mL, seguito da 4–6 colpi attraverso un ago calibro 26 1/2 attaccato a una siringa da 1 mL.
   NOTA: È necessario il passaggio attraverso un ago di piccolo calibro per ottenere una sospensione uniforme a singola e prevenire l'aggregazione cellulare. Sebbene questo passaggio possa causare stress di taglio e morte cellulare, gli autori hanno ottimizzato il numero di colpi con ago e siringa per fornire una singola sospensione senza eccessiva morte cellulare. Saltare questo passaggio comporta una grande proporzione di cellule raggruppate, il che confonderà analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e la citometria a flusso.
8. Aggiungi 1 mL di tampone di lavaggio per bagnare la superficie di un filtro di pre-separazione da 30 micron posizionato su un tubo da 5 mL. Usa la siringa collegata all'ago 26 1/2 per trasferire 1 mL della soluzione cellulare attraverso il colino.
9. Aggiungi 1 mL di buffer aggiuntivo al tubo contenente le cellule, poi prendi questa soluzione con la siringa e la fai passare attraverso il filtro. Cellule a pellet centrifugate a 600 x g per 5 minuti a 4 °C utilizzando un rotore oscillante a secchio.
10. Aspirare il sovrantantante e risospendere il pellet in 100 μL di tampone di lavaggio, aggiungendo 100 μL di 1x tampone di lisi per globuli rossi (RBC). Incuba la sospensione a temperatura ambiente per esattamente 3 minuti, poi aggiungi 4 mL di buffer di lavaggio e risospendi il pellet.
    NOTA: La lisi dei globuli rossi è raccomandata per rimuovere i globuli sanguigni dalla sospensione epiteliale uretrale. Sebbene questo passaggio possa avere un effetto minore sulla vitalità delle cellule epiteliali, il protocollo utilizzava un buffer di lisi dei globuli rossi diluito 0,5 volte e un'incubazione di 3 minuti per minimizzare la perdita cellulare e preservare la vitalità cellulare.
11. Prelevare le celle tramite centrifugazione a 600 x g per 5 minuti a 4 °C utilizzando un rotore oscillante a secchio.
12. Aspirare il sovrandanzante e risospendere il pellet in 50–200 μL di tampone di lavaggio in base alla dimensione del pellet.
    NOTA: La dimensione del pellet da tessuti ottenuti da 4–5 campioni epiteliali uretrali del topo aggregati sarà piccola ma comunque visibile a occhio. È essenziale centrifugare le celle utilizzando un rotore oscillante a secchio in modo che il pellet si accumuli sul fondo del tubo invece di essere spalmato lungo il lato. I ricercatori hanno registrato una resa cellulare di 28.000–34.000 cellule vive per epitelio uretrale del topo.
13. Trasferire 5 μL di aliquota di celle a un MCT da 0,5 mL e aggiungere 5 μL di blu di tripano. Mescola e carica sull'emocitometro per verificare la resa e la vitalità cellulare.

4. Analisi della citometria a flusso degli isolati unicellulari epiteliali uretrali

1. Aliquota 100.000 cellule totali in un tubo centrifuga da 5 mL per effettuare una colorazione immunostatica fluorescente di singole cellule dal compartimento epiteliale uretrale o stromale per la citometria a flusso. Riempi il volume nel tubo a 4 mL con 1x PBS.
   NOTA: Per ottenere risultati affidabili con la citometria a flusso, si raccomanda un minimo di 50.000 cellule per campione.
2. Fai girare la sospensione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C usando un rotore oscillante a secchio.
3. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet in 50 μL di 1x PBS.
4. Aggiungi 50 μL di 2x Ghost dye Violet 450 (1 μL Ghost colorante in 500 μL di 1x PBS) alla sospensione della cella per ottenere 100 μL di soluzione 1x Ghost dye.
   NOTA: Il Ghost Dye V450 è un colorante di vitalità reattivo all'amina che può essere utilizzato per discriminare tra cellule vitali e non vitali nelle applicazioni della citometria a flusso.
5. Aggiungere 5 μL di soluzione bloccante del recettore Fc (anti-topo CD16/32) per ogni 100 μL di sospensione cellulare e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Questo passaggio è necessario per bloccare il legame delle immunoglobuline ai recettori Fc.
6. Incubare la sospensione cellulare sul ghiaccio per altri 25 minuti.
7. Diluire la sospensione cellulare a 5 mL usando tampone di colorazione cellulare (1x PBS, 0,02% (p/v) di azido di sodio e 1% (w/v) BSA, vedi Tabella Supplementare 3). Gira a 500 x g per 5 minuti a 4 °C usando un rotore oscillante del secchio. Scartare il sovrandanante e risospendere il pellet cellulare in 100 μL di tampone di colorazione cellulare.
   NOTA: L'azide di sodio è altamente tossica. Evita il contatto con pelle, occhi e vestiti. Utilizzare l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata durante la manipolazione.
8. In 100 μL di sospensione cellulare, aggiungere 5 μL di anticorpi primari coniugati: anti-CD326/EPCAM (etichetta le cellule epiteliali), anti-F4/80 (marcatore con macrofagi murini) e anti-CD45 (marcatore pan-immunitario) con una diluizione di 1:20. Incuba la sospensione cellulare sul ghiaccio per 30 minuti.
9. Diluire la sospensione della cella a 5 mL usando il tampone di colorazione delle celle, poi centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C usando un rotore oscillante a secchio. Aspirare il sovrantantante e risospendere il pellet cellulare in 500 μL di tampone di colorazione cellulare.
10. Trasferire la sospensione della cella attraverso un filtro a rete di nylon da 35 micron su tubi di selezione del tappo filtrante. Metti i tubi sul ghiaccio fino a ulteriori analisi.
11. Esegui la configurazione iniziale e il controllo delle prestazioni sul citometro.
12. Regola le tensioni usando campioni non colorati e completamente colorati. Effettua la compensazione con i controlli delle perline e procedi all'acquisizione.
    NOTA: Gli esperimenti con più di un fluoroferano richiedono la compensazione. Prepara i necessari controlli di compensazione. Avrai bisogno di controlli con una singola colorazione (cioè perline di compensazione) per ogni fluoroferano utilizzato nell'esperimento. La compensazione può essere eseguita automaticamente in base alle impostazioni del software del citometro di flusso. I controlli FMO (fluorescenza meno uno) sono raccomandati per distinguere tra popolazioni cellulari positive e negative per un dato fluoroforo. Prepara i FMO includendo tutti i fluorofori nel campione tranne quello per cui si sta controllando.
13. Regolare le porte usando controlli FMO (fluorescenza meno uno) e acquisire 50.000 eventi per campione.

5. Cultura degli organoidi epiteliali uretrali

NOTA: Per gli organoidi epiteliali uretrali del topo, segui i Protocolli, Sezione 3, Dalla digestione alla sospensione monocellulare, passaggi 3.1 a 3.11. per ottenere sospensioni a singola cella.

1. Risospendere la pellet delle cellule epiteliali uretrali in un mezzo di espansione organoide da 50–100 μL (dettagli riportati nella Tabella Supplementare 4). Ottieni la vitalità e il numero cellulare contando su un emocitometro.
2. Prepara una miscela 1:4 di sospensione cellulare (1 parte) e Cultrex (4 parti), con una concentrazione finale di 5000 celle a 25 μL. Aggiungi 3 gocce di sospensione a celle da 25 μL (5000 cellule/gocce) in ciascun pozzo di una piastra a 12 pozzi.
   NOTA: Pipetta sempre delicatamente Cultrex con una punta di taglio per evitare bolle.
3. Trasferire la piastra in un incubatore a 37 °C (5% CO₂) per 15 minuti per solidificare le gocce.
4. Sovrappone le goccioline con 800 μL di mezzo di espansione organoide, delicatamente dai lati del pozzo, e trasferite la lastra di nuovo nell'incubatrice.
   NOTA: Il cambio media è obbligatorio ogni 2 giorni. Sostituire il mezzo esaurito con un mezzo di espansione organoide fresco da 800 μL.
5. Scattare immagini degli organoidi ogni giorno dal giorno 0 al 6 giorni utilizzando un microscopio rovesciato a ingrandimento 4x–20x.

6. Organoidi uretrali, istologia e immunocolorazione

ATTENZIONE: Lo xilene è un solvente altamente infiammabile. Usa DPI adeguati per maneggiare la sostanza chimica. Raccogliere lo xilene usato come rifiuto di solvente organico. Smaltire attraverso programmi approvati per rifiuti chimici pericolosi. La formalina è tossica e causa irritazione della pelle, degli occhi e delle vie respiratorie. Evita il contatto con la pelle e l'inalazione. Usa DPI adeguati per maneggiare la sostanza chimica. Smaltire tramite sistemi istituzionali di smaltimento di rifiuti chimici pericolosi. Il protocollo per inserire organoidi uretrali nei blocchi di paraffina è stato modificato e ottimizzato da un protocollo per inserire organoidi^{endometriali 14}.

1. Al sesto giorno di coltura organoide, si elimina il materiale esaurito e si lava gli organoidi con 1x HBSS a temperatura ambiente. Aggiungi 1,5 mL di formalina neutra tamponata (10%) ai pozzi per 15 minuti.
2. Elimina il fissativo e aggiungi 1,5 mL di ematossilina ai pozzi per 10 minuti. Elimina la macchia e lava due volte con 1x HBSS.
3. Aggiungi 1 mL di agarosio UltraPure al 2% a basso punto di fusione prodotto in 1x HBSS in ogni pozzo contenente 3 gocce, lascia solidificare l'agarosio per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovi delicatamente l'agarosio dal pozzo usando l'estremità piatta di una spatola sottile, assicurandoti che le gocce di Cultrex si stacchino con essa.
5. Trasferire il disco di agarosio in una cassetta di tessuto e disidratare al 70% di etanolo per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione costante.
6. Ulteriormente disidratazione in diverse concentrazioni di etanolo e durata: 90% etanolo per 30 minuti, 100% etanolo per 30 minuti, 100% etanolo per 60 minuti, 100% etanolo per 90 minuti.
7. Asciuga l'eccesso di etanolo e schiarisce con xilene per 45 minuti a temperatura ambiente con agitazione costante. Ripeti il passaggio di pulizia dello xilene per 60 minuti.
8. Tamponare l'eccesso di xilene e trasferirlo durante la notte alla cera di paraffina infiltrata (65 °C).
9. Aggiungi uno strato sottile di cera da incastonamento alla base di uno stampo metallico e posiziona sopra il disco di agarosio. Rimuovi lo stampo dal scaldatore a cullone e sovrapporlo rapidamente con cera da incastonare attraverso le stecche del fondo della cassetta. Lascia solidificare a temperatura ambiente.
10. Tagliare blocchi organoidi di paraffina su un microtomo per ottenere sezioni a 5 μm. Metti le sezioni su scivoli a carica positiva.
11. Colorazione ematossilina-eosina
    1. Cuocere le lamine a 60 °C e deparaffinare con xilene e reidratare attraverso una serie di lavaggi con etanolo (xilene 1 minuto, 100% etanolo 1 minuto, etanolo 95% 1 minuto, 75% etanolo 1 minuto)
    2. Lavare i vetri in acqua del rubinetto e incubare con l'Ematossilina n. 2 di Gill per 3 minuti. Metti delle lame sotto un getto di acqua del rubinetto per sviluppare un colore blu.
    3. Incubare le vetrine in etanolo al 95% per 1 minuto, seguita da una soluzione di eosina allo 0,25% per 1 minuto. Lava le scorre nell'acqua del rubinetto finché l'acqua non scorre limpida.
    4. Lamina disidratante (95% etanolo 1 minuto, 100% etanolo 1 minuto) e trasparente con xilene (1 minuto) prima di montare con un mezzo di montaggio a rapido indurirmento.
12. Immunocolorazione delle sezioni di paraffina
    1. Cuocere sezioni di paraffina da 5 μm in un forno di ibridazione a 60 °C per 1–2 ore.
    2. Dewax scivola immergendolo nello xilene per 6 minuti in un barattolo per la tintura per vetrine.
    3. Reidrat si inserisce 100%, 95%, 75% etanolo in acqua distillata per 6 minuti ciascuno. Poi lava i vetri in acqua distillata per 5 minuti.
    4. Aggiungi le lamine in una teglia quadrata di Pyrex contenente 0,01 M di acido citrico (in acqua distillata) per il recupero dell'antigene, e copri la teglia con pellicola traslucida. Esegui il prelievo dell'antigene riscaldando al microonde ad alta potenza per 20 minuti.
    5. Raffreddare a tenersi tiepido per 20 minuti e risciacquare i vetri in PBS per 5 minuti. Disegna una barriera idrofobica attorno alle sezioni di tessuto e aggiungi 100 μL/sezione di tampone bloccante per cavalli per 1 ora a temperatura ambiente con un leggero dondolio (vedi Tabella Supplementare 5 per la preparazione del tampone bloccante per cavalli).
    6. Preparare la soluzione primaria di anticorpi in un tampone di blocco del cavallo aggiungendo anticorpi primari a una diluizione adeguata (1:100–1:200). Aggiungere 100 μL di soluzione primaria di anticorpi a ciascuna sezione. Incubare i vetri durante la notte a 4 °C con un leggero dondolo.
       NOTA: Gli organoidi sono stati immunocolorati con anticorpi contro la cheratina 5/KRT5 (marcatore epiteliale basale), P63 (marcatore epiteliale basale), KRT4 (marcatore epiteliale intermedio/soprabasale) e KRT13 (marcatore epiteliale intermedio/soprabasale).
    7. Dopo l'incubazione notturna, lavare i vetri in PBS 4 x 5 min a temperatura ambiente con un leggero dondolo.
       NOTA: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in una scatola protetta dalla luce a temperatura ambiente.
    8. Preparare una soluzione secondaria di anticorpi in un tampone bloccante per cavalli, aggiungendo anticorpi secondari marcati fluorescenti a una diluizione 1:500. Incubare i vetri per 1 ora a temperatura ambiente con un leggero dondolo.
    9. Lava i vetri in PBS 4 x 5 min a temperatura ambiente con un leggero dondolo.
       NOTA: Passaggio opzionale: usa kit di tempra autofluorescenza per spegnere il segnale di autofluorescenza.
    10. Incuba con una soluzione DAPI da 300 nM per 5 minuti con un dondolio delicato. Lava in PBS per 2 x 5 minuti a temperatura ambiente con un dondolio delicato.
    11. Montare con soluzione anti-sfumatura (90% glicerolo, 0,2% n-propile gallato in 1x PBS). Sezioni immagini su un microscopio fluorescente widefield.
        NOTA: Le impostazioni di esposizione della fotocamera per ogni fluoroforo devono essere regolate per massimizzare il rapporto segnale-rumore evitando la saturazione dei pixel. Usa le stesse impostazioni di esposizione mentre immagini gli organoidi colorati in una determinata sessione.

7. Immunocolorazione completa di fogli epiteliali uretrali isolati

NOTA: Per l'immunocolorazione a montaggio completo, segui il Protocollo, Sezione 2, Isolamento del tessuto epiteliale uretrale, passaggi 2.1 a 2.12. per ottenere i fogli epiteliali uretrali.

1. Trasferire con cura il tessuto epiteliale utilizzando una pipetta di trasferimento o la punta di una pipetta da 200 μL in un pozzetto di una piastra di coltura tessutale a 24 pozzi contenente 500 μL di formalina tamponata neutra al 10%. Sigilla il coperchio del piatto con paraffina e incuba su un dondolo per 20 minuti a 4 °C.
   NOTA: Esegui tutti i passaggi nello stesso pozzo per evitare la perdita di tessuto epiteliale.
2. Aspira con cura la formalina dal pozzo. Esegui un lavaggio con 500 μL di 1x PBS e incuba su un oscillatore per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripeti ancora una volta lo stesso passaggio di lavaggio.
3. Aggiungere 500 μL di soluzione di permeabilizzazione contenente 1x PBS + 1% Triton X-100 al pozzo. Sigilla il coperchio della piastra usando parafilm e incuba per 2 ore a 4 °C con un leggero dondolo.
4. Aspira con cura la soluzione di permeabilizzazione dal pozzo.
5. Eseguire il blocco incubando tessuti in un buffer di blocco per cavalli da 500 μL contenente un ulteriore 1% di Triton X-100 (la ricetta per il buffer di blocco per cavalli è fornita nella Tabella Supplementare 5). Sigilla il coperchio della ciotola con parafilm e incuba durante la notte a 4 °C con un dondolio delicato.
6. Preparare la soluzione primaria di anticorpi in un tampone di blocco per cavalli contenente un ulteriore 1% di Triton X-100 aggiungendo anticorpi primari a una diluizione adeguata (1:100–1:200). Aspirare la soluzione bloccante e aggiungere 500 μL di soluzione primaria di anticorpi: anti-CDH1 (marcatore delle cellule epiteliali) e anti-F4/80 (marcatore macrofagico murino). Sigilla il coperchio con parafilm e incuba per 48–72 ore a 4 °C con un leggero dondolio.
7. Aspira con cura la soluzione primaria di anticorpi e lava 3 volte con 1 PBS per 30 minuti ciascuna a temperatura ambiente, dondolando dolcemente.
8. Prepara soluzioni secondarie di anticorpi in un tampone di blocco per cavalli con un ulteriore 1% di Triton X-100 aggiungendo anticorpi secondari a una diluizione adeguata (1:500).
9. Aggiungere 500 μL di soluzione secondaria di anticorpi al pozzo e coprire la piastra con carta stagnola, e incubare per 4–6 ore a temperatura ambiente su un oscillante.
10. Aspirare con cura la soluzione secondaria di anticorpi e lavare 3 volte con 1 PBS per 30 minuti ciascuna a temperatura ambiente.
    NOTA: La colorazione DAPI può essere eseguita incubando tessuti con soluzione di stock DAPI diluita (concentrazione finale di 300 nM) per 10 minuti a temperatura ambiente. Lava i fazzoletti con 1x PBS (2x 5 min) a temperatura ambiente su un dondolo.
11. Trasferire con cura i tessuti epiteliali su un vetrino di vetro o una piastra di imaging e aggiungere una soluzione anti-sfumatura (90% Glicerolo, 0,2% n-propile gallato in 1x PBS).
12. Tessuti dell'immagine su un microscopio fluorescente.
    NOTA: Data la densità del campione, gli autori raccomandano di effettuare immagini su microscopio fluorescente capace di sezionamento ottico. In questo studio, gli autori hanno utilizzato un microscopio fluorescente a campo ampio con sezione ottica Apotome per rimuovere la luce fuori fuoco e ottenere gli z-stack. Sono state ottenute le pile z di immagini per visualizzare proiezioni dendritiche dei macrofagi associati all'epitelio.

Risultati

Dissezione e raccolta dell'uretra femmina adulta del topo

Nella prima parte di questo studio, gli autori forniscono un protocollo dettagliato per la dissezione dell'uretra femminile del topo. Data la sua inserzione alla parete vaginale ventrale e la posizione sotto la simfisi pubica, il metodo qui fornito consente la dissezione pulita dell'uretra femminile a tutta lunghezza (Figura 1).

Isolamento del tessuto epiteliale uretrale e analisi della citometria a flusso per isolati monocellulari

La digestione della tripsina consente una facile separazione del rivestimento epiteliale dell'uretra dallo stroma circostante. Dopo la separazione si possono osservare fogli epiteliali con maggiore trasparenza rispetto al tessuto stromale (Figura 2). I fogli epiteliali separati hanno prodotto sospensioni monocellulari durante la digestione enzimatica. Le singole cellule isolate dall'epitelio uretrale mostrano costantemente alta vitalità (>80%) tramite esclusione del blu di tripano su un emocitometro (Figura 2L) e citometria di flusso utilizzando coloranti di vitalità per portare cellule vive (Figura 3, Fascicolo Supplementare 1).

Gli autori hanno eseguito la citometria a flusso per valutare l'arricchimento delle cellule epiteliali da sospensioni monocellulari dell'epitelio uretrale. Per verificare la vitalità cellulare, la sospensione cellulare è stata colorata con un marcatore vivo/morto, il colorante fantasma reattivo all'amina V450. Gli autori hanno costantemente osservato una vitalità cellulare dell'>80% rispetto al marcatore vivo/morto. Il marcatore vivo/morto ha permesso di eliminare detriti e cellule morte durante l'analisi del flusso. Hanno colorato campioni con un marcatore cellulare epiteliale (CD326/EPCAM), un marcatore macrofagico (F4/80) e un marcatore cellulare immunitaria (CD45) per registrare la composizione delle cellule isolate tramite questo metodo. I risultati della citometria a flusso hanno mostrato che gli autori hanno isolato una popolazione cellulare epiteliale arricchita dall'epitelio uretrale femminile del topo. Per entrambi gli esperimenti indipendenti condotti, il gruppo ha ottenuto l'80–90% delle cellule epiteliali positive a EPCAM dopo il gating sulle cellule vive. Gli autori hanno inoltre osservato ~1,30% delle cellule immunitarie CD45+ nella preparazione epiteliale. I macrofagi associati al rivestimento epiteliale rappresentavano ~1,18% delle cellule vive provenienti dal compartimento epiteliale. L'analisi della citometria a flusso delle sospensioni monocellulari da fogli epiteliali mostra una contaminazione stromale minima (5–6%), attribuita principalmente all'endotelio vascolare secondo il loro precedente^{studio 5}. Il File Supplementare 1 mostra i risultati della citometria a flusso per preparazioni monocellulari dai compartimenti epiteliale e stromico. Rispetto all'arricchimento dell'80–90% delle cellule epiteliali isolate dal compartimento epiteliale, il compartimento stromale mostrava anche il 40–50% delle cellule epiteliali, che provengono dai dotti corti e dall'epitelio ghiandolare che si estendono dal lumen uretrale allo stroma circostante (Figura 3, File supplementare 1).

Coltivazione degli organoidi epiteliali uretrali, istologia e immunocolorazione

Gli autori dimostrano inoltre come singole cellule epiteliali isolate dall'uretra siano vitali e possano formare organoidi in una matrice 3D, e hanno osservato la crescita organoide da singole cellule epiteliali uretrali fino al Giorno 6 in coltura (Figura 4B–G). Hanno eseguito la colorazione dell'ematossilina-eosina (H&E) per osservare l'istologia degli organoidi (Figura 4H–J). Gli autori hanno osservato due morfologie distinte di organoidi epiteliali uretrali, una grande e cava, mentre l'altra era più piccola e solida. In entrambi i casi, gli organoidi erano marcatori stratificati e ricapitolati espressi nel rivestimento epiteliale dell'uretra femminile, inclusi KRT5 e P63 che segnano lo strato basale e KRT4 e KRT13 che marcano gli strati cellulari suprabasali/intermedi (Figura 4K–N), Figura supplementare 1). Sono state esaminate le differenze nella capacità di formazione organoide tra l'uretra prossimale e distale. Gli organoidi generati dall'uretra prossimale presentavano una proporzione maggiore di organoidi cavi, mentre gli organoidi provenienti dall'uretra distale formavano sfere solide (Figura 4O–P). Inoltre, hanno osservato differenze nell'efficienza nella formazione di organoidi nelle cellule epiteliali isolate dalle parti prossimale e distale dell'uretra. L'epitelio uretrale distale ha formato organoidi con maggiore efficienza rispetto all'epitelio uretrale prossimale con la stessa densità iniziale di semina (5000 cellule/gocce) (Figura 4Q–S).

Immunocolorazione a montaggio intero di fogli epiteliali uretrali isolati

I ricercatori presentano anche un metodo ottimizzato per la colorazione completa delle lastre epiteliali uretrali femmine del topo. Qui, hanno colorato fogli epiteliali con due marcatori: F4/80 per i macrofagi ed E-cadherina/CDH1 per segnare le giunzioni cellula-cellula epiteliale (Figura 5). I tessuti sono stati fotografati utilizzando un microscopio Zeiss Axio Observer 7 con sezionamento ottico Apotome 3. I fogli epiteliali mostrano una forte marcatura con l'anticorpo CDH1. Preparazioni intere di epitelio uretrale marcate con anticorpi contro F4/80 hanno mostrato macrofagi che formano un albero di dendriti nel rivestimento epiteliale. Si possono osservare macrofagi che trasmettono processi dendritici tra cellule epiteliali dell'uretra. Nel complesso, i risultati dimostrano l'utilità dei protocolli descritti qui per lo studio del rivestimento epiteliale dell'uretra femminile del topo.

Figura 1: Dissezione del topo per la raccolta dell'uretra femminile. (A) Posizionare il topo in posizione supina e spruzzare l'addome con il 70% di EtOH. (B–C) Apri l'addome sollevando la pelle e facendo un'incisione verticale. (D) Tagliare il tessuto adiposo e connettivo per esporre le ossa pubiche a forma di farfalla collegate alla (freccia in nero) simfisi pubica. (E) Taglia la simfisi pubica. (F) Una volta rimosse le ossa pubiche, si può vedere l'uretra scorrere verso il basso (delineata con una linea tratteggiata nera) dalla vescica. (G) Tira delicatamente la vescica con la pinza. L'uretra è chiaramente visibile come un sottile tubo rosso. (H–I) Tira la vescica verso l'alto dalla cavità corporea. Usa la tensione sulla vescica per separare l'uretra dalla parete vaginale ventrale. Fai passare le forbici tra l'uretra e la parete vaginale per separare le vie urinarie e riproduttive. (J–K) Stacca l'estremità distale dell'uretra attaccata alla pelle. (A sinistra) Immagine di una femmina del tratto urinario inferiore (FLUT) dissezionata, che mostra vescica e uretra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Isolamento dell'epitelio uretrale e preparazione di una sospensione unicellulare. (A) Schema che raffigura la digestione enzimatica e la separazione meccanica dei compartimenti epiteliale e stromale dell'uretra, seguita dalla digestione a singola cellula. (B) Eliminare il grasso in eccesso dalle vie urinarie inferiori femminili. (C–F) Taglia l'uretra dalla zona del collo della vescica per separare l'uretra dalla vescica. Poi taglia l'uretra in due metà usando forbici sottili. (G) Lavare i pezzi uretrali con una soluzione HBSS 1x passando sopra un filtro da 100 micron. (H) Trasferire frammenti di tessuto uretrale in una soluzione all'1% di tripsina. Incubare su un rotatore campione nella camera fredda. Aggiungi MgCl₂ e DNasi I allo stesso tubo. Incubare a 37 °C in un forno di ibridazione su un rotatore campione. (I–J) Isola l'epitelio stringendo delicatamente con pinze sottili lungo tutta la lunghezza del frammento uretrale. (K) I tessuti vengono tritati in piccoli frammenti usando forbici fini. Trasferire il tessuto epiteliale tritato in una soluzione digerente Accutase e incubare a 37 °C in un forno di ibridazione su un rotatore campione. (L) Contare le cellule epiteliali e valutare la vitalità usando il blu di tripano con un emocitometro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Citometria a flusso per valutare le sospensioni monocellulari dai compartimenti epitelio uretrale e stroma. La citometria a flusso è stata eseguita su preparazioni unicellulari dei compartimenti epiteliali dell'uretra (A) e dello stromale (B) del topo aggregati. Le cellule vive sono state bloccate per escludere quelle morte colorate con Ghost Dye V450. Le cellule vive sono state valutate per l'espressione di CD45 (marcatore pan-immunitario), CD326/EPCAM (marcatore pan-epiteliale) e F4/80 (marcatore macrofagico murino). I dati sono rappresentativi di 2 esperimenti indipendenti condotti su un gruppo di 5–6 topi per esperimento per generare campioni epiteliali e stromali. Abbreviazioni; SSC-A = area di picco di dispersione laterale; FITC = fluoresceina isotiocianato; APC = alloficocianina; PE = ficoeritrina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Istologia e immunocolorazione degli organoidi epiteliali uretrali. (A) Schema che mostra il flusso di lavoro per la generazione degli organoidi epiteliali uretrali. (B–G) Micrografie rappresentative in campo chiaro degli organoidi epiteliali uretrali (UEO) generate da singole cellule in giorni diversi di espansione in vitro. Immagini rappresentative in campo chiaro degli organoidi epiteliali uretrali (H) cavi e (I) solidi (UEO) colorati con ematossilina ed eosina (H&E). (J) Quantificazione dei tipi di organoidi generati in tre esperimenti indipendenti. La barra di errore rappresenta l'errore standard della media. Immagini rappresentative di organoidi epiteliali uretrali (K) cavi e (L) solidi (UEO) immunocolorati con marcatori epiteliali KRT13 (marcatore epiteliale soprabasale), KRT5 (marcatore epiteliale basale) e P63 (marcatore epiteliale basale). Le immagini che raffigurano singoli canali fluorescenti sono raffigurate in K', K'', K''', L', L'' e L''''. Immagini rappresentative di organoidi epiteliali uretrali (M) cavi e (N) solidi (UEO) immunocolorati con marcatori epiteliali KRT4 (marcatore epiteliale soprabasale) e KRT5 (marcatore epiteliale basale). Le immagini che raffigurano singoli canali fluorescenti sono raffigurate in M', M'', N' e N". (O) Schema della dissezione dell'uretra prossimale e distale. (P) Quantificazione dei tipi di organoidi generati dall'uretra prossimale e distale attraverso due esperimenti indipendenti. Micrografie rappresentative in campo chiaro degli organoidi epiteliali uretrali (UEO) del giorno 6 generate dall'epitelio isolato dall'uretra prossimale (Q) e dalla (destra) distale. I dati sugli organoidi generati dall'intera uretra sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti condotti con un gruppo di 3–5 topi per esperimento. (S) I dati sugli organoidi generati dall'uretra prossimale e distale sono rappresentativi di 2 esperimenti indipendenti condotti con un gruppo di 3–4 topi per esperimento. Nuclei marcati con DAPI (blu). (Barre di scala, 100 μM). Schemi preparati con BioRender e Adobe Illustrator. Creato in BioRender. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immunocolorazione integrale dei fogli epiteliali uretrali. (A) Sezione congelata a 10 micron dell'uretra femmina adulta del topo in un mezzo di taglio ottimale, che mostra immunocolorazione per il marcatore macrofagico murino F4/80 (in rosso) e la proteina epiteliale E-cadherina/CDH1 (in verde). (A') rappresenta la visuale ingrandita dell'inserimento in (A). (B) Diagramma schematico che mostra i passaggi per la colorazione completa delle lastre epiteliali uretrali isolate. L'immunocolorazione integrale del rivestimento epiteliale uretrale femminile di topo è stata eseguita con anticorpi contro il marcatore macrofagico murino F4/80 (in rosso) e la proteina epiteliale E-cadherina/CDH1 (in verde). (C) Immagine rappresentativa della visione unificata. (D) Proiezione ortogonale di massima intensità del canale rosso che mostra l'organizzazione dei macrofagi. (E–F) Vista ingrandita dell'epitelio e dei macrofagi associati. Barra a scala bianca, 50 μM. Barra a scala di grigia, 500 μM. I dati rappresentano 2 esperimenti indipendenti condotti su un gruppo di 4–5 topi. Schemi preparati in BioRender e Adobe Illustrator. Creato in BioRender. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Preparazione di 1x HBSS (senza Ca, Mg).Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Preparazione di 1x sHBSSa e soluzione di tripsina all'1%.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Preparazione del tampone di colorazione cellulare/flusso.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 4: Preparazione dei mezzi di espansione organoide per organoidi epiteliali uretrali.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 5: Preparazione del buffer di blocco per cavalli.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Conteggio cellulare per l'esperimento di citometria a flusso condotto su singole cellule dei compartimenti epiteliale uretrale e stromale da due esperimenti indipendenti.Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 1: Confronto tra l'epitelio uretrale femmina adulta del topo e gli organoidi epiteliali uretrali. Immagini rappresentative di (A) epitelio uretrale femmina adulta di topo, (B) organoidi epiteliali uretrali cavi e (C) organoidi epiteliali uretrali solidi (UEO) immunocolorati con marcatori epiteliali KRT13 (marcatore epiteliale soprabasale), KRT5 (marcatore epiteliale basale) e P63 (marcatore epiteliale basale). Le immagini che raffigurano singoli canali fluorescenti sono raffigurate in A', A'', A',B', B'', B', C' e C'''. Immagini rappresentative di (D) epitelio uretrale femmina adulta di topo, (E) organoidi epiteliali uretrali cavi e (F) organoidi epiteliali uretrali solidi (UEO) immunocolorati con marcatori epiteliali KRT4 (marcatore epiteliale soprabasale) e KRT5 (marcatore epiteliale basale). Le immagini che rappresentano canali fluorescenti singoli sono raffigurate in D', D''', E', E'', F' e F". Dati rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti condotti con un gruppo di 3–4 topi per esperimento. Nuclei marcati con DAPI (blu). (Barre di scala, 100 μM). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Le barriere epiteliali nel corpo sono di importanza cruciale per la difesa dell'ospite. Si tratta di compartimenti specializzati con molteplici tipi di cellule epiteliali e cellule immunitarie residenti associate. Le barriere epiteliali cambiano nel tempo dello sviluppo, acquisendo espressione genica della difesa dell'ospite spesso in risposta al microbiota o all'esposizione ambientale. Difetti nell'integrità epiteliale o nell'espressione genica possono influenzare la difesa^{dell'ospite 15}. È essenziale studiare il tessuto epiteliale in isolamento per comprendere le firme trascricomiche e per indagare i contatti cellula-cellula e l'integrità epiteliale. Attualmente non sono stati descritti in dettaglio metodi ottimizzati per l'isolamento del tessuto epiteliale uretrale dalla femmina del topo. Mentre l'epitelio della vescica può essere isolato solo tramite separazione^{meccanica 16}, l'epitelio uretrale è presente all'interno del tubo stromaico dell'uretra e richiede una combinazione di separazione enzimatica e meccanica per isolare il tessuto epiteliale.

Qui, gli autori presentano un metodo ottimizzato per l'isolamento dei fogli epiteliali dal lumen uretrale delle femmine di topo. Il metodo può essere utilizzato per generare sospensioni monocellulari ad alta vitalità di cellule epiteliali uretrali per applicazioni a valle come la citometria a flusso, la coltura organoide e l'immunocolorazione. La compatibilità di questo metodo con i flussi di lavoro di sequenziamento dell'RNA a singola cellula era stata precedentemente dimostrata dallo stesso gruppo⁵. Con modifiche e ulteriori ottimizzazioni, il protocollo qui presentato può essere adattato per estrarre tessuti epiteliali da altri organi tubolari per applicazioni a valle.

I passaggi chiave del protocollo prevedono un'attenta dissezione dell'uretra femmina adulta di topo a lunghezza intera, permettendo lo studio delle differenze regionali lungo l'asse prossimale-distale. Successivamente, il protocollo utilizza una digestione enzimatica delicata per allentare la mucosa epiteliale dell'uretra rispetto allo stroma circostante. La digestione enzimatica allenta l'epitelio per permettere la separazione meccanica stringendo delicatamente il tubo uretrale tra le pinze per liberare il tessuto epiteliale. I ricercatori hanno ottimizzato con cura il tempismo della digestione della tripsina per consentire l'isolamento dell'epitelio uretrale ad alta vitalità (> 80%) come fogli per l'immunocolorazione o per l'isolamento a valle di singole cellule (Figura 3, File Supplementare 1). La digestione unicellulare dell'epitelio uretrale ha rivelato l'80–90% delle cellule epiteliali negli isolati epiteliali uretrali. Da uno studio precedente, gli autori hanno identificato che le cellule non epiteliali in questa preparazione sono composte principalmente da cellule immunitarie associate all'epitelio e da endotelio^{vascolare 5}. L'attuale metodo per l'isolamento a singola cellula produce sospensioni di alta qualità per applicazioni a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, eliminando gli ammassi cellulari tramite interruzioni meccaniche tramite aspirazione con ago a piccolo calibro e rimozione dei globuli rossi tramite lisi delicata.

I risultati dimostrano che questo metodo può essere utilizzato per arricchire cellule immunitarie specifiche di compartimenti (Figura 3). Anche l'epitelio isolato dall'uretra prossimale e distale può essere studiato separatamente. Inoltre, gli autori hanno dimostrato che cellule epiteliali isolate possono essere utilizzate per la generazione di organoidi uretrali che non sono stati descritti in precedenza (Figura 4). Questi risultati dimostrano anche la variabilità regionale nella capacità di generazione organoide nell'uretra femminile. Sebbene gli studi recenti dell'autore abbiano mostrato differenze prossimali-distali nell'espressione genica epiteliale e nell'organizzazione delle cellule immunitarie nell'uretra^{femmina del topo}, lo studio attuale mostra che le cellule epiteliali uretrali prossimali formano meno organoidi rispetto all'epitelio isolato dall'uretra distale (Figura 4). Una limitazione di questa demarcazione spaziale tra uretra prossimale e distale è che non esiste un punto di riferimento anatomico che possa essere utilizzato al momento della dissezione per distinguere tra queste due aree. In questo studio, gli autori hanno diviso la lunghezza dell'uretra per metà per ottenere i compartimenti prossimali e distali. Il metodo di isolamento epiteliale descritto qui può essere utilizzato per caratterizzare ulteriormente le differenze nell'espressione genica e nella composizione cellulare tra l'epitelio uretrale prossimale e distale.

Sebbene il protocollo ottimizzato qui presentato sia accessibile e riproducibile, alcuni passaggi richiedono pratica e calibrazione accurata. In particolare, il metodo di dissezione mostrato qui richiede un'accurata estrazione del tubo uretrale da sotto la simfisi pubica, preservando l'intera lunghezza dell'uretra. Inoltre, è necessario prestare attenzione alla rimozione di qualsiasi tessuto vaginale attaccato alla parete uretrale dorsale dopo la dissezione. Il grasso presente attorno al collo della vescica deve essere rimosso con attenzione per ridurre la contaminazione da adipociti durante applicazioni a valle come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Inoltre, la digestione della tripsina dovrebbe essere ottimizzata con attenzione con ogni lotto di enzima per garantire una digestione costante. Una digestione eccessiva dei tessuti può portare a una perdita di vitalità cellulare. Gli autori hanno ottimizzato con cura il tempo di digestione della tripsina, indicando una finestra temporale di 15–30 minuti per le fasi di incubazione a 4 °C e 37 °C. Questo può essere ulteriormente ottimizzato in base al lotto di enzima utilizzato. È inoltre fondamentale triturare i tessuti in piccoli pezzi per una digestione efficiente delle singole cellule. Gli autori hanno utilizzato Accutase per una digestione ulteriore a singola cellula, poiché produce una dissociazione delicata. In caso di riduzione della vitalità cellulare, il tempo di incubazione dell'Accutasi può essere ridotti. Inoltre, gli autori hanno incluso l'inibitore delle rocce nel mix digerente Accutase per migliorare la sopravvivenza cellulare. La digestione della DNasi è raccomandata per ridurre l'aggregazione cellulare digerendo il DNA extracellulare rilasciato dalle cellule morte e morenti. Gli autori raccomandano inoltre l'uso del tampone di lisi RBC per ridurre la contaminazione da globuli rossi che confonderebbe risultati a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Una limitazione del metodo di isolamento epiteliale presentato qui è che è stato ottimizzato per l'uretra femminile del topo. L'uretra maschile del topo è più anatomicamente complessa, con variazioni dell'architettura epiteliale dall'uretra prossimale a quella distale. Inoltre, il metodo può isolare solo le cellule epiteliali che rivestono il lume uretrale. Le ghiandole secretorie uretrali collegate al lumen uretrale tramite brevi dotti epiteliali non possono essere isolate poiché sono immerse nel tessuto stromale. Invece, queste strutture epiteliali si arricchiscono nel compartimento stromale rimasto dopo l'isolamento del rivestimento epiteliale uretrale (Figura 3).

Nonostante queste limitazioni, questo metodo ha permesso importanti approfondimenti sull'architettura epiteliale uretrale e permetterà ulteriori indagini sulle cellule immunitarie associate all'epitelio tramite la visualizzazione in situ dei macrofagi associati all'epitelio. Il metodo è già stato dimostrato compatibile con i flussi di lavoro di sequenziamento dell'RNA a singola cellula per identificare l'eterogeneità cellulare nell'epitelio uretrale e nelle cellule immunitarie associate⁵. Inoltre, la capacità di isolare l'epitelio dall'uretra prossimale e distale permetterà agli studi di comprendere le differenze spaziali nell'uretra. In modo significativo, il metodo di digestione delle cellule epiteliali produce singole cellule vitali in grado di generare organoidi epiteliali uretrali utili per studiare le interazioni ospite-patogeno e la biologia epiteliale dell'uretra. Nel complesso, questi metodi arricchiscono il kit degli strumenti per consentire indagini più approfondite sulla biologia epiteliale uretrale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#5 fine forceps
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12-well plate	Corning	3513
30-micron pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		Per realizzare i pannelli della figura
Adobe Photoshop	Adobe		Per realizzare i pannelli della figura
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Antibiotic/antimycotic	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	1:20 diluzione, per citometria a flusso
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	1:20 diluzione, per citometria a flusso
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	1:200 diluzione
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	1:20 diluzione, per citometria a flusso
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	1:200 diluzione
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	1:200 diluzione
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	1:200 diluzione
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	1:800 diluzione
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	1:200 diluzione
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	1:200 diluzione
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 supplement	Invitrogen	12587010
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Genetix	PG-2330
CD-1 Mice	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI solution	Sigma Aldrich	D5942
D-Glucose	Qualigens	Q15405
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Himedia	MB058
di-Sodium Hydrogen Ortophosphate (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	1:500 diluzione
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	1:500 diluzione
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	1:500 diluzione
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	1:500 diluzione
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	1:500 diluzione
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	1:500 diluzione
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	1:500 diluzione
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosin	Himedia	GRM938
Ethanol	Supelco	1.00983
Eukitt mounting media	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
Filter cap sorting tubes	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
Glycerol anhydrous	Merck	DA1P692899
Hematoxylin	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
Horse serum	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	Analisi dei dati di citometria a flusso
Magnesium chloride (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )	Biolegend	101320
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130
Paraffin wax	Qualigens	Q19215
Potassium chloride (KCl)	Qualigens	Q13305
Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC Lysis Buffer (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625
Rocki  (Y-27632)	Cell Signalling Technology	13624S
R-spondin 1	PeproTech	315-32
Sodium azide	Sigma